JPS5822445B2 - 安定な固体の人血漿コリンエステラ−ゼ製剤の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人血漿あるいはこれに由来するコリンエステラ
ーゼ含有画分から得られるコリンエステラーゼ水溶液か
ら安定な固体のコリンエステラーゼ製剤を製造する方法
に係わる。

コリンエステラーゼ（以下ＣｈＥ と記す）は人血漿中
に微量存在する酵素であり、外科手術時頻用される筋弛
緩剤塩化サクシニールコリンによる無呼吸状態の発現に
対しその投与が有効である３、（第２４回［１本輸血学
会発表） また有機燐中毒の際生体のＣｈＥは不活性化されること
がらＣｈＥ製剤を投与することにより中毒症の治療にも
有効なことが考えられる。

一般に人血漿コリンエステラーゼの水溶液は安定性に乏
しく、その製剤は凍結乾燥により固体として提供される
のが好ましい。

しかし、凍結乾燥時ならびにその後の固体においても活
性の低下が認められる。

本発明の目的は、コリンエステラーゼの安定化、特にそ
の凍結乾燥時ならびに固化製剤の安定化にある。

本発明により、人血漿コリンエステラーゼ水溶液にコリ
ンエステラーゼを含む蛋白質の１重量部に対し、安定剤
としての中性アミノ酸、単糖類、三糖類、糖アルコール
類またはそれらの混合物を０．４−９重量部添加し、次
いで凍結乾燥することからなる安定な固体コリンエステ
ラーゼ製剤の製法が提供される。

従来人血漿からＣｈ、Ｅ を製法するには各種の方法が
報告されており、エタノール分画法〔ジャーナルーオブ
・ジアメリカンケミカル・ソサイエテイ（Ｊ、 Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ −） ７０．６０４９、（１９
５４）、ＤＥＡＥ セルロースクロマトグラフィー法
〔カナディアン・ジャーナル・オブーバイオケミカル・
フイジオロジー（Ｃａｎ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ 、） ３９．１
０１３、（１９６１））、硫安分画および電気泳動法の
組合せ（Ｂｉｏｃｈｉｍ−Ｂ １ｏｐｈｙｓ 、 Ａｃ
ｔａ 、） ６７ 。

４４１、（１９６３））、リバノール分画、硫安分画、
アルミニウム・ハイドロオキザイドゲルによる吸着、ゾ
ーン電気泳動およびゲルろ過の組合せによる方法〔プリ
ュー１□ （Ｂｌｕｔ ） １．４．６５．１、９６６
） ）、ＤＥＡＥ −セルロースクロマトグラフィ
ー、電気泳動（エレクトロフォーカシングおよびゲルろ
過による方法〔バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃ
ｈｍ、Ｊ ） １１６．８７５、（１９７０）、：ｌ
などが主なものである。

更に工業的に大量製造に有利な方法としては、本発明者
等の発明になる特開昭５４−９８３０６号（被分割出願
）の方法がある。

この方法は、人の血漿またはコリンエステラーゼを含む
人の血漿蛋白画分を、 ＠）その蛋白濃度０．５−５％（ｗ／■）において含む
水性媒質にｐＨ３−７においてポリエチレングリコール
を加えポリエチレングリコールの濃度を３−５％（ｗ／
ｖ ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得、上清に
ポリエチレングリコールを加えポリエチレングリコール
の濃度を５％より犬で２５％（ｗ／ｖ）までとし、生ず
る沈澱を集める工程、 （ロ）イオン強度０．０５以下の低塩濃度、そしてｐＨ
４−６において陰イオン交換体に接触させコリンエステ
ラーゼを吸着させ、次いでイオン強度０．０５−０．５
のｐＨ４−１０の塩溶液で溶離する工程、および （・う その蛋白濃度０．０１−５％（ｗ／ｖ）におい
て含む水性媒質よりｐＨ４−１０において硫安の３０−
４０％飽和量および芒硝３−１０％（ｗ／ｖ）濃度量の
添加により生ずる沈澱を除去し、次いで上清より硫安の
３０−６０％飽和量および芒硝１０−２０％Ｃｗ／ｖ）
濃度量の添加により生ずる沈澱画分を集める工程 上記（イＸ口）および（／υの工程を任意の順序におい
て含むことよりなる。

この方法に用いられる原料としては人血漿そのものおよ
びコリンエステラーゼを含むその各種蛋白分画、特にα
−およびβ＝ニブロブ９フ分を用いることが好ましい。

α−およびβ−グロブリン画分は人の血漿よりフィブリ
ノーゲン、γ−グロブリン、アルブミンなど生物学的薬
剤を製造する際、一般に用いられる血漿蛋白分画法にお
ける副産物であることは本方法の工業的意義を高くする
。

このα−およびβ−グロブリン画分は例えば周知のコー
ンの低温アルコール分画法の画分■又は■−４〔ジャー
ナル・オブ・ジアメリカンケミカルソサイエテイ（Ｊ、
Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、６８．４５９（１９４６
））に相当する。

人柚漿あるいはコリンエステラーゼを含む血漿蛋白画分
例えばα−およびβ−グロブリン画分を蛋白濃度０．５
−５％好ましくは２−３％に懸濁しｐＨを３〜７、好ま
しくは４〜６に調整する。

これにポリエチレングリコールを３−５ｗ／ｖ％となる
ように加え生じた沈澱を遠心分離機を用℃・て分離除去
し、得られた上清にさらにポリエチレングリコールを終
濃度５−２０ ｗ／ ｖとなるように加え沈澱する画分
を分取する。

この沈澱は非常に上清と分離し易く一般に用いられる分
画法の場合に必要な遠心分離機による分離やろ紙あるい
はろ過剤を用いての分離の必要はなく単に容器を傾斜さ
せ上清を除去できる点で簡便であり大量製造において有
利である。

得られる沈澱を純水に溶解しｐＨ４−６に調整し、同じ
ｐＨを示すイオン強度０．０５以下の低イオン強度の緩
衝液例えば酢酸緩衝液で平衡とした陰イオン交換体例え
ばＤＥＡＥ −セファデックスＤＥＡＥ −セルロ
ースまたはＴＥＡＥ −セルロースと接触させる。

ＣｈＥ を吸着した陰イオン交換体は要すれば前記低イ
オン強度の緩衝液の少量で洗浄し次いでイオン強度０．
０５−０．５、ｐＨ４−１０の緩衝液で溶離処理し溶離
液を得る。

この工程で大部分の不純物、血圧降下作用物質およびＨ
ＢｓＡｇが除去される他、陰イオン交換処理前に比して
著しくその液量が少なくなるので大量処理が非常に容易
となる。

得られた溶離液をｐＨ４−１０に調整し硫安の３０−４
０％飽和に相当する量および芒硝３−１０ ｗ／ ｖ％
に相当する量を加えて沈澱する両分を除去する。

さらにその上清に硫安３０−６０％飽和相当量芒硝１０
−２０ｗ／ｖ％相当量を添加し沈澱する両分を得る。

この工程で溶離液中に残存している不純物の大部分およ
び血圧降下作用物質が除かれるとともにＣｈＥの濃縮が
行える。

本方法における諸工程の組み合せは、上記のようにポリ
エチレングリコール分画（イ）−イオン交換クロマトグ
ラフィー（ロ）−硫安芒硝併用Ｃ→の順序による分画が
最も望ましいが、都合によりいかなる組み合せも適用で
きる。

例えばイオン交換クロマトグラフィー−ポリエチレング
リコール分画−硫安芒硝併用による分画あるいは、硫安
芒硝分画−イオン交換クロマトグラフィー−ポリエチレ
ングリコール分画等である。

上記（イ）、（ロ）Ｃつの工程の順序が好ましいのは、
ポリエチレングリコールはイオン強度に影響を与えない
ので、続いて行うイオン交換法の工程を行う場合でも一
般に用いられる分画法例えば硫安分画あるいは芒硝分画
の場合に必要な脱塩操作が不要となることである。

この様にして得られた沈澱を適当な溶媒好ましくは生理
学的に受入れられる水性溶媒、例えば生理食塩水の適量
に溶解し同じ溶媒で透析し硫安および芒硝を除去する。

得られたＣｈＥ水溶液は生理学的に受入れられる製剤で
ある。

本発明の安定化方法は上記すべての方法により得られる
コリンエステラーゼ水溶液より固体製剤を製造する際に
適用される。

本発明に用いられる安定化剤としては、グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの中性アミ
ノ酸（モノアミノモノカルボン酸）グルコース、マンノ
ース、カラクトース、果糖すどの単糖類、シロ類、麦芽
糖、乳糖などの］Ｕ糖類およびマンニット、キシリット
などの糖アルコール類が有効である。

安定化剤の添加量は、ＣｈＥを含む蛋白質の１重量部に
対して０．４〜９重量部を含有させることで十分であり
、さらに既知賦形剤をＯ〜０．５重量部含有させてもよ
い。

これらの添加物は相当する量を適当な水溶液に浴解し混
合する。

なお添加する安定化剤を２種以ｌｘ混合して使用する場
合においても添加量は総量として上記幅であればよい。

凍結乾燥時の濃度として規定すると、安定化剤は、０，
５％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの水溶液として処理する。

水溶液のｐＨは６０〜９．０特に好ましくはｐＨ７〜８
に調整し、必要あれば除菌と過を行った後、包装単位に
従い１００〜１０００単位のＣｈＥを含むように分注す
る。

この分注液は急速に凍結乾燥し、凍結乾燥粉末製剤とす
る。

この得られたＣｈＥ を主成分とする凍結乾燥製剤の組
成は少なくともＣｈＥを含む蛋白質の１重量部に対して
０．４〜９重量部の安定化剤、必要に応じ０．５重量部
までの賦形剤を含有するものである。

本発明製剤の使用に際しては、注射用蒸溜水によってＣ
ｈＥの約１〜１０％ｗ／ｖ溶液に調整し、静脈内に投与
する。

投与量は、必要に応じて適時選択できるものであり、一
般的には包装単位に従って使用できる。

本発明を参考例及び実施例によって詳細に説明するが、
これらは本発明を何んら限定するものではない。

実施例中のＣｈＥの活性はへストリンらの方法に従って
測定し１単位ば３７°Ｃ１時間で１ミリモルのアセチル
コリンを分解する酵素量である。

〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ ） １８０．２４９（
１９４，９） ） 急性毒性はマウスおよびラットに静脈内注射した場合の
しＤ５ｏより求め血圧降下作用物質の測定は放火を用い
薬液投与前の平均動脈圧に対する降下車によって行った
。

ＨＢｓＡｇの測定はＫＫミドリ十十字製試薬アンティジ
ブセル商品名）を用いたＲＰＨＡ 法（逆受身赤血球凝
集反応法）により行った。

参考例 １ 人血漿よりコーンの低温エタノール分画法で得た画分■
３０ｋｇに水２５０１を加え懸濁した。

この懸濁液をＩＮ−塩酸でｐＨ６とした後ポリエチレン
グリコール＃４０００を４ｗ／ｖ％となるように加え１
時間かきませ２時間静置後シャープレス遠心分離機を用
いて沈澱を分離除去し、得られた上清にさらにポリエチ
レングリコール＃４０００を終濃度１０ ｗ／ ｖ％に
加えて１時間かきまぜ３時間静置した。

容器を傾斜させて上清を除去し沈澱を分取した。

この沈澱を水２５１で溶解しＩＮ−酢酸でｐＨ４，３に
しだ後あらかじめｐＨ４，３，０，０１Ｍ＝酢酸緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ −セファデックスＡ−５０（
乾燥重量１５０ ｆｔ＞を加えて３０分間かきまぜＣｈ
Ｅ を吸着させた。

ＣｈＥを吸着した上記ＤＥＡＥ −セファテックスＡ
＝５０をｐＨ４，３，０，０１Ｍ酢酸緩衝液３１で洗っ
た後ｐＨ６，０，０，２Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ−酢酸
緩衝液でＣｈＥを溶離した。

溶離液をＩＮ＝ＮａＯＨでｐＨ，７，０にした後硫安３
５％飽和量および芒硝５ｗ／ｖ％加えて生じた沈澱を遠
心分離機によって分離除去した。

得られた上清はさらに終濃度として硫安５０％飽和量お
よび芒硝１５ｗ／ｖ％量加えて生じた沈澱を遠心分離機
によって分取した。

得られた沈澱を生理食塩水２００ｍ１に溶解後生即食塩
水に対し透析を行った。

透析後０．２μのミリポアフィルタ−でろ過しＣｈＥ水
溶液を得た。

この場合のＣｈＥ の回収率は画分■から７０％で比活
性は３２単位／〃夕であった。

この比活性は人血漿中のＣｈＥ のそれの約１１２００
倍に相当する。

得られたＣｈＥ水溶液の性状を表１に示す。

血圧降下率は画分■では３２％であったが本発明の方法
により得られたＣｈＥ水溶液では１．２％にまで血圧降
下作用物質は除かれた。

またＨＢｓＡｇも陰性であった。

参考例 ２ 人血漿１０１に水１０１を加えた後ＩＮ−塩酸でｐＨ７
，０とした。

これにポリエチレングリコール＃４０００を４ｗ／ｖ％
加え１時間かきまぜ２時間静置後遠心機を用いて沈澱を
除去し、得られた上清にさらにポリエチレングリコール
＃４０００を終濃度６ｗ／ｖ％加えて１時間かきまぜ３
時間静置した。

容器を傾斜させて上清を除去し沈澱を分取した。

この沈澱を水で溶解してＩＮ−酢酸でｐＨ４，３にした
後、あらかじめｐＨ４，３，０，００５Ｍ−酢酸緩衝液
で平衡化したＴＥＡＥ −セルロース（乾燥重量７０
２）を加え３０分間かきまぜＣｈＥを吸着させた。

ＣｈＥを吸着した上記Ｔ ＥＡＥ −セルロースをｐ
Ｈ４，３、Ｃ１００５Ｍ酢酸緩衝液１１で洗った後ｐＨ
６，０，０，１５Ｍ−食塩を含む０．００５Ｍ酢酸緩衝
液でＣｈＥを溶離した。

溶離液をｌＮ−ＮａＯＨでｐＨ７，４にした後硫安３５
％飽和量および芒硝７ｗ／ｖ％加えて生じた沈澱を遠心
分離機によって除去した。

得られた上清に終濃度として硫安５０％飽和量および芒
硝］ ３ｗ／ｖ％量に加えて生じた沈澱を遠心分離機に
よって分取した。

得られた沈澱を生理食塩水３ｍｌに溶解後生即食塩水に
対して透析した。

透析後０．２μの、５１Ｊポアフイルターでろ過しＣｈ
Ｅ水溶液を得た。

この場合のＣｈＥＯ人血漿からの回収率は６５％で比活
性は３０単位／ｍ９であった。

この比活性は人血漿の約１．０５００倍である。

得られた水溶液の性状を表２に示す。

参考例 ３ 従来法（前述）の追試によってもコリンエステラーゼが
製造される。

出発物は血漿を使用し回収率は血漿からの値で示した。

結果は表３に示される。

実施例 ＣｈＥは比較的安定な酵素であるが、液状で長期の保存
では徐々に失活してゆく。

そこで参考例１で得たＣｈＥ水溶液を凍結乾燥したもの
および各種安定化剤を添加し凍結乾燥したものについて
保存安定性を見た。

安定化剤は、中性アミノ酸としてグリシンおよびアラニ
ンを、糖類としてグルコース、ショ糖、マンニットをそ
れぞれ表４に示す割合に添加して、凍結乾燥直後４℃お
よび室温で６ケ月間保存した後ＣｈＥ活性を測定し安定
剤を添加しない凍結乾燥前の値との比を％で示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 人血漿コリンエステラーゼ水溶液にコリンエステラ
   ーゼを含む蛋白質の１重量部に対し、安定剤としての中
   性アミノ酸、単糖類、三糖類、糖アルコール類またはそ
   れらの混合物を０．４−９重量部添加し、次いで凍結乾
   燥することからなる安定な固体コリンエステラーゼ製剤
   の製法。 ２ 中性アミノ酸かグリセリン、アラニン、バリン、ロ
   イシンまたはイソロイシンである特許請求の範囲の項第
   １項記載の方法。 ３ 単糖類がグルコース、マンノース、カラクト−スま
   たは果糖である特許請求の範囲の項第１項記載の方法６
   ． ４ 三糖類が、ショ糖、麦芽糖または乳糖である特許請
   求の範囲の項第１項記載の方法。 ５ 糖アルコール類がマンニットまたはキシリットであ
   る特許請求の範囲の項第１項記載の方法。 ６ 人血漿コリンエステラーゼ水溶液が、人の抑漿また
   はコリンエステラーゼを含む人の血漿蛋白両分を、 （イ）その蛋白質濃度０．５−５％（ｗ／ｖ）において
   含む水性媒質にｐＨ３−７においてポリエチレングリコ
   ールを加えポリエチレングリコールの濃度を３−５％（
   ｗ／ｖ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得、上清に
   ポリエチレングリコールな加え、ポリエチレングリコー
   ルの濃度を５％より大で２５％（ｗ／ｖ）までとし、生
   ずる沈澱を集める工程、 （ロ）イオン強度０．０５以下の低塩濃度、そしてｐＨ
   ４−６において陰イオン交換体に接触させコリンエステ
   ラーゼを吸着させ、次いでイオン強度０．０５−（１５
   のｐＨ４−１０の塩溶液で溶離する工程、および （・→ その蛋白濃度０．０１−５％（ｗ／ｖ）の水性
   媒質よりｐＨ４−１０において硫安の３０−４０％飽和
   量および芒硝３−１０％（ｗ／ｖ）濃度量の添加により
   生ずる沈澱を除去し、次いで上清より硫安の３０−６０
   ％飽和量および芒硝１０−２０％（ｗ／ｖ）濃度量の添
   加により生ずる沈澱画分を集める工程 十言αイ廁）およびｅｉの工程を任意の順序において含
   むことにより製造されたものである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。