JPS606620A - ひと血漿フラクシヨン製品の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、凝固因子製品、グロブリン製品、血漿酵素
および血漿酵素阻害剤のようなひと血漿製品の製造法に
関するものである。

〔従来の技術およびその問題点〕

供血者を注意深く選別しても、血液または血液由来製品
の注入後に微生物感染による疾病に罹患するおそれがあ
る。血漿フラクションのような血液製剤中の微小生命体
（ｇｅｒｍ：新らしい有機体を生成し得る生きた有機体
の部分または微生物）を不活化するために多くの努力が
なされたが、これらの方法の信頼性は期待に沿うもので
はなかった。

すなわち、ヨーロッパ特許出願公開第００１８５６１号
により、実質的にフィブリノーゲンを含まない凝固因子
（特に第■因子）含有製剤の熱に対する安定化法におい
て、凝固因子の溶液にアミノ酸および単糖類、少糖類ま
たは糖アルコールを混合する方法が知られている。この
ような処理後、製剤を６０°Ｃに１０時間加熱すること
ができ、上記処理がひとアルブミン中のへパテイテイヌ
ウイルスの不活化を起すことが知られている。この公知
方法は、保護成分を高濃度に（溶解度の上限まで）加え
る必要があるのに加えて、凝固因子の収率が充分でない
という欠点を有する。

ヨーロッパ特許出願公開第００３５２０４号には、さら
に、特に第■因子を含む蛋白質組成物の製造法を記載し
ているが、その方法は、組成物をポリオールと混合し、
混合物を、蛋白質組成物が低温殺菌されるに充分な時間
加熱することから構成されている。

従来提案された方法は、Ｂ型肝炎ウィルスを含まない製
品の製造を実質的に対象とし、これは、その製品をチン
パンジーに用いたとき感染症を起さないことによシ確か
められたが、提案された手段がさらに広い範囲の効果を
もつかどうかについては不明であった。例えば、上記公
報の提案する手段は、モデルウィルスとして、いぬ肝炎
ウイルスには全く無効である。しだがって、血漿製品注
入の際には、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスまたは現在確認さ
れていない未知ウィルスについて、なお感染のおそれが
あった。

〔問題点の解決および発明の構成〕

この発明は、上記の不利益および欠点を回避しようとす
るものであって、肝炎ウィルスのみでなく、未知ウィル
スを含む広範囲の微小生命体に対して有効であシ、しか
も貴重な血液製剤の生物活性および分子状態の維持を追
求した、血漿製品中の増殖性微小生命体の不活化方法を
提供しようとするものである。

」二記の目的を達成するだめのこの発明方法は、血漿フ
ラクションを遊離ラジカルで処理することからなるもの
である。今日では、遊離ラージカルの語は、その原子価
が不飽和で反応性が高く、孤立電子または奇数電子を分
子中に有する、極めて短命の無機まだは有機化合物を広
く指すものとして用いられている。

西独公開公報第１６１７５００号に、血漿の保存にアセ
タールペルオキシドを用いることが提案され、この場合
溶液を酸素の不存在下に保存すると無菌に保たれるが、
全血漿中の主成分として存在するアｌレブミンがペルオ
キシダーゼの殺菌作用に対して阻害効果を有するため、
この血漿フラクション不活化法は広範囲のウィルスを対
象とするには不適当である。（ジョング等、ザ・ジャー
ナル・オブ・イムノロジ−１２４巻、３号、１３７８−
１３８２頁、１９８０年３月の「ニオジノフィル・ペル
オキシダーゼの殺菌作用」参照。）また、不活化を達成
するためにウィルス水性けんだく液をアノード酸化する
ことによシ（マーネ７し、ＺＢｌ　、Ｂａｋｔ　、Ｈｙ
ｇ、ｌ　、Ａｂ　【　、Ｏｒ　ｉｇ、ｌ　５　５巻５４
２−５５７頁、１９７８年、「アノード酸化による水中
ウィルスの不活化」参照）、または遊離ラジカルと接触
させることによシ（ベルディング、クレバノフおよびレ
イ、サイエンス１６７巻１９５−１９６頁、１９７０年
、［ペルオキシダーゼ書メゾイエーデッド・ビルデイカ
ルシステムズ」）処理することが提案されているが、こ
の処理はウィルスけんだく液そのもの、すなわち血液製
品の序在しないものについて行なうものである。しかし
、周知のように血液成分はウィルスに列して保護作用を
示すことがあるから、上記課題の達成はベルディング等
の発見した事実から直ちに銹導されるものではない。

この発明において、遊離ラジカルは例えば反応混合物中
に生成させるととができる。

ラジカノげ吋ン ヒドロキシル　水 ラジカル 別の例としては、アルキルペルオキシド、アシルペルオ
キシド、ペルオキシ酸、ペルオキシエステル、およびペ
ルオキシカーボネートから生成する遊離ラジカｌしが含
まれる。

アルキルペルオキシドは、’−４式 ％式％） （式中、Ｋおよびｋはアルキル基または置換アルキル基
を示す）で示される有機化合物である。アルキルヒドロ
ペルオキシドでは　Ｒ’＝Ｈでｘ＝１または２である。

一般に、単官能性アルキルヘルオキシドでは、ｘ　＝　
ｌ　、Ｒ＝＝Ｈまたはアルキルあり、例えば ＣＨ３ ＣＨ３　−Ｃ−０−０−Ｈ ＣＨ３ Ｃ　Ｈ　３Ｃ　Ｈ　３ １ ＣＨ３　−Ｃ−０−０−Ｃ−ＣＨ３ １ Ｃ　ｆ（　３　Ｃ　［１　３ が含まれる。

通常の２官能性アルキルペルオキシド えばｘ　＝　２、Ｒ＝ｔ−ブチル、Ｒ＝ｔ−アルキルジ
ラジカルであシ、次のようなもの が含まれる。

アルキルペルオキシドは、ホモリシス分解ヲ受けて２個
の遊離ラジカルになる。

Ｒ−０−０−Ｈ−一→Ｒ−Ｑ＊　＋　＊０ＨＲ−０−０
−４４−−→Ｒ−Ｑ＊＋Ｒ’−０＊ｔ−アルコキシラジ
カルは、さらに解裂してケトンとアルキルラジカルを生
スる。

ＣＨ３ ジアシルペルオキシドは、下記一般式を有する。

０　０ あシふれたジアシルペルオキシドとしては、例えば が含まれる。

希薄溶液中では、ジアシルペルオキシドは分解して遊離
ラジカルを生成する。

ペルオキシ酸およびペルオキシエステｌｖ＝通常の過酸
および過エステル（ｐｅｒｅｓｔｅｒｓ）中量も重要な
群は、下記一般式を有するモノカｌレボン酸のアルキル
ペルオキシエステル、 Ｒ−０−０−Ｃ−Ｒ／　Ｒ＝Ｈ：ペルオキシ酸例えば す １ （ＣＨ３）３Ｃ−０−０−Ｃ−Ｃ（ＣＨ３）３Ｉ 下記一般式を有するモノおよびジアルキルペルオキシエ
ステル並びにペルオキシ酸、 　０ Ｒ−Ｃ−０−０−Ｒ’−０−０−Ｃ−Ｒ例えば 過酸または過エステルがホモリシヌ解裂をすると遊離ラ
ジカルが生成する。ジ過エステルも同様に反応する。

１ （Ｒ）３　Ｃ−０−０−Ｃ−Ｒ１→（Ｒ）３Ｃ−０＊＋
へ−Ｃ−ＲＩ１ （Ｒ）３　Ｃ−０−０−Ｃ−Ｒ１→（’Ｒ）３Ｃ−０＊
＋ＣＯ２＋＊Ｒ１１１ ペルオキシカルボネートは、下記一般式を有する有機ペ
ルオキシ化合物群である。

ｌζ−０−Ｃ−０−０−Ｃ−０−Ｒ （式中、ｋは１級または２級アルキル、シクロアルギル
、アラルキル、またはアリール基を示ス）例えば、 過炭酸の最も重要な反応は、ホモリシス解裂とそれに続
く脱炭酸による遊離ラジカルの生成であ＋１．　ＩＩ　
ＩＩ １、Ｒ−０−Ｃ−０−０−Ｃ−Ｒ−、２Ｒ−０−Ｃ−０
＊＊　＊ ２、Ｒ−０−Ｃ−０→Ｒ−０±　ＣＯ２１ Ｃ） この発明によ多処理される血漿フラクションは、液体ま
たは固体の形、例えば凍結乾燥された形で存在すること
ができる。

好ましい実施態様によると、遊離ラジカルに分解する化
合物を血漿フラクションに混合するが、例えば遊離ラジ
カル　アセチルおよび＊ＯＩＩに分＊ 解する過酢酸を混合するのが有利である。

遊離ラジカルを生成しながら反応している混合物、例え
ば０２０２と還元剤の小９合物を混合するのも有利であ
る。

Ｈ２Ｏ２から還元によジヒドロキシ、ルラジカルが生成
する。還元剤としては、例えばアヌコルビン酸ニジヒド
ロキシマレイン酸、またはペルオキシドラジカルアニオ
ンが使用される。この反応は、遷移金属イオンまたはそ
のキレート錯体によ多接触される。

ペルオキシドラジカルとＨ２Ｏ２の反応性混合物は、キ
サンチンオキシダーゼによる０２の１価還元と、それに
続くペルオキシドラジカルから１１２０２（および０２
）への不均化反応によっても製造することができる。

反応混合物に触媒を加えるのが有利てあシ、触媒として
は、遷移金属イオンまたは金属イオン配位錯体、例えば
エチレンジアミン４酢酸塩が用いられる。

基質には、Ｈ２０２、ハライドもしくは擬ハライドまた
はこれらの混合物およびペルオキシダーゼのような生物
学的触媒を加えるのが適当でおる。

好ましい実施態様によると、処理は０ないし１２１°Ｃ
の温度で０．１ないし２４時間、特に０．１ないし１時
間の期間、５ないし９のｐＨで実施される。

広範なスペクトルの効果を得るために、血漿フラクショ
ンの遊離ラジカルによる処理を、他のウィルス不活化処
理、特に熱処理と組合わせて行なうのが有利であシ、こ
の処理は、フラクション化の同一または異なる段階中に
おいて、交互に実施される。

糖アルコールまたはチオ尿素のようなラジカル掃去剤を
血漿フラクションに混合するのが適当である。

この発明の別の実施態様によると、存在し得る残留遊離
ラジカルを分解するために、血漿フラクションを４０な
いし１００°Ｃの温度で１時間ないし５日間の期間、後
処理する。

〔効果〕

この発明による不活化手段（剤）の効果は、下記代表的
試験例によシ説明される。

試験例１ ひと新鮮凍結血漿を約１°Ｃで解凍した。解凍した結晶
を遠心分離して低温沈殿を分離した。低温沈殿をｐＨ７
，０でくえん酸デキストロース緩衝液に溶解した。溶液
のｐｔｔを６．３に調節し、１５°Ｃに冷却して不活性
な繊維性固体を除去した。得られた上清は第■因子含量
３ないし４単−位／ｄであった（米国特許第３９７．３
００２号参照）。これに、ウィルス力価Ｉ　Ｑ　・ＴＣ
ＩＤｓ□／　０．１　ｍｌのいぬ肝炎ウィルスけんだく
液を加えた。混合物をｐＨ８に調節し、最終濃度がＱ、
１ｍＭになる量の過酢酸水溶液を加えた。混合物を３７
°Ｃに３０分間保った。この処理後、ウィルス力価を測
定したところ、１０　未満に減少していることがわかっ
た。

残留節■因子活性を測定したところ、８０％の残留活性
を示した。

試験例２ Ｖｏｘ、Ｓａｎｇ　３３．　：　３７５０．３７−５０
頁（１９７７年）の方法にしたがって、ひと血漿から第
■、■およびＸ凝固因子分離後、プロトロンビン製剤を
製造した。得られた第■因子７０単位、第庶子５２単位
、第Ｘ因子６１単位／ｒｎｌの溶液に、ウイｔＶ７．力
価１０４・９ＴＣＩＤ５ｏ１０．１ｒｎｌのいぬ肝炎ウ
ィルスけんだく液を加えた。混合物をｐｉ−１３に調節
し、最終濃度がＱ、　ｌ　ｍ　Ｍになる量のメタクロロ
ペルオキシ安息香酸溶液を加えた。混合物を４５°Ｃに
３０分間保った。この処理後、ウィルス力１１１１を測
定したところ、１０１未満に減少していることがわかっ
た。残留第Ｘ因子活性を測定したところ、８６％の残留
活性を示した。

試験例３ メタクロロペルオキシ安息香酸の代りに、混合物中の濃
度が各ＩＱｍＭのＨ２０２とアヌコルビン酸からなる遊
離ラジカル＊ＯＨ生成混合物を加え、＋＋ 各１０μｍ濃度のＦｅ　触媒とエチレンジアミン４酢酸
塩を加えて、試験例２を反復した。この試験例でも、ウ
ィルス力価は１０から１０未満に減少し、第Ｘ因子残留
活性が２５％に維持されることがわかった。

別のウィルスを用いて試験を行なったところ、この発明
の方法がコクサラキー（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）ウィルス
および他のウィルスにも同様な作用を示すことがわかっ
た。

試験例４ 第■因子製剤を、米国特許第３９７３００２号記載の方
法で製造した。得られた第■因子含量３ないし４単位／
ｍｌの溶液に、ウィルス力価１０４°７ＴＣＩ　Ｄ５ｏ
１０．１　ｒｎｌのいぬ肝炎ウィルスけんだく液を加え
た。混合物をｐＨ５に調節し、最終濃度が１００μｍお
よび３０μｍになる量のＨ２Ｏ２とよう化カリウムを試
験混合物に加えた。ラフ１ペルオキシダーゼ（シグマ社
）２国際車位を加えた後、３７°Ｃで３０分間反応させ
る間によう素ラジカルが生成した。処理後、ウィルス力
価を測定したところ、１０１未満に減少していることが
わかった。

残留節■因子活性を測定したところ、６０％残留活性を
示した。

〔実施例〕

以下、この発明の実施例を示す。

実施例１ ひと新鮮凍結血漿を約１°Ｃで解凍した。解凍した結晶
を遠心分離して低温沈殿を分離した。低温沈殿をくえん
酸デキストロース緩衝液にｐＬ（７，Ｑで溶解した。溶
液のｐＨを６．３に調節し、１５°Ｃに冷却して不活性
な繊維性固体を除去した。得られた上清は第■因子含量
３ないし４単位／ｒｎｌであった。これをｐＨ３に調節
し、最終濃度がＱ、　ｌ　ｍＭになる量の過酢酸水溶液
を加えて、この発明の血漿フラクション製品を得た。　
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ひと血漿フラクションを遊離ラジカルで処理して
   上記血漿フラクション中に存在し得る増殖性微小生命体
   を不活化することからなる、ひと血漿フラクション製品
   の製法。 （２）血漿フラクションに、分解して遊離ラジカルにな
   る化合物を加えることにより、血漿フラクションを特徴
   する特許請求の範囲第１項記載の製法。 （３）化合物を水相として加える、特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 （４）化合物を非水相として加える、特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 （５）化合物を水相および非水相の混合物として加える
   、特許請求の範囲第２項記載の方法。 （６）化合物が、１アセチルと＊ＯＨの遊離ラジカルに
   分解する過酢酸である、特許請求の範囲第２項記載の製
   法。 （７）血漿フラクションに、遊離ラジカルを生成するこ
   とによシ反応する混合物を加える、特許請求の範囲第１
   項記載の製法。 （８）混合物がＨ２０２と還元剤の混合物である、特許
   請求の範囲第７項記載の製法。 （９）還元剤がアスコルビン酸である、特許請求の範囲
   第８項記載の製法。 （１０）さらに反応する混合物に触媒を加えることから
   なる、特許請求の範囲第７項記載の製法。 （１１）触媒として遷移金属イオンを特徴する特許請求
   の範囲第１０項記載の製法。 （１２）触媒として金属イオン配位錯体を特徴する特許
   請求の範囲第１０項記載の製法。 （１３）金属イオン配位錯体がエチレンジアミン４酢酸
   からなる、特許請求の範囲第１２項記載の製法。 （１４Ｍｕ漿フラクションＫ、Ｈ２Ｏ２と、）１ライド
   、擬ハライドおよびハライドと擬ハライドの混合物の少
   なくとも１種と、生物学的触媒とを加える、特許請求の
   範囲第１項記載の製法。 （１５）生物学的触媒がペルオキシダーゼである、特許
   請求の範囲第１４項記載の製法。 （１６）血漿７ラクシヨンを０ないし１２１°Ｃの温度
   範囲で処理する、特許請求の範囲第１項記載の製法。 （１７）血漿フラクションを０．１秒ないし２４時間の
   期間処理する、特許請求の範囲第１項記載の製法。 （１８）血漿７ラクシヨンを０．１秒ないし１時間の期
   間処理する、特許請求の範囲第１項記戦の製法。 （１９）血漿フラクションをｐＨ５ないし９で処理する
   、特許請求の範囲第１項記載の製法。 （２０）さらに該処理に組合わせて実施する他のウィル
   ス不活化処理によシ広範囲の効果スペクトルを得ること
   からなる、特許請求の範囲第１項記載の製法。 （２１）他のウィルス不活化処理が熱処理からなる１、
   特許請求の範囲第２０項記載の製法。 （２２）処理を、フラクション化法の同一段階内で交互
   に実施する、特許請求の範囲第２０項記載の製法。 （２３）処理を、フラクション化法の異なる段階で交互
   に実施する、特許請求の範囲第２０項記載の製法。 （２４）さらに血漿フラクションにラジカル掃去剤を加
   えることからなる、特許請求の範囲第１項記載の製法。 （２５）ラジカル掃去剤が糖アルコールからなる、特許
   請求の範囲第２４項記載の製法。 （２６）ラジカル掃去剤がチオ尿素からなる、特許請求
   の範囲第２４項記載の製法。 （２７）さらに、血漿フラクションを４０ないし１００
   °Ｃの温度で１時間ないし５日間の期間、後処理して、
   存在し得る残留遊離ラジカルを破壊することからなる、
   特許請求の範囲第１項記載の製法。 （２８）血漿フラクションを遊離ラジカルで処理して上
   記血漿フラクション中に存在し得る増殖性微小生命体を
   不活化することからなる、凝固因子製品、グロブリン製
   品、血漿酵素および血漿酵素阻害剤から選ばれたひと血
   漿フラクション製品の製法。