JPS6071958A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素免疫測定法における新規な手法であり、
更に詳しくはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識酵素とし
て使用する酵素免疫法における定量を、発光法によって
行なう手法に関する。

抗原抗体反応を利用して、生体内の微量の物質を定量す
る方法としては、螢光免疫測定法（ＦＩＡ）　、放射免
疫測定法（ＲＩＡ）　、酵素免疫測定法（ＫＩＡ）など
種々の方法が使用されていた。なかでも高感度で定量で
きるＲＩＡが広く使用されていた。しかしながら、同位
元素標識化合物に不安定なものが多いこと、人体に対す
る危険性および環境汚染の立場からその取り扱いが厳し
く廃棄が困難であることなど、問題点が多い。

４駄＼ そこで最近になり、安全性に問題がなく実験室の制約も
なく、また測定に使用される物質も比較的安定で保存で
き、操作も比較的容易であるＦＩＡが注目された。とく
に、標識として使用される酵素の活性の測定において、
ＲＩＡに匹敵する高感度の測定法、即ち螢光反応や発光
反応を利用する方法が開発されるに到り、更に重要視さ
れてきた。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、酵素免疫法における標識
酵素として広く使用されているが、その測定は比色法お
よび螢光法であった。

本発明者は、β−Ｄ−ガ２クトシダーゼを標識酵素とす
る手法に、グルコース−グルコースオキシダーゼ系を組
み合せることによって、発光法による定量ができること
を見出して本発明を完成した。

即ち、本発明に係る酵素免疫測定法は、標識酵素として
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用する酵素免疫測定法に
おいて、基質としてラクトースを使用し、標識酵素であ
るβ−Ｄ−ガラクトシダーゼによって分解生成されるグ
ルコースにグルコースオキシダーゼを作用させ、生成す
る過酸化水素を化学発光法によって測定することを特徴
とするものである。

本発明の測定方法に使用される化学発光法は通常使用さ
れる発光法、例えばルミノール、イソルミノール、アミ
ノナフチルヒドラジド等を発光物質とするルミノール法
およびビス（トリクロロフェニル）蓚酸エステル（’ｒ
Ｐｃｏ）等ヲ使用するバーオキジオギザレート法（蓚酸
エステル法）等限定なくいずれも使用することができる
。

本発明の方法において、β−Ｄ−ガラクトシダーゼによ
る酵素免疫反応は、全く常法によって行なわれる。例え
ば、抗原が低分子の成分の場合には、検体例えば血清ま
たは血漿とβ−り一ガラクトシダーゼ標識抗原および抗
体を接触させることにより、また抗原が高分子のときＫ
は、抗体として第１抗体および第２抗体を使用し、夫々
常法によって反応させる。次に、これを化学発光系に誘
導するために、反応によって得られた抗体と結合したβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗原に、ラクトースとグル
コースオキシダーゼとを加えて、過酸化水素を発生させ
る。

このようにして発生した過酸化水素が、前記発光法の常
法によって定量される。

次に実施例をあげて本発明の方法を更に具体的に説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものではない。

なお実施例においては、抗原物質の標準液を使用してい
るが、検体（例えば抗原物質を含む血清或いは血漿等）
を使用して全く同様に実施できる。

実施例１　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｔ）の
化学発光法による定量 Ａ法）　種々の濃度のβ−Ｇａ　ｔ〔バーリンガー社製
：（ｏ−ニトロフェニル−β−ガ２クトシドを基質とし
て）１，５，１０，２５，５０゜１００＋ｎｖ／１１１
〕の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５゜０．１チ牛血
清アルブミン含有）溶液５０μｔに、グルコースオキシ
ダーゼ（５ｖ／ｄ）の０．０１　Ｍリン酸緩衝液（同上
）溶液５０μｔおよび０．１　Ｍ　：）クトースの０．
０１　Ｍリン酸緩衝液（同上）溶液１００μｔを加え、
３１℃で２時間反応させた後、その反応液５０μｔを採
り、これに、２００μｆ／ｍｌ濃度の８−アニリノナフ
タレン−１−スルホンＭ　（Ａｌ１）の０．２Ｍバルビ
ッール酸緩衝液（１）Ｈ９０、０，１％牛血清アルブミ
ン含有）溶液１００ｐＬおよび、５ｍＭのビス（２，４
，６−テト２りロフェニル）オキザレー）　（ＴＣＰＯ
）の酢酸エチル溶液２００μｔを加え、２秒間混和して
、アロカルミネセンスリーダー（アロカ社製）で発光強
度を測定した（　Ｗａｉｔｉｎｇ　ｔｉｍｅ　１５秒ｊ
ｒｎｔｅｇ、ｔｉｍｅ６秒）。その結果が第１図である
。以下ＡＮ８−　ＴＰＣＯ発元系ではこの装置を使用し
た。

Ｂ法）　種々ノ濃度のβ−ｏａｚ（ｏ、ｏｓ　、　０．
１２５　、０．２５　、０．５　、１　、２ｍｖ／ｉｆ
）の０．１Ｍリン酸緩衝液（同上）溶液５０μｔに、グ
ルコースオキシダーゼ（６，２５ｖ／ｍ／）溶液（同上
）′２０μｔおよび０．２５　Ｍラクトース溶液（同上
）２０μＬを加えて混和し、３１℃で２時間反応させた
後、ＡＮ８溶液１００　ｔｉＬオよびＴＣＰＯ溶液２０
０μｔを加え、Ａ法と同様にして発光強度を測定した。

その結果が第２図である。

Ｃ法）　上記Ｂ法において、Ａｌ１−Ｔ（！ＰＯを使用
する代りにルミノール−ミクロパーオキシダーゼ液（後
記）１００μＬを使用し、発光強度をオート・ピコライ
ト−６０００型（Ａｕｔｏ−Ｐｉｃｏｌｉｔｅｓｏｏｏ
、パラカード社＃）で行なった以外は、全くＢ法と同様
にして操作した。結果が第３図である。

ルミノール−ミクロパーオキシダーゼ液とは、５０　ｍ
Ｍ　ＣＡＲ８緩衝液（シクロへキシルアミノスルホン酸
緩衝液、ｐＨ９゜５）に９．２ｍＭ濃度でルミノールを
溶かした溶液１０ｔｎｌと、ミクロパーオキシダーゼの
ｌ　ｍＭ濃度の水溶液０．３　ｍＡ！とを混合した溶液
である。

実施例２　市販のキットを利用したジギトキシンの定置 比色定量用に調製された、市販のツギトキシン定量用キ
ット〔大日本製薬（株）製、マーキットジギトキシン〕
を使用して以下の実験を行なった。

各種濃度のジギトキシン標準液（夫々３．７５　。

７．５　、　１　５　、　３０　、　６０ｎｇ／ｍｊ）
２５　μｔにβ−り一ガラクトシダーゼ標識抗原液１０
０μｔを加えて混和する。これに抗体液１００μｔを攪
拌下に加えた後、３１℃で３０分間インキュベートする
。

混合物に０．８％食塩水２ｄを加え遠心分離する（３０
００ｒｐｍ、１０分間）。デカンテーションにて上清を
除き、沈降物に０．１　Ｍリン酸緩衝液（実施例１と同
じ）　ｓ　ｏ　μｔ、　６．２ＳＶ／−グルコースオキ
シダーゼ溶液（実施例１参照）２０μｔ、および０．２
５　Ｍラクトース溶液（実施例１参照）２０μｔを加え
て混和し、３１℃で２時間インキュベートする。混合物
にＡＮ８溶液１００μｔおよびＴＣＰＯ溶液２００μｔ
を加え、実施例１（Ａ、鰺）と同様にして発光強度を測
定した。その結果が第４図である。

実施例３　市販のキットを利用したフェニトインの定量 比色定量用に調製された、市販のフェニトイン定量用キ
ット〔大日本製薬（株）Ｊｌｌ！、マーキットフエニト
インコを使用して以下の実験を行なった。

マーセントチューブに各種濃度のフェニトイン標準液（
夫々０．２５　、０．５　、１．０．２、θ、４．ａμ
ｔ７ｙ）ｓ　ｏμｔ１β−ガラストンダーゼ標識抗原液
１００μｔおよび抗体液（１，５倍希釈）　ｓ　ｏ　ｐ
ｔを加え、攪拌混和して、３１℃で１時間インキ、：Ｌ
　ヘ−トｆる。マーセントチューブにゴムキャップを装
着し、２〜３秒間攪拌混和した後、倒置して１０分間１
０００〜１５０（ｌで遠心分離する。静かに元の状態に
戻し、沈澱が液中に落ちないように注意してゴムキャッ
プをはずす。チューブ中の透明な液５０μｔを他のチュ
ーブにとり、６．２５　ｖ／Ｒ１グルコースオキシダー
ゼ溶液２０μＬ、　０．２５　Ｍ　９クトース溶液２０
μｔ、　ＡＮ８溶液１００μｔおよびＴＣＰＯ溶・液２
００μｔを使用して、実施例２と全く同様にして発光強
度を測定した。

その結果が第５図である。

実施例４　市販のキットを利用したα−フェトプロティ
ンの定量 比色定量用に調製された、市販のα−フェトプロティン
定量用キット〔大日本製薬（株）製、マーキットα−フ
ェトプロティン〕を使用して以下の実験を行なった。

各種濃度のα−フェトプロティン標準液（１０，３０，
１００，３００ｎｆ／ｍｊ）５０　μｍおよびα−フェ
トプロティン抗体液５０μｔを混和し、゛　ｓｒ℃で３
時間インキュベートする。混合物にβ−ガラクトシダー
ゼ標標識α−フェトプロティ液液５０μｔ加え、３７℃
で３０分間インキュベートした後、不溶化ウサギ１ｇＧ
抗体液１００μｔを加え、３１℃で１時間インキュベー
トする。

混合物を遠心分離（３０ＱＯｒｐｍ、１０分間）し、デ
カンテーションで上清を除いた後、沈降物を実施例２に
おけると同じようにグルコースオキシダーゼを使用した
発光系に接続して発光強度を測定した。その結果を第６
図に示す。

実施例５　市販のキットを利用したヒト甲状腺刺激ホル
モン（ヒ）　Ｔ８Ｈ）の定量 螢光強度定量用に調製された、市販の〒８Ｈ定量用キッ
ト〔富士臓器製薬（株）、イムザインスクリー二ングｒ
ｓＨ）を使用して以下の実験を行なった。

種々の菫のヒ）　Ｔ８Ｈ標準血液ろ紙ディスク（１０，
２０，４０，８０，１６０μＩＶ／ｄ）各２枚を夫々ガ
ラス試験管（１０Ｘ７５ｍ）に入れ、これに第１抗体液
（抗ヒ）ＴＢＨウサギ免疫血清、１／２稀釈１）１０θ
μＬを加え、１０分間振とり混和した後、３Ｆ’Ｃで１
６時間インキュベートする。混合物に、β−Ｄ−ガンク
トシダーゼ標識ヒトＴＳＨ（抗原）　ｌ　２００　Ａｔ
を加え、混和した後、第２抗体不溶化ビーズ（抗つサギ
ＩｆＧヤギ特異抗体のポリアセタールビーズ不溶化体）
１個を入れ、十分振とうした後、３７℃で４時間インキ
ュベートする。混合物より液を除き、ビーズをリン酸緩
衝１（１％アジ化ナトリウム含有）で３度洗った後、ビ
ーズのみ他の試験管に移す。

ビーズの入った試験管に、０．１Ｍリン酸緩衝液（実施
例１−Ａと同じ’）　１００　ｆｉｔ、　５Ｖ／ｒａｔ
グルコースオキシダーゼ溶液（同上）１００μｔおよび
０、１　Ｍ　？クトース溶液（同上）２００μｔを加え
、３７℃で２時間インキュベートした後、その１００μ
ｔをとり、ＡＮ８溶液（実施例１と同じ）１００μｔお
よび’１’ａｐｏ溶液（同上）２００μｔを加え、実施
例１−Ａ法と同様にして発光強度を測定した。その結果
を第７図に示す。

【図面の簡単な説明】 第１図乃至第３図は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの化学
発光法による検量線である。 第４図乃至第７図はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識抗
素として使用した場合の次の各抗原に対する検量線であ
って、第４図はジギトキシン、第５図はフェニトイン、
第６図はα−フェトプロティン、第７図はヒト甲状腺刺
戟ホルモンに対するものである。いずれも、縦軸は発光
強度、横軸は濃度である。 特許出願人　辻　章　夫 代理人弁理士　樫　出　庄　治 竿２　図 泊ＩＪ／ｍＡ 譚　１＋　図 ηｇ／ｍＬ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）標識酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用す
   る酵素免疫測定法において、基質としてラクトースを使
   用し、標識酵素であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼによっ
   て分解生成されるグルコースにグルコースオキシダーゼ
   を作用させ、生成する過酸化水素を化学発光法で測定す
   ることを特徴とする酵素免疫測定法。 ２）化学発光法がバーオキジオギザレート発光法である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）化学発光法がルミノール発光法である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。