JPS6089433A - 制癌作用物質複合体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、新規制癌作用物質複合体の製造方法及び制癌
作用物質複合体の安定化方法に関する。

〔従来技術〕

今日、多数の制癌作用物質が制癌剤として開発され、臨
床応用されているが、これらはいずれも癌細胞に対し非
特異的であって、正雷細胞に対しても毒性を有するため
、制癌剤単独による治療効果はあまり得られていない。

このことから、制癌作用物質を癌細胞に親和性を有する
物質と結合さ・せて複合体とし、この複合体を特異的に
癌細胞に到達させて制癌作用を発揮させようとする治療
法のアイデアが生まれた。この１つとして、Ｅ、Ｈｕｒ
ｗｉら（Ｅｕｒｏｐ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、Ｖｏｌ、１４，１２１３　１２２０
．１９７８年）により層表面抗原に対する抗体にデキス
トランを介し、制癌作用を有するアドリアマイシン、ダ
ウノマイシン等を結合させた複合体が開発された。この
複合体の製法は、アルドヘキソピラノース環の開裂した
デキストランのアルデヒド基に抗体のアミノ基と制癌作
用物質のアミノ基とを結合させると言うものである。と
ころが、酸化デキストランのアルデヒド基は非特異的に
結合容易な抗体のアミノ基と結合するため、デキストラ
ン１モル当たり６〜１００モルの抗体が結合した複合体
が調製される。この複合体は分子量が１００万〜７００
万の巨大分子で、長期保存時における安定性の低下、及
び抗体価の低下さらには制癌作用の低下などが認められ
、効果的な薬理作用かえられていない。

〔本発明の開示〕

かかる実情下、本発明者らは、より安定で癌細胞に対し
てより特異的に作用する制癌剤、即ち抗体−デキストラ
ン−制癌作用物質複合体の鋼製研究を行って来たところ
、従来の複合体中の未反応アルデヒド基をマスキングし
ておけば複合体の安定化が図られること、抗体価の低下
が抑制されること、当該複合体がより特異的に癌細胞に
作用することを見出して本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、アルドヘキソピラノース環の開裂したデ
スキトラン（以下、開裂デキストランという）のアルデ
ヒド基に、 ■アルデヒド基と反応性の制癌性物質を反応させる工程
（工程Ａ） ■当該アルデヒド基をマスキングする工程（工程Ｂ） ■当該アルデヒド基に癌表面抗原に対する抗体（以下、
単に抗体という）を結合させる工程（工程Ｃ） をほどこしてなる制癌作用物質複合体の製造方法及び開
裂デキストランを介して、制癌作用物質及び抗体を結合
させた複合体において、開裂デキストランのアルデヒド
基をマスキングすることによる当該複合体の安定性、抗
体価及び制癌作用の向上方法に関する。

本発明に用いる抗体は、医薬として精製されたものであ
れば、抗原を動物に免疫して得られる動物由来特異抗体
、遺伝子工学又は細胞融合法によって得られるモノクロ
ーナル抗体などいずれのものでもよい。

デキストランは、医薬用として使用しうるものであれば
特に限定されるものでなく、好適には分子１１０００〜
２００万の範囲のものが用いられる。

制癌作用物質は、アルデヒド基と反応性の基（例えばア
ミノ基、水酸基）を有するものであればよく、また、か
かる反応性の基を有しないものについても、当該制癌作
用物質に適当な化合物を反応させてアルデヒド基と反応
性のものに導くことによって本発明に使用しう、る。好
適な制癌作用物質としてはたとえば、ダウノマイシン、
マイトマイシンＣ、アドリアマイシンなどがあげられる
。

アルデヒド基のマスキングは、アルデヒド基を不活化す
るもの、特に抗体に対して不活化するものであればよい
。

マスキングとしては、例えば水素化ホウ素金属塩、水素
化ホウ素シアン金属塩などの還元剤による処理、アルコ
ール類によるアセクールの生成、アミン化合物（特にア
ミノ酸）による処理が例示される。

アミノ酸としては、たとえば次の如きものが例示される
。

中性アミノ酸； 脂肪族アミノ酸〔グリシン、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシンなど〕、オキシアミノ酸〔セリン、ス
レオニンなど〕、含硫アミノ酸〔システィン、シスチン
、メチオニンなど〕、芳香族アミノ酸〔フェニルアラニ
ン、チロシン、トリ１１〜フアンなど〕 酸性アミノ酸： アスパラギン酸、グルタミン酸など 塩基性アミノ酸： ヒスチジン、リシン、アルギニンなど イミノ酸残基ニ グリシン、オキシプロリンなど α−アミノ酸以外のアミノ酸： β−アラニンなど 本発明は、開裂デキストラン、即ち式 （） （ただし、分子量１０００〜２００万のもの力＜桑子ま
しい）のアルデヒド基に、アルデヒド基と反応性の制癌
作用物質を結合させること、当該デキストランのアルデ
ヒド基のマスキングすること、及び抗体を結合させるこ
とを経て製造される力（、桑子通には上記の順序にて処
理される。

上記開裂デキストランは公知であり、その製法は、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１８．２
１２８　（１９７６年）などに開示がある。

本発明の製造法によって得られる複合体における各成分
の構成の比は、好ましくむよ抗体１分子Ｇこ対して、デ
キストラン５〜３０分子、制癌作用物質２０〜７０分子
であり、残余のアルデヒド基番よ可及的多数が不活化さ
れていることが好ましく、通當少な（とも８０％のアル
デヒド基がマスキングされていることが好適である。

本発明の製造法の一例の概略は次の通りである。

デキストランのアルドヘキソピラノース環の開裂は、通
常酸化によって行われる。酸化剤としては、過ヨウ酸ナ
トリウムを用いることが好ましら）。たとえば、デキス
トラン５００■に対して、約１００〜７００■の酸化剤
を添加し５〜２４時間反応を行う。反応の終了後、たと
えば反応液を蒸溜水に対し１０〜３０時間透析し、好ま
しくむま凍結乾燥を行って酸化（開裂）デキストランを
得る。

開裂デキストランと制癌作用物質との反応Ｇこト祭して
、開裂デキストラン１分子に対して制癌作用物質２〜Ｉ
Ｏを結合させることが好ましく、力Ａ力する比とするた
めには、たとえば、ｐＨ６〜９Ｇこおし）で水性溶媒（
好ましくは、リン酸緩衝液）中Ｇこ、開裂デキストラン
を最終濃度約ｌθ〜３０Ｗ／Ｖ％、制癌作用物質を最終
濃度約０．５〜５Ｗ／Ｖ％加えて、５〜１５時間程度反
応させることが好適である。かくしてデスキトラン−制
癌作用物質が得られる。未反応の制癌作用物質は、たと
えばトヨバールＨＷ４０などによる吸着クロマトグラフ
ィー、その他自体既知の手段にて除去される。

かくして得られた複合体中のアルデヒド基をマスキング
するに際しては、当該複合体中の遊離のアルデヒド基の
約８５〜９５％がマスキングされるに十分な条件を選択
すればよい。

例えば、還元処理は１〜１０モルの還元剤によって０〜
１０℃で１５〜２０時間処理することが好ましい。また
、α−アミノ酸を用いる場合は、反応時間は通常１２〜
３０時間であり、ｐｔｌは５〜８程度であることが好ま
しい。

かくして、制癌作用物質−マスキングデキストラン複合
体が得られる。

当該複合体に抗体を結合させるに際しては、当該複合体
５〜３０Ｗ／Ｖ％を含有する反応液に、抗体を最終濃度
が、例えば０．１〜３Ｗ／Ｖ％になるように添加し、冷
所で１２〜４０時間反応させる。

このようにして得られた本発明に関する複合体は、ゲル
濾過イオン交換樹脂、抗原−セファロースなどにアプラ
イして精製することができる。

かくして得られた複合体ＩＪ、例えば除菌濾過を行った
後、分注し、凍結乾燥して乾燥製剤とされる。

本発明は、従来の複合体が開裂デキストランのアルデヒ
ド基に多数の抗体が結合して巨大分子化してしまうとい
う欠点を、当該アルデヒド基をマスキングすることによ
り、防がんとするものである。

即ち、従来の複合体では、分子量は１００万〜７００万
であるのに対して、本発明に関する複合体では、１５万
〜２５万の分子量をもち、抗体１分子に５〜３０分子の
デキストランと多数（２０〜７０分子）の制癌作用物質
が結合したものである。この複合体は、以下に述べるよ
うに巨大分子化したものに比べ、安定性、性状さらには
癌細胞の増殖抑制作用において優れている。

液状保存安定性に関して、巨大分子化した従来の複合体
では、冷所保存においても、１ケ月目で沈澱が認められ
、抗体活性の低下が認められる。

また、凍結乾燥処理により不溶物が生じやすい。

しかし、本発明で得られた複合体では液状保存１ヶ月目
でも沈澱は認められず、凍結乾燥後の保存安定性につい
ても、抗体活性の低下は認められない。

抗体活性について、本発明で得られた複合体と従来の複
合体とを比較すると、従来の巨大分子化した複合体では
、抗体の４０〜６０％の活性を示すに過ぎないのに対し
て、本発明で得られた複合体では、はぼ１００％と抗体
活性がそこなわれずに発現している。これは、巨大分子
化した複合体では、デキストランに複数の抗体が結合し
ているために、立体障害等により、充分な活性の発現が
抑えられてしまうことによると思われる。

電気泳動位置に関しては、γ位にハンドの認められる抗
体に対して、巨大分子化した複合体ではβ位にバンドが
認められ、また、本発明で得られた複合体では、その中
間にバンドが認められる。

デキストラン−制癌作用物質の結合により、荷電が変化
しているのがわかるが、本発明で得られた複合体では、
より元の抗体に近似した性質を持つことがわかる。

α−フェトプロティン産生肝芽腫培養株を用いたｉｎ　
ｖｉｔｒｏ実験では、第１図のように、細胞数からめた
細胞増殖抑制効果は、従来の複合体より、本発明で得ら
れた複合体の方が、より優れているという結果が得られ
ている。

以上のように、従来の巨大分子化した複合体に比べて本
発明で得られた複合体は、デキストランを介して抗体１
分子に多数の制癌作用物質力ｊ結合可能であり、安定性
、抗体活性に優れ、抗体本来の性質に近いものであって
、このものの標的細胞への到達しやすさや膜透過性の良
さ等の有利な面があげられる。また、凍結乾燥製剤とし
ての安定性も認められている。

本発明で得られた複合体の臨床使用における投与量およ
び投与方法は、１０〜３００ｍｇの本品を日本薬局方注
射用蒸留水０．５〜５ｍｌに溶解し、年齢、症状および
経過に応じて、適宜加減して静脈内注射、点滴静注、点
滴注射して用いる。

実験例１ 後記実施例で得られた複合体及び比較として、従来の抗
α−フェトプロティン−ウマ抗体−デキストラン−ダウ
ノマイシン複合体（分子量２５×１０’ｉ）を、４℃に
て保存したところ、従来品は１ケ月で沈澱が認められる
のに対して、本発明で得られた複合体は、１ケ月を経て
も沈澱は認められなかった。また、両者の抗体活性をＲ
ＰＨＡ法にて測定したところ、従来品は４０〜６０％の
活性の低下が認められたのに対して、実施例１の複合体
は、１ケ月後においても活性の低下は全く認められなか
った。

さらに、両複合体を凍結乾燥したところ、従来品は不溶
物が生じたのに対して、実施例１の複合体は不溶物が生
ぜず、また、その活性の低下は認められなかった。

実験例２ 実施例１で得られた複合体、及び実験例１で用いた従来
の複合体のα−フェトプロティン産生肝芽腫細胞１．　
ＯＸ　１０５個／ｍｌに対する増殖抑制作用の比較実験
を行った。その結果は第１図に示す通りである。

なお、培地はＲＰＭ１６４０　（日水製薬社脛）を用い
た。

実施例１ デキストランＴ−１０，１００ｍｇを０．０１５Ｍの過
ヨウ素酸ナトリウム２０　ｍ　ｌに溶解後、遮光して室
温８時間処理後、４℃で１晩、蒸留水に対して充分に透
析した。その後、凍結乾燥して、乾燥酸化デキストラン
ｌｏＯ＋ｎｇを得た。

この乾燥酸化デキストラン１００ｍｇを食塩加リン酸緩
衝液、ｐＨ９，０，０，５ｍｌに熔解後、同量の同波で
熔解したダウノマイシン１０ｍｇを混合して室温で１時
間反応させた。続いて、反応液をトヨパール樹脂をつめ
たカラムに通して、遊離のダウノマイシンを除去し、通
過液にグリシン５０ｍｇを添加後、４℃で２４時間反応
させた。つぎに、これに肝細胞性肝癌の表面抗原に対す
る抗体の一種である抗ヒト・アルファフェトプロティン
ウマ抗体を１２．５〜２０ｍｇ添加後、４℃で２４時間
反応させ、反応液をセファデックスＧ２００のゲル濾過
カラムにかけ、本発明の複合体の画分を得たく第２図）
。さらに、これに安定剤を添加して、凍結乾燥剤を得た
。

得られた複合体の性状は、ダウノマイシン／抗体モル比
４０〜５０、デキストラン／抗体モル比１２、残存抗体
活性、はぼ１００％、分子量２５万、電気泳動位置β２
〜γ位というものであった実施例２ デキストランＴ−４０，１ｇを０．０３Ｍの過ヨウ素酸
ナトリウム１００ｎ＋１に溶解後、遮光して、室温８時
間処理後、４℃で１晩蒸溜水に対して透析した。その後
、凍結乾燥して乾燥酸化デキストランを得た。

この乾燥酸化デキストラン５０ｍｇを生理的食塩液０．
５＋Ｉｌｌに溶解後、同量の同波で溶解したアドリアマ
イシン５ｍｇを混合して、室温で１時間反応させた。反
応液を樹脂を用いてノ＼・フチ法で処理し、処理後液に
リジン２０ｍｇを添加後、４℃で２４時間反応させた。

つぎに、これにヒトメラノーマに対するモノクローナル
抗体（マウス由来）を２ｍｇ添加後、４℃で４００時間
反応せ、反応液をセファクリル５３００のゲル濾過によ
り、本発明の複合体の両分をプールし、安定剤を添加し
て凍結乾燥製剤を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１の複合体及び従来複合体（巨大分子
化した抗α−フエ１〜プロティン・ウマ抗体−デキスト
ラン−ダウノマイシン複合体）のα−フェトプロティン
産生肝芽腫細胞に対する増殖抑制作用の比較を示すグラ
フであり、第２図は、本発明複合体と未反応デキストラ
ン−グリシン−ダウンマイシン複合体との分離を示す図
である。 ■・・・本発明複合体（実施例１） ２・・・従来の複合体　３・・・対照 ４・・・未反応のデキストラン複合体 第１図 １０　２０　３０　４０　５０ ：Ｉ１８　を　呼量 第２図 今Ｉｉｌ＃ｏ。 昭和５９年３月１５日 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１９８１３１号 ２、発明の名称 制癌作用物質複合体の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人　■５４１ 住　所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライ
フ平野町４０６号 電話（０６）　２２７−１１５６ ６、補正の対象 明細書の１特許請求の範囲」の欄、 「発明の詳細な説明」の欄、および 「図面の簡単な説明」の面 ７、補正の内容 （１）明細書の１特許請求の範囲」を別紙のとおりに訂
正する。 （２）同書第２頁、第１５行のｒＨｕｒｗｉＪを［）１
ｕｒｗｉｔｚＪに訂正する。 （３）同書第２頁、第１７行の「癌表面抗原Ｊを１癌抗
原」に訂正する。 （４）同書第２頁、第１８行〜第１９行の「アドリアマ
イシン、」を削＋ｔする。 （５）同書第２頁、第１９行の「等」を削除する。 （６）同書第４頁、第８行の１癌表面」を「癌細胞表面
」に訂正する。 （７）同書第４頁、第１７行〜第１８行の「医薬として
精製されたものであれば、」を削除する。 （８）同書第５頁、第２行〜第３行の「医薬用として使
用しうるちのであれば」を削除する。 （９）同書第６頁、第１４行の「リシン」を「リジン」
に訂正する。 （１０）同書第１Ｏ頁、第１行の「ゲル濾過」の後に「
担体」を加入する。 （１１）同書第１０頁、第４行の「分注し、」の後に「
液状凍結晶あるいは」を加入する。 （１２）同書第１０頁、第４行の「凍結乾燥して」を「
凍結乾燥した」に訂正する。 （１３）同書第１２頁、第５行のｒｌｎＪをｒｉｎＪに
訂正する。 （１４）同書第１３頁、第４行の「フェトプロティン−
ウマ抗体」を「フェトプロティン・ウマ抗体」に訂正す
る。 （１５）同書第１３頁、第５行の「２５」を「１００」
に訂正する。 （１６）同書第１３頁、第９行のｒＲＰ）ＴＡＪを「Ｐ
ＨＡＪに訂正する。 （１７）同書第１３頁、最終行の「フェトプロティン」
を「フェトプロティン」に訂正する。 （１８）同書第１４頁、第４行のｒＲＰＭＪをｒＲＰＭ
ＩＪに訂正する。 （１９）同書第１５頁、第２行のｒＧ２００Ｊを［Ｇ−
２００Ｊに訂正する。 （２０）同書第１５頁、第５行の「乾燥剤」を「乾燥製
剤」に訂正する。 （２１）同書第１５頁、最終行の「樹脂］の前に「トヨ
バール」を加入する。 （２２）同書第１６頁、第１０行の「フェトプロティン
」を「フェトプロティン」に訂正する。 （２３）同書第１６頁、第１２行の「フェトプロティン
」を「フェトプロティン」に訂正する。 以上 （別ＩＥ） 特許請求の範囲 ｆｉｌ　アルドヘキソピラノース環の開裂したデスキト
ランのアルデヒド基に、 ■アルデヒド基と反応性の制癌作用物質を反応させる工
程（工程Ａ） ■当該アルデヒド基をマスキングする工程（工程Ｂ） ■当該アルデヒド基に癌細胞表面抗原に対する抗体を結
合させる工程（工程Ｃ） をほどこしてなる制癌作用物質複合体の製造方法。 （２）工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃの順序で処理することを
特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の制癌作用物
質複合体の製造方法。 （３）抗体１分子に対して５〜３０分子のデキストラン
、２０〜７０分子の制癌作用物質を結合させることを特
徴とする特許請求の範囲第（１）または第（２）項記載
の制癌作用物質複合体の製造方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１フルドヘキソピラノース環の開裂したデスキトラ
   ンのアルデヒド基に、 ■アルデヒド基と反応性の制癌作用物質を反応させる工
   程（工程Ａ） ■当該アルデヒド基をマスキングする工程（工程Ｂ） ■当該アルデヒド基に層表面抗原に対する抗体を結合さ
   せる工程（工程Ｃ） をほどこしてなる制癌作用物質複合体の製造方法。 （２）工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃの順序で処理することを
   特徴とする特許請求の範囲第（１１項記載の制癌作用物
   質複合体の製造方法。 （３）抗体１分子に対して５〜３０分子のデキストラン
   、２０〜７０分子の制癌作用物質を結合させることを特
   徴とする特許請求の範囲第（１１または第（２）項記載
   の制癌作用物質複合体の製造方法。