JPS6094087A - 固定された５′‐ホスホジエステラーゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒＪｌ素の固定は既に幾通りか記載されて（・る。

英国特許第１，５６９，４６２号には，Ｎ−アシノレー
Ｄ，Ｌーアミノ酸をアシラーゼと反応させることができ
、その際選択的にＬ−アミノ酸が反応することが記載さ
れている。アシラーゼはまたセルロース、砂または酸化
アルミニウムのような不活性物質に吸着されることがで
きそしてグルタルジアルデヒドのような二官能性試薬で
交叉結合されうろことが言及されている。西ドイツ特許
公開公報Ｍ２，７３２，ｉｌ号明細書には蛋白質の固定
が記載されており、そこでは特別に酵素ベニシリンアシ
ラーセが言及されている。西ドイツ特許第３，０４８，
６１２号明細書によれば、かかる固定されたペニシリン
−〇アシラーゼは２セミ化合物り山−２−アミノ−４−
メチルホスフィノ酪酸の分割に使用されうる。

ヨーロッパ特許出願Ａ１−４３１６９号はイヌリナーゼ
活性を有する酵素製剤に関するものである。好ましい実
施形においては酵素はグルタルジアルデヒドとの反応に
よりアミノおよび／またはとドロキシ基を有するマクロ
細孔性樹ＥＴＩＫ結合される。例としてヒドロキシ基を
有するフェノール−ホルムアルデヒド樹脂が引用されそ
してアミノ基を有するフェノール−ホルムアルデヒド樹
脂も使用され得ることが言及されている。さらに担体に
酵素な結合させるためには二官能性試薬としてジアルデ
ヒドと並んでジカルボン酸、それらの無水物またはジイ
ソシアナートがあげられることが言及されている。

このヨーロッパ特許用１Ａ１−４３１６９１においては
アミノ基を有するフェノール−ホルムアルデヒド樹脂担
体−１ｌｘ登録Ｆｍ標デュ第２イト（加ｏｌｉｔθＰＡ
−７により特徴づけられている。ヨーロッパ特許出願第
Ａ２−５７６６７号によればこれは粒子直径２５０〜８
４ＣＩＪＩ＋、　Ｊｔ表１ｆｆｉ積３１　ｍ２／ｌＳｍ
孔直径１０〜２００　ｎｍを有するマクロ細孔の総容量
０．５２ａｍ’／Ｆおよび第一および第二アミノ基に基
づく陰イオン交換体６量７．５ｍｅｑ／ｐを有するフェ
ノールーホルムアルデヒドニ基づくマクロ細孔性陰イオ
ン交換樹脂である。この生成物はＦｉｒｍａ　Ｄｉａｍ
ｏｎｄ　Ｓｈａｍｒｏｃｋ社から販売されている。

一般的に過当であるものとしてその寸法が好ましくは２
５０μｍ　＝　１４　ｍｍ　Ｉｃある７エ／　−、ｐｙ
　−ホルムアルデヒドに基づく粒状またはビード形の陰
イオン交換樹脂が記載されている。

ヨーロッパ特許出顧第Ａ２−７５２６２号からは粗製核
酸溶液中のリボ核酸（ＭＡ）を重合体担体に同定された
５′−ホスネジエステ２−ゼを用いて選択的に加水分解
することｔ（より５′−リボヌクレオチドが調製され、
その際デオキシリポ核Ｍ（ＤＮＡ）は未変化のまま残る
ことが知られている。好ましいのは１１００ｎまでの直
径および約２〜３ｍＱ／９の細孔容量を有する管を備え
たマクロ細孔性担体である。５′−ホスホジェステラー
ゼの固定は既に早くに記載されているがしかしながら加
水分解の選択性については何ら記載されてい１工かった
（　Ｓ、Ｎｏｇｕｃｈｉ氏他、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ　ｔｒｙ
　第１釉＠　ｉ　Ｑ　５頁（１９７６年）参照ノ。

今、特定の担体に５′−ホスホジェステラーゼを固定す
ると高分子デオキシリボ核酸を含めて一般的に核酸をヌ
クレオチドに解裂させる非常に活性な酵素が得られるこ
とが見出された。

本発明により５′−ホスホジェステラーゼが好マシくは
篤二アミノ基を有するフェノール−ホルムアルデヒドに
基づく陰イオン交換樹脂にジイソシアナートにより結合
される。例えばヨーロッパ特許出願ＢＰ−ＡＩ−５２３
６５号に記載されている方法の場合と対照的に担体への
酵素の結合に何ら触媒が必要でないことは特別有利であ
る。

ジイソシアナートとしては例えばＥＰ−ＡＩ−５２５６
５号明細書に記載されているような芳香族、環状脂肪族
および特に脂肪族ジイソシアナートがあげられる。好ま
しいのは２，２．４−および２，４．４−　）リメチル
ーへキサメチレン−１，６−ジイソシアナートおよび特
にヘキサメチレン−１，６−ジイツシアナートのような
商業上入手しうる脂肪族ジイソシアナートである。

酵素をイオン交換体に結合させるにはこれを初めに好都
合には水酸化ナトリウムのような強水性塩基中に眉、濁
させることにより遊離の塩基形態に変換する。洗液が中
性となるまで洗浄しそして乾燥したのち無水の樹脂をジ
イソシアナート用の非プロトン性溶媒中にとりそしてそ
のまままたは溶液中におけるジイソシアナートを加えそ
してよく混合する。反応生成物は反応溶液から分離しそ
して溶媒で洗浄したのち直接酵素との反応に用いられう
る。しかしながらこれはまた単離および乾燥できそして
水分の遮断下に比較的長時間安定である。

かくして予備処理された樹脂は直接酵素の水浴液と反応
でき、その際反応条件はｒｈ８の性質の如何による。一
般に予備処理された樹脂を水性酵素溶液と充分に長く室
温で攪拌し、生成物を濾過しそして例えば飽和または生
理食塩溶液そして次に水で洗浄する。洗浄されたｉ！ｌ
、素同定物は直接使用されうる。

本発明はさらに本発明により固定された５′−ホスホジ
エステラーゼの核酸特に高分子ＤＮＡの解裂への使用に
も関する。出発物質としては舒Ａ２−７５２６２号記載
の方法により得られるようなりＮＡ浴溶液適当である。

もう一つの適当な出発物質は粗製核酸溶液を膜分離法で
分離することにより得られ、その場合ＤＮＡは保持され
て残留しそしてＲＮＡは透過する。好ましいのは中壁繊
維膜での限外濾過である（西ドイツ特許公開公報第５，
３０８，９５２号明細書参照）。

本発明の好ましい態様を以下の実施例により詳細に説明
する。百分率の記載は別に断わりなければ重量によるも
のとする。

実施例　１ フェノール−ホルムアルデヒドに基づき且つ実質上第二
アミノ基を有する商業上入手し５るマクロ細孔性陰イオ
ン交換樹脂デュオライ）Ａ−７を遊離塩基形に変換する
ために２Ｎ水酸化ナトリウム溶液中にとり、攪拌しそし
て脱イオン水で洗液が中性となるまで洗う。真空キャビ
ネット中で乾燥（４０℃、５０ミリバール、２４時間）
した後無水の樹脂１００９を無水ジクロロメタン２００
ｍＱ中にとり、ヘキサメチレン−１，６−ジイソシアナ
ート１０２を加えそして水分を遮断して室温で２時間攪
拌する。次ＫＰ遇しそして樹脂をジクロロメタンで充分
に洗う。この樹脂から水分を遮断してジクロロメタンを
除去しそして使用時まで水分を遮断して保存する。

実施例　２ ５′−ホスホジエステラーゼ（Ｆａ　、Ａｍａｎｏ社製
のＮｕｃｌｅａｓｅ　Ｒｐ　）　５　ｊｌを０．１Ｎ水
性酢酸塩緩衝液−−−＋＋−＋＋＋ａ＋４＋ＩＩ枦・−
一に；ζ４−−１−Ｊｔｌ−−２ｉピー＞（ｆ１コｅｔ
ｔｍ山に攪拌下に実施例１により処理された樹脂１００
Ｐを加えそしてさらに２時問屋温で攪拌する。

生成物をｖ５遇しそしてはじめ０．１Ｎ酢酸塩緩衝液（
ｐＨ５，５）％次に飽和食塩溶液そして再び酢酸塩緩衝
液で洗う。沖過した生成物をカラム中に充填する。

活性度を測定するために４　％　ＲＮＡおよび０．１ｍ
％ル硫酸叱鉛からなる基質溶液（ｐＨ５，０）を２０〜
３０ｈ　の流速（ＳＶ）で固定された酵素に５５℃でポ
ンプで送る。生成するモノヌクレオチドの量を測光的に
または高圧液体クロマトグラフィーにより測定する。

実施例　３ ＤＮＡ２００ｊを水ｉｏｉ中にとりそしてｐＨを５．０
に調整することにより酸層させる。この溶液に硫酸亜鉛
−７水化物５００町を加えそして実施例２により固定さ
れた５′−ホスホジエステラ−ゼ５００峨を充填したカ
ラムに５５℃で加える。

ＤＮＡのまさに１００％が５′−デオキシヌクレオチド
に部層されるように流速を調整する（毎時５、悲　ン　
。

４種の異なる５′−デオキシヌクレオチドカイオン交換
クロマドグ２フイーまたは吸着により既知方法で単離お
よび分離されうる。

出発物質としてはＥＰ　−Ａ２−７５２６２号の実施例
２または西ドイツ特許公開公報、＠３．３［１８，９３
２号の実施例１または２に記載されたＤＮＡが適当であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）フェノール−ホルムアルデヒドに基づき且つ実質上
   第二アミノ基を有するマクロ細孔性陰イオン交換樹脂に
   固定され、ｒ＃、素および担体がジイソシアナートによ
   り結合されている５′−ホスホジェステラーゼ。 ２〕担体樹脂が細孔直径１０〜２００　ｎｍおよび粒子
   直径２５０〜８４０μｍを有することを特徴とする特許 スホジェステラーゼ。 ６ン　ジインシアナートがアルキレン鎖中Ｋ１０個まで
   の炭素原子を有するアルキレンジイソシアナートである
   ことを特徴とする前記特許請求の範囲第１または２項記
   載の５′−ホスホジェステラーゼ。 ４）遊離の塩基形態をした担体樹脂をジイソシアナート
   と反応させそして反応生成物を水性媒体中で酵素の溶液
   と反応させることを特徴とする前記特許請求の範囲第１
   項記載の５′一ホスホジエステラーゼの製法。