JPS6066995A - Ｌ−グルタミンの分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−クルタミ／の分ＪＪｉ　法に関する。

従来、Ｌ−グルタミンを分１１１４−るノコ−法として
はｉｌｌクロマトクラフィー　法　リｑと（０ツ県、ｔ
）ｇ−ｒ、、　２２−り（１）１８８−１９２　（＋９
８２）；同２！−２４＋２１　＋　７７１８８　（１９
８＋）；特開昭５５．１５２４５５’：　ナト）　、　
（２１微生物定ｌｉｔθ、（Ｂｉｏｃｈｃｍ、　、１．
、４２．４８５（１９４８）なと）　、　＋８１微生物
電極法（Ｑｌｊ開昭５４−１２８８９４弓なと）　、　
＋４１クルタミ７合成酵メ・；を使用する方法（ＭｅＬ
ｌｌｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔ＋ｃＡｎａｌｙｓｉｓ
、ｙｏｌ、４　、ｌ）＋）、１　７　１　６　−　１　
７　１　９（１９７４）。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅ、ｓｓ、　Ｉｎｃなど）また
は（５）グルタミンを化学的もしくは酵素的に加水分解
してグルタミンｈ 酸もしくはアンモニアを定量する方法（Ｍｅｌｌｏｄ　
ｏｆｆ５ｎｚｙｍａＬＩｃＡｎａｌｙｓｉｓ、Ｖｏｌ、
４ｐｐ、１７１９−１７２２（１９７４）　、　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　；　Ａｎａｌ、
　Ｉ−ｃｔｔ、。

１８　（Ｂ１５）　１８４５−１８５７　（１９８０）
；Ｎ凹１針上□、５６．８８３　（１９７１）；特開昭
５８−１６６９６づなど）が知られているが（１）、（
４）および（５）の方法が一般的である。

（１）の方法は精度および信頼度の高い方法であるか装
置が高価であり、測定操作も煩鮪である。

（４）の方法としてはグルタミン合成酵素の作用で生成
するｒ−グルタミル上１′ロキサム酸を塩化＆Ｊ、（ｔ
ｉｌｌと反応させて錯塩を形成させ、５　’ＯＯｎｍも
しくは５４６τ１１１１における吸光度を測定する方法
が知られているが、感度か悪く、使用する試薬数か多い
点など麿問題点かある。

（５）の方θ；てアンモニアを定量する方法としてはア
ンモ−アカスミ極を用いる方法、カチオン電極を用いる
方法などが知られているか、この方ｔノ、は測定条（’
Ｉの設定が困難な上に、測定に際して（ノンプルから発
生ずるアンモニアの影響４受りたり、共存イオンの影廿
を受けるおそれかある。

（５）の方法でＬ−グルタミン酸を定１；ｌする方θ、
としてはグルタミン酸脱水素酵素を使用り−る方法か一
般的であるが、該酵素による反応の平衡を／Ｊケトグル
タル酸か生成する側に寄せる下火か必要であり、操作が
煩雑となるなとの欠点をイ）する。

なお、従来、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼとして（ｊ
特開昭５７−４　ａ　６ｓ　５　ｒ３および特開昭５８
−　＋　４９　ａ　７７　弓に記載された酵素か知らば
１対する基質特異性か明らかではないことからこれらの
酵素はＬ−グルタミンの疋１１１には適さｔぽいものと
思われる。

本発明者は、本発明前らにＪ、つて見出さ４また１゜−
グルタミノに対して実質的に作用し■ない１、グルタミ
ノ酸オキシダーゼ（以下、ＧＬＸＤと称することもある
。）を使用することによって前記のような従来の分析法
の欠点を克服し、Ｌ−グルタミンを正確かつ簡単に分析
しうることを見出し、・本発明を完成した。

本発明は、分析試料中のし一グルタミンに対してグルタ
ミナーゼを作用させ、次いて遊離するし一グルタミン酸
１こ対し、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性かきわ
めて高く、Ｌ−グルタミンに対しては実質的に作用しな
いし一グルタミン酸オキ／ダ〜ゼを作用さＵｏ、反応に
伴う酸素の消費１ｉ１または過酸化水素、アンモニアも
しくはａ−ケ］・グルタル酸の生成■を検出することを
特徴とする１、−グルタミンの分析法を提供するもので
ある。

本発明で使用されるし一グルタミン酸オキシダーゼは公
知のし一グルタミン酸オキソダーゼとは５１ｉ！なり、
し−グルタミンには実質的にイ′１用せず、■、−グル
タミ／酸にのみ作用する酵素であり、このような性質の
ＧＬＸＤとグルタミナーゼを組み合ゼることによっては
しめてＬ−グルタミンをオキシダーゼ反応を子す用して
分析することを可能としたものである。

本発明に関与する酵素反応を概略的に月１すと辺土のと
おりである。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明におりる分析試料とは、■７−クルタミンを含有
し、もしくは含有することが予想される試料であり、特
に限定されない。具体的には例えは血液なとの生体試１
゛［、食品、食品片￥１および胃腸薬／Ｊとの医薬品か
挙げられる。

本発明において使用されるＩ、−クルタミノ酸Ａキシ １−ダーゼは基本的には前記の反応式で小される作用を
示し、Ｌ−グルタミン酸に７・１する基質性５°１：性
カ１１う（、Ｉ、−グルタミンには実質的にイ′１川）
遍・１、他のアミノ酸に対しては本発明の１ｌｌｌｌ定
条（’Ｌ＋−（＋、１とんど作用しない酵素であればよ
い。

ＧＬＸＤの具体例としては、本発明とにｊニー＞てＪ’
；Ｉ　ｒｌＪされた酵素であり、ストレプトマイセス・
エスピー　Ｘ−１１９−６（３１，ｒｅｐＬｏｍｙｃｅ
ｓ　ｓｌ）、Ｘ−１１９−６，微土研菌寄第６５６０号
、　Ａ　Ｔ　ＣＣ３９８４８）のｌ＋Ｈ３養物より得ら
４する酵素（ＡｇｒｉｃＢｉｏｌ、　（：ｈｅ＋ｕ、　
。

４７（６１１８２８−１８２８（１９８８）；特願昭５
７−１１２２７１−弓なき参照、この酵素を以下１本酵
素−１ということもある。）を例示することができる。

以下に本酵素の特徴的ｔａ質を示す。

本酵素は］７−グルタミン酸に対１−る基質特異性か極
めて高く、他のアミノ酸に対しては実質的／ｊ作用は示
さない。ずなゎち、Ｉ）Ｔｌ　７．４においてはＬ−ア
スパラギン酸とＬ−アスパラギンにゎリーがな活性（Ｌ
−グルタミン酸に対する活性の０６〜０７％）を示すが
、■、−グルタミンを含む他の１゜−アミノ酸およびＤ
−アミノ酸ｊこは全く作用しない。また、ｐＨ６，０に
おいてはＬ−アスパラギン酸およびＬ−アスパランギン
に対しても実質的に活１１１を示さない。

本酵素の作用ｐＨ範囲は広＜（＋）８５〜１０）、至適
ｐＨはｐｆ（７〜８５である。ナｔイ）ち、中イ１１イ
；」近て効率よく作用する酵素である。

本酵素は広いｐＨ範囲において安定である、すなわち、
３７°Ｃ２６０分間保持の条イ１１士て＋；１．１）Ｉ
Ｉ５５〜１０５の範囲において、４５°０１１５分間保
持の条件下ではｐＪＴ５．５〜９５のＦＪ　ｆ／１＋　
１こわいて、６０°Ｃ１１５分間保持の条件下ではｒ）
Ｈ５，５〜７５の範囲においてそれぞれ安定であった。

本酵素の作用適温の範囲は３０〜６０°Ｃと広く。

イ′１用至適温度は５０°Ｃ（＝Ｉ近である。　一本酵
素のｌ）１安疋性ＩＪノｌ’　：＋ｉｉに、：、“、い
。−４なわら、ｐ　Ｈ２Ｓにおいては６５°Ｃまて安定
−Ｃあり、８５°Ｃても約５０％の残存活性を示す。ｐ
１１７．５においては５０°Ｃ−ｔて安定てあり、７５
°Ｃても約６０％の残存油４４＋を示す。ｐＨ９，５に
おいては４５°Ｃま−Ｃ安定てあり、７００Ｇで約５０
％の残７ｆ／１ξｊ’ｌを小４１、なお、活性の測定は
上記の条（１１１・に１５分二重ｌｊ　ｌだ後に行った
ものである。

本酵素の活性はパラクロロマーキュリペッツ１−イトに
よって約４５％阻害されるが、銅イオンはしめ他の通）
：Ｘの阻害剤によっては阻害されなし葛０不酵素の製造
法の一例は参考例にＪＴ述する。

本発明において使用されるグルタミナーゼとは、Ｌ　グ
ルタミンに作用してＬ−グルタミン酸を生成する酵素で
あればよく、特に限定されない、通’７；’Ｉはグルタ
ミナーゼ（Ｅ　Ｃ８，５，１，２）か好適に使／ＩＩさ
れるか分析試料中のアスパラギン含量か極端に多くなり
ればグルタミン−（アスパラギン−）アーゼ（ＥＣ８，
５，１，８８）を使用しても」：い。

グルタミナーゼ（Ｅ　Ｃ８，５，］、　］２）としては
以外的＋ｃ　ｒＪ　（Ｊ）　人ｆｌｕ　ｒｌ：ＩＣＥ、
　ｌ１ｏｌｉ）由来の酵素（至適ｐＨ５５付　近、Ｊ　
壓３ｉｏ１．　Ｃｌλ乏二五皐−１１孔−−ご鼾−３，
８５３−８６３（１９６８）路照）　、（２’＋　７ユ
ウドモナス・エルキ／−１勺（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ
　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の酵素（至ｊ［１ｐｌ＋
　８〜９イζ］近、　Ｂｉｏｃｌ＋ｃｍ、　１３ｉｏｐ
ｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ、。

４６、’］２７８−１２８４　（１９７２）参１ｊｊ　
）、Ｃ）ブタ腎皮質由来の酵素（至適ｐＨ８〜９．５　
（Ｊ近。

、口３ｉｏＩＣｈｅｍ、、　２４５．　］　８７１−１
８７７および１８７’８−１８８２　（１９７０）参１
ｉＬｊ　）などを例ホすることができる。特に■おｊ：
０■の酵素は本酵素、！：至適ｐｌ−１が近いのでこれ
らの酵素と本酵ス；を同一反応系で同時もしく（４通続
して作用さ１４ることかできる点て好ましい。

本発明の分析法は基本的にはｎｉｉ記のとおりの一゛の
Ｉ、−グルタミノに対してクルタミナ　ゼを顕用さゼＬ
−クルタミン酸をイＩ：成さゼる反応、およ０（２）ｉ
ｌ＋の反応で生成した］７−クルタミン酸１こ刑し−Ｃ
酸素と水の存在下、ＧＬＸＤを作用さゼ、過酸化水素、
アノモニアおＪ：ひ〆ｌ−ケトクルタル成させる反応で
ある。

（１）および（２）の酵素反応は両反応の条（’ｌ　ｈ
・ｒ１致・する場合は同一反応系中で同時もしく　＋Ｊ
連続してｉｔうこともてき、反応条（’ｌが異なる場合
ｉ．．１．（ＩＩのＩｙ−　１・Ｃ、・後、反応釜イ１
１を調節して（２）の反応をｉｊえＩＪ’　、１：　Ｌ
’　、。

（１）およＯ（２）の反応系には必要に応して緩衝削り
・添加される。緩衝剤としては＾１酸塩、りん酸１ｉ，
，，、はう酸塩、炭酸塩、トリスヒト【」４−ノメチＪ
＋ーアミノメタン、バルビツール、トすＪ−タ／　／し
゛ｌゝミ／、グリ／／なとを使用ブーることかてきる。

＋］ｌの反応は使用する酵素によって条（ｌｌが異なる
か、通富、Ｉ）Ｈ５〜１０、温度１５〜４０°Ｃの範囲
の任Ｃの条（’ｌて行われる。

（２）の反応も使用する酵素によって条件か異なるか、
本酵素を使用ノーる場合、ｐｌ−１５〜９．１１、（度
１５〜６０°Ｃの範囲の任意の条４’ｌて行われる。

また、（１）および（２）の反応は多層分析フィルムな
とを使用Ｊるドライ・システム（化学のりｆ１域、３５
ｆ４１．２７ｇ−２８０（１９８１））＋こＪ二って（
ｊつてもよい。

反応に際し、クルタミブーゼおよｆｆ　Ｇ　Ｌ　Ｘ　Ｄ
はθＪ溶性酵素または固定化酵素として使用される。

両酵素は同一の担体に一緒に固Ｗ化してもよく、別々に
固定化してもよく、一方の１）を固定化して使用しても
よい。

固定化酵素は包括法（格子室、マイクロカプセル（−′
〕なと）、世体結合法（共有に１１１合法、イオン結合
法、物理的吸着なと）、架橋θ、なとの一般的力ツノ、
（］］固定化酵素１．千畑一部編集１昭和５０年３月２
０日伯３＝Ｉｉ談社光行）によって製造−４ることかで
きる。

たとえば、固定化用の担体と（２てはセルＵ　）（セロ
ファン、濾紙なと）、アセチルセル［コース誘導体、各
種イオノ交換セル１コース、カラキ　−ノ−７なとの多
糖Ｍ）、コラーゲン、セラグンな表のフコ１白質、ボリ
スすレ／、ポリアミノスーｆレン、１ｌ−１ｉ史化樹脂
（エチレンｔ１不飽和）、１、をイｆ−ツる親水１’ｌ
光硬化樹脂（牛５公昭５５−４０弓、特公昭５５−２０
６７（ｉ−づ）なと）、４オン交換樹脂／、ｌ−との合
成ｆｉ機１：’：＋分ノー物質、カラス（多孔性カラス
ヒ　スｌＳと）、ノリ力なとの佃機物貿を使用すること
かできる。酵素の固軍化に際し、こノ（らの（１１体は
そのＪ」１史月ｊするか、あるいは適当な゛自能基のＪ
５Ｃ〕いスベ　」Ｊ−の導入、１゛Ｘ能ノ、（の話ｔ’
、ｌ化ＩＳとｏ）ｉｉｉ＋処理をＩｊｉｉｉ　１．、−
（使用される。）１ｌ体き酵にの結合は、ジ゛ｊ′ノ法
、・〈ブチト法、アル−１−ル化法、架（１′ら試−５
（クルタルｌ′ルテヒド、ヘキ→Ｊメチレノノイノ／ア
ナ　ｌ・ｔ、Ｉと）を使用する方法に。Ｌつてｊｌうこ
とかてきる７１、また上記のような架橋試薬に、Ｌつで
酵素間を架も′ｈ・」イ）ことにＪこっても固定化する
ことかできる。

固定化酵素は膜状、ゲル状、粒状、チンプ状、粉末状、
マイクロカプセル状、チューブ状、容器状、Ｍｉ維状、
ｄ−ロフアイバー状なと使用の態様ｆこ応した形態に調
製される。たとえば、膜状に調製して酵素電極として、
粉状に調製し、カラムに充Ｉ↓゛］シてり゛ノ′クター
型バイオセン→ノーとして、あるいは発色試薬、ゼラチ
ンなとのバイ／ダ−なととともＪこ多層分析フィルムの
酵素試′Ｘ層として調製して１使用することか′Ｃきる
。

本発明によるグルタミンの分析は、＋ｉｉ＋記二段階の
反応にともなう酸素の消費量、または過酸化水素、アン
モニアもしくはａ−ケトグルタル酸の生成ｍを検出する
こ七Ｊこよって行われるが特１ｃ酸素の消費ｌｌ−４も
しくは過酸化水素−の生成量を検出する／ｊ’　ツノ、
が好ましい。なお、検出法はレ−１・法でもエントポイ
ツト法でもよい。

（１）　酸素消費咀 酸素のｌＩ’Ｊ費ｍの検出は、通７；１ワールブルク検
圧法（牛化７実験１溝座５．酵素研究法ＬＩＪ、第３５
〜４１頁、領）東京化学同人、１９７５３１８月２０１
１発行）または酸素電極ｎ、（電極法ににる酸素測定。

萩原文二編、領３講談社、１９７７３１１１月２０１１
発行）によって行われる。

酸素電極としては、たとえは、カッ−Ｉ・と［７゛Ｃ白
金電極、アノードとして鉛電極を具備し、水酸化カリウ
ム溶〆ｌ＆を内部液とし、白金ツノソー　１人面に酸素
透過性のテフロ：／　＋＋ｙ″２か装着され）、クラ　
り５り酸素電極を使用することかできる。

酵素電極は酵素電極としてイ、使用４ることかでさる。

たとえは、タルタミナ　セＪＪ、１、ひ′ｌノーはＧ　
Ｌ　Ｘ　Ｉ）の内力で化酵素もしくはｌ′ｊｂ　ｌ’ｌ
膜て＋ＯわＡまた可ｄ龍１４酵素をクラーク型１−ＩＪ
ｉ極の１１１極１１Ｗ！に゛トド、イ゛１して装：”ｆ
　した１ｕ極装着型酵素電極として使用−４ることかで
き、固定化酵素を充填し、たカラ！・／ｊとに３するリ
アクターと分離して装イ°１さ４＋、　ｔ、：酸Ａ’ｉ
　’ＩＬ極とから成るリアフタル型酵素７１．極として
も使用でＩるこかへ と■できる（１化゛；′の領域、増＋１＋　３４　＋；
　、バイオマテリアル′ＩＪイエ／ス第１集１１）ｌ）
、　６９〜７（」。

１９　ｓ　２　（＋：　４月２０１−１．　（を９南１
１．・：１発ｆｊｌｌ化、′１業−１１９８２年６月弓
、　Ｉ）Ｉ）、４９１〜４９６；ｒイＡ／７ｈ極と酵素
電極１．鈴木周−編＋ｐｐ、６５〜１（１６，１！］８
１弓１゛１１月１［１，■講談社発行。

１−化学の領域１第３６巻、第５号、ｐｐ、３４８〜３
４９、（１９８２））。

（２）　過酸化水素生成量 過酸化水素の生成量の検出は、電気化学的方法、分光学
的方法、化学発光法、けい光法なと公知の方法（’ｉ、
’ｉ公昭５６、−３２９１９号など）によって（ｊうこ
とかできる。

電気化学釣力θ、としては過酸化水素電極を用いる方法
か一般的であるか、過酸化水素とヨウ素イＡンを反応さ
せ、ヨウ累イオンの活量減少をヨウ素イメン電極で測定
する方法によっても過酸化水素を検出することかできる
。

過酸化水素電極としては、たとえば白金電極を使用した
クラーク型過酸化水素電極を使用することかできる。ま
た、酸素電極と同様の酵素噛Ｔｉ＜Ｑ！として使用する
こともてきる。

分光ｑ的方法としては■バーメキノダーゼ法、■カタラ
ーゼ法、■”「ｉｌｌ’ｌ／　４−　（２−ビリノルア
ソ〕レゾルノノール系、　ｖｔｎ／キルノール　Ａレン
ジ系なとを使用する化学釣力／Ｊ：　（ｊ；ｕ　、、Ｌ
、ｆＪ機合成化学８９ｔ７１．　６５９〜６６６　（１
９８１，１参１１ｊ（）、■グルタチオン／グルクチメ
ンバーオキ／ダーゼ系を利用する方法（ＡｎａｌＢｉｏ
ｃｈｃ＋ｎ　７６　。

１８４〜］　９１．　（］　９７６　）　）なとを使用
することができる。

■のバーオキ／ダーセ法は、被酸化１４１発色剤をパー
オキシターセもしく（ｊ同様の活性を小づ物性の存在士
に過酸化水素と反応させ、反応生成物Ｃある色素を吸光
爪側、定によって定；、ｌする方法−Ｃある。パーＡキ
／タ−ゼとしては通゛畠、西ｌＹわさび（ｄ−スラデイ
ノユ）由来の酵素か使用される。。

発色剤としては、たとえはＯ−ツアー　ノンン、４−メ
トキノ−１−ナフｉ−ルもｔ、　＜　＋Ｊ　２．　２′
　アジノービス（３−工−１ルへ７ノー１）′ノリ１０
スルホノ酸）なとの中種、４−アミノ７′ン１ヒリンと
フェノール、ｐ−クロロフェノール、２．４６−ドリフ
ロモフエノールなとのフェノール系化ｒ）物Ｊの絹合せ
、４−アミノアンヂピリ／とＮ。

Ｎ−ジエチルアニリノ、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリノなと
のアニリン系化合物との絹合せ、４−アミノアノヂビリ
ンとＮ、Ｎ−ジエチル−Ｉｌｌ　−１−ルイ７ノなとの
トルインン系化合物との刑１合せ、また（１３−メチル
−２−ペンジチアノリノンヒドラジノとＮ、Ｎ−ジメチ
ルアニリンとの組合ぜなとを使用することかできる。

なお、バーオキシターゼ法による発色反応は中１’ｌ　
（ＪＭのｐ　Ｉ−１で行われる場合が多い。たとえば、
４−アミノアノチピリ／／〕１ノール系の場合、発色反
応はＩ）ＩＩ　７．５てマラわれる。したがって、ＧＬ
ＸＤにＪ：る反応はＩＩＩ児中性伺近てＦｉゎれること
がら、発色反応に際して１）Ｉ−１を変更することなく
、同一反応系中で連続して反応をｊｊうこともてきる。

さらに、グルタミナーゼによる酵素反応も同しｐＨｉｉ
ｉ囲てｉｊうことＭ　ｉ’ｉＪ能である。ずなゎち、グ
ルタミナーゼににる酵素反応、Ｇ　Ｌ　Ｘ　Ｉ）による
酵素反応お、１；ひ発色反応の三反応を同一反応系中で
連ゎ゛こして（ｊうことかできる。

■のカタラーセ法としては過酸化水素をカタフーゼの存
在下にアルコール（メタノールなと）と反応させ、生成
するアルデヒ１′（ホルムアルデヒドなど）を発色系に
専き、生成色素を吸光度測定するか、あるいはアルデヒ
ドをアルデヒドテヒ］・ロゲナ〜セを利用して定量する
方法なとを採用することかてきる。ホルムアルデヒドを
発色さ（る方法としては、アノモニアと反応さゼるカｌ
）、：Ｉたは酸化剤（過ヨウ素酸すトリウム、赤血塩（
ソエリノアン化カリウム）なと）、の台７１　ドＣヒド
ラツノ（４〜アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルヵノｉ
・−１，２，４−１リフ′）′−ルなと）と反ｊ心さ］
ノる方／１：を用いることができる（特公昭５６−１９
２３８５じ）。

イヒ学発光θ、としては、過龜化ノ１（素を赤面１４．
ｉの７ｆ狛下てルミノールと反応さＵ、化、！発光１１
：を）Ａ１−ツノノウツタ−にＪ、って１ｌｌｌｌシ」
１４る刀７１．　（１’、’？開昭５８゜−４７４ｓ　
４　Ｘ；＞か好適である。同、様の方ｌ）（グ１血塩の
代りにバーメキ／ダーセを使用してらＪ：＜（特開昭５
７−７１３９９シじ　４４ｒ開昭５７７１４００　ｒ：
　）　、ルミノールの代りにイソルミノール、ビ［ｊガ
Ｕ″−ルを使用してもよい。

りい先払としては、ホモバニリン酸をパー、ｔ　−１−
クラークの７ｆ７１下、過酸化水素と反応させてけい光
強度を測定する方法か挙げられる。発けい光試−（（と
じては１〕−ヒドロキシフェニル酢酸またはジアセチル
フルオレス７ノ（特開昭５５−４８６５６シ３）なとを
用いてもよい。

（３）　アンモニア生成量 アンモニアはミクロケルプール法、ネスラー法、インド
フェノール法、ニンヒドリン法、フェノサフラニ／／Ｌ
なとの力θ、によって分析できる。また、カヂオノ選根
性電極によってアンモニウムイオンを分４Ｊｊする方θ
、または疎水性のガス透過性膜を装ｊ′〒シタカラス電
極からなるアンモニアガス’Ｆｈ　Ｆ５に」；つてアン
モニアガスとして分析する方法なと、市気化’Ｙ的分析
法によって分析してもよい。

（４）ａ−ケトグルタル酸生成量 σ−ケトクルクル酸は、３−メチル−２−ヘンゾチアゾ
リノンヒドラゾン（Ｍ　Ｔ３　Ｔ　Ｈ）と反応さぜで生
成物の吸光度を測定する方法、２．４−　／ニトロフェ
ニルヒドラジンと反応さセ、生成物の吸光度を測定する
方法、Ｏ−フ土ニレ７ノアミンと反応さゼで生成物の吸
光１すを測定する）Ｊ法、その他公知の方法を使用する
ことかてきる。

実　施　例 以下、本発明による測定θ、の−例を小ず実施例およＵ
：　Ｌ−クルタミンＩＩ＆　ｎキ、／ターセの製１ｊ１
ｉ〆人を示す参考例によって本発明をより尺体的に説明
づる。本発明はこれらの例小１こにつて限）」！される
ものではない。実施例おＪ、Ｏ・参考例において酵素中
位（ｌＪｎｉＬ）は１０−Ｊ　と表記するものと−４る
。

実施例１ （１）　試Ａ１２の調製 ｑ）発色試薬 フェノール２０　Ｉｎ９．４−アミノア／チヒリ７２０
　ｍＬＪ、バーメキ／ターセ（東ｔ’ｎ　ｔｈ　！＋７
　ｆ作製、西ｌ工わさび由来、］　ＯＯｕ／Ｐｇ）３ｍ
ｆｔお１、ひ部分１ｊ’ｉ製したＧＬＸＤＣ本酵素；　
］　２　（Ｊ／ｒｒｑｔ　）　２ｍｌ／を４０ｍ１の０
．２　Ｍりん酸カリウム緩衝ｉ１ｋ　（１）ＩＩ　７．
４１に溶解した。

Ｑ）グルタミナーゼ溶液 グルタミナーゼ（ノグマ社製、大腸菌由来。

５　Ｕ／ｍｇ）　２ｍｆｔを１０ｓｎｌの０．１　Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５５）に溶解した。

（２）（々）作法 試験管に標準Ｌ−グルタミン溶液（０〜２μ夏＋１０１
／　ｍｌ）　０．１　ｍｌを入れ、グルタミナーゼ溶液
ｏ２＃ｌを加えて３７°Ｃて２０分間インキュベートし
た後、発色試薬０７ゴを加えてよ＜　＋ｊ’ｔ、打し、
さらに５分間好気的に振＜Ｅンしなから３７°Ｃてイン
キュベ−１・した。ｈ検を対照として５００１団〕の吸
光度を測定し、第１　Ｉ：１．ｌに示ず検岱線を作成し
た。

実施例２ 試験管に杼準し一グルタミン溶液（０〜１７１＋ｎｏｌ
／ｍｆ）　Ｏ，Ｉ　ｍｌを入れ、実施例Ｉて用いたクル
タミー１−−−セ溶ｒ（ｋ　０．１　ｍｌを加えテ３７
°Ｃ，１０分間イノキュヘ−１・した。次にＧ　Ｌ　Ｘ
　Ｉ）　（本酵素）１０をｒ：ｏｏＩＭ酢酸緩衝Ｗｊ　
（ｐ）］　５．５　）　１　ｍｌを３゜０Ｃの１ｊ−ｆ
ｉ　Ｗｉ７１水を循環しているクラーク型酸素電極のキ
ュベラＩ・に密封し、」二部反応終了後５０ｐ（！をｔ
１人して酸素消費量を測定した。この測定値１こ基−）
いて第２図に示ず検屈線を作成した。

参考例 ５００　ｍｌ容三角フラスコにフスマ２０ｇおよび水１
６１１ｆを入れ、１２０’Ｃ，，９０分間加圧滅菌して
調製したフスマ培地にストレプトマイセス・エスピー　
Ｘ−１１９−６（微」二研菌第６５６０号）を植菌し、
２８°Ｃ，７日間培養して種菌を調製しｌこ。

５　ｔ！容Ｅ　角フラスコ２５本にそれぞれフスマ２０
０　ｑｉ、４　Ｊ：　ｉＪ水］　６０　ｍｌを入れ、１
２０’Ｃ，３０分間加圧滅菌した後、前記の種菌を無菌
的に接種し、２８°Ｃで２　ＩＪ間培養後、温度ヲ２ｏ
０ｃニ下けてさらに２週間培養した。

得うＪｌり培ａ　物ヲ８７．５７’　０）　水ニ１　時
間Ｂ　’／Ｉ７　した後、濾過し、さらに【プいそう土
を通過さゼてＩ’ｌｌ酵素液約３４／／を得た。この粗
酵素液に硫酸アンモニウムを５０９６飽和まで加え、生
成した沈澱を遠沈採取して００２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５
，５）８．９？’に溶ＭＬ、５７°Ｃて３ｏ分間加執し
た。この熱処理した酵素液を５°Ｃ以下に冷却後、２倍
量の予め冷却したエタノールを加え、生成した沈澱を遠
沈採取して００２Ｍりん酸緩衝液（１）！−１７，４）
２１１こ溶解し、同一緩衝液で一夜透析した。透析中に
生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を同一緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ　（／エヂルアミノエチル）−セルロー
スカラム（３，５ｘ５０Ｌ：ｒｎ）に通し、吸着した酵
素を食塩０３５Ｍを含む同一緩衝液を用いて溶出した。

溶出された活（’１区分を集め、００５Ｍの食塩を含む
０．０５Ｍ１１酸緩（（・■液（Ｉ）１１５５）で−夜
透析した。この透析内液を同−緩＋ｈ液で平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファロースＣ１，、（ｉＢ（ファルマノア・
ファイン１１ミカルス１１製）ツノラム　（２ＸＩ０１
）に通し、吸７１シた酵、＋二をｒ′Ｊ塩００５〜０．
７５　Ｍのりニアクラノエノｌ法−Ｃ溶出した。溶出さ
れた活性区分を集め、透析濃縮後、セファテックスＧ−
２００（ファルマ７）゛　フ゛ノ′イ／ケミカルズＨ製
）カラム（２５ン１２０ζＭ）を用いてゲル濾過を９ｊ
い、活性区分を集めて濃縮後、００２Ｍりん酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７，４）で透析した。この透析内液を遠沈
し、ｌｌｉ’ｉ　ｉｉν４−１１°１密濾過した後、凍
結＜１λ燥してＬ　クルタミノ酸イキノダーゼの精製標
品（比活性５５．１１１Ｊ／ｌＩｔｇ蛋白１収率ｌｓ、
４９６）Ｂｏｌｎｙを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におζプる１、−グルタミンの検ＩＩ
Ｉ線を小ず。 第２１．！、ｌは実施例２におりる１、−グルタミンの
検量線を示す厘。 特ｉｒｌ出願人（６７７）　ヤ７　”ｊｋｌＭｌｌ　株
ＺＥ　会ｔ、１手続ｈ１１正暫（自発） １．　−１１ｉ件の表示 昭和５８年特許願第１７５７４１号 ２　発明の名称 Ｌ−グルタミンのり）析ｄ、 ３　補正をする一殻 ＪＪＩ　ｆ！＋との関係　特許出願人 住所　（ｊｌｉｊｔ便番号　２８８） 千葉県銚」−市新生町２丁目１０番地の１電話　０４７
９（２２）００９５ ４　補正の対象 明細７１）の発明の詳細な説明の欄 ５　補正の内容 １）明細＋１第６貞末マノに「不発明古」とあるのを１
−不発明老ら−１と５ｊ正する。 ２　＞　１ｕｌｌ　細鵬第１７　ｒ、ｔｉｉ’＋　８１
Ｊ［−１）ｒ’ＣＩ−Ｘ　Ｉ）ｊ　ノ後に１（本市Ｗ、
）」を加入する。 ３）明細ス：第２２丁■第＋ｆＪＩＪに１反応終了後１
２あるのを１反応終了液」と３ｊ正する。 ４）明細潜第２５頁第１　ｊｌｌ−１の１４ツタ　や−
１の後にｌ−（本酵素）−１を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ］）　分析試料中の■７−グルタミンに対してグルタミ
   ナーゼを作用させ、次いて遊離するし一グルタミン酸に
   対し、Ｉ７−グルタミン酸に対する基質特異ｖ１かきわ
   めてバラク、Ｌ−グルタミンに対しては実質的に作用し
   ない１、−クルタミン酸オキシターゼを作用させ、反応
   にＣＩ’う酸素の消費早または過酸化水素、アンモニア
   もしくはσ−ケトグルタル酸の生成ＩＴ１を横用するこ
   とを特徴とするし一りルタミンの分ＪＪｉ法。 ２）Ｌ−グルタミン酸メキ／ダーゼかｐｉ−１５〜１０
   ．６０°Ｃす＋の条件下で好適に作用する酵素である１
   １ｊ許請求の範囲第１項記載のＬ−グルタミンの分＋Ｊ
   ｉ法、。 ３）　Ｉ、−グルタミノ酸メキンダーゼがｒ）Ｔ〜１７
   ．５゜７５°Ｃて１５分二重、５した際に約６０％の活
   性を保持している酵素である特許請求の範囲第１または
   ２項記載感フルタミ・の分析法。 ４）　Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが３７℃、６０分
   の保持条件下て１）Ｈ５：５〜】０５の範囲において安
   定な酵素である特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに
   記載跡グルタミンの分析ｔノ、。 ５）　Ｌ−グルタミン酸オキシタ−セかバラクＯＩＪマ
   マ−ュリへ／ゾエイトによって１ｑｌ害されるか。 銅イオンによってはＩ！Ｉｔ害さ４１ない酵素である！
   ｌ’、’ｊ　１γ１請求の範囲第１〜４項のい１れかに
   記載菖ケルタミンの分１１１法。