JPS6070069A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミクロコツカス属に屈する新規な微生物に関す
る。

従来、脂肪酸のω−末端のみを選択重しこ酸化すること
は工業的には困難とされてきた。例えば、ラクトン系ム
スク（じ壱香合成香料）の主成分であるヘキサデカノラ
イドの製造にはω−ヒドロキシパルミチン酸が使用され
るが、ムスクが高価であるのは、この前駆体たるω−ヒ
ト　。

ロキシパルミチン酸の製造が困難なことに起因する。即
ち、パルミチン酸のω−末端を選択的に酸化してω−ヒ
ドロキシパルミチン酸とすることは、合成化学上困難で
ある。

一方、微生物にノルマルパラフィンを資化させてジカル
ボン酸を製造する際に副産物としてω−ヒドロキシ高級
脂肪酸も得られることが報告されている（例えば特公昭
４８−２６２３８）このようにω−ヒドロキシ高級脂肪
酸はノルマルパラフィンのアルカン資化性菌によるジカ
ルボン酸への代謝中間体であるが、その著量生産は困難
とされている。その理由としてはω−ヒドロキシ高級脂
肪酸の生成速度に比べて、そのジカルボン酸への転化速
度の方がずっと大きいためと推測される。

また、ω−ヒドロキシ脂肪酸と同様にラクトン系ムスク
の主成分である大環状ラクトンの有用な中間体としては
ω−ハロカルボン酸がある。ω−ハロカルボン酸はハロ
ゲンに官能基を導入することにより種々の誘導体にも導
びくこともできる。このω−ハロカルボン酸に関しては
、アルスロバクタ−属、コリネバクテリウム属、ノカル
ディア属に属し、アルキルハライドからω−ハロカルボ
ン酸を生産する能力を有する菌を培養し、ω−ハロカル
ボン酸を生産する方法が報告されている（特開昭５７−
５０８９３号〕。

そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑みアルキル（又
はアルケニル）ハライドを対応するω−ハロカルボン酸
に変換する能力を有する菌を自然界より広く検索した結
果、ミクロコツカス属に属する微生物中に斯かる能力を
有するものがあることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はミクロコツカス属に属し、アルキル
（又はアルケニル）ハライドを資化してω−ハロカルボ
ン酸を生産する能力を有する新規なミクロコツカス・エ
スピー・ＫＳＭ−８−１６（微工研菌寄第７００４号）
に関するものである。

次に、本発明者らが分離、採取した本菌株の菌学的性質
を詳述する。

（ａ）形態 １）細胞の形および大きさ： 球菌、直径０，８〜１．２角 ２）集団：不規則連鎖及び房状は認められない３）運動
性：　なし ４）胞子：　形成しない ５）ダラム染色性：　陽性 ６〕抗酸性：　はとんど認められない （ｂ）各培地における生育状態 】）肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。

うす緑色で光沢を有し、凸円状 ２）肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな集落を生ずる。う
す緑色の光沢を有す。

３）肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、沈殿を生じない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、−Ｌ部のみ液化する５）リドマス
ミルク： わずかにアルカリ性を示しペプトン化しない。リドマス
の還元はない。

（Ｃ）生理学的性質 工〕硝酸塩の還元：　還元しない ２）脱窒反応：　陰性 ３）Ｍ　Ｒテスト：　陰性 ４）ＶＰテスＩ・：　陰性 ５）インドールの生成：　陰性 ６月ｔｌ化水素の生成（ＴＳＩ寒天）二　弱陽性７）テ
ンマンの加水分解：　陰性 ８〕クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地；　利用しない Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：　利用する９）無機窒
素源の利用 硝酸塩：　陽性 アンモニウム塩：　陰性 １０）色素の生成：　水溶性の緑色の色素】】）ウレア
ーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　培地：　陰性ＳＳＲ培地：　
陰性 １２）オキシダーゼ：　陰性 １３）カタラーゼ；　陽性 １４）生育の範囲： １４〜４２°Ｃ（最適２８〜３５℃） ｐＨ５，０〜９．５０＆適８．５〜８．０）１５）酸素
に対する態度：　好気性 １６）ＯＦテスト：　陰性 １７）糖類からの酸、ガスの生成　： Ｌ−アラビノース　；　− Ｄ−キシロース　− Ｄ−グルコース　− Ｄ−マンノース　− Ｄ−フラクトース　二　− Ｄ−ガラクト−ス　：　− 麦芽糖　− ショ糖　− 乳糖　− トレハロース　・　− Ｄ−ソルビット　・　− Ｄ−マンニット　・　− イノシット　・　− グリセリン　− テンマン　− １日）５％塩化すトリウム耐性：　生育するＩ９）採集
地：沖縄県石垣島伊良問の土壌から分離 以上の蘭学的性質を有する菌についてバージエイのマニ
ュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）第８版（１９７５年）に基づいて検索した結果、本菌
株はミクロコ・ンカス（Ｍｉｃｒｏｃａｃｃｕｓ　）属
に属する新菌株と８忍め、ミクロコツカス・エスピー・
ＫＳＭ−Ｂ−ＩＣ、ｌＩ業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されて、、いる。

本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用する菌株が
良好に生育し、アルキル（又はアルケニル）ハライドか
らのω−ハロカルボン酸の生産を順調に行なわしめるた
めに適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養源、無機塩
などからなる。炭素源としては、炭水化物（例えば、グ
ルコース、フラクトース、シュクロース、ソルビトール
等）、有機酸（例えば、クエン酸、コハク酸等　）、炭
化水素（例えば、ｎ−ドデカン、ｎ−ヘキサテカン等）
、アルキル（又はアルケニル）ハライドなど資化される
ものならばいずれも使用できる。また、窒素源あるいは
有機栄養源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カ
リウム、硝酸アンモニウム等の硝酸１ 塩類、酵母エキス、肉エキス、ペプトンが挙げられる。

また、無機塩としては各種リン酸塩、養要求を必要とす
る変異株を用いる場合には、その栄養要求を満たす物質
を培地に添加しなげ、ればならない。

し、２８〜３５°Ｃで３〜５日振盪又は通気攪拌すれば
良い。ｐＨは６．５〜８程度に調整すると良い結果が得
られる。水に難溶性の炭素源等を使用する場合には、ポ
リオキシェチレンソルビクン等の各種界面活性剤を培地
に添加することも可能である。

斜上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源として用
いることもできるが、菌体を培養液より分離する場合は
、通常の固液分離手段が用いられる。このように分瑚゛
された生菌体及びその処理物（凍結乾燥菌体等）も酵素
源としても２ ちいることができる。

アルキル（又はアルケニル）ハライドを反応基質として
本菌株を上記の如く培養するとω−ハロカルボン酸が生
産される。これらの培養液から目的物質であるω−ハロ
カルボン酸の採取および精製は、一般の有機化合物の採
取およびＣ１゜ １：の有機溶媒で抽出する。この抽出物をカラムクｂマ
ドグラフィーあるいは再結晶などの方法をＬｌ、ｈいて
・−・・・カルボン酸を単離することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 採取した土壌及び土壌付着の落葉落枝の小スパーチル１
杯分（約０．５ｇ）を１０ｍ１滅菌水に懸濁し、充分攪
拌した後放置する。がくして得られる土壌懸濁液上清の
１００倍希釈液０．１ｍ文を下記組成のｎ−ヘキサデカ
ン含有の分離用寒天培地（Ｉ）に直接移し、３０　’Ｏ
にて５日間培養する。

分離用寒天培地（Ｉ）　組成 ｎ−ヘキサデカン　２０　ｇ Ｎ８４ＮＯ３２５ｇ ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ Ｍｇ　ＳＯ４・　７Ｈ２０５ｇ ＫＣｌ　５ｇ 酵母エキス　１ｇ 寒天　２０　ｇ ポリオキシエチレン− ソルビタンモノラウリン酸エステル （平均ＥＯ数２０モル）　５０　ｍ　ｇ水道水　１　文 」−記分離用寒天培地（１）の調製法は、寒天とそれ以
外の培地成分を別滅菌し、６ｏ０ｃ付近に冷却後両者を
混合し、ダイナミックシェーカーで充分攪拌、乳化させ
た後、滅菌シャーレに分注するものである。

上記培養により発生するコロニーの一白金耳を滅菌水で
１００倍希釈し、この希釈液０．１ｍＭを不運の分離用
寒天培地（ＩＩ）に移し、３０’０にて３日間培養し、
生じた複数のコロニーが相互間に相異しないことを肉眼
的及び顕微鏡的に確認する。なお、分離用寒天培地（Ｉ
Ｉ）は、分離用寒天培地（Ｉ）の組成よりｎ−ヘキサデ
カンとポリオキシエチレンソルビクンモノラウリン酸エ
ステルを除いた寒天培地の底にｎ−ヘキサデカンを含浸
させたろ紙を敷いてｎ−へキサデカ〒穿地に接種し、３
０°Ｃで３日間培養し、ｌＯ木１１′ 一菌株の各培地上の性状及び生理学的性質が同一である
ことを確認した。上記菌株の各培地上の性状及び生理学
的性質は前述した通りである。

上記試験の結果、各１０本の培養菌はすべて自然界より
純粋に分離された単一菌株であることが判る。

次いで、上記で純粋培養された斜面培地」二の菌株より
一白金耳を滅菌した１０％グリセリン水溶液（２ｍ　ｌ
　）の入った凍結保存用バイアルに懸濁し、−８０°Ｃ
にて凍結保存する。かくして３ケ月凍結保存後、迅速に
解凍し得られる懸濁液の一白金耳を普通寒天培地に蘇生
後前記と同条件下に各培地上での性状及び生理学的性質
を調べた結果、凍結前とは変化が認められなかった。

また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り返した菌
株について同様に、各培地上での性−次いで、本菌株を
利用してω−ハロカルボン５ 参考例１ セチルクロライド５０ｇ、リン酸ニアンモニウム　１０
ｇ、リン酸−カリウム　２ｇ、硫酸マグネシウム（７水
塩）　０．２ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）０．０２ｇ、硫
酸亜鉛（７水塩）　Ｏ，ＯＩｆ３ｇ、硫酸マンガン（４
〜６水塩）　０．０１８ｇ、酵母エキス２ｇを水道水１
文に溶かしＰＨを７．０に調製した。この液体培地５　
ｍｌを５０　ｍｌ容振盪試験管に仕込み、１２０°０Ｔ
１５分間蒸気滅菌した後、ミクロコツカス・エスピー−
ＫＳＭ−Ｂ−１８（旧ｃｒｏｃｏ−ｃｃｕｓ　ｓｐ、Ｋ
ｓＭ−Ｂ−１８）を−白金耳接種し、３０”０で９６時
間振盪培養した。

培養終了後、この培養液に９Ｎ硫酸１ｍｌを加えｐＨを
強酸性として、クロロホルム−メタノール（２：　１）
混液２０ｍ１で抽出した。この抽出液を減圧下濃縮した
後メタノール−ＢＦ３触媒でメチル化し、ガスクロマト
グラフィーにて生成物のω−クロルパルミチン酸の定量
を行なった。その結果を８１表に示す。

６ なお、生成物はガス−マス（ＧＣ−ＭＳ）に第１表 Ｊ事件の表示 昭和５８年特許願第５３８４８号 ２発明の名称 新規微生物 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 明細書および図面 ６補正の内容 別紙のとおり 明細書１８頁の第１表の後に次のとおり挿入する。

［４、図面の簡単な説明

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の性質を有する微工研菌寄第７００４号として
   寄託された新規なミクロコツカス・エスピー−ＫＳＭ−
   Ｂ−１８株。 （ａ）形態 １）細胞の形および大きさ： 球菌、直径０．８〜１．２１１゜ ２）集団：不規則連鎖及び房状は認められない３）運動
   性：　なし ４）胞子：　形成しない ５）ダラム染色性：　陽性 ６）抗酸性：　はとんど認められない （ｂ）各培地における生育状態 ｌ）肉汁寒天平板培養： 正円形の表面なめらかな集落を生ずる。 うす緑色で光沢を有し、凸円状 ２）肉汁寒天斜面培養： 中程度の生育を示し、表面なめらかな集落を生ずる。う
   す緑色の光沢を有す。 ３）肉汁液体培養： 表面に膜は生ぜず、中程度に混濁し、沈殿を生じない。 ４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３日培養で菌生育し、上部のみ液化する５）リドマスミ
   ルク： わずかにアルカリ性を示しペプトン化しない。リドマス
   の還元はない。 （ｃ）生理学的性質 １〕硝酸塩の還元：　還元しない ２）脱窒反応：　陰性 ３）Ｍ　Ｒテスト：　陰性 ４）ＶＰテスト：　陰性 ５）インドールの生成：　陰性 ６）硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天）二　弱陽性７）テン
   ブンの加水分解：　陰性 ８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地：　利用しない Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：　利用する９）無機窒
   素源の利用 硝酸塩：　陽性 アンモニウム塩：　陰性 １０）色素の生成：　水溶性の緑色の色素１１）ウレア
   ーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地：　陰性 ＳＳＲ培地：　陰性 １２）オキシダーゼ：　陰性 １３）カタラーゼ：　陽性 １４）生育の範囲： １４〜４２°Ｃ（最適２８〜３５°Ｃ）ｐ）＋５．ｏ　
   〜９．５（最適８．５〜８．０）１５）酸素に対する態
   度：　好気性 １６）ＯＦテスト：　陰性 １７）＠類からの酸、ガスの生成　： Ｌ−アラビノース　：　− Ｄ−キシロース　− Ｄ−グルコース　・　− Ｄ−マンノース　・　− Ｄ−フラクトース　：　− Ｄ−ガラクトース　：　− 麦芽糖　− ショ糖　− 乳糖　− トレハロース　・　− Ｄ−ソルビット　゛　− Ｄ−マンニット　゛　− イノシット　− グリセリン　− デンプン　− １８）５％塩化ナトリウム耐性：　生育する