JPS6069033A - 免疫毒素複合体 - Google Patents

免疫毒素複合体

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JPS6069033A JP59127258A JP12725884A JPS6069033A JP S6069033 A JPS6069033 A JP S6069033A JP 59127258 A JP59127258 A JP 59127258A JP 12725884 A JP12725884 A JP 12725884A JP S6069033 A JPS6069033 A JP S6069033A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の目的 本発明は免疫ｊ７Ｊ　素複合体（Ｔ、ｍｍｕｎｏｔｏｘ
ｉｎ　Ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｃ　）およびその用途である
標的細胞群の選択的排除に関１−る９特に、細胞表面親
和性結合物質（Ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）と結合した毒素
Ａ鎖部分は、毒素Ａ鎖部分と結合した細胞表面親和性結
合物質が与える細胞毒性を増強するのに有用である。
リシン（Ｒｉｃｉｎ）は微少量で真核細胞に対してかな
りの毒性を示す多数の植物蛋白質のうちの一種であり、
１つのジスルフィド結合により共有結合した２つの糖蛋
白質から成る。リジンのＡ鎖の見か（すの分子量（ＡＭ
Ｗ）は約３０．０００であり、リジンのＡ鎖は毒性発現
に寄与し、６０Ｓのリポソーム・ザブユニットに酵素的
に作用して蛋白質合成を不可逆的に停止きせてしまう［
０１ｓｎｅｓ、ａｔ　ａｌ、。
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　、　２８．４８−５０（１９７
２）１．リシンＢ鎖（ＡＭＷ３２．０００）はガラクト
ースに対して特異性を有するレクチン（ｌｅｃｔｉｎ）
として作用し、細胞膜に毒素を結合きせるように働く［
例えば、Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ、　ｅｔａｌ、　、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　２５４．９７９５−９７
９９（１９７９）を参照、］。
抗体き結合したりシンまたは精製リシンＡを用いること
は、腫瘍の治療に際し、潜在的に有用な薬剤として大き
な興味の対象となってきた。抗体−リシンおよび抗体−
Ａ銀複合体、即ち、′免疫毒素」は、成功の程度は変わ
るが多数の系に用いられてきた［例えば、Ｖｉｔｅｔｔ
ａ、ａｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ。
２１９、６４４−６５０（１９８３）、　Ｔｈｏｒｐｅ
　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、。
６２、１２０−１５８（１９８，２）、　Ｎｅｖｉｌｌ
ｃ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ。
６２、７５−９１　（１９８２）およびＪａｎｓｅｎ、
ｅｔ　ａｌ、　、　ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ、、６２．１
８５−２１６（１９８２）を参照、］。
リシンＡ鎖−抗体複合体により選択的に細胞群を排除す
る方法はよく知られている。好ましい抗体は、腫瘍細胞
上または正常なリンパ球のサブセット上の抗原と反応す
るものである。腫瘍細胞を排除することにより、例えば
、体内の腫瘍による苦痛を減じたり［Ｋｒｏｌｉｃｋ、
　ｅｔ　ａｈ　、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５５
゜１７９９（１９８２）　］、自己骨髄移植に際して骨
髄から腫瘍細胞を排除したり［Ｔｈｏｒｐｅ、ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２７１．７５２
＜１９７８）およびＫｒｏｌｉｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、　
。
Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２９５．６０４（１
９８２）　］することが可能である。
また、正常なリンパ球のサブセットを排除することによ
り、免疫応答を高くも低くも調整できる。免疫毒素の利
点は、標的細胞に非常に特異的であることおよび費用量
で不要な細胞を排除できることである。リジンＡ鎖−抗
体複合体は、主に、生体内系および生体外系において正
常および新生物性Ｂ細胞を排除するのに用（・られる。
ある研究施設では、リシンＡ鎖とモノクロナール抗体の
複合体をＴ細胞由来の新生物性細胞およびその他の種々
の癌性細胞を排除するのにも用いている。
しかし、リジンＡａ−抗体複合体は、ある特定の型の腫
瘍細胞（例えば、ある種のＴ細胞腫瘍）に用いた場合、
活性ではない［Ｎｅｖｉｌｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、　。
Ｉｍｍｕｎｃｌ、　Ｒｅｖ、　、　６２．７５（１９８
２）およびＴｈｏｒｐｅ、ｅｔ　ａｌ、。
１ｍｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、　、　６２．１１９（１９
８２）　］。
これに対して、リジン毒素全体と結合した免疫毒素はさ
らに強力な細胞毒性物質である。ところが、完全なりシ
ンにはりシンＢにガラクトース結合部位が存在すること
から、上記免疫毒素はその標的細胞に対する特異性を失
い、それが生体内系での使用を妨げている。ガラクトー
ス結合部位を閉本することにより、リジン含有免疫毒素
が非特異性となるのを克服しようとする試みが為きれて
いるが、その生体内系での使用については未だ記載きれ
ていない。
一方、リジンＡＭ−抗体複合体が細胞培養液に遊離Ｂ鎖
を添加することにより増強され得るとする記載もある（
Ｎｅｖｉｌｌ、ｅｔ　ａｌ、　、同上）。従って、リシ
ンＢ鎖は、（１）ガラクトース結合性により細胞内への
りシンの侵入を促進すること、および（２）Ａ鎖を細胞
質に急速に接触きせること（おそらく、細胞内性小胞体
膜に穴を形成させることによる）の２つの機能を有する
ものと想定されている。
最近為された刊行物未記載の研究によれば、非毒性リシ
ンＡ鎖を注射し、その４〜８時間後に非毒性Ｂ鎖を注射
したマウスはりシンにより死亡した。これは、おそらく
、血清中または循環細胞の表面で完全なりシン分子が再
形成されることによると忠われる。従って、Ｂ鎖はりシ
ンＡ鎖の毒性を増強する上で活発な役割を果たしている
と考えられる。
発明の構成 本発明により、標的細胞への特異性を保持しつつ、細胞
表面結合物質−毒素複合体の細胞毒性度を増強する組成
物および方法を提供する。本発明により提供する組成物
は毒素Ｂ鎖部分と結合した選択的結合物質を含有する。
更に、毒素Ｂ鎖部分と結合した選択的結合物質を含有す
る第１複合体を毒素Ａ鎖部分と結合した細胞表面結合物
質を含有する第２複合体と共に含有する組成物を提供す
る。第１複合体中の選択的結合物質は細胞表面結合物質
か第２複合体の細胞表面結合物質に特異性を有する結合
物質のどちらであってもよい。
本発明の一側面は、リシンＢ鎖部分と結合する細胞表面
結合物質として抗体を含有する複合体を提供することで
ある。更にまた、リシンＢ鎖部分と結合した抗体を含有
する第１複合体とりシンＡ鎖部分と結合した抗体を含有
する第２複合体の混、合物からなる組成物を提供する。
本発明の更に別の側面は、標的細胞を含有する細胞群を
、標的細胞の抗原性決定部位に特異性を有し毒素Ｂ鎖部
分と結合する親和性結合物質からなる第１複合体および
前記標的細胞上の異なる抗原性決定部位に特異性を有し
毒素Ａ鎖部分と結合する細胞表面親和性結合物質からな
る第２複合体と接触さぜることにより、上記細胞群から
標的細胞を排除する方法を提供することである。前記の
複合体混合物は、毒素Ａ鎖部分と結合する細胞表面親和
性結合物質を含有する複合体だけによる選択的細胞毒仕
度を増強する。
また、毒素Ｂ鎖部分を抗体と共有結合させることを特徴
とする毒素Ｂ鎖複合体の製造方法を提供する。
好ましい具体的内容として、本発明は毒素Ｂ鎖部分と結
合した抗体からなる複合体を提供する。
更に、本発明はりノンＢ鎖部分を含有する第１複合体と
りシンＡ鎖部分を含有する第２複合体を含有する組成物
を協調的に用いて標的細胞を排除する方法を提供する。
リジンは微少量で細胞に対しかなりの毒性を示す多くの
蛋白質毒素のうちの１つである６リシン青素は１つのン
スルフイド結合により共有結合した２種の糖蛋白質から
成る。リジンのＡ鎖（ＡＭＷ　３０．０００　）は蛋白
質合成を不可逆的に停止させることにより毒性を現わす
。リシンＢ鎖（ＡＭＷ３２、０００　）は細胞表面上に
露出したガラクトース含有糖蛋白質または糖脂質に結合
するレクチンとして作用する。リジンにみられる一般的
構造および作用機作は、アブリン（ａｂｒｉｎ）　、モ
デクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ　）、ポークライード・マ
イトジェン（ｐｏｋｅｗｅｅｄ　ｍｉｔｏｇｅｎ）因子
およびビスカミン（ｖｉｓｃｕ−ｍ１ｎ）なとの種々の
植物蛋白質毒素ならびにコレラ毒素、大腸菌易熱性毒素
、百日咳菌毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、シュー
ドモナス毒素、赤痢菌毒素およびジフテリア毒素などの
細菌性蛋白質毒素中にも存在する。
本発明方法に用いるリシンＢ複合体およびリシンＡ複合
体はそれぞれ２つの活性部分を含有し、それは、細胞表
面結合物質または選択的結合物質と、（好ましくは縮合
剤によって）共有結合した毒素ＡまたはＢ鎖ザブユニッ
トである。それぞれの組成物において、活性部分の１つ
は、標的細胞表面構造に結合親和性（Ｂｉｎｄｉｎｇ　
ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するかまたは毒素Ａ鎖複合体中
の細胞表面結合物質（ｃｃｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅｂｉｎ
ｄｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）に結合親和性を有する分子とし
て示きれる。このような分子の代表的なものには、ホル
モン、成長因子、レクチン、抗体などの物質が挙げられ
る。好ましい分子は、細胞表面に結合親和性を有する抗
体またはそのフラグメント（特に、Ｆｅｂフラグメント
）である。
モノクロナール抗体は好ましいが必須ではない。
標的への特異性は多少低下するが、血清から得た免疫グ
ロブリン分画を用い得る。抗血清の免疫グロブリン分画
は広範囲の異なる抗原に関係する多数の抗体を保有する
ので、本発明組成物および標的細胞を排除する本発明方
法を実際に用いるには特定の標的細胞上に存在する細胞
表面抗原性決定部位（Ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ
ｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）に結合し得る各々の抗
体を所望に応して単離する必要が生しる。
上記の抗体を効果的に単離するには、充填剤に科学的に
結合許せた各々の抗原を含有するカラムに免疫グロブリ
ン分画を通せはよい。抗原に特異性を有する抗体はカラ
ムに保持きれ、関係のない免疫グロブリンはカラムを通
過する。次に、ケイオトロピツク剤（Ｃｈａｏｔｒｏｐ
ｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）の酸性緩衝液なとの適当な溶出剤
を用いて保持された抗体をカラムから溶出させて採取し
得る。単離された免疫グロブリンは、単一の抗原に対応
するが、均一ではないことに注意を要し、抗原分子上に
存在する種々の抗原性決定部位に対応する抗体を含有す
る。従って、他の関連した抗原と交差反応する可、能性
がある。
それ故に、本発明組成物を製造する際に、モノクロナー
ル抗体を用いることはモノクロナール抗体が抗原上に存
在し得る多くの抗原性決定部位のうちの唯一つに対応す
ることから非常に好ましい。モノクロナール抗体は牌臓
またはその他の臓器中に存在するリンパ球から誘導した
ハイブリドーマから公知の方法で入手し得る。
また、本発明方法で用いる組成物中にモノクロナール抗
体を用いると選択性の向上という非常に望ましい特徴が
得られる。従って、リシンＢ鎖複合体およびリンンＡ鎖
複合体が共にモノクロナール抗体からなることは非常に
好ましく、これにより標的細胞・＼の特異性は確実に高
く保てる。
前節では、本発明の一側面である、リシンＡ鎖複合体お
よびリンンＢ鎖複合体の両方を構成するのに同し細胞表
面親和性結合物質を用いることについて述へた。しかし
、特異性をより高めることは可能である。正割細胞また
は腫瘍細胞は表面に数種の標識物質を有しているので、
リシンＡ鎖とりシンＢ鎖の各々を同し細胞上の異なる抗
原性決定部位に対応する抗体と結合さゼることにより、
リンンＡ鎖およびリシンＢ鎖を上記細胞に誘導できる。
例えは、表面Ｉａ（ｓＩａ）および表面Ｉｇ（ｓＩｇ）
を共に有する新生物性Ｂ細胞の場合は、ｓＩａおよびｓ
Ｉｇイディオタイプに対する免疫毒素を、それぞれリン
ンＢ鎖およびリシンＡ鎖を用いて製造し得る。Ｔ細胞腫
瘍の場合、ヒトＴ細胞のり°ヅセントと反応する多数の
モノクロナール抗体が存在する。抗体の組合わせを選択
して、リシンＡ鎖およびリンンＢ鎖を上記細胞の特定の
サブセットに誘導し得る。好ましくは、一方の抗体（リ
シンＡ鎖に結合）は目的のザブセットを特定し、他方の
抗体（リシンＢ鎖に結合）は多数のザブセットに共通し
たもつと一般的な標識物質であるのがよい。
共通の標識物質と対応するＢ鎖免疫青素は正常細胞にも
結合するが、これらの細胞は排除されない。これに対し
て、Ａ鎖免疫毒素は腫瘍細胞のみに集中し、Ｂ鎖含有免
疫毒素によって増強きれ本発明が意図する他の側面は、
まず第１に、腫瘍細胞反応性抗体−リシンＡ鎖複合体を
生体内で腫瘍細胞に誘導することを含む。抗体は、キャ
ップ（ｃａｐ）あるいはモジュレート（ｍｏｄｕｌａｔ
ｅ）され得ないように１価（例えば、Ｆ（ａｂ）−Ａ）
であることが好ましい。抗体−リシンＡ複合体を癌患者
に投与して過剰分がυ［泄または分解により患者体内か
ら消失し、たのも、リシンＡ複合体中の抗体に対応する
りシンＢ鎖含有免疫毒素を注射する。最初の免疫毒素と
結合した細胞たけが２番目の免疫毒素を最初の免疫毒素
へと誘導させる。その結果、そのような細胞が選択的に
排除される。２番目の免疫毒素は、マクロファージ、単
核細胞またはＦｃ受容体を有する他の細胞に結合しない
２価の抗抗体（例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｂ）であること
が好ましい。
また、Ｂ鎖含有免疫毒素は、仮に最初の免疫毒素に予め
結合していない細胞に非特異的に結合しても、無害であ
るので、２番目の免疫毒素を投与することによる副作用
は排除できる。これに対して、両方の免疫毒素と結合す
る細胞は死滅する。
前述したように、本発明のリンンＢ含有組成物および本
発明方法で用いるリシンＡ含有組成物はそれぞれ少なく
とも２種の活性部分を有しており、その活性部分のうら
の一フＪは結合親和性（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ＞　（Ｂ　Ａ　）であり、他方はりシン・サブユニ
ット（Ｒ３）（リシンＡ（ＲＡ）にしろリシンＢ（ＲＢ
）にしろ）である。各々の組成物は縮合剤で結合するが
、得られる組成物は、（ａ）上記の活性部分が少なくと
も１つずつ存在すること、および（ｂ）上記の活性部分
の少なくとも１つずつの本来の活性を保有していること
を要する。
本発明においては、他の蛋白質毒素も同様に結合物質成
分（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
）に結合させて使用きれる。構造と作用機作が似ている
ため、アブリン、モデクシン、ポークライード・マイト
ジェン因子、ビスカミン、およびコレラ毒素、大腸菌易
熱性毒素、百日咳菌毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素
、シュードモナス毒素、赤痢菌毒素、ジフテリア毒素な
どの植物性または細菌性蛋白質毒素が利用され得る。ま
た、例えはアブリンなとから得たＡ鎖を細胞表面結合性
物質（Ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍ
ｏｉｅｔｙ）　に結合ｊｌで本発明の第１複合体を形成
し、例えばビスカミンなどから得たＢ鎖を選択的結合性
物質（Ｓｓｌｅｃｔｉｖｅｂｉｎｄｉｎｇａｇｅｎｔ　
ｍｏｉｅｔｙ）　に結合さけて第２複合体を形成するの
が有利である。細胞表面結合性物質に結合して第１複合
体を形成するＡ鎖として、Ａ鎖たＣフから成るゲロニン
（ｇｅｌｏｎｉｎ）などの植物性蛋白質青紫を用いるの
が有利である。この第１複合体は、リシン、ビスカミン
、モテクシンまたはアブリン毒素のうちのいずれか１つ
から選んたＢ鎖と結合した選択的結合性物質からなる複
合体と共に用いる。
上記の制限に従えば、本発明組成物および本発明方法に
用いる組成物は二量体（ＢＡ−Ｒ３）、即ち、それぞれ
の部分を１つずつ含有する、二量体［（Ｂ　Ａｓ−ＲＳ
　）または（ＢＡ−Ｒ３り］、即ち、各部分の一方を２
つ有して他方を１つ含有する、四量体［（ＢＡ、−Ｒ８
）、（ＢＡ−Ｒ８＊）または（ＢＡ　Ｒ３５）］などで
あり得る。
前述したように、本発明方法に用いる非常に好ましい組
成物は結合部分が抗体または抗体の抗原結合性フラグメ
ント、好ましくは、モノクロナール抗体またはその抗原
結合性フラグメントであるものである。代表的組成物は
Ａｂ−ＲＢ、Ａｂ、−ＲＢ　、Ａｂ　ＲＢ！　、Ａｂ’
ｓ　ＲＢ　、Ａｂ！−ＲＢ、、Ａｂ−ＲＢ、、Ａｂ−Ｒ
Ａ、Ａｂ、−ＲＡ　、　Ａ　ｂ　ＲＡ　ｒ　、　Ａ　ｂ
　ｓ　ＲＡ　、　Ａ　ｂ　ａ　ＲＡ　ｔまたはＡｂ−Ｒ
Ａｓである。
本発明組成物を製造するには、ＢＡおよびＲ３部分を適
当な縮合剤で結合する。多種の縮合剤がＧｈｏｓｃ、　
Ｔ、　ａｎｄ　Ｂｌａｉｒ、　Ａ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、　。
虹、６５７−６７６（１９８０）に報告されている。１
）１１記著渚らは抗体を細胞毒性物質に結合させるのに
グルタルアルデヒド、ｐ−ヘンツキノン、ｐ、ｐ’−ジ
フルオロ−ｍ、ｍ′−ジニトロジフェニルスルポンまた
はジメチルアジビミデートなどの二官能性物質とカルボ
ジイミド類を使用することを報告している。
屯一部分多重合体、例えば、（ＢＡ）ｎまたは（Ｒ８）
ｎの形成を防ぐことは非箔に望ましいことなので、ヘテ
ロ二官能性物質を用いて各活性部分を少なくとも１つず
つ有する組成物が必ず得られるようにするのが好ましい
。このようなヘテロ二官能性物質の例としては、Ｎ−ス
クシーニミシル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）、ｍ　−７レイミドヘンソイルーＮ
−ヒドロキシ−スクシニミジルエステル、ブロモアセテ
ルーｐ−アミノヘンソイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニ
ミジルエステルまたはヨードアセテルーＮ−ヒドロキシ
−スクシニミジルエステルが挙げられる。
例えは、縮合、剤として５ＰＤＰを用いて、本発明の組
成物を製造する方法は、（ａ）ＳＰＤＰと反応さゼるこ
とによりＡｂおよびＲ３を別々に修飾し、（ｂ）Ａｂ含
有生成物を還元し、（ｃ）ＡＢ含有生成物とＲ３含有生
成物を混合することにより組成物を形成許せ、および（
ｄ）ゲル濾過により非反応性の単量体を除去することを
特徴とする。
リンフＢを含有する本発明の複合体は、リシンＡ複合体
とり（に用いた場合、特定の抗原標識物質により規定さ
れたタイプの細胞を特異的かつ選択的に死滅さ七るのに
一般的に適応させることができる。抗原標識物質を適当
に選択することにより、細胞表面結合物質を対応する認
識決定部位を有する一群の正常細胞または新生物性細胞
のサブセットに誘導し得る。このようにして、上記複合
体は、例えは癌の免疫治療などの際に、また寄生感染症
の治療および広範囲の自己免疫疾患の治療に有用である
。更に、本組成物には、例えば、自己骨１１市移植に先
立つ骨髄中の白血球細胞の除去、遺伝的に異質な骨髄移
植に先立つ骨髄中のＴ細胞の除去および変異株選別の際
の野生株の殺菌などのような幾つもの生体外での適用の
仕−Ｊｊがある。
本発明組成物は種々の製剤に用いることができ、筋肉内
、静脈内、皮下、腹腔内投与などの汎用される種々の経
路で投与し得る。′製薬上許容される」という用語は、
混血動物の化学療法に利用できることを意味する。
本複合体組成物を非経口投与または腹腔内投与する場合
、注射用の製薬上許容される形には、滅菌水溶液または
分散液および注射可能な滅菌溶液または分散液に再構成
し得る滅菌粉末などが挙げられる。担体は、例えば、水
、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリン、
プロピレングリコ−４，ポリエチレングリコール液なと
）およびその適当な混合物ならびに植物油などの溶媒ま
たは分散媒であればよい。適当な流動度は、例えは、レ
シチンなとのコーティング剤を用いたり、分散液の場合
は所望の粒径を維持したり、界面活性剤を用いたりする
ことにより維持できる。種々の抗生物質および抗真菌剤
、例えは、バラヘン類、クロロブタノール、フェノール
、ソルビン酸なとも用いるとよい。多くの場合、等張剤
、例えは、糖類、塩化ナトリウムなどを含有することが
望ましい。注射可能な剤型の吸収を長期化するには、モ
ノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収
遅延剤を用いればよい。
注射可能な滅菌溶液は、所望量の適当な溶媒に溶解した
前記の複合体組成物を所望の他の成分と組み合わせるこ
とにより製造できる。
要すれば、より有効に分布させるために、本組成物は多
重保持体（ｐｏｌｙｍｅｒ　ｍａｔｒｉｘ）、リポソー
ム、微粒体価１ｃｒｏｓｐｈｅｒｅ　）なとの緩徐放出
系内に取り込ませることができる。また、本組成物は単
独でまたは多数の活性成分の混合物として投与し得る。
本組成物は治療への反応が所望どおりとなる間隔で対象
に投与する。対象の体重および投与形式により所望の反
応を誘起するのに必要な用量が決まる。
投与を簡単にして用量を均一化するために、本複合体組
成物は単位投与剤型に製剤化するのが特に有利である。
単位投与剤型とは、治療対象の単位投与量として適した
物理的に区分きれる単位である。各単位は所望の治療効
果を生しるように計算された既定量の本組成物を製薬上
許容される担体と共に含有する。個々の単位投与剤型は
、（８）個々の組成物の特性および（ｂ）達成すべき個
々の治療効果に依存する。
以下に限定を意図しない実施例を提示して本発明を更に
例示する。
（以下余白） 衷皇忽 免疫毒素の製造 Ａ、リンンＡ鎖およびリシンＢ鎖 リシンのＡおよびＢ鎖ザブユニットをＸｏｍａＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａ１
ｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、使用する前にＡおよびＢ
鎖をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７，２）にて４
℃で完全に透析した。ＡおよびＢ鎖の回収率はそれぞれ
５０％および８０％であった。
Ｂ、抗体 桟体的な選択的に細胞表面に結合する物質として、文献
（例えば、Ｍｕｉｒｈｅａｄ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂ
ｌｏｏｄ、　４２゜３２７　（１９８３）　、　Ｖｉｔ
ｅｔｔａ、　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２
１９．６４４（１９８３）参照）記載の方法に従ってア
フィニティー法で精製したウサギ抗ヒト免疫グロブリン
（２６８１ｇ）を用いた。
Ｃ１複合 ６０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）のＰＢＳ混液
ＩＱｐＱを透析したＡまたはＢ鎖１ｍｇに加えて２５℃
で６０分間インキュベートし、還元された鎖を２５℃で
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５のカラム（１８×１．５ｃ
ｍ）中にてｐＨ７，２でＰＢＳによりゲル濾過してＤＴ
Ｔから分離した。抗体を文献（Ｖｉｔｅｔｔａｅｔ　ａ
ｌ、　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、　、　６２：１５９
−１８３（１９８２）およびＣａｒｌｓｓｏｎ、ｅｔ　
ａｌ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、　１７３，７２３
（１９７８）参照）に記載されたようにして結合した。
詳しくは、前記抗体のＰＢＳ混液をおよそｐＨ７，０〜
７５で約２０”Ｃ−約２５℃ノ温度下−Ｃ’　Ｓ　Ｐ　
Ｄ　Ｐ、　’ＩＩＩ］チＮ−スクシニミジルー３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネートと処理する。この抗
体誘導体を緩衝溶液中でジチオスレイトールと処理する
。所望ならば、このチオール化抗体をゲル濾過により精
製してもよい６得られる活性化された結合抗体と還元し
たてのＡまたはＢＥとを、抗体：Ａ鎖または抗体：Ｂ鎖
のモル比５：１の比率で混合した。
混液を穏やかに振盪しなから４°Ｃで１５分間インキュ
ベートしたのち、４℃でＰＢＳにて一晩透析した。得ら
れた免疫毒素を蒸発（四ｒｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　）に
より１　ｍｇ／　ｄまで濃縮し、４℃でＰＢＳにて２〜
１６時間透析し、遠心分離して不溶物質を取出した。免
疫毒素と大部分の遊離Ａ６１４、Ｂ鎖および抗体との分
離はＰＢＳで平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００
のカラム中で２５℃、ｐＨ７，２でゲル濾過して実施し
た。みかけの分子量が２００．０００以上の物質を保存
した。還元きれアルキル化きれた牛αグロブリン、分画
４　（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度１　ｍｇ／　ｎＱで上記
保存試料に加えた。この試料はアフィニティー法で精製
する前に４°Ｃで１６〜２０時間放置した。
このＲαＨ１ｇ−Ａ鎖（２６８１ｇ−Ａ　）および２６
８１ｇ−Ｂ鎖（２６８１ｇ−Ｂ　）免疫毒素はＳｃｐｈ
ａｒｏｓｅ−Ｈｌｇのアフィニティー・クロマトグラブ
イ−で精製した。Ａ鎖含有免疫毒素を精製するために、
カラムをｐＨ７，２のＰＢＳ中で平衡化して洗浄し、Ｂ
鎖含有免疫毒素を精製するために、カラムを０．ＩＭ力
ラクトースを含有するｐＨ７，６のＰＢＳで平衡化して
洗浄した。上記試料をこのカラムに通し溶出分は廃棄し
た。カラムをＰＢＳ（またはＰＢＳ　Ｏ、ＩＭ　ｇａｌ
）、次に０．８５％ＮａＣ１で完全に洗浄した。免疫毒
素をカラム容量の２〜３倍量（７）　３　、５　Ｍ　Ｍ
ｇＣＬで３７℃にてハツチ式により溶出した。ＭｇＣ１
、を透析により除去し、試料を蒸発（ｐｅｒｖａｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）によりおよそ２００〜３００ｐｇ／　ｎＱ
まで濃縮した。還元されアルキル化された牛αグロブリ
ンを最終濃度１　ｍｇ　／　ｎＱで加えた。試料を濾過
滅菌［ＰＢ８２％牛脂児血清（Ｆｅ２）で前駆て湿らせ
たフィルター上でコして、適量を滅菌バイアル中に入れ
て一２０℃で保存した。この方法で保存した試料は４〜
６ケ月間は安定であった。
アフィニティー法での精製による免疫毒素の回収率は２
６〜４５％であり、各々の免疫毒素は抗体１分子当り１
または２個のＡ（またはＢ）鎖サブユニットを含有して
いた。免疫毒素を感受性のよいシルバー・ステイニンク
ヲ用い−ｃｓｐｓ−ｐＡ　Ｇ　Ｅｓ１ａｂゲルで分析す
ると、いずれの免疫毒素にも遊離のＡまたはＢ鎖は検出
きれなかった。
発明の効果 リシンＢ鎖含有複合体およびリシンＡ鎖含有複合体の新
生物性ヒ）Ｂ細胞死滅作用 Ａ、新生物性細胞培養 Ｈｏｕｓｔｏｎ、　Ｌ、　Ｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　。
９２：３１９−３２６（１９８０）に記載されたヒトの
パーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）のリンパ腫細胞系、ダウ
ジ（Ｄａｕｄｉ　）を１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（Ｆ
ｅ２）、新たに調製した２０ｍＭグルタミンおよび抗生
物質を補なったＲＰＭＩ−１６４０の懸濁培養液中に保
持した。
培養液を／ｆｉ！潤な培養器中、３７°Ｃで９５％０２
１５％ＣＯ２雰囲気下に維持した。全ての培養液は２日
間の予備培養ののち用いた。
Ｂ、ダラシ細胞の処理 ２日間の予備培養ののちダラシ細胞を採取し、緩衝化し
た食塩水（ＢＳＳ）中で洗浄した。ＢＳＳ中の１０５個
の細胞を微量滴定容器（ｍｉｃｒｏｔｉｔａｒｗａｌｌ
）に分配した。２つの免疫毒素、ＲａＨＩｇ−Ａおよび
ＲａＨＩｇ−Ｂまたはその両方の組合わさったものの各
々を希釈して、３組の上記容器に１５分間４°Ｃで加え
、遠心分離してＢＳＳで３回洗浄した。ロイシンを欠き
１０％ＦＣ３を含有するＲＰＭ　１２００　ＰＱを各容
器に加え、細胞を穏やかに攪けして再懸濁した。プレー
トを５％ＣＯ２培養器中で３７°Ｃ１２２時間培養し、
細胞を１容器当り５μＣｉのＩＨ−ロイシン（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）で５％Ｃ０２中にて
３７℃、６時間パルスさ七た。
細胞をグラスファイバー製ディスク」二に採取し、液体
シンチレーション螢光測定器で計測した。細胞を各々の
免疫毒素で独立に、または以下のように組合わゼたもの
で処理した。
１、非毒性量のＲａＨＩｇ−Ａ（０、３ｐｇ／ｎｕ）と
種々の量のＲａＨＩｇ−Ｂ、または ２、非毒性量のＲａＨＩｇ−Ｂ（０，５μｇ　／　ｎＱ
　）と種ｈ　（７）　ｌｉｔ　（７）Ｒａ　Ｈｏｇ　−
Ａ。
結果は第１表に示す。
（以下余白） 」二記の表に示したように、タウン細胞を１０５個の細
胞当り０．３μｇのＲａＨｌｇ−Ａ鎖で処理した場合、
殆と毒性はみられず、Ｒα）ｌＩｇ−Ｂは存在しなく−
Ｃも毒性を示した。しかし、０．３１ＪｇのＲα１（Ｉ
ｇ−Ａを種々の濃度のＲａＨｌｇ−Ｂと混合した場合、
著しい細胞毒性を示した。このようなタウン細胞と免疫
青紫混合物との処理は刀ラクトースを欠＜ＢＳＳ中で実
施したことを特記しておく。第１表に示したように、タ
ウン細胞を０．５ｓｇのＲａＨｌｇ−Ｂで処理した場合
、毒性は認められなかったのに対して、ＲａＨｌｇ−Ａ
はタウン細胞を用量に依存して死滅さ七た。しかし、Ｒ
ａＨｌｇ−Ａと混合した０、５ｕｇのＲａＨｌｇ−Ｂで
細胞を処理すると、Ｒα）Ｉｌｇ−Ａ、ｔのものでは毒
性の認められなかった濃度でさえ、細胞に対し−〔毒性
であった。
複合体組成物およびその使用法を好ましい具体的内容と
して記載したが、当業者には、本発明の意図する範囲か
ら逸脱することなく種々の変化を加え得ることは理解さ
れるところである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）枇素Ｂ鎖部分と共有結合した抗体を含有する複合
    体。 （２）抗体が細胞表面の抗原に対して特異性を有する特
    許請求の範囲（１）記載の複合体。 （３）抗体が腫瘍細胞表面の抗原に対応する特許請求の
    範囲（１）または（２）記載の複合体。 （４）抗体が第２の抗体と対応する特許請求の範囲（１
    ）記載の複合体。 （５）毒素Ｂ鎖がリシンＢ鎖、モテクシンＢ鎖、アブリ
    ンＢ鎖、ポークライード・マイトジェン因子Ｂ鎖、ビス
    カミンＢ鎖、コレラ毒素Ｂ鎖、大腸菌易熱性毒素Ｂ鎖、
    百日咳菌毒素Ｂ鎖、ポッリヌス毒素Ｂ鎖、ンユードモナ
    ス毒素Ｂ鎖、赤痢菌毒素Ｂ鎖またはジフテリア毒素ＢＭ
    から選択きれる特許請求の範囲（１）から（４）のいず
    れか−項に記載の複合体。 （６）毒素Ｂ鎖がリシンＢ鎖である特許請求の範囲（９
    記載の複合体。 （７）毒素Ｂ鎖部分と共有結合した抗体を含有する第１
    複合体を毒素Ａ鎖部分と共有結合した抗体を含有する第
    ２複合体とからなることを特徴とする細胞毒性組成物。 （８）第２複合体中の抗体が細胞表面の抗原性決定部位
    と対応する特許請求の範囲（７）記載の組成物。 （９）第１および第２複合体の各々が細胞表面の抗原性
    決定部位に対して同等の特異性を有する抗体を含有する
    特許請求の範囲（７）または（８）記載の組成物。 ｑ■　第１複合体中の抗体が、第２複合体中の抗体に対
    応する細胞表面の抗原性決定部位とは異なる細胞表面の
    抗原性決定ｍ１位と対応する特許請求の範囲（７）また
    は（８）記載の組成物。 （１１）各々の抗体が腫瘍細胞の抗原性決定部位に対し
    て特異性を有する特許請求の範囲（７）から（１０）の
    いずれか−項に記載の組成物。 （１２）第２複合体が細胞表面の抗原性決定部位に特異
    性を有する抗体を含有し、第１複合体が第２複合体中の
    抗体に特異性を有する抗体を含有する特許請求の範囲（
    ７）記載の組成物。 （１３）毒素Ａ鎖がリジン、アブリン、七デクシン、ゲ
    ロニン、ポークライード・マイトジェン因子、ビスカミ
    ン、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳菌毒素、ボ
    ツリヌス青素、シュードモナス毒素、赤痢菌毒素および
    ジフテリア毒素のＡ鎖部分から選択きれる特許請求の範
    囲（７）から（１２）のいずれか−項に記載の組成物。 （１４）毒素Ａ鎖部分がリジンＡ鎖であり、毒素Ｂ鎖部
    分がリンンＢ鎖である特許請求の範囲（１３）記載の組
    成物。 （１５）毒素Ｂ鎖部分と共有結合した抗体を含有する複
    合体を１種またはそれ以」二の製薬上ｉｆ容される担体
    または賦形剤と共に含有する製薬。 （１６〉細胞群を、毒素Ｂ鎖部分と）（重結合した抗体
    を含有する第１複合体および毒素Ａ鎖部分と共有結合し
    た抗体を含有する第２複合体と接触させることを特徴と
    する細胞群から標的細胞を選択的に排除する方法。 （１７）毒素Ｂ鎖部分を抗体と共イ１結合さセることを
    特徴とする毒素Ｂ鎖複合体の製造方法。
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