JPH0424997B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−グルタミンの分析法に関する。

従来、Ｌ−グルタミンを分析する方法としては
(1)クロマトグラフイー法（J.Chromatogr.，229
(1)188−192（1982）；同224(2)177−183（1981）；特
開昭55−152455号など）、(2)微生物定量法
（Biochem.J.，42，485（1948）など）、(3)微生物
電極法（特開昭54−128394号など）、(4)グルタミ
ン合成酵素を使用する方法（Method of
Enzymatic Analysis，Vol.4，pp.1716−1719
（1974），Academic Press，Inc.など）または(5)
グルタミンを化学的もしくは酵素的に加水分解し
てグルタミン酸もしくはアンモニアを定量する方
法（Method of Enzymatic Analysis，
Vol.4pp.1719−1722（1974），Academic Press，
Inc.；Anal.Lett.，13（B15）1345−1357（1980）；
Anal.Chim.Acta.，56，333（1971）；特開昭58−
16696号など）が知られているが(1)、(4)および(5)
の方法が一般的である。

(1)の方法は精度および信頼度の高い方法である
が装置が高価であり、測定操作も煩雑である。

(4)の方法としてはグルタミン合成酵素の作用で
生成するγ−グルタミンヒドロキサム酸を塩化鉄
（）と反応させて錯塩を形成させ、500nmもし
くは546nmにおける吸光度を測定する方法が知ら
れているが、感度が悪く、使用する試薬数が多い
点などに問題点がある。

(5)の方法でアンモニアを定量する方法としては
アンモニアガス電極を用いる方法、カチオン電極
を用いる方法などが知られている。この方法は測
定条件の設定が困難な上に、測定に際してサンプ
ルから発生するアンモニアの影響を受けたり、共
存イオンの影響を受けるおそれがある。

(5)の方法でＬ−グルタミン酸を定量する方法と
してはグルタミン酸脱水素酵素を使用する方法が
一般的であるが、該酵素による反応の平衡をα−
ケトグルタル酸が生成する側に寄せる工夫が必要
であり、操作が煩雑となるなどの欠点を有する。

なお、従来、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと
しては特開昭57−43685号および特開昭58−
149677号に記載された酵素が知られているが、前
者の酵素はＬ−グルタミンに対して作用し、後者
の酵素についてはＬ−グルタミンに対する基質特
異性が明らかではないことからこれらの酵素はＬ
−グルタミンの定量には適さないものと思われ
る。

本発明者は、本発明者らによつて見出されたＬ
−グルタミンに対して実質的に作用しないＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（以下、GLXDと称す
ることもある。）を使用することによつて前記の
ような従来の分析法の欠点を克服し、Ｌ−グルタ
ミンを正確かつ簡単に分析しうることを見出し、
本発明を完成した。

本発明は、分析試料中のＬ−グルタミンに対し
てグルタミナーゼを作用させ、次いで遊離するＬ
−グルタミン酸に対し、Ｌ−グルタミン酸に対す
る基質特異性がきわめて高く、Ｌ−グルタミンに
対しては実質的に作用しないＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼを作用させ、反応に伴う酸素の消費量
または過酸化水素、アンモニアもしくはα−ケト
グルタル酸の生成量を検出することを特徴とする
Ｌ−グルタミンの分析法を提供するものである。

本発明で使用されるＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼは公知のＬ−グルタミン酸オキシダーゼとは
異なり、Ｌ−グルタミンには実質的に作用せず、
Ｌ−グルタミン酸にのみ作用する酵素であり、こ
のような性質のGLXDとグルタミナーゼを組み
合せることによつてはじめてＬ−グルタミンをオ
キシダーゼ反応を利用して分析することを可能と
したものである。

本発明に関与する酵素反応を概略的に示すと以
下のとおりである。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明における分析試料とは、Ｌ−グルタミン
を含有し、もしくは含有することが予想される試
料であり、特に限定されない。具体的には例えば
血液などの生体試料、食品、食品原料および胃腸
薬などの医薬品が挙げられる。

本発明において使用されるＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼは基本的には前記の反応式で示される
作用を示し、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異
性が高く、Ｌ−グルタミンには実質的に作用せ
ず、他のアミノ酸に対しては本発明の測定条件下
でほとんど作用しない酵素であればよい。

GLXDの具体例としては、本発明者らによつ
て見出された酵素であり、ストレプトマイセス・
エスピー Ｘ−119−６（Streptomyces sp.X−
119−６；微工研菌寄第6560号、ATCC39343）の
培養物より得られる酵素（Agric.Biol.Chem.，47
(6)1323−1328（1983）；特開昭59−2687号など参
照；この酵素を以下「本酵素」ということもあ
る。）を例示することができる。

以下に本酵素の特徴的性質を示す。

本酵素はＬ−グルタミン酸に対する基質特異性
が極めて高く、他のアミノ酸に対しては実質的な
作用は示さない。すなわち、PH7.4においてはＬ
−アスパラギン酸とＬ−アスパラギンにわずかな
活性（Ｌ−グルタミン酸に対する活性の0.6〜0.7
％）を示すが、Ｌ−グルタミンを含む他のＬ−ア
ミノ酸およびＤ−アミノ酸には全く作用しない。
また、PH6.0においてはＬ−アスパラギン酸およ
びＬ−アスパラギンに対しても実質的に活性を示
さない。

本酵素の作用PH範囲は広く（PH５〜10）、至適
PHはPH７〜8.5である。すなわち、中性付近で効
率よく作用する酵素である。

本酵素は広いPH範囲において安定である。すな
わち、37℃、60分間保持の条件下ではPH5.5〜
10.5の範囲において、45℃、15分間保持の条件下
ではPH5.5〜9.5の範囲において、60℃、15分間保
持の条件下ではPH5.5〜7.5の範囲においてそれぞ
れ安定であつた。

本酵素の作用適温の範囲は30〜60℃と広く、作
用至適温度は50℃付近である。

本酵素の熱安定性は非常に高い。すなわち、PH
5.5においては65℃まで安定であり、85℃でも約
50％の残存活性を示す。PH7.5においては50℃ま
で安定であり、75℃でも約60％の残存活性を示
す。PH9.5においては45℃まで安定であり、70℃
で約50％の残存活性を示す。なお、活性の測定は
上記の条件下に15分保持した後に行つたものであ
る。

本酵素の活性はパラクロロマーキユリベンゾエ
イトによつて約45％阻害されるが、銅イオンはじ
め他の通常の阻害剤によつては阻害されない。

本酵素の製造法の一例は参考例に詳述する。

本発明において使用されるグルタミナーゼと
は、Ｌ−グルタミンに作用してＬ−グルタミン酸
を生成する酵素であればよく、特に限定されな
い。

通常はグルタミナーゼ（EC 3.5.1.2）が好適に
使用されるが分析試料中のアスパラギン含量が極
端に多くなければグルタミン−（アスパラギン−）
アーゼ（EC 3.5.1.38）を使用してもよい。

グルタミナーゼ（EC 3.5.1.2）としては具体的
には大腸菌（E.coli）由来の酵素（至適PH5.5付
近，J.Biol.Chem.，243，853−863（1968）参照）、
シユウドモナス・エルギノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）由来の酵素（至適
PH８〜９付近，Biochem.Biophys.Res.
Commun.，46，1278−1284（1972）参照）、ブ
タ腎皮質由来の酵素（至適PH８〜9.5付近，J.
Biol.Chem.，245，1871−1877および1878−1882
（1970）参照）などを例示することができる。特
におよびの酵素は本酵素と至適PHが近いので
これらの酵素と本酵素を同一反応系で同時もしく
は連続して作用させることができる点で好まし
い。

本発明の分析法は基本的には前記のとおりの二
段階の酵素反応から成る。すなわち(1)分析試料中
のＬ−グルタミンに対してグルタミナーゼを作用
させＬ−グルタミン酸を生成させる反応、および
(2)(1)の反応で生成したＬ−グルタミン酸に対して
酸素と水の存在下、GLXDを作用させ、過酸化
水素、アンモニアおよびα−ケトグルタル酸を生
成させる反応である。

(1)および(2)の酵素反応は両反応の条件が合致す
る場合は同一反応系中で同時もしくは連続して行
うこともでき、反応条件が異なる場合は(1)の反応
後、反応条件を調節して(2)の反応を行えばよい。

(1)および(2)の反応系には必要に応じて緩衝剤が
添加される。緩衝剤としては酢酸塩、りん酸塩、
ほう酸塩、炭酸塩、トリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン、バルビタール、トリエタノールアミ
ン、グリシンなどを使用することができる。

(1)の反応は使用する酵素によつて条件が異なる
が、通常、PH５〜10、温度15〜40℃の範囲の任意
の条件で行われる。

(2)の反応も使用する酵素によつて条件が異なる
が、本酵素を使用する場合、PH５〜９、温度15〜
60℃の範囲の任意の条件で行われる。

また、(1)および(2)の反応は多層分析フイルムな
どを使用するドライ・システム（化学の領域、35
(4)、273−280（1981））によつて行つてもよい。

反応に際し、グルタミナーゼおよびGLXDは
可溶性酵素または固定化酵素として使用される。
両酵素は同一の担体に一緒に固定化してもよく、
別々に固定化してもよく、一方のみを固定化して
使用してもよい。

固定化酵素は包括法（格子型、マイクロカプセ
ル型など）、担体結合法（共有結合法、イオン結
合法、物理的吸着など）、架橋法などの一般的方
法（「固定化酵素」、千畑一郎編集、昭和50年３月
20日、(株)講談社発行）によつて製造することがで
きる。

たとえば、固定化用の担体としてはセルロース
（セロフアン、瀘紙など）、アセチルセルロース誘
導体、各種イオン交換セルロース、カラギーナン
などの多糖類；コラーゲン、ゼラチンなどの蛋白
質；ポリスチレン、ポリアミノスチレン、光硬化
樹脂（エチレン性不飽和基を有する親水性光硬化
樹脂（特公昭55−40号、特公昭55−20676号）な
ど）、イオン交換樹脂などの合成有機高分子物質、
ガラス（多孔性ガラスビーズなど）、シリカなど
の無機物質を使用することができる。酵素の固定
化に際し、これらの担体はそのまま使用するか、
あるいは適当な官能基の導入、スペーサーの導
入、官能基の活性化などの前処理を施して使用さ
れる。担体と酵素の結合は、ジアゾ法、ペプチド
法、アルキル化法、架橋試薬（グルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネートなど）を使
用する方法によつて行うことができる。また上記
のような架橋試薬によつて酵素間を架橋すること
によつても固定化することができる。

固定化酵素は膜状、ゲル状、粒状、チツプ状、
粉末状、マイクロカプセル状、チユーブ状、容器
状、繊維状、ホロフアイバー状など使用の態様に
応じた形態に調製される。たとえば、膜状に調製
して酵素電極として、粒状に調製し、カラムに充
填してリアクター型バイオセンサーとして、ある
いは発色試薬、ゼラチンなどのバインダーなどと
ともに多層分析フイルムの酵素試薬層として調製
して使用することができる。

本発明によるグルタミンの分析は、前記二段階
の反応にともなう酵素の消費量、または過酸化水
素、アンモニアもしくはα−ケトグルタル酸の生
成量を検出することによつて行われるが特に酸素
の消費量もしくは過酸化水素の生成量を検出する
方法が好ましい。なお、検出法はレート法でもエ
ンドポイント法でもよい。

(1) 酸素消費量 酸素の消費量の検出は、通常ワールブルク検
圧法（生化学実験講座５，酵素研究法（上）、
第35〜41頁、(株)東京化学同人、1975年８月20日
発行）または酸素電極法（電極法による酸素測
定、萩原文二編、(株)講談社、1977年11月20日発
行）によつて行われる。

酸素電極としては、たとえば、カソードとし
て白金電極、アノードとして鉛電極を具備し、
水酸化カリウム溶液を内部液とし、白金カソー
ド表面に酸素透過性のテフロン膜が装着された
クラーク型酸素電極を使用することができる。

酸素電極は酵素電極としても使用することが
できる。たとえば、グルタミナーゼおよび／ま
たはGLXDの固定化酵素もしくは半透性膜で
覆われた可溶性酵素をクラーク型電極の電極膜
に密着して装着した電極装着型酵素電極として
使用することができ、固定化酵素を充填したカ
ラムなどによるリアクターと分離して装着され
た酸素電極とから成るリアクター型酵素電極と
しても使用することができる（「化学の領域、
増刊134号、バイオマルテリアルサイエンス第
１集」pp.69〜79，1982年４月20日，(株)南江堂
発行；「化学工業」1982年６月号，pp491〜
496；「イオン電極と酵素電極」、鈴木周一編，
pp65〜106，1981年11月１日、(株)講談社発行；
「化学の領域」第36巻、第５号，pp.343〜349，
（1982））。

(2) 過酸化水素生成量 過酸化水素の生成量の検出は、電気化学的方
法、分光学的方法、化学発光法、けい光法など
公知の方法（特公昭56−32919号など）によつ
て行うことができる。

電気化学的方法としては過酸化水素電極を用
いる方法が一般的であるが、過酸化水素とヨウ
素イオンを反応させ、ヨウ素イオンの活量減少
をヨウ素イオン電極で測定する方法によつても
過酸化水素を検出することができる。

過酸化水素電極としては、たとえば白金電極
を使用したクラーク型過酸化水素電極を使用す
ることができる。また、酸素電極と同様の酵素
電極として使用することもできる。

分光学的方法としてはパーオキシダーゼ
法、カタラーゼ法、Tⁱ（）／４−（２−ピ
リジルアゾ）レゾルシノール系、（）／キ
シレノール・オレンジ系などを使用する化学的
方法（以上、有機合成化学39(7)、659〜666
（1981）参照）、グルタチオン／グルタチオン
パーオキシダーゼ系を利用する方法（Anal.
Biochem 76，184〜191（1976））などを使用す
ることができる。

のパーオキシダーゼ法は、被酸化性発色剤
をパーオキシダーゼもしくは同様の活性を示す
物質の存在下に過酸化水素と反応させ、反応生
成物である色素を吸光度測定によつて定量する
方法である。パーオキシダーゼとしては通常、
西洋わさび（ホースラデイシユ）由来の酵素が
使用される。発色剤としては、たとえばｏ−ジ
アニシジン、４−メトキシ−１−ナフト−ルも
しくは２，2′−アジノ−ビス（３−エチルベン
ゾチアゾリン−６−スルホン酸）などの単独；
４−アミノアンチピリンとフエノール、ｐ−ク
ロロフエノール、２，46−トリブロモフエノー
ルなどのフエノール系化合物との組合せ；４−
アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなどのアニリン
系化合物との組合せ；４−アミノアンチピリン
とＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジンなどのト
ルイジン系化合物との組合せ；または３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとＮ，
Ｎ−ジメチルアニリンとの組合せなどを使用す
ることができる。

なお、パーオキシダーゼ法による発色反応は
中性付近のPHで行われる場合に多い。たとえ
ば、４−アミノアンチピリン／フエノール系の
場合、発色反応はPH7.5で行われる。したがつ
て、GLXD本酵素による反応は通常中性付近
で行われることから、発色反応に際してPHを変
更することなく、同一反応系中で連続して反応
を行うこともできる。さらに、グルタミナーゼ
による酵素反応も同じPH範囲で行うことが可能
である。すなわち、グルタミナーゼによる酵素
反応、GLXDによる酵素反応および発色反応
の三反応を同一反応系中で連続して行うことが
できる。

のカタラーゼ法としては過酸化水素をカタ
ラーゼの存在下にアルコール（メタノールな
ど）と反応させ、生成するアルデヒド（ホルム
アルデヒドなど）を発色系に導き、生成色素を
吸光度測定するか、あるいはアルデヒドをアル
デヒドデヒドロゲナーゼを利用して定量する方
法などを採用することができる。ホルムアルデ
ヒドを発色させる方法としては、アンモニアと
反応させる方法または酸化剤（過ヨウ素酸ナト
リウム、赤血塩（フエリシアン化カリウム）な
ど）の存在下でヒドラゾン（４−アミノ−３−
ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−ト
リアゾールなど）と反応させる方法を用いるこ
とができる（特公昭56−19238号）。

化学発光法としては、過酸化水素を赤血塩の
存在下でルミノールと反応させ、化学発行量を
フオトンカウンターによつて測定する方法（特
開昭58−47484号）が好適である。同様の方法
で赤血塩の代りにパーオキシダーゼを使用して
もよく（特開昭57−71399号、特開昭57−71400
号）、ルミノールの代りにイソルミノール、ピ
ロガロールを使用してもよい。

けい光法としては、ホモバニリン酸をパーオ
キシダーゼの存在下、過酸化水素と反応させて
けい光強度を測定する方法が挙げられる。発け
い光試薬としてはｐ−ヒドロキシフエニル酢酸
またはジアセチルフルオレスシン（特開昭55−
48656号）などを用いてもよい。

(3) アンモニア生成量 アンモニアはミクロケルダール法、ネフラー
法、インドフエネール法、ニンヒドリン法、フ
エノサフラニン法などの方法によつて分析でき
る。また、カチオン選択性電極によつてアンモ
ニウムイオンを分析する方法または疎水性のガ
ス透過性膜を装着したガラス電極からなるアン
モニアガス電極によつてアンモニアガスとして
分析する方法など、電気化学的分析法によつて
分析してもよい。

(4) α−ケトグルタル酸生成量 α−ケトグルタル酸は、３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）と反
応させて生成物の吸光度を測定する方法、２，
４−ジニトロフエニルヒドラジンと反応させ、
生成物の吸光度を測定する方法、ｏ−フエニレ
ンジアミンと反応させて生成物の吸光度を測定
する方法、その他公知の方法を使用することが
できる。

実施例 以下、本発明による測定法の一例を示す実施例
およびＬ−グルタミン酸オキシダーゼの製造法を
示す参考例によつて本発明をより具体的に説明す
る。本発明はこれらの例示によつて限定されるも
のではない。実施例および参考例において酵素単
位（Unit）は「Ｕ」と表記するものとする。

実施例 １ (1) 試薬の調製 発色試薬 フエノール20mg、４−アミノアンチピリン
20mg、パーオキシダーゼ（東洋紡績(株)製、西
洋わさび由来、100U／mg）３mgおよび部分
精製したGLXD（本酵素；12U／mg）２mgを
40mlの0.2Mりん酸カリウム緩衝液（PH7.4）
に溶解した。

グルタミナーゼ溶液 グルタミナーゼ（シグマ社製、大腸菌由
来、5U／mg）２mgを10mlの0.1M酢酸緩衝液
（PH5.5）に溶解した。

(2) 操作法 試験管に標準Ｌ−グルタミン溶液（０〜
2μmol／ml）0.1mlを入れ、グルタミナーゼ溶
液0.2mlを加えて37℃で20分間インキユベート
した後、発色試薬0.7mlを加えてよく撹拌し、
さらに５分間好気的に振盪しながら37℃でイン
キユベートした。盲検を対照として500nmの吸
光度を測定し、第１図に示す検量線を作成し
た。

実施例 ２ 試験管に標準Ｌ−グルタミン溶液（０〜
1μmol／ml）0.1mlを入れ、実施例１で用いたグ
ルタミナーゼ溶液0.1mlを加えて37℃、10分間イ
ンキユベートした。次にGLXD（本酵素）1Uを含
む0.1M酢酸緩衝液（PH5.5）１mlを30℃の恒温水
を循環しているクラーク型酸素電極のキユベツト
に密封し、上記反応終了液50μを注入して酸素
消費量を測定した。この測定値に基づいて第２図
に示す検量線を作成した。

参考例 500ml容三角フラスコにフスマ20ｇおよび水16
mlを入れ、120℃、30分間加圧滅菌して調製した
フスマ培地にストレプトマイセス・エスピーＸ−
119−６（微工研菌第6560号）を植菌し、28℃、７
日間培養して種菌を調製した。

５容三角フラスコ25本にそれぞれフスマ200
ｇおよび水160mlを入れ、120℃、30分間加圧滅菌
した後、前記の種菌を無菌的に接種し、28℃で２
日間培養後、温度を20℃に下げてさらに２週間培
養した。

得られた培養物を37.5の水に１時間浸漬した
後、濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵
素液約34を得た。この粗酵素液に硫酸アンモニ
ウムを50％飽和まで加え、生成した沈澱を遠沈採
取して0.02M酢酸緩衝液（PH5.5）3.9に溶解し、
57℃で30分間加熱した。この熱処理した酵素液を
５℃以下に冷却後、２倍量の予め冷却したエタノ
ールを加え、生成した沈澱を遠沈採取して0.02M
りん酸緩衝液（PH7.4）２に溶解し、同一緩衝
液で一夜透析した。透析中に生成した沈澱を遠沈
除去し、上清液を同一緩衝液で平衡化したDEAE
（ジエチルアミノエチル）−セルロースカラム
（3.5×50cm）に通し、吸着した酵素を食塩0.35M
を含む同一緩衝液を用いて溶出した。溶出された
活性区分を集め、0.05Mの食塩を含む0.05M酢酸
緩衝液（PH5.5）で一夜透析した。この透析内液
を同一緩衝液で平衡化したDEAE−セフアロース
CL−6B（フアルマシア・フアインケミカルズ社
製）カラム（２×10cm）に通し、吸着した酵素を
食塩0.05〜0.75Mのリニアグラジエント法で溶出
した。溶出された活性区分を集め、透析濃縮後、
セフアデツクスＧ−200（フアルマシア・フアイン
ケミカルズ社製）カラム（2.5×120cm）を用いて
ゲル濾過を行い、活性区分を集めて濃縮後、
0.02Mりん酸カリウム緩衝液（PH7.4）で透析し
た。この透析内液を遠沈し、上清液を精密濾過し
た後、凍結乾燥してＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼ本酵素の精製標品（比活性5.51U／mg蛋白、収
率18.4％）30mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＬ−グルタミンの検
量線を示す。第２図は実施例２におけるＬ−グル
タミンの検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分析試料中のＬ−グルタミンに対してグルタ
   ミナーゼを作用させ、ついで遊離するＬ−グルタ
   ミン酸に対して下記の基質特異性を有するＬ−グ
   ルタミン酸オキシダーゼを作用させ、反応に伴う
   酸素の消費量、または過酸化水素、アンモニアも
   しくはα−ケトグルタル酸の生成量を検出するこ
   とを特徴とするＬ−グルタミンの分析法。 （Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの基質特異性） PH7.4の条件下で測定した場合、Ｌ−グルタミ
   ン酸に対する特異性を100％とした時、Ｌ−グル
   タミンに対する特異性は0.1％以下である。 ２ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼがPH５〜10、
   60℃以下の条件下で好適に作用する酵素である特
   許請求に範囲第１項記載のＬ−グルタミンの分析
   法。 ３ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼがPH7.5、75
   ℃で15分保持した際に60％の活性を保持している
   酵素である特許請求に範囲第１または２項記載の
   Ｌ−グルタミンの分析法。 ４ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが37℃、60分
   の保持条件下でPH5.5〜10.5の範囲において安定
   な酵素である特許請求に範囲第１〜３項のいずれ
   かに記載のＬ−グルタミンの分析法。 ５ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼがパラクロロ
   マーキユリベンゾエイトによつて阻害されるが、
   銅イオンによつては阻害されない酵素である特許
   請求に範囲第１〜４項のいずれかに記載のＬ−グ
   ルタミンの分析法。