JPS607229B2 - 免疫化学的測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生理活性物質の免疫化学的測定方法に関する。

ィンスリン、繊毛性ゴナドトロビン、成長ホルモン、Ｑ
−フェトブロティン、免疫グロブリン等の抗原性を有す
る物質（以下抗原性物質という。）は、これらの物質の
抗体との結合反応が非常に特異的かつ鋭敏であるので、
この反応を利用して抗原性物質または抗原性物質の抗体
を測定する方法が数多く開発され、既に多くの免疫化学
的測定法が実用に供されている。例えば、寒天ゲル内で
抗原と抗体とを反応させるゲル内沈降法、血球またはポ
リスチレンラテックスのような微粒子を抗原または抗体
の担体として用いる凝集反応および凝集阻止反応、放射
性同位元素、酵素または蛍光物質を抗原あるいは抗体の
標識剤として用いる放射免疫分析法（Ｒａｄｉｏ−ｊｍ
ｍ肌ｏａｓｓａｙ以下ＲＩＡと略す。）、酵素免疫分析
法（Ｅｍｙｍｅｌｍｍ肌ｏａｓｓａｙ依下ＥＩＡと略す
。

）、蛍光免疫分析法がある。一方、免疫化学的測定法に
おける抗体の代わりに測定しようとする物質（以下測定
物質という。

）に特異的に結合する蛋白質、即ち受容体または結合蛋
白質を利用する競合的蛋白分析法によっても測定される
。これらの方法は、それぞれ特徴があり、その特徴を生
かして広く用いられているが、なかでもＲＩＡおよびＥ
ＩＡは他の方法に比べ、測定感度が非常に高く、定量性
に優れているので、その応用範囲は広く、測定可能な物
質は蛋白性ホルモン、ウイルス、免疫グロブリン等の高
分子物質からべブチド、ステロイド、合成医薬品等の低
分子物質まで多種多様にわたっている。

前記ＲＩＡおよびＥＩＡの測定原理は共通しており、従
来競合法およびサンドイッチ法と呼ばれる２つの方法が
用いられているが、その測定原理は次の通りである。

以下本明細書においては測定物質として抗原を、この物
質と特異的に結合する物質（以下結合性物質という。

）として抗体を使用する場合について記述するが、本発
明はこれに限定されるものではなく、測定物質が抗体で
あり、この物質の結合性物質が抗原である場合も、また
抗原−抗体の系に限らず生理活性物質−受容体蛋白質の
系も同様に実施することができる。次に、ＲＩＡおよび
ＥＩＡにおける競合法とサンドイッチ法について、その
概要を図面によって説明する。

競合法の測定原理は、第１図の模型図に示すように、測
定する未知の量の非標識抗原１と、標識剤で標識した標
識抗原２の一定量とを、対応する抗体３の一定量に競合
反応させる。

この場合、非標識抗原１と標識抗原２は、それぞれの量
に比例して抗体３に結合し、非標識抗原１の量の増減に
反比例して抗体３に結合する標識抗原２の量が増減する
。次に、適当な方法で抗体に結合した標識抗原２ａと結
合しなかった標識抗原２とに分離し、そのいずれかの分
画の標識剤の活性を測定する。同時に、濃度既知の標準
物質を用いて同様に操作して標準曲線を作成し、この標
準曲線によって未知の量の抗原１の量を算出する。サン
ドイッチ法の測定原理は、第２図の模型図を示すように
、測定する禾知の量の非標識抗原１と、その抗原の抗体
を不溶化した不溶化抗体４とを反応させる。

両者は結合して抗原抗体複合体５を形成する（第１反応
）。この複合体５を反応混合液から一旦分離し、この複
合体に、測定抗原の抗体に標識剤を結合させた標識抗体
６の一定量を反応させる（第２反応）。標識抗体６は前
記複合体５に結合するが、複合体５の結合能を越えた分
の標識抗体６は結合しないで遊離状態で存在する。次に
、前記複合体に結合した標識抗体６ａと結合しなかった
標識抗体６とに分離し、そのいずれかの分画の標識剤の
活性を測定する。同時に、濃度既知の標準物質を用いて
同様に操作して標準曲線を作成し、この標準曲線によっ
て未知の量の抗原１の量を算出する。前記競合法は、測
定する抗原の量の変化に比べ、標識剤の活性の変化量が
少ないので、標準曲線の勾配が小さく、測定しうる抗原
の量の範囲がせまし、のに対し、サンドイッチ法は測定
する抗原の量の変化が直接に標識剤の活性の変化量に対
応するので、標準曲線の勾配が大きく、広い範囲にわた
る抗原の存在を測定することができる。

しかし、従来のサンドイッチ法では満足に測定できる抗
原量の上限は下限の１ぴ〜１ぴであるのに対し、測定す
る物質の存在量の上限は下限の１ぴ〜１ぴ倍に及ぶこと
もいよいよある。例えば、Ｑ−フェトプロティンの血中
濃度は、正常人では１×１びｎ夕／の【以下であるが、
原発性肝癌の患者では１×１ぴｎｇ／の‘の濃度に達す
ることがある。このような場合、測定法の測定可能範囲
に入るよういくつもの段階に希釈した検体を準備しなけ
ればならない不便がある。また「希釈回数が多くなるの
で、測定精度が低下するおそれが生ずる。本発明者らは
、前記のような不都合がなく、側定範囲の広い測定法を
関発すべく研究を重ねた結果、従来のサンドイッチ法に
おいて、ゾーン現象を生ずるため測定不可能と考えられ
ていた抗原過剰領域を積極的に利用することにより、従
来の方法に比べて非常に広い範囲にわたる測定が可能で
あることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明の測定方法は測定物質と結合性物質と
を反応させた後、反応生成物を反応液から分離すること
なく標識物質を反応させて、結合性物質−測定物質−標
識物質複合物を形成せしめ、該複合物中の標識剤の活性
を測定することにより測定物質を測定する免疫化学的測
定方法において、結合性物質に対する測定物質の割合が
過少量（例えば抗体過剰）から過剰量（例えば抗原過剰
）にわたる各割合で反応させて、測定物質量と標識剤の
活性との関係を表わす曲線が漸次上昇した後下降する型
となる標準曲線を得、この標準曲線を利用して、検体の
少なくとも２点について測定して測定物質の量を測定す
る方法である。

本発明を実施するには、通常次のように行なつｏ１つの
検体溶液から抗原を多く含むサンプル（以下、多量とい
う）と少なく含むサンプル（以下、少量という）との２
つのサンプルを調整し、これに不落化抗体浮遊液を加え
て抗原と抗体とを反応させる。

次に、この反応混合液に標識抗体溶液を加えて反応させ
た後、遠心して固体相を分取し、よく先液した後、これ
に含まれる標識剤の活性を測定する。例えば、標識剤と
して酵素を使用した場合には、よく洗練した固体相に、
適当な基質溶液を加えて反応させて酵素活性を測定する
。得られた２つの測定値を比較して、多量の測定値＞少
量の測定値の場合は標準曲線の上昇側（左側）、多量の
測定値＜少量の測定値の場合は下降側（右側）に各測定
値をあてはめ、多量の測定値＝少量の測定値の場合は多
量の測定値を下降側に、少量の測定値を上昇側にあては
めて検体溶液中の抗原の量を求める。なお、異なった量
の抗原の採取は通常、同一濃度の検体を異なった容量採
取して行なうが、勿論、異なった濃度の検体を同容量採
取して行なってもよい。次に本発明の測定方法を原理的
に説明すると第２図および第３図の模式図のようになる
。

測定抗原１とその不溶化抗体４の一定量を反応させた場
合、抗原１の量が不溶化抗体４の量に比べて少ない場合
は、前記第２図に示したサンドィ・ッチ法の原理が作動
して（但し抗原抗体複合体を反応混合液から分離しない
。

）、未知の量の抗原１の量が測定される。次に「測定抗
原１の量が不溶化抗体４の量に比べ多い場合は、第３図
に示すように、抗原抗体複合体５の他に遊離状態の抗原
１が存在することとなり、両者の混合液に標識抗原６の
一定量を反応させると、標識抗原６に対し抗原抗体複合
体５と遊離の抗原１とが競合反応を起こし、遊離の抗原
１が多い程抗原抗体複合体５に結合する標識抗体６の量
は減少する。

従って抗原抗体複合体に結合した標識剤の活性は抗原量
の増加に反比例して減少する。即ち、本発明は測定する
抗原の量が不溶化抗体の量に比べて少ない場合はサンド
イッチ法の原理が、該抗原の量が該抗体の量より多い場
合は競合法の原理が作動するのであって、抗原と抗体と
の量的関係によって、作動する原理が自動的に選択され
るものであり、その標準曲線は、抗原抗体複合体に結合
した固体相の標識剤の活性を測定した場合には、測定す
る抗原の量の増加にしたがって漸次上昇した後下降する
山型の曲線を、結合しなかった液体相の標識剤の活性を
測定した場合には、漸次下降した後上昇する谷型の曲線
を描く。

本発明の測定方法は、その標準曲線から明らかなように
同じ測定値を与える量が、標準曲線の上昇側と下降側と
に存在する。したがって、単一の測定値からではその測
定値を上昇側にあてはめるのか、下降側にあてはめるの
か判断し得ない。そこで、少なくとも２つの量について
測定を行ない、得られた測定値の大小を比較して、多量
の測定値＞少量の測定値の場合は標準曲線の上昇側、多
量の測定値＜少量の測定値の場合は下降側、多量の測定
値＝少量の測定値の場合は両側を利用するのである。抗
原抗体複合体に結合した標識抗体と結合しなかった標識
抗体とを分離するには、通常、抗体を、セルロース化合
物、ポリスチレン、デキストランなどの担体に結合させ
て不落化した不落化抗体を用いるが、その他二抗体法な
どの分離方法を利用することもできる。

標識剤としては、放射性同位元素（例えば、山５１，肌
１，３日など）、酵素（例えば、西洋わさびパーオキシ
ダーゼ、アルカリフオスフアターゼ、３一Ｄガラクトシ
ダーゼ、グリコースオキシダーゼなど）または蛍光物質
（例えば、フルオレツセンスイソチオシアネート、ロー
ダミンなど）を用いることができ、それぞれ特徴を有す
るが、測定の感度、精度および簡便性を考慮すると酵素
を用いるのが最も有利である。

本発明を実施するには、通常次のように行なつ。

適当な濃度とした検体溶液に、不溶化抗体浮遊液を加え
て抗原と抗体とを反応させる。

次に、この反応混合液に標識抗体溶液を加えて反応させ
た後、遠心して固体相を分取し、よく洗練した後、これ
に含まれる標識剤の活性を測定する。例えば、標識剤と
して酵素を使用した場合には、よく洗練した固体相に、
適当な基質溶液を加えて反応させて酵素活性を測定する
。得られた測定値を、濃度既知の標準物質を同様に操作
して得た標準曲線にあてはめ、検体溶液中の抗原の量を
測定する。測定を実施するにあたって、検体の量、使用
する試薬の濃度および量、反応の温度および時間等の条
件は、測定物質の種類、使用する抗体の力価、標識剤の
種類およびその活性等によって異なるので、各測定にお
ける最も適当な条件は実験的に定める。

標識剤の活性の測定は、遠心分離した後の固体相または
液体相いずれも測定することができるが、本発明におい
ては、検体溶液と不溶化抗体との反応の後、抗原抗体複
合体を反応混合液から分離しないから、液体相の活性を
測る場合には、検体溶液中に存在する爽雑物により活性
の測定が妨害されるおそれがある。

そのため特に酵素を標識剤として用いる場合には、固体
相の活性を測定するのが有利である。本発明は、従来の
測定法に比べ、以下に述べるような特徴を有する。

本発明は、前述のごとく１つの測定法においてサンドイ
ッチ法の原理と競合法の原理とを包含するものであるか
ら、その結果非常に広い濃度範囲を測定することができ
る。

このことは、測定物質の存在量の範囲が広く、検体溶液
中の存在量の予想をつけ難い場合においても、従来のよ
うに測定範囲をはずれないようにいくつもの希釈液を準
備する必要がなく、操作が簡便であり、希釈による誤差
も少なく、測定精度を向上させることができる。また、
従来のサンドイッチ法では反応生成物の分離操作を２回
行なう必要があったが、本発明では１回で済み、操作を
簡略にしうるとともに分離操作に伴う試料の損失も減少
するので、測定精度を向上することができる。さらに、
本発明においては、抗原と抗体とを反応させた後、抗体
と結合しなかった抗原を分離せずそのま）反応を進める
ので、短時間では十分に抗体と反応しなかった抗原も抗
体との結合が促進され、抗体に結合する抗原の量が多く
なるので「従来の測定法よりも測定感度を上昇させるこ
とができる。

本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例 １ Ｑーフェトブロテインの測定 ａ Ｑ−フェトプロティン標準溶液の調製西ら（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ−，３０，２５０７〜２５１３，（１９
７０））の方法により、肝癖患者腹水より抽出、精製し
たＱ−フェトプロティン（以下ＡＦＰと略す。

）を、０．５％ッィーン２．０および１％牛血清アルブ
ミン（以下ＢＳＡと略す。）を含むリン酸緩衝食塩水（
以下Ｐ聡と略す。）で、１び，１ぴ，１ぴ，１ぴ，１び
，１ぴおよび１０７ｎ夕／奴の濃度に落籍した。ｂ 抗
ＡＦＰ抗体の製造 西らの方法により、肝癖患者腹水より抽出、精製したＡ
ＦＰを、２の９／泌の濃度になるよう生理食塩水に溶解
し、その０．５の‘をフロィントの完全アジュバントと
混合し、ウサギに５回以上免疫して抗ＡＦＰ血清を得た
。

この抗血清を硫酸ナトリウムで塩析し、抗ＡＦＰ抗体グ
ロフリンを得た。ｃ 抗ＡＦＰ抗体・セルロース結合物
の製造２．５％ブロムシアン溶液３２０の‘にセルロー
スパウダー（メルク社製）を８夕加え、ＩＮ水酸化ナト
リウム溶液でｐＨ１０〜１１に調節して２分間燈洋下に
反応させた後、ガラスフィルターで炉遇し、０．１Ｍ炭
酸水酸ナトリウム溶液で洗液して活性セルロースを得た
。

次いで、この活性セルロースを０．１Ｍ炭酸水素ナトリ
ウム溶液３２の上に浮遊させ、この浮遊液に前記抗ＡＦ
Ｐ抗体８の９を加え、４℃で２細時間健投下に反応させ
た。反応終了後、ＰＢＳおよび母Ｍ尿素・０．２Ｍグリ
シン混液（ｐＨ７．０）で洗膝し、０．５％ツイーン２
．０および１％茂Ａを含むＰＢＳにｌｏ％の濃度の浮遊
させた。ｄ 抗ＡＦＰ抗体・酵素結合物の製造 ５の夕の西洋わさびパーオキシダーゼ （Ｈｏｒｓｅｒａｄｄｊｓｈ Ｐｅｒｏｘｉ船ｓｅ、以
下ＨＲＰと略す。

）を、１の‘の０．９Ｍ炭酸水酸ナトリウム溶液に溶解
し、０．１の‘の１％２・４−ジニトロフルオロベンゼ
ンを加えて、室温で１時間櫨拝した。この溶液に０．０
８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１私を加え、３０分間室
温で混合した後、１．０叫の０．１８Ｍエチレングリコ
ール溶液を加え、室温で１時間混合した。０．０１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９．５）に対して１夜透析後、これに、
前記ｂ）で製造した抗ＡＦＰ抗体を、０．０１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９．５）に５の９／の‘の濃度に溶解して得
た抗ＡＦＰ抗体溶液１．０の‘を加え、室温で３時間反
応させた後、５の９の水素化ホウ素ナトリウムを加え４
℃で更に３時間反応させた。

反応終了後、Ｐ斑（ＰＨ７．２）に対して１夜透析した
後、セフアデックスＣ２００で分画、精製して抗ＡＦＰ
抗体・ＨＲＰ結合物（以下ａｎｔｉＡＦＰ・ＨＲＰと略
す。）を得た。ｅ 標準曲線の作成 前記ａで調製した各濃度の標準ＡＦＰ溶液の０．１の‘
を試験管にとり、これに前記ｃで製造した抗ＡＦＰ抗体
。

セルロース結合物浮遊液の０．４泌を加えて室温で６０
分間反応させた。反応終了後、この反応混合液に前記ｄ
で製造したａｎｔｉＡＦＰ・ＨＲＰＯ．１の‘を加え、
室温で１２び分間反応させた。

反応終了後遠心分離し、固相を０．００５％ッィーン２
０を含む生理食塩水で２回洗総し、これに５−アミノサ
リチル酸６０の９／ｄ‘と０．３％過酸化水素水１肌／
のとを含む基質溶液３の‘を加えて、室温で６０分間反
応させた。

反応停止後軽く遠心して、上清の吸光度を測定した（５
０仇ｍ）。このときの標準曲線を第４図に示した。次に
、この標準曲線を利用した測定例を述べる。

ｆ 正常人および患者血清中ＡＦＰの測定前記ｅの標準
曲線の作成の方法に準じ、正常人、妊婦ならびに肝疾患
々者血清中のＡＦＰ量を測定した。

測定検体の０．０５地ならびに０．１地をそれぞれ試験
管にとり、これに前記ｃで製造した抗ＡＦＰ抗体・セル
ロース結合物浮遊液の０．物上を加え、室温で６０分間
反応させた。

以下、前記ｅと同様に操作し、５０仇皿における吸光度
を測定した。． 検体量０．０５の‘の吸光度（ＯＤｏ
．。

５）と検体量０．１泌の吸光度（ＯＤｏ．，）とを比較
し、ＯＤｏ．鷹ＳＯＤ。

．，なら標準曲線の上昇側、ＯＤｏ．ｏ５＞ＯＤｏ．．
なら下降側を利用して血清中のＡＦＰ量を算出した。結
果を第１表に示した。

第１表 実施例 ２ ｈＣＧの測定 ａ 標準ｈＣＧ溶液の調製 日本薬局方収載のｈＣＧ標準品を、０．１％ＢＳＡを含
むＰＢＳに溶解し、１び，１ぴ，１ぴ，１ぴ，Ｉ０４
，１び及び１ぴｍｉｕ／の‘濃度のｈＣＧ溶液を調製し
た。

ｂ 抗ｈＣＧ抗体の製造 市販ｈＣＧを陰イオン交換樹脂およびセフアデックスに
よるゲル炉適法にて精製し、これを抗原として実施例１
−ｂの方法で家兎を免疫した。

得られた抗血清に、正常ヒト血清および尿成分を添加し
て血清および尿成分に対する抗体を吸収して除去した後
、硫酸ナトリウムで塩析して抗ｈＣＧ抗体を得た。ｃ
抗ｈＣＧ抗体感作ポリエチレン綾の製造前記ｂの抗ｈＣ
Ｇを１０ムタ／泌の濃度にグリシン緩衝液（ｐＨ８．２
）に溶解し、この抗体溶液１０の‘に直径３肌、長さ８
肋のポリエチレン綾を１００本入れ「 ３７ｑ０で２時
間インキュベートした。

これを生理食塩水で洗浄した後、１％正常家兎血清を含
むＰ斑を加え４℃で１夜放置して抗ｈＣＧ感作ポリエチ
レン榛を製造した。ｄ 抗ｈＣＧ抗体・ＨＲＰ結合物の
製造 実施例１一ｄの方法に準じて、５の９のＨＲＰと前記ｃ
の抗ｈＣＧ抗体５地を結合させ、抗ｈＣＧ抗体・ＨＲＰ
結合物を得た。

ｅ 標準曲線の作成 ０．１％茂Ａを含むＰ斑０．４の‘、前記ａの標準ｈＣ
Ｇ溶液０．１の‘および前記ｃの抗ｈＣＧ抗体感作ポリ
エチレン榛３本を試験管に入れ、３７ｏ０で６０分間イ
ンキュべ−トした。

次いで前記ｄの抗ｈＣＧ抗体・ＨＲＰ結合物溶液０．１
叫を加え、３７００で１８０分間インキュベートした。
反応終了後ポリエチレン棒を０．００５％ツィーン２０
を含む生理食塩水で洗浄し、０．５の【の基質溶液（ｏ
−フェニレンジアミン：５の９／仇とＰ斑，ＰＨ６．４
〉に加えた。室温で１晩反応後２地のＩＮ一日ＣＩを加
え、４９かｍの欧光度を測定した。得られた標準曲線を
第６図に示した。次にこの標準曲線を利用した測定例を
述べる。ｆ 正常人および患者血清中のｈＣＧの測定前
記ｅの標準曲線作成の方法に準じ、非妊婦、妊婦ならび
に胞状奇胎患者血清中のｈＣＯ量を測定した。

測定検体の０．０５机ならびに０．１の‘をそれぞれ試
験管にとり、これに０．１％既Ａを含むＰ既０．４の‘
および、前記ｃで製造した抗ｈＣＧ感作ポリエチレン榛
を加え、室温で６び分間反応させた。

以下、前記ｅと同様に操作し、４９かｍにおける吸光度
を測定した。検体量０．０５のとの吸光度（ＯＤｏ．。

５）と検体量０．１の上の吸光度（ＯＤ。

．，）とを比較し、ＯＤｏ．仮＜ＯＤＭならば標準曲線
の上昇側、ＯＤｏ．ｏ５＞ＯＤｏ．，ならば下降側を利
用して血清中のｈＣＧ量を算出した。結果を表２に示し
た。表 ２

【図面の簡単な説明】

第１図は競合法の測定原理説明のため模型図、第２図は
サンドイッチ法の測定原理説明のための模型図、第３図
は本発明測定方法の測定原理説明のための模型図、第４
図は実施例１のＡＦＰ測定の標準曲線を示すグラフ、第
５図は実施例２のｈＣＧ測定の標準曲線を示すグラフで
ある。 図中、１・・・・・・非標識抗原、２・・・・・・標識
抗原、３…・・・抗体、４・・…・不溶化抗体、５…・
・・抗原抗体複合体、６…・・・標識抗体を表わす。第
１図 第２図 第３図 第４図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 測定物質と、この物質に特異的に結合する物質（以
   下、結合性物質という）とを反応させた後、反応生成物
   を反応液から分離することなく、更に、結合性物質に標
   識剤を結合させた標識物質を反応させて、結合性物質−
   測定物質−標識物質複合物を形成せしめ、この複合物中
   の標識剤の活性（以下、活性値という）を測定すること
   により、測定物質を免疫化学的に測定する方法において
   、結合性物質に対する測定物質の割合が過少量から過剰
   量にわたる各割合で反応させて測定物質量と活性値との
   関係を表わす曲線が漸次上昇した後下降する型となる標
   準曲線を得、そして測定物質を含む同一被検液から、一
   方が他方に比して測定物質を多く含む少なくとも２つの
   量（以下、夫々を多量および少量という）で該測定物質
   を採取し、その各々について測定操作を行ない、こうし
   て得られた２つの活性値の大小関係を調べ、ａ 多量の
   活性値が少量の活性値より大きい場合は標準曲線の上昇
   側に各測定値をあてはめ、ｂ 多量の活性値が少量の活
   性値より小さい場合は標準曲線の下降側に各活性値をあ
   てはめ、ｃ 多量と少量の活性値が等しい場合は標準曲
   線の下降側に多量の活性値を、上昇側に少量の活性値を
   あてはめて、測定物質量を求めることを特徴とする免疫
   化学的測定方法。 ２ 多量と少量の採取を同一被検液を一方は多容量で、
   他方は少容量で採取することにより行なう特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 多量と少量の採取を同一被検液を一方は未希釈で、
   他方は未希釈して夫々同容量づつ採取することにより行
   なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 多量と少量の採取を、同一被検液を一方は濃縮して
   、他方は濃縮せずに、夫々同容量づつ採取することによ
   り行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。