JPS6079268A - 抗原抗体反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明け、抗原抗体反応の測定法に関する。

抗ｆｊａＷｒ、体反応を利用した免疫測定法（イムノア
セイ）は、近時、急速な進展をみている。この免疫ｉｉ
＋：１定法け、標識法と非ｔ１〃諏法とに大別ひノ１．
る。

標識法における標識として幻、放射ｌｌ］：同位元素を
はじめ、＃：素、螢光物質、電子スピン共鳴物ダｑ、発
光物力、金鵬、バクテリオファージ、電気化学活性物置
等があり、標識抗原又はゎ１９体のＵａｊ定には、放射
活性、吸光・螢光・発光等の光学分析に電子スピン共鳴
、ポーラログラフイー等が用いられている。

一方、非標識法にお込ては、たとえは、抗原をあら妙・
しめ結合させた不溶性粒子（２デックスなど）を用いて
凝集反応に伴う濁度の変化を光学的にとらえる方法、不
溶性粒子を使用しηい免疫比濁法、レーザーネフエロメ
トリー法勢が知られている。

どれらの免疫測定法は、いずれも抗原と抗体が反応して
生じる結合物の光を油接又は間接的に迎］定する点にお
りては軌を−にする。

ところが、このような免疫測定法においでは、ある濃度
以上に抗原が存在するいわゆる°“抗原違剰域″の場合
における測定が問題となる。

すカわち、上記非標静法の一例の楊＠（でついて説明す
る。

たとえば、不溶性和体粒子に担持させた抗体又ｄ抗掠と
、抗原又は抗体とを液体媒体中で反応さぜ、その反応の
進行に伴う反応混合物の透過率の減少（すｋわち吸光度
の増加）からその抗原抗体反応の速度を測定し、さらに
その速度から被検体中の抗原又は抗体の濃度を６１１］
定する方法が知られている。そして、この方法によれば
、抗原又は抗体の濃度を高い精度で、迅速に定量しうる
。

しかしながら、たとえば、抗体を感作した不溶性担体の
場合、抗加分子翻が抗体分子姦υに比して過剰な領域で
は、炉剰な」）（刃車が本来々らは゛粒子の凝集に寄与
しうる抗体をブロックし、てし７ます、みかけ上、抗原
抗体反応の進行が１ｌｌｑ　、！；される。いわゆる抗
涼鯛剰域と［２て知ら）する現象がみられ、このような
場合には、一つの反応速度に対応して被数の濃度が存在
−することに々る。

臨床検査においての、上記の非標識法ｒ（＋計りす、上
記抗原過剰域を程するような抗体ｑ〕出現頻度１ｌ−ｉ
ｌＪＸさく、またそういう場合にｄ、仙の１１八床知見
力）ら注意病きが添えらノするＣ〕で、予め検体を希釈
して検査に供するのが一般であった。

しかるに、自動機械の出現ｅ（より、短時間に大詔の検
体を処理するときにｄ、出現頻度（・′ｊきわめて小さ
いとけいえ、臨床的に車少なこの神の抗原過剰検体を発
見する技術が必要とさね、る。

たとえば、このようｆｒ場合に正確な測定を行なうため
には、同一検体に対して希釈訃１を俊才て、２度以上の
測定を行々う一回希釈法等をいつも行なう必要がある。

そこで本発明者らは、自動化による多数検体の迅速処理
にさらに好適々測定法を見出すべく種々検討した結果、
本発明に到達した。

す々わち、本発明の要旨ｄ、 抗原と抗体を反応させ、その反応結合物の唐。

生量又は速度を測定することにより、抗原又は抗体のｄ
央度を決定する免疫測定法にお込て、抗原又は抗体の濃
度が既知である試料を用いてイ１７らねる反応結合物の
産生肯又は速度の側建値とｇＨＨ度との対応曲線におい
て、一つの測定１ｉｌ′Ｉにねむの磯度が対応する場合
に、この対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度
を決定するＫあたり、 （１）抗原又は抗体の濃度が未知の試料を、そ力、に対
応する抗体又は１．１ｃ涼と反応させで得られる反応結
合物の産生速度の時間変化をｆｉｌｊｉ定し、産生速度
の欅太値（ＶｒｐａＸ　）が存在するか否かによシ濃度
を一義的に決定しうる濃度測定可能領域の１′１」定基
準を設定し２、（Ｉｆ）　上記極大値（Ｖｍａｘ　）が
肴在するとき、νｈ度測定可能領域に属すると判定し７
、手記対応曲線から未知試料中の抗原又ｄわ１体の７６
・度を決定する、 ことよりなる抗原抗体反応の測定方法にある。

以下、本発明を詳細にｉ％１明する。

まず本発明が適用される免疫測定法ｔ」、特に制限され
ず、上記の標識法、非似九法のいずれにも適用される。

たとえば、代表的々方法として、ラジオイムノアセイ（
ＲＩＡ）、酵素イムノアセイ、（ＫＩＡ）、ｌ光イムノ
アセイ、ラテックス凝集反応、免疫比濁法的が孕けらｆ
する。

以下１本発明の実施の態様として、冷浴イイト担体粒子
に抗体又は抗原を支持さぜ、この支持された抗体又は抗
原に、抗原又は抗体を液体媒体中で反応させて、この反
応混合物に反応面ｈｖｔ−以上の時点で光を照射し、一
定時間内におｄるその反応混合物の透通率の減少を測定
する方法（ラテックス凝集反応を含む）において適用す
る場合について説明する。

まず、この方法においてｄ、平均粒径がへ６μ程度以下
、好ましくけｏ、ｉ〜７．０μの不溶性担体粒子を用い
、これに抗体又は抗原を相持させ（感作し）、これに被
検体中の抗原又は抗体を反応させ、その反応混合物の透
過率を１通常０．３〜２．りμ、好ましくけθ、６〜／
、りμの範９１１の波長の光線で測定してその反応速度
をめることによシ、被検体中の抗原又は抗体の濃度を測
定する。

不溶性相体粒子としては、測定を行なう時に用いられる
液体媒体に実質的に不溶性で前記平均粒径を有する有装
置分子、たとえばボυスチレン、スチレン−ブタジェン
共重合体のような乳化重合によシ得られるラテックス、
あるいはアルミナ等の無機酸化物等が用いられる。

こ、のよう々不溶性担体粒子（好ましくけラテン、゛ク
ス粒子）に、測定しようとする被検体中の抗原又は抗体
と反応しうる抗体又は抗原を常法によル担持させる（感
作する）。

抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子の濃度が通常θ
、θ／重蛋％以上、好−！ｔ２〈けθ、／−／重量％程
度・の懸濁液と（２て用１．ｎｌ：）ｆする。

この感作担体を液体媒体中において、抗原又は抗体と一
定条件下で反応させ、反応開始後の一定時間後の反応混
合物の単位時間当りの透通率の減少量を測定することに
より抗原抗体反応を定量的に測定し２うる。この減少率
の測定は、反応混合物の構成成分である感作担体と被検
液中の抗原又は抗体との反尾、開始後抗原抗体反応の進
行が少なくとも安定した時点以後に行なうのが望ましｂ
ｏ このためには、感作担体と被検液とを好寸し７くは撹拌
下に混合し、好寸し、〈は混合後たとえは２〜３秒以後
の時点で、その透消率を測定するのが好適である。

このような抗原抗体反応の測定は、たとえは以下のよう
にして実施される。

まず、ある一定の平均粒径を有する不溶性担体粒子ＶＣ
ある一定の抗体又は抗原を感作して感作担体を調與する
。他方、実際に測定しようとする被検液（試料）中に含
有される抗原又は抗体と同一の抗原又は抗体を用いて、
それをね１々の既知濃度で被検液の媒体と実質的に同一
の液体媒体中に含有する種々の奴度の標準被検液を調製
する。

次に、上記感作担体と上ｎピ標準被検液とを用いて、両
者を混合させ、抗原抗体反応の進行状態が安定した段階
で、経時的に上記反応混合物の透過率を測定する。たと
えば、透過率が定量的に減少する段階において、Ｍｉｌ
記各種濃度の被検液について、その各反応混合物の透過
率の単位時間当りの減少率を測定する。

次に、との減少率を、たとえば、標準被検液中の抗原又
は抗体の濃度を＋ｔ、、軸とし、たとえば減少率を縦軸
としたグラフにプロットすると。

標準被検液中の抗原又は抗体濃度と、反応混合物の透過
率の単位時間当シの減少率（反応速度）との対応曲線が
得られる。

そこで、特定の抗原又は抗体について、予を上記のより
ん対応曲線を作成して」？き、それと同一の抗原又は抗
体を含有するｆｌｋ　１１（未知のネ１υ検液につｂて
、上記と同様の反応速度を測定し、こハを前記対応曲線
と対比することにより、被検液中に含有される抗原又は
抗体の渋川を定１イ１的に測定［２うる。

本発明は、上記の測定法にオｒ−ｔ、−＋で、濃度１Ｍ
、知の試料をｍ−て得られる反応速度と渋川−の対応曲
線にふ・いて、一つの反応速度に松抄の？１′み１方が
対応する場合に、この対応曲線から未知試料の濃度を決
定するのに有用である。

す々わち、たとえば抗原の濃度が未知の距（ネ・１の反
応速度を測定して、能度を決定するためには、 （１）予め、挑１ｊ、１に既知の試第１の４１１１定に
よって、抗ノＱ陶Ｍ〔と反応速度の対応曲線がめら）１
ていること。

（２）未知試料の反応速〃ｙとこの対応曲線力・ら、濃
度が一義的に決定しうるこｈ、 が必要であるが、（２）は、−齢的には成立しなり０十
々わち、抗原濃度の増加とともに、けじめは反応速度も
増加するが、途中力）ら反応速度の増加の度合が低下す
る領域が出現し、さらに抗原濃度が増大すると、むし、
ろ反応速度が減少する領域が現われたシ、また、減少し
た後、再度増加、減少する場合もある。

このような場合には、一つの反応速度に複数の濃度が対
応するため、未知試料の濃度が一義的に定寸ら力い。こ
のよう々覗、象がおこる抗原遍剰域においては、存在す
る抗原先−に仰合うめ【集反応、透溝率変化が期待でき
々いので、未知　゛抗原砲バＶが濃度測定可能領域にあ
るかどう〃・を、まず判定する必要かある。

めることかできる。濃度測定不能の領域であることがわ
かれば、試料を希釈して測定可能領域に々るようにして
測定することができる。

そこで、上記ラテックス凝集反応における本発明の測定
方法についてさらに隨明す乙。

まず、抗原又は抗体の礎ＩＷが未知の試料を。

それに対応する抗体又は抗原を感作し７たラテックス試
薬を反応させて得られる反応結合物の産生速度の時間変
化をｎ＋＋＋定する。ｆｒとλ附、ノ又尾。

の初期の時点（たとえは反応開始伐多３０秒イｉ、８１
ケ）妙）ら、ある一定の時間１での透ｊ７．．ｊ“・率
を／〜グθ秒程度から選はれた間隔でａｔｔｊ足し、−
次夕＋：　（Ｊ：Ｊ、　ｔ−＝てその傾きの太ささを初
期迅卿富・でｌｃ＋−Ｊる産物反応速度が好適に側足さ
ｈ　、又れｌう←、乙１１、“１点の；＋、−傍での平
均反応速度、等が測定さ：ｉｉ、　７＋　。

本発明は、この産生速度の極太佃（Ｖｍａｘ　）の存在
の有無上、未知試半」の抗原又にト抗体の碇ｔＨを一義
的に決冗しうる濃）Ｍ　ｉｌ＋ｉｌ定〒’Ｊ’　ｆｊｉ
、Ｉ・１Ｉｆ１城にｉ’ＩＱするが否かが、よく対応す
ること脅見出し７、本）へ明に到述したものである。

この極太値（Ｖｍａｘ　）が存在する巴゛び度飾、　ｌ
／］１け、ラテックスの＃度粒径、温度、測定波長、速
度の取込み間隔等によ＃）バカるが、臨床的に必要な濃
度範囲を得るために、これらの条件を適宜選定すること
ができる。

上記ＶｍａＸが存在し２．隨度１ｆｌｉ定Ｔｉ］能恥囲
内に統すると判定できるときは、上記対応曲睨から未知
試料中の抗原又は抗体の濃度を決定し７うる。

この場合、対応曲線として、抗原又は抗体の濃度が既知
の試料について作成された（１１１・大仏Ｖｍａｘとρ
度との対応曲線を用いると、さらに高濃度の範囲につい
て、濃度を決定することができる。

一方、極太値Ｖｍａｘが存在しないときは、銀度測定可
能範囲内にｒ、５シないと判定ぴ九、試イ１を希釈して
さらに＃　Ｗ　ｎ＋１＋定に供することができる。

本発明は、上記の免疫６１１］定法にかさらず、抗加箭
剰域が問題となる他の免疫ｉｌす定法にも適用しうる。

こわらの場合においで、１４ヨ生速度な」、そｔぞれの
迎１定法で常用される１１７！！Ｉ坤量より、ｉ口接又
は間接的に得ることができ、Ｉ！＋＜太イｌｌζＶｎｌ
ａＸの存在の有無を知ることができる。

本発明に係る抗原抗体反応の測定方法は、上記のように
短時間に大量の検体を０８胛するＪＩ＋４合に特に有用
である。

以下、本発明を実施例によりさらに訂しくｉ（７明する
。

実施例／ ＣＡＦＰ　（α−フェトプロティン）のｉ１１］定Ｊ測
定条件（ラテックス凝集反応） （イ）　ラテックス（ＬＴＸ）：　粒径　θ１．２Ｙｌ
！ｍ確度　７％ ＡＦＰ感作 ←）　測定系　標準物質（Ｓｔｄ、　）　！θμを希釈
安定化液及びバッファー　オｏθ／ｉｔ感作ラテックス
　２θ１１１ 波　長　θ、９りμｍ （ハ）速度の測定 初期時点として反応開始後？　４ｆｈ　ｆ＞＞４ひ、ざ
秒１１」Ｊ隔で透通率をａ＋：＋定し、こノ１．１、す
椋人値Ｖｍａ、Ｘのイｊ無をしらべた。

結果は図／〜２に示した。約り０θθｇ／□、ｅの濃度
まではＶｍ、ａＸが得らｈた（し１乙）。

す々わちり、θθθ＋ｖ　／　ｍｌの濃度までは濃度測
定可能領域と判定される。

実施例コ ラテックスの粒径を０．−２りｌｔｍ、濃度を０．２３
チとした以外は実施例／と同様にして、０ＲＰ（Ｃ反応
性蛋白）Ｋ′）ＩＡで、極大値Ｖｍａｘの有無をしらべ
たところ！、θθθｎｇ　／　ｒｎｌまでＶｍａｘが得
られた。

【図面の簡単な説明】

図／〜７はＡＦＰＶｃついて、透過Ｎ５（Ｔ）１反応結
合物の産生速度（Ｖ）と時間との関係を示す図である。 出　願　人　三菱化成工業株式会社 代　理　人　弁理士　長谷用　〜 は７）１７名 図　１ ｔｉｍｅ　（ｍｊｎ、） 図　３ ＩＺ、Ｊ ｆ／ｉｙｙｅ（ｍｉｔｙ、） ｔｉｍｅとｍｉｎ　） ・Ｊ匙　彰°１−ン山　Ｊ、ＬＩＥ　’ｔＥ；Ｅ’　（
）ｊ　ｊ（）１１（（和５）９イ１２月％＃−１１ １小イ′１の表示 ／Ｉ　＞ｊ ２　発明の名称 抗原抗体反応の１ｌｉｌｌ定方ｄ、 ３３　補正をりる者 事件どの関係　特ｉ’ｌ出願人 （！＋９６）三谷化成［−業株式会ン１４代理人　〒１
０ｆ） 東京都千代１．１１区丸の内二丁１」：〕番２号三菱化
成二１業株式会社内 （はか１名） ５　補正命令のロイｑ　昭和５９　ｆ４１１−ｊ　３１
　Ｅｌ　（光ｉ；！１ｌＪ）６　補正の対象 願用、明ｌ１ｌｌ　ｉ、！；お上ひ図面７　補正の内容

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原と抗体を反応させ、その反応結合物の産生偏
   −又は速度を測定することによジ、抗原又は抗体の濃度
   を決定する免役測定法において、 抗原又は抗体のＩＩＡ度が既知である試料を用いて得ら
   れる反応結合物の産生魚又は速度の測定値と濃度どの対
   応曲線において、一つの測定飴に複数の濃度が対応する
   」ム合に、この対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体
   の濃度を決定する妊あたシ、 （１）抗原又は抗体の濃度が未知の試料を、それに対応
   する抗体又は抗原と反応させて得られる反応結合物の産
   生速度の時間変化を測定し、産生速度の極太値（Ｖ＋ｎ
   ａｘ　）が存在するか否かにより濃度を一義的に決定し
   うる濃度測定可能領域の判定基準を設定し、（ト）上記
   極大値（Ｖｒｎａｘ　）が存在するとき、ｇ度８１ＩＪ
   定可能領域に属すると判定し、。 上舵対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度を決
   定する、 ことよりなる抗原抗体反応の！Ｉｆ！ｌ定方法。