JPS609488A - 酢酸菌ベクタ− - Google Patents
酢酸菌ベクタ−Info
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- JPS609488A JPS609488A JP58116149A JP11614983A JPS609488A JP S609488 A JPS609488 A JP S609488A JP 58116149 A JP58116149 A JP 58116149A JP 11614983 A JP11614983 A JP 11614983A JP S609488 A JPS609488 A JP S609488A
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- plasmid
- pta5001
- restriction enzyme
- acetic acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酢酸菌ベクターとしてきわめて有用なプラス
ミドｐ’ｌ’Ａ５［］０１ （Ａ）及び／又はプラスミ
Ｆ’ｐＴＡ５００１（Ｂ）に関するものである。
ミドｐ’ｌ’Ａ５［］０１ （Ａ）及び／又はプラスミ
Ｆ’ｐＴＡ５００１（Ｂ）に関するものである。
更に詳細には、本発明け、いずｎも制限酵素ＸｈｏＩＩ
Ｃよる認識部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への移入
が容易なプラスミドｐＴλ５００１（Ａ）及び／又はプ
ラスミドｐ’ｒＡ５０［］１（Ｂ）に関するものである
。
Ｃよる認識部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への移入
が容易なプラスミドｐＴλ５００１（Ａ）及び／又はプ
ラスミドｐ’ｒＡ５０［］１（Ｂ）に関するものである
。
従来、酢酸菌由来のプラスミドに関しては、アセトバク
ター・アセチＡ１０２３が分子量１７Ｘ１１１６ダルト
ンのプラスミドｐＴＡ５０Ｄ１ （Ａｇｙｉｃ、 Ｂ１
ｎ１゜Ｃｈｅｍ、 ４６（２）、３８１〜５８９．１９
８２）を持つこと及びグルコノバクタ−属細区（醗酵工
学雑誌、６１ （１）、１５−１８．１９８３）の持つ
プラスミドなどの報告があった。
ター・アセチＡ１０２３が分子量１７Ｘ１１１６ダルト
ンのプラスミドｐＴＡ５０Ｄ１ （Ａｇｙｉｃ、 Ｂ１
ｎ１゜Ｃｈｅｍ、 ４６（２）、３８１〜５８９．１９
８２）を持つこと及びグルコノバクタ−属細区（醗酵工
学雑誌、６１ （１）、１５−１８．１９８３）の持つ
プラスミドなどの報告があった。
本発明者らは、このプラスミドｐＴＡ５０旧を詳細に研
究したところ、実際１−ｔ２ヶのプラスミドの混在物で
あることを知り、更に２ケのプラスミドの制限酵素開裂
地図の作成を完成させ、その用途を詳細に検討したとこ
ろ、いすへのプラスミドも制限酵素Ｘｈｏ工による認識
部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への移入の容易なす
ぐ扛タベクターであることを確認し、本発明を完成する
に至った。
究したところ、実際１−ｔ２ヶのプラスミドの混在物で
あることを知り、更に２ケのプラスミドの制限酵素開裂
地図の作成を完成させ、その用途を詳細に検討したとこ
ろ、いすへのプラスミドも制限酵素Ｘｈｏ工による認識
部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への移入の容易なす
ぐ扛タベクターであることを確認し、本発明を完成する
に至った。
本発明は２３．５Ｋｂの分子量で、第１図に示される制
限酵素開裂地図で示さｎるプラスミドｐＴＡ５００１（
Ａ）及び／又は７２．５Ｋｂの分子量で、第２図に示さ
ｎる制限酵素開裂地図で示さｎるプラスミドｐＴＡ５０
０１（Ｂ）からなることを特徴とする酢酸菌ベクターに
関する。
限酵素開裂地図で示さｎるプラスミドｐＴＡ５００１（
Ａ）及び／又は７２．５Ｋｂの分子量で、第２図に示さ
ｎる制限酵素開裂地図で示さｎるプラスミドｐＴＡ５０
０１（Ｂ）からなることを特徴とする酢酸菌ベクターに
関する。
本発明のプラスミドルＴへ５［］［）１ （Ａ）とプラ
スミドｐＴＡ５’ｏ０１ （Ｂ）は同時にアセトバクタ
ー・アセチＡ１０２３に存在Ｌ７、該萌より両者の混在
物として分離することができる。
スミドｐＴＡ５’ｏ０１ （Ｂ）は同時にアセトバクタ
ー・アセチＡ１０２３に存在Ｌ７、該萌より両者の混在
物として分離することができる。
アセトバクター・アセチＡ１０２３は酢酸発酵醪から単
離・同定されたものであり、（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ
。
離・同定されたものであり、（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ
。
Ｃｈｅｍ、、 ４４（１２）、２９０１〜２９０６．１
９Ｆ３０）プラスミドｐＴＡ５００１ （Ａ）及びプラ
スミドｐＴＡ５［１［１１（Ｒ）を含んだませ微工研［
ＦＦＲＭ Ｐ−７１２２として寄託されている。
９Ｆ３０）プラスミドｐＴＡ５００１ （Ａ）及びプラ
スミドｐＴＡ５［１［１１（Ｒ）を含んだませ微工研［
ＦＦＲＭ Ｐ−７１２２として寄託されている。
アセトバクター・アセチＡｌＯ２ろけ菌学的性質におい
てパーシイ第８版のアセトバクター・アセチの菌学的性
質の記載とよく一致し、更に酢酸耐性及びエタノール酸
化能を有することで特徴的であり、ＡＣｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ ａｃｅｔｉ ＡｌＯ２ろ（Ａｃｅ’。
てパーシイ第８版のアセトバクター・アセチの菌学的性
質の記載とよく一致し、更に酢酸耐性及びエタノール酸
化能を有することで特徴的であり、ＡＣｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ ａｃｅｔｉ ＡｌＯ２ろ（Ａｃｅ’。
ｇｔｈ＋＋）と表示は１．ることもある。
アセトバクター・アセチ４１０２３け、例えば通常的圧
は下記のＹＰＧ培地で培養さ几、また形質転換株の検出
にけＹＰＧ培地に抗生物質等の薬剤を適当な濃度となる
ようＶＣｌ例えばアンピアリンを５０ｒ／ＩＩＬｌの濃
度となるように、添加したものを用いて培養さノしる。
は下記のＹＰＧ培地で培養さ几、また形質転換株の検出
にけＹＰＧ培地に抗生物質等の薬剤を適当な濃度となる
ようＶＣｌ例えばアンピアリンを５０ｒ／ＩＩＬｌの濃
度となるように、添加したものを用いて培養さノしる。
（ＹＰＧ培地）
イーストエキストラクト ０．５チ
ボリベプトン ０．２チ
グルコース ３．０チ
寒天（固体培地の場合）２．０チ
ｐＩ（−４５
アセトバクター・アセチ、（６１０２３はｙｐｏＭ体培
地で、３０℃で２４〜５６時間振とり培養し、培養液を
遠心分離処理して集菌される。菌体は緩衝液で十分洗浄
し、緩衝液に懸濁され、これＫＩＪゾチームが添加さｔ
し、溶菌される。溶菌液に、け界面活性剤及び食塩が添
加され、静置後遠心分離し、上清にポリエチレングリコ
ールが添加芒第１．静置後遠心分離し沈澱物を得る。こ
の沈澱物を緩衝液に溶解し、エチジウムブロマイドを加
え、更に塩化セシウムを加え、密度を１．５７に合わせ
、密度勾配遠心分離を行こなう。遠心分離後、遠心チュ
ーブに紫外線ランプで５６５ｎｍの紫外線照射により、
染色体バンドの下に出たバンドを分取する。
地で、３０℃で２４〜５６時間振とり培養し、培養液を
遠心分離処理して集菌される。菌体は緩衝液で十分洗浄
し、緩衝液に懸濁され、これＫＩＪゾチームが添加さｔ
し、溶菌される。溶菌液に、け界面活性剤及び食塩が添
加され、静置後遠心分離し、上清にポリエチレングリコ
ールが添加芒第１．静置後遠心分離し沈澱物を得る。こ
の沈澱物を緩衝液に溶解し、エチジウムブロマイドを加
え、更に塩化セシウムを加え、密度を１．５７に合わせ
、密度勾配遠心分離を行こなう。遠心分離後、遠心チュ
ーブに紫外線ランプで５６５ｎｍの紫外線照射により、
染色体バンドの下に出たバンドを分取する。
ここに得らｎるバンドにはプラスミドｐＴＡ５’００１
（Ａ）とプラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）が混在してい
る。
（Ａ）とプラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）が混在してい
る。
混在する２つのプラスミドは制限酵素による解析の結果
、はじめて２種類のほぼ同−分子量のプラスミドの混在
物であることが明らかとなったものである、 プラスミドｐＴ−Ａ５００１ （Ａ）の分子量は２３．
５Ｋ）ｌで、制限酵素開裂地図は第１図に示さｎ、る。
、はじめて２種類のほぼ同−分子量のプラスミドの混在
物であることが明らかとなったものである、 プラスミドｐＴ−Ａ５００１ （Ａ）の分子量は２３．
５Ｋ）ｌで、制限酵素開裂地図は第１図に示さｎ、る。
また、プラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）の分子量け２２
．５に＋）で、制限酵素開裂地図は第２図に示きγＬる
。
．５に＋）で、制限酵素開裂地図は第２図に示きγＬる
。
第１図及び第２図に示８れる略記号の意味は次の通りで
ある。
ある。
Ｂ：Ｆｔｒ、ｏＴもＩ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉＲＹ１３給源の制限酵素 Ｓ ： ８ａｌｌ ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｌｈｕｓ Ｇ給源の制限酵素 Ｘ ： Ｘ４＋１１ Ｉ ： Ｘｈａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ｈｏｌｃｉｃｎｌａ給源の制限酵素 本発明のプラスミドｐＴＡ５００１（Ａ）及びプラスミ
ドｐＴＡ５０［］１（Ｂ）けいずｎもＸｈｎＩによって
ただ１ケ所のみ切断されることによってきわめて特徴的
であって、この切断部位に他のプラスミド断片や染色体
断片を導入し、キメラプラスミドを作成するのがきわめ
て容易である。
ｉＲＹ１３給源の制限酵素 Ｓ ： ８ａｌｌ ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｌｈｕｓ Ｇ給源の制限酵素 Ｘ ： Ｘ４＋１１ Ｉ ： Ｘｈａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ｈｏｌｃｉｃｎｌａ給源の制限酵素 本発明のプラスミドｐＴＡ５００１（Ａ）及びプラスミ
ドｐＴＡ５０［］１（Ｂ）けいずｎもＸｈｎＩによって
ただ１ケ所のみ切断されることによってきわめて特徴的
であって、この切断部位に他のプラスミド断片や染色体
断片を導入し、キメラプラスミドを作成するのがきわめ
て容易である。
本発明のプラスミドＤＴＡ５００１（Ａ）及びプラスミ
ドｐＴＡ５ＤＯ１（Ｒ）はそれぞれ単独も１．＜は混在
物で酢酸菌ベクターとして使用されるものである。
ドｐＴＡ５ＤＯ１（Ｒ）はそれぞれ単独も１．＜は混在
物で酢酸菌ベクターとして使用されるものである。
即ち、プラスミドｐＴＡ５［］ｒ口（Ａ）及び／又はプ
ラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）にプラスミド断片又は染
色体断片を導入［７たキメラプラスミドは、酢酸菌（ア
セトバクター組菌、グルコノバクタ−椙菌）に容易に移
入することができ、酢酸菌の形質転換及び／又は物質生
産に新たな画期的手法を提供するものである。
ラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）にプラスミド断片又は染
色体断片を導入［７たキメラプラスミドは、酢酸菌（ア
セトバクター組菌、グルコノバクタ−椙菌）に容易に移
入することができ、酢酸菌の形質転換及び／又は物質生
産に新たな画期的手法を提供するものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１、ＤＮＡ受容菌体の調製
アセトバクター・アセチＡ １〔ｌ ２３ 、 ＦＢＲ
Ｍ Ｐ−７１２２より１００μｇ／ｌｎ＃に度のニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）変異処理によって得られたプロ
リン要求性（Ｐｒｏ−）の親株であるアセトバクター・
アセチ１０−８ （Ａｃｅｒ、 Ｄｔｈ＋”、 Ｐｒｎ
−）から自然変異によ−って得た酢酸耐性およびエタノ
ール酸化能が低下、欠失（ＡｃｅＳ！Ｊ、 Ｆｉｔｈ−
） Ｌ、、かつ、ストレプトマイシン耐性（Ｓｔｒｒ）
の菌株であるアセトバクター・アセチ１０−８０８１
（ＡｃｅＳＳ＋ Ｒｔ ｈ −＋ Ｐ ｒｎ−ｐ Ｓ
ｔ ｒｒ）を５００ｍＡ！坂ロフラスコに入才した１０
０ｍ１！ＹＰＧ液体培地に接種し、６０℃で２０時間振
とう培養した。
Ｍ Ｐ−７１２２より１００μｇ／ｌｎ＃に度のニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）変異処理によって得られたプロ
リン要求性（Ｐｒｏ−）の親株であるアセトバクター・
アセチ１０−８ （Ａｃｅｒ、 Ｄｔｈ＋”、 Ｐｒｎ
−）から自然変異によ−って得た酢酸耐性およびエタノ
ール酸化能が低下、欠失（ＡｃｅＳ！Ｊ、 Ｆｉｔｈ−
） Ｌ、、かつ、ストレプトマイシン耐性（Ｓｔｒｒ）
の菌株であるアセトバクター・アセチ１０−８０８１
（ＡｃｅＳＳ＋ Ｒｔ ｈ −＋ Ｐ ｒｎ−ｐ Ｓ
ｔ ｒｒ）を５００ｍＡ！坂ロフラスコに入才した１０
０ｍ１！ＹＰＧ液体培地に接種し、６０℃で２０時間振
とう培養した。
培養液は０℃で、６．Ｏ［ｌＯｘｇで、１０分間遠心分
離し、集菌する。菌体は１００ ｍＭ Ｎａ（Ｊ及び５
ｍＭＭｇＣｄｔを含有する５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）の０５倍容量で２回洗滌する。再び０℃で６
，０００ｘｇで、５分間遠心分離し、集菌する。
離し、集菌する。菌体は１００ ｍＭ Ｎａ（Ｊ及び５
ｍＭＭｇＣｄｔを含有する５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）の０５倍容量で２回洗滌する。再び０℃で６
，０００ｘｇで、５分間遠心分離し、集菌する。
この菌体には０．４倍答量のｅａ（’４２容液（１００
ｍＭＣａＣｄ ｔ １２５０ｍＭ ＫＱ！ 、 ５ｍＭ
ＭｙＣｌｌ ２．５ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ −Ｈ（Ｊ
ｌｐＨ７，６）が加えらｎ、０℃で５０分間静置した後
０℃で、６，０００ｘｇで、５分間遠心分離し、集菌す
る。
ｍＭＣａＣｄ ｔ １２５０ｍＭ ＫＱ！ 、 ５ｍＭ
ＭｙＣｌｌ ２．５ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ −Ｈ（Ｊ
ｌｐＨ７，６）が加えらｎ、０℃で５０分間静置した後
０℃で、６，０００ｘｇで、５分間遠心分離し、集菌す
る。
菌体には０．００４倍容邦−の上記Ｃａ（Ｍ？浴溶液添
加しＤＮＡ受容菌体懸濁液とした。
加しＤＮＡ受容菌体懸濁液とした。
実施例２、プラスミドｐＴＡ５００１ （Ａ）とプラス
ミドｐＴＡ５ｏｏ１（Ｂ）の混在物の単離アセトバクタ
ー・アセチ／／ｇｌ ０２３ 、 ＦＦ！ｒＬＭ Ｐ−
７１２２を４０ｍ１のＹＰＧ培地に植菌し、６０°Ｃで
一晩振とり培養した。
ミドｐＴＡ５ｏｏ１（Ｂ）の混在物の単離アセトバクタ
ー・アセチ／／ｇｌ ０２３ 、 ＦＦ！ｒＬＭ Ｐ−
７１２２を４０ｍ１のＹＰＧ培地に植菌し、６０°Ｃで
一晩振とり培養した。
その後新らしいＹＰＧ培地４１に１チで植え継ぎさらに
６０′Ｇで５６時間振とり培養した。
６０′Ｇで５６時間振とり培養した。
集画後、ＴＥ緩衝液（２０ｍＭＥＤＴＡ 、 ５０ ｍ
Ｍ ）リス塩酸、ｐ１４８．０ ）で２同条体を洗浄し
た。
Ｍ ）リス塩酸、ｐ１４８．０ ）で２同条体を洗浄し
た。
侍らｎた湿菌体２ｇあたり７ｍｌのＴＢＳ緩衝液（５０
ｍＭトリス塩酸、２０ｍＭＥＤＴＡ、２５％ショ糖、ｐ
Ｈ８，０）を加え、菌体を懸濁し、４１ｎｌのリゾチー
ム液（０，２５Ｍ）リス塩酸、リゾチーム２憾、ｐｌ（
８，０）をさらに加え、０℃で５分静置した。次ＫＯ，
２ＳＭＥＤＴＡ液（ｐｆ１８．０ ）ｉ４ｍｌ加え、０
℃で５分静置した後、６７℃で２０分間反応芒せた。反
応後、３＃Ｌｔの１０係ラウリル硫酸ナトリウムを加え
、３７℃で２０分間静置後、５ｍｌの５Ｍ食塩水を加え
、０℃で一夜静置した。４８，２００ｘｒで６０分間遠
心分離をかけ、上清を分取した。次にこの上清に最終濃
度で１０チになるようにポリエチレングリコール６．０
００を加え、４℃で一夜静置した後、３．０００Ｘｆで
１０分間遠心分離し、沈澱物を得た。
ｍＭトリス塩酸、２０ｍＭＥＤＴＡ、２５％ショ糖、ｐ
Ｈ８，０）を加え、菌体を懸濁し、４１ｎｌのリゾチー
ム液（０，２５Ｍ）リス塩酸、リゾチーム２憾、ｐｌ（
８，０）をさらに加え、０℃で５分静置した。次ＫＯ，
２ＳＭＥＤＴＡ液（ｐｆ１８．０ ）ｉ４ｍｌ加え、０
℃で５分静置した後、６７℃で２０分間反応芒せた。反
応後、３＃Ｌｔの１０係ラウリル硫酸ナトリウムを加え
、３７℃で２０分間静置後、５ｍｌの５Ｍ食塩水を加え
、０℃で一夜静置した。４８，２００ｘｒで６０分間遠
心分離をかけ、上清を分取した。次にこの上清に最終濃
度で１０チになるようにポリエチレングリコール６．０
００を加え、４℃で一夜静置した後、３．０００Ｘｆで
１０分間遠心分離し、沈澱物を得た。
この沈澱物を７ ｍ、ｌのＵＣ緩衝液（５［１ｍＭ）リ
ス塩酸、５ ｍＭ ［ＩＴＡ、 ５ＤｍＭ Ｎａｒｄ、
ｐｌ４７．８ ）に溶解させた後、最終濃ｆＫで５００
ａ ｇ／ｍｌになるようにエチジウムブロマイドを加
え、烙らに塩化セシウムを加えて密度を１．５７に合わ
せた。この溶液を１５℃、１０［１，２００Ｘｒで４０
時間密度勾配遠心分離をおこなった。遠Ｉｂ分離後、遠
心チューブに紫外線ランプで５６５μｍの紫外線を照射
することにより、染色体バンドの下にあられれろバンド
をプラスミド分画として分取した。次いで、分画液をイ
ソプロパツールで処理し、エチジウムブロマイドを除去
した後、ＴＢ緩衝ｇ （１０ｍ＾・１トリス塩酸、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ１５）に対して透析した。これ
をプラスミド混在溶液と［７た。
ス塩酸、５ ｍＭ ［ＩＴＡ、 ５ＤｍＭ Ｎａｒｄ、
ｐｌ４７．８ ）に溶解させた後、最終濃ｆＫで５００
ａ ｇ／ｍｌになるようにエチジウムブロマイドを加
え、烙らに塩化セシウムを加えて密度を１．５７に合わ
せた。この溶液を１５℃、１０［１，２００Ｘｒで４０
時間密度勾配遠心分離をおこなった。遠Ｉｂ分離後、遠
心チューブに紫外線ランプで５６５μｍの紫外線を照射
することにより、染色体バンドの下にあられれろバンド
をプラスミド分画として分取した。次いで、分画液をイ
ソプロパツールで処理し、エチジウムブロマイドを除去
した後、ＴＢ緩衝ｇ （１０ｍ＾・１トリス塩酸、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ１５）に対して透析した。これ
をプラスミド混在溶液と［７た。
得ら！″したプラスミド混在溶液中には２つの環状プラ
スミドが混在しており、制限酵素による解析の結果、Ｎ
１，１図に示すプラスミドｐＴＡ５０Ｄ１ （Ａ）と第
２図に示すプラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）であること
が明らかとなった。
スミドが混在しており、制限酵素による解析の結果、Ｎ
１，１図に示すプラスミドｐＴＡ５０Ｄ１ （Ａ）と第
２図に示すプラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ）であること
が明らかとなった。
すなわち前記で調製したプラスミド混在溶液に対し、少
なくとも５倍量過剰の制限酵素（ＥｃｎＲＩおよび５ａ
ｌＩは全酒造社製、ＸｈｎＩけ、ベセスダ・リサーチ社
製を使用した。）を常法に従がって各々の制限酵素の至
適条件下で反応式せた。反応後、垂直型アガロ−スゲ゛
ル電気泳動で分析［７た。即ち、１％アガロースゲルを
用い、トリス酢酸緩衝液（４０ｍＭトリス、２０ ｍＭ
酢酸、２ ｍｔＶ ＥＤＴＡ。
なくとも５倍量過剰の制限酵素（ＥｃｎＲＩおよび５ａ
ｌＩは全酒造社製、ＸｈｎＩけ、ベセスダ・リサーチ社
製を使用した。）を常法に従がって各々の制限酵素の至
適条件下で反応式せた。反応後、垂直型アガロ−スゲ゛
ル電気泳動で分析［７た。即ち、１％アガロースゲルを
用い、トリス酢酸緩衝液（４０ｍＭトリス、２０ ｍＭ
酢酸、２ ｍｔＶ ＥＤＴＡ。
ｐｌ−１８，１）中で泳動芒せた。その後、ゲ゛ルをエ
チジウムブロマイドの１μｇ １ｍｌ液に浸して染色し
７た。このゲルに紫外線を照射し、生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から、各々の分子量を算出した。
チジウムブロマイドの１μｇ １ｍｌ液に浸して染色し
７た。このゲルに紫外線を照射し、生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から、各々の分子量を算出した。
既知の各断片の泳動距離から作成した標準線をもとに算
出した。
出した。
各種制限酵素を単独で用いて得ら几た各断力及び各制限
酵素の２種以上を組合わせて用いた処理によって得らｎ
た各断片の断片数及び分子量などからｐＴＡ５００１
（Ａ）及びｐＴＡ５［］０１（Ｂ）の第１図及び第２図
に示した制限酵素開裂地図が決定された。
酵素の２種以上を組合わせて用いた処理によって得らｎ
た各断片の断片数及び分子量などからｐＴＡ５００１
（Ａ）及びｐＴＡ５［］０１（Ｂ）の第１図及び第２図
に示した制限酵素開裂地図が決定された。
実施例ろ、プラスミドｐＴＡ５Ｄｒ１１（Ａ）とプラス
ミドＩ）Ｔｉ６Ｏ１１（Ｂ）の混在物のベクターとして
の利用 実施例２で得らｔしたプラスミド混在溶液（ＤＮＡ１ｉ
Ｏａｇ）中に、大腸菌薬剤耐性ベクターであるＩ）Ａ
ＣＹＣ１７７（カナマイシン耐性及びアンピシリン耐性
； Ｊｎｕｒｎａｌ ｎｆ Ｂｐ＋ｃｔｅｒｉｎｌｎｇ
ｙ 、 １３４ｆ３１＊１１４１−１１５６ 、１９７
８ ）を持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｎｌｉ
Ｃ６００）から得たプラスミドｐＡｃＹｃ１７７（第
６図に示す。ＤＮＡｈｉ２μｇ）を添加し、少なくとも
５倍量過剰の制限酵素ＸｈｎＩを常法により至適条件下
で反応させ、反応終了後、等量のフェノールを加え激し
く攪拌して制限酵素を失活させた後、さらにエーテル抽
出を充分性なってフェノールを除去し、さらに２倍量の
エタノールを加えて一８０℃に１時間保持した後、１５
．Ｄ ＯＯＸｆで５分間遠心分離を行なってＤＮＡを法
師させ、芒らに真空乾燥してエタノールを除去した後、
次に沈澱を水に溶解後、常法によってＴ４ＤＮＡ＋ｊガ
ーゼによる反応を２１℃で２時間行ない、さらに前記と
同様にしてエタノール沈澱、真空乾燥を行なって得られ
た沈澱をＴＢ緩衝液０１ｍ１に溶解してキメラプラスミ
ド含有溶液を得た。
ミドＩ）Ｔｉ６Ｏ１１（Ｂ）の混在物のベクターとして
の利用 実施例２で得らｔしたプラスミド混在溶液（ＤＮＡ１ｉ
Ｏａｇ）中に、大腸菌薬剤耐性ベクターであるＩ）Ａ
ＣＹＣ１７７（カナマイシン耐性及びアンピシリン耐性
； Ｊｎｕｒｎａｌ ｎｆ Ｂｐ＋ｃｔｅｒｉｎｌｎｇ
ｙ 、 １３４ｆ３１＊１１４１−１１５６ 、１９７
８ ）を持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｎｌｉ
Ｃ６００）から得たプラスミドｐＡｃＹｃ１７７（第
６図に示す。ＤＮＡｈｉ２μｇ）を添加し、少なくとも
５倍量過剰の制限酵素ＸｈｎＩを常法により至適条件下
で反応させ、反応終了後、等量のフェノールを加え激し
く攪拌して制限酵素を失活させた後、さらにエーテル抽
出を充分性なってフェノールを除去し、さらに２倍量の
エタノールを加えて一８０℃に１時間保持した後、１５
．Ｄ ＯＯＸｆで５分間遠心分離を行なってＤＮＡを法
師させ、芒らに真空乾燥してエタノールを除去した後、
次に沈澱を水に溶解後、常法によってＴ４ＤＮＡ＋ｊガ
ーゼによる反応を２１℃で２時間行ない、さらに前記と
同様にしてエタノール沈澱、真空乾燥を行なって得られ
た沈澱をＴＢ緩衝液０１ｍ１に溶解してキメラプラスミ
ド含有溶液を得た。
そｎぞ几のキメラシラスミドはいずｎもプラスミドｐＡ
ＣＹＣ１７７を含有している。しかＬ７、プラスミドｐ
Ａ、ＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性部位にＸｈｎＩ切
断点があって、そこが切断さ１１でいるためにカナマイ
シン耐性は発現せず、アン１イゾリン耐性のみが発現す
ることになる。
ＣＹＣ１７７を含有している。しかＬ７、プラスミドｐ
Ａ、ＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性部位にＸｈｎＩ切
断点があって、そこが切断さ１１でいるためにカナマイ
シン耐性は発現せず、アン１イゾリン耐性のみが発現す
ることになる。
次に実施例１で得らｎたＤＮＡ受容菌体懸濁液０２ｍ１
を用意し、これに上記そｆＬぞｎのキメラプラスミド含
有溶液を加え、０℃で９０分間ゆるやかに攪拌しつつ、
キメラシラスミドの直接導入を行なった。
を用意し、これに上記そｆＬぞｎのキメラプラスミド含
有溶液を加え、０℃で９０分間ゆるやかに攪拌しつつ、
キメラシラスミドの直接導入を行なった。
ここに得らｎたキメラプラスミド導入菌体を含む液を６
ＨのＹＰＧ培地（（移［７、′５０°Ｃ６時間振とう培
養を行なった後。
ＨのＹＰＧ培地（（移［７、′５０°Ｃ６時間振とう培
養を行なった後。
アンピシリン５０γ／ｍｌ添加したＹＰＧ培地（固体）
上でろＯ℃で５日間鳴養し、９珠のコロニーを得た。こ
几らを１０−ＦＩＤＩ −Ａ、１〜−人９と命名した。
上でろＯ℃で５日間鳴養し、９珠のコロニーを得た。こ
几らを１０−ＦＩＤＩ −Ａ、１〜−人９と命名した。
このうち、１Ｏ−８０８１−ＡＩをアンピシリンを６０
γ／ｍｌ添加したｙｐｎ液体培地で５０℃、２４時時間
表り培養【７、実施例２の方法に従ってプラスミドを分
離して解析Ｉ７たところ、プラスミドｐＴＡ、５００１
（Ａ）とプラスミド、ＴＡ５ＤＯ１（Ｂ）の混在物以外
にこ几らよりやや分子間の大きいプラスミドが得らｎ、
た、このプラスミドは先に導入したキメラプラスミドの
うち、’ｐＴＡ５００１（Ａ）とｐＡＣＹＣ１７７がＸ
ｈｎＩ切断部位を介して連結したキメラプラスミドと認
めら扛た。寸だ、アセトバクター・アセチ１０−８０８
１はアンピシリン耐性を有しないが１０−８０８１−Ａ
Ｉはアンピシリン耐性を持っていることなどからもキメ
ラプラスミドが導入され、形何転換が行なわれたことが
確認烙ｎた。
γ／ｍｌ添加したｙｐｎ液体培地で５０℃、２４時時間
表り培養【７、実施例２の方法に従ってプラスミドを分
離して解析Ｉ７たところ、プラスミドｐＴＡ、５００１
（Ａ）とプラスミド、ＴＡ５ＤＯ１（Ｂ）の混在物以外
にこ几らよりやや分子間の大きいプラスミドが得らｎ、
た、このプラスミドは先に導入したキメラプラスミドの
うち、’ｐＴＡ５００１（Ａ）とｐＡＣＹＣ１７７がＸ
ｈｎＩ切断部位を介して連結したキメラプラスミドと認
めら扛た。寸だ、アセトバクター・アセチ１０−８０８
１はアンピシリン耐性を有しないが１０−８０８１−Ａ
Ｉはアンピシリン耐性を持っていることなどからもキメ
ラプラスミドが導入され、形何転換が行なわれたことが
確認烙ｎた。
同様にして、少なくとも１０−８１’）８１−Ａ２−−
Ａ６はｐＴＡ５００１（Ｂ）とｐＡｃＹｃｌ ７７が制
限酵素ＸｈｎＩ切断部位を介して連結したキメラシラス
ミドが導入式ｎていることが確認をｆ′した。
Ａ６はｐＴＡ５００１（Ｂ）とｐＡｃＹｃｌ ７７が制
限酵素ＸｈｎＩ切断部位を介して連結したキメラシラス
ミドが導入式ｎていることが確認をｆ′した。
また、１０−８１１８１−Ａｌ−−Ａ６の持つキメラプ
ラスミドを再度１ｎ−ｅｎｓｉに前記と同様の方法で導
入したところ、１０−８０８１４１〜−Ａ６の各キメラ
プラスミドにおいて、１７７ｇＤＮＡ量当りに換算して
１０５個前後のアンピシリン耐性の形質転換株が得られ
た。
ラスミドを再度１ｎ−ｅｎｓｉに前記と同様の方法で導
入したところ、１０−８０８１４１〜−Ａ６の各キメラ
プラスミドにおいて、１７７ｇＤＮＡ量当りに換算して
１０５個前後のアンピシリン耐性の形質転換株が得られ
た。
第１図はプラスミドｐＴＡ５００１ （Ａ）の制限酵素
開裂地図を示し、第２図はプラスミドｐＴＡ５００１（
ｎ）の制限酵素開裂地図を示し、第６図はプラスミドｐ
ＡｃＹｃ１７７の制限酵素開裂地図を示す。 Ｅ・・・Ｅｃ’ｎＲＩによる切断部位、Ｓ・・・８ａｌ
Ｉによる切断部位、Ｘ・・・ＸｈｎＩによる切断部位
、Ｋｍ・・・カナマイシン耐性遺伝子、Ａｍ・・・アン
ピシリン耐性遺伝子 代理人 弁理士 戸 １）親 男
開裂地図を示し、第２図はプラスミドｐＴＡ５００１（
ｎ）の制限酵素開裂地図を示し、第６図はプラスミドｐ
ＡｃＹｃ１７７の制限酵素開裂地図を示す。 Ｅ・・・Ｅｃ’ｎＲＩによる切断部位、Ｓ・・・８ａｌ
Ｉによる切断部位、Ｘ・・・ＸｈｎＩによる切断部位
、Ｋｍ・・・カナマイシン耐性遺伝子、Ａｍ・・・アン
ピシリン耐性遺伝子 代理人 弁理士 戸 １）親 男
Claims (1)
- ２３、５ Ｋｂの分子量で、第１図に示される制限酵素
開裂地図で示さ才９．るプラスミドｐＴＡ５ｒＩ０１（
Ａ）及び／又は２２．５ Ｋｂの分子量で、第２図に示
される制限酵素開裂地図で示されるプラスミドｏＴＡ５
ｏｏ１（Ｂ）からなることを特徴上する酢酸菌ベクター
。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58116149A JPS609488A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 酢酸菌ベクタ− |
| JP25431490A JPH03151881A (ja) | 1983-06-29 | 1990-09-26 | プラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ） |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58116149A JPS609488A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 酢酸菌ベクタ− |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25431490A Division JPH03151881A (ja) | 1983-06-29 | 1990-09-26 | プラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ） |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS609488A true JPS609488A (ja) | 1985-01-18 |
| JPH0363356B2 JPH0363356B2 (ja) | 1991-09-30 |
Family
ID=14679964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58116149A Granted JPS609488A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 酢酸菌ベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS609488A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61139388A (ja) * | 1984-12-11 | 1986-06-26 | Nakano Vinegar Co Ltd | 薬剤耐性遺伝子を用いるグルコノバクタ−属酢酸菌の形質転換方法 |
| US4826768A (en) * | 1987-04-27 | 1989-05-02 | Texaco Inc. | Polyoxyalkylene glycol conversion to monocarboxylic acid |
| US5344777A (en) * | 1990-02-26 | 1994-09-06 | Nakano Vinegar Co., Ltd. | Structural gene of membrane-bound alcohol dehydrogenase complex, plasmid containing the same and transformed acetic acid bacteria |
| WO2003078622A1 (fr) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Mitsukan Group Corporation | Gene cyclase de squalene-hopene de bacterie acetique, bacterie acetique cultivee avec ce gene et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie |
| WO2004053122A1 (ja) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | Mitsukan Group Corporation | 酢酸菌の温度耐性向上遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 |
| US7354751B2 (en) | 2003-03-12 | 2008-04-08 | Mitsukan Group Corporation | Alcohol dehydrogenase gene of acetic acid bacterium |
-
1983
- 1983-06-29 JP JP58116149A patent/JPS609488A/ja active Granted
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61139388A (ja) * | 1984-12-11 | 1986-06-26 | Nakano Vinegar Co Ltd | 薬剤耐性遺伝子を用いるグルコノバクタ−属酢酸菌の形質転換方法 |
| US4826768A (en) * | 1987-04-27 | 1989-05-02 | Texaco Inc. | Polyoxyalkylene glycol conversion to monocarboxylic acid |
| US5344777A (en) * | 1990-02-26 | 1994-09-06 | Nakano Vinegar Co., Ltd. | Structural gene of membrane-bound alcohol dehydrogenase complex, plasmid containing the same and transformed acetic acid bacteria |
| WO2003078622A1 (fr) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Mitsukan Group Corporation | Gene cyclase de squalene-hopene de bacterie acetique, bacterie acetique cultivee avec ce gene et procede de production de vinaigre au moyen de cette bacterie |
| WO2004053122A1 (ja) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | Mitsukan Group Corporation | 酢酸菌の温度耐性向上遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 |
| US7256025B2 (en) | 2002-12-09 | 2007-08-14 | Mitsukan Group Corporation | Gene improving temperature-tolerance of acetic acid bacterium, acetic acid bacterium bred using the gene and process for producing vinegar using the acetic acid bacterium |
| CN100335627C (zh) * | 2002-12-09 | 2007-09-05 | 株式会社味滋集团公司 | 提高醋酸细菌温度耐受性的基因、利用该基因培育的醋酸细菌以及利用该醋酸细菌生产醋的方法 |
| US7354751B2 (en) | 2003-03-12 | 2008-04-08 | Mitsukan Group Corporation | Alcohol dehydrogenase gene of acetic acid bacterium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0363356B2 (ja) | 1991-09-30 |
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