JPH0543348B2 - - Google Patents

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JPH0543348B2
JPH0543348B2 JP58501746A JP50174683A JPH0543348B2 JP H0543348 B2 JPH0543348 B2 JP H0543348B2 JP 58501746 A JP58501746 A JP 58501746A JP 50174683 A JP50174683 A JP 50174683A JP H0543348 B2 JPH0543348 B2 JP H0543348B2
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plasmid
lactis
kluyveromyces
dna
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Korunerisu Teodoru Beritsupusu
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Description

請求の範囲 １ 組み換え体DNAプラスミドを含むクルイベ
ロマイセス属の酵母であつて、 (i) プレプロソーマチン、プレソーマチン、プロ
ソーマチン、ソーマチン、これらの天然由来の
対立型又は変異型および生成物の発現や性質に
有意に悪影響を及ぼさないこれらの人工修飾型
からなる群から選ばれるソーマチン様生成物を
コードする構造遺伝子、 (ii) クルイベロマイセス・ラクテイス（所謂
KARS）由来の自律的に複製する配列、およ
び (iii) サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ
（GAPDH）遺伝子由来の酵母レギユロンを包
含し、この酵母は組み換え体DNAプラスミド
にてコードされるソーマチン様生成物を発現し
うることを特徴とする、上記酵母。 ２ 酵母はクルイベロマイセス・ラクテイスであ
る、特許請求の範囲第１項記載の酵母。 ３ 組み換え体DNAプラスミドは野生株K.ラク
テイスCBS2360由来のKARS−配列を含む、特
許請求の範囲第１項記載の酵母。 ４ 組み換え体DNAプラスミドはさらに選択マ
ーカおよび／又は酵母由来転写ターミネータおよ
び／又は酵母由来動原体および／又は酵母由来複
製領域を含む、特許請求の範囲第１項記載の酵
母。 ５ クルイベロマイセス属酵母の調製法におい
て、 (i) プレプロソーマチン、プレソーマチン、プロ
ソーマチン、ソーマチン、これらの天然由来対
立型又は変異型および生成物の発現や性質に有
意に悪影響を及ぼさないこれらの人工修飾型か
らなるソーマチン様生成物をコードする構造遺
伝子、 (ii) クルイベロマイセス・ラクテイス（所謂
KARS）由来の自律的に複製する配列、およ
び (iii) サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ
（GAPDH）遺伝子由来の酵母レギユロンから
なる組み換え体DNAプラスミドを調製し、つ
いでこのプラスミドをクルイベロマイセス属の
酵母に導入し、得られた酵母は組み換え体
DNAプラスミドにてコードされるソーマチン
様生成物を発現しうることを特徴とする、上記
方法。 ６ 酵母はクルイベロマイセス・ラクテイスであ
る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 組み換え体DNAプラスミドはK.ラクテイス
CBS2360野生株由来のKARS−配列を含む、特
許請求の範囲第５項記載の方法。 ８ 組み換えDNAプラスミドはさらに選択マー
カおよび／又は酵母由来転写ターミネータおよ
び／又は酵母由来動原体および／又は酵母由来複
製領域を含む、特許請求の範囲第５項記載の方
法。 明細書 本発明は、組換えDNA技術で可能となつたプ
レプロソーマチン及び関連化合物の微生物学的製
造法に関する。いずれも1982年６月23に公告され
たヨーロツパ特許出願（A2）0054330号及び
0054331号にはプロプロソーマチンの種々の対立
型、プロソーマチン、プロソーマチン及びソーマ
チンの様なその成熟型及びそれ等の誘導型を暗号
づけるDNA配列又該DNA配列より成るクローニ
ングビヒクル（伝播体）、又それ等の微生物特に
エシエリヒア コリー（E.coli）を形質転換する
ための使用及びソーマチン様蛋白質の製造法が記
載されている。 商業的に魅力ある生産のためには、エシエリヒ
ア コリー（E.coli）について得られる収量は充
分でないので、ソーマチン様蛋白質をはるかに高
い量生産出来る微生物系の必要性が存在する。ソ
ーマチン様蛋白質とは、プレプロソーマチン、そ
の種々の対立型又は誘導型及びプレソーマチン、
プロソーマチン及びソーマチンの様なそれ等の成
熟型を意味する。 上記のヨーロツパ特許出願に記載された構造遺
伝子はクルイベロミセス ラクテイス
（Kluyveromyces lactis）（いわゆるKARS）起
源の自律的に複製する配列、撰択マーカー、及び
プラスミド中への酵母レギユロンと組み合され、
そのプラスミドはクルイベロミセス属の酵母細胞
中に導入され次いでソーマチン様蛋白質を生産し
得る様になることが分つた。この方法で酵母細胞
中のソーマチン様蛋白質の発現が成功した。 従つて、本発明は： (i) プレプロソーマチン又はその各種の対立型、
又は修飾型又はそれ等の成熟型を暗号づける構
造遺伝子、 (ii) クルイベロミセス ラクテイス
Kluyveromyces lactis（いわゆるKARS）起源
の自律的複製配列、 (iii) サツカロミセス セレビシエー
Saccharomyces cerevisiaeのグリセルアルデ
ヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）
遺伝子から誘導された酵母レギユロン及び (iv) trp−１又はlac−４遺伝子の様な撰択マーカ
ーより成る組換えDNAプラスミドを含むクル
イベロミセス属の酵母を提供するものである。 この方法で、希望する蛋白質の大きく改良され
た発現が得られ、従つて商業的応用はずつと近付
いて来ている。 望ましくはプラスミドは酵母より誘導された転
写停止暗号及び／又は動原体及び／又は酵母から
誘導された複製領域を含むものである。 クルイベロミセス ラクテイス酵母について良
い結果が得られているがその他のクルイベロミセ
スの種も同様に効果的である可能性は充分であ
る。構造遺伝子は好ましくは上述のヨーロツパ特
許出願中に開示されている構造遺伝子より成る群
から選択されたものである。 以下に記載する様に満足すべきKARS−配列
が野生株K.lactis CBS2360から分離された。 クルイベロミセス ラクテイス（K.lactis）中
の形質転換の目的のため、例えばサツカロミセス
セレビジエー（S.cerevisiae）に起因するトリ
プトフアン遺伝子（trp−１）及びクルイベロミ
セス ラクテイス（K.lactis）に起因するラクタ
ーゼ遺伝子（lac−４）の様なベクター上の選択
可能なマーカーの使用が望ましい。此等のDNA
配列は選択マーカーとしてのみならず其の後の増
殖中にシステムに選択圧力を働かせる点において
も効果的である。 もし転写停止暗号が使用される場合、これは好
ましくはサツカロミセス セレビジエー（S.
cerevisiae）の２ミクロンDNAベクターのHind
−Eco Ｒ断片に起因する停止配列及びサツ
カロミセス セレビジエー（S.cerevisiae）の
GAPDH遺伝子から誘導される停止配列より成る
群より選ばれる。 動原体又は例えばサツカロミセス セレビジエ
ー（S.cerevisiae）又はクルイベロミセス ラク
テイス（K.lactis）の様な酵母染色体から誘導さ
れた複製領域の存在は本発明に従うプラスミドの
安定性を改良する。 本発明は更に、上記の様にクルイベロミセス属
の酵母の製造法を提供するものであつて、その方
法は上記構造遺伝子をKARS−配列及び構造遺
伝子の上流に酵母GAPDHレギユロン、及び選択
マーカー又任意には酵母の染色体から誘導された
動原体又は複製領域又任意には構造遺伝子の下流
に酵母から誘導された転写停止暗号を組み合せる
組み換えDNAプラスミドの調製とこれに続いて
この様に調製したプラスミドをクルイベロミセス
属の酵母中への導入により成つている。 最終的に、本発明はプレプロソーマチン又はそ
の各種の対立型又は修飾型又は上述のヨーロツパ
特許出願中に開示されたそれ等の成熟型及びその
様に調製した蛋白質の微生物学的調製法を提供
し、その方法は上記のクルイベロミセス属の酵母
を培養し次いで酵母により生産されたソーマチン
又はソーマチン様蛋白質を採取することにより成
る。 本発明を以下に詳述する。 クルイベロミセス属の酵母を、これ等の微生物
は食品や医薬品の製造に使用出来る多くの無害な
微生物群より成つているという理由により選ん
だ。例えばクルイベロミセス ラクテイス
（Kluyveromyces lactis）及びクルイベロミセス
フラジリス（Kluyveromyces fragilis）はア
メリカ合衆国FDAのグラスリスト（GRAS＝一
般的に安全と認められる）に記載されている安全
な種である。醗酵工程におけるクルイベロミセス
ラクテイス（K.lactis）の行動はエシエリヒア
コリー（E.coli）についてよりもよく知られて
いて全く管理可能である：醗酵液から酵母の分離
は例えばエシエリヒア コリー（E.coli）の場合
より好ましく、酵母はしばしばエシエリヒア コ
リー（E.coli）よりも大量の（細胞外又はペリプ
ラスム）蛋白質を生産する。従つてクルイベロミ
セス属の酵母はエシエリヒア コリー（E.coli）
よりも工業生産に好適である。 現在迄のところ、クルイベロミセスのためのベ
クターは全く知られていない。 広汎な研究と実験の結果としてホスト微生物ク
ルイベロミセス ラクテイスを形質転換させ更に
形質転換した細胞中で自律的に複製する新しいベ
クターが発見された。 新しいクルイベロミセス ラクテイス（K.
lactis）のベクターはクルイベロミセス ラクテ
イス（K.lactis）中の複製と維持の機能を制御す
る。此等の複製配列はクルイベロミセス ラクテ
イス（KARS）に起源をもつ配列を自律的に複
製する。 その高い形質転換頻度の故にKARS型のベク
ターが使用される。 最も好適な代表は既知サツカロミセス セレビ
ジエー（S.cerevisice）プラスミドYRp7（Stouhl
等Proc.Natl.Acad.Sci USA76、1035−1039）中
に挿入したKARS−２配列を含むクルイベロミ
セス ラクテイス（K.lactis）DNA断片より成
るハイブリドプラスミド（雑種プラスミド）であ
るpKARS−２である。 ベクター上には更に遺伝子クローニングを可能
にするための適切な制限部位がある。 エシエリヒア コリー（Escherichia coli）も
又好適なホストである。その場合アンピシリン耐
性遺伝子（Amp Ｒ）も又ベクター上の選択可能
なマーカーである。プラスミドは好ましくは増加
させられ、エシエリヒア コリー（E.coli）細胞
中に貯蔵される。形質転換した株はアンピシリン
を含む（100マイクログラム／ミリリツター）Ｌ
−ブロス上で選択的に生育する。形質転換した株
の１つ即ちエシエリヒア コリー（E.coli）
JA221（pKARS12）はオランダのSK
Baarn3742、Oosterstraat1にあるCentral
Burean VOOR SchimmelculturesにCBS353、
82（＝LMD82.20）の番号で1982年５月19日に寄
託された。プラスミドは例えばカツツ等の方法
で、J.Bacterol114（1973）577菌体から分離出来
る。 酵母ホストのプロトプラスト（原形質体）はト
リス、塩化カルシウム及び分子量が2000から6000
の範囲好ましくは4000のポリエチレングリコール
を含む通常のインキユベーシヨン培地の中で前述
のベクターにより形質転換される。 KARS−型プラスミドを使用すると、形質転
換物にトリプトフアン原栄養体を選択する可能性
がある。 形質転換細胞中のKARS−含有プラスミドの
自律的存在はDNA分析により示される。形質転
換物の未分解微小溶解物pKARSプラスミドの細
菌部である標識pBR322とのハイブリダイゼーシ
ヨン（雑種形成）によりサザーン法に従つて分析
した。 非形質転換クルイベロミセス ラクテイスlac
−４変異菌の微小溶解物と精製プラスミド調製物
の比較電気泳動は形質転換物にのみ、形質転換に
使用したプラスミドの高次コイル及び開環型に相
当する電気泳動移動度を持つハイブリツド形成バ
ンドの存在を示した。 形質転換細胞中のプラスミドの存在は酵母形質
転換物から調製したDNAによるE.coliの形質転
換と生じたE.coli形質転換物から同じプラスミド
を分離することにより更に確められた。 特に有用なホストはクルイベロミセス ラクテ
イスの変異菌SD11lac−4trp−１及びSD69lac−
４であり、これ等は野生株CBS2360から誘導さ
れオランダ国3242SK Baarn、Oosterstraat1の
Centraal Burean Voor Schimmelcultweに夫々
CBS8092及びCBS8093という寄託番号で1982年
５月19日に寄託された。 通常、形質転換するプラスミドはホスト細胞中
に自律的に複製及び発現可能な独立した存在とし
て止まる。しかしながらこゝでプラスミド（複製
配列であつてもなくても）上に存在する遺伝子は
引き続いて細胞の染色体DNA中にも組み込まれ
るということが指摘される。 本発明をプレプロソーマチンの生産に関する詳
細な記述により例示する。然し本発明の方法はソ
ーマチン−様蛋白質を暗号づけるその他の遺伝子
のクローニングと発現にも又応用出来る。 本発明の菌株を大量生産に適用する時は、ベク
タープラスミドからすべての細菌DNA配列を除
去することが望ましい。 遺伝子は細胞中に導入された後、自律的に複製
するプラスミド上に止まり得るか又はホスト細胞
の染色体DNA中に組み込むことができる。 KARS−配列の分離、その組み換えDNAプラ
スミドへの取り込み及びそれ等のクルイベロミセ
ス ラクテイス（K.lactis）細胞中への導入 Ａ 組み換えpKARSプラスミドの調製 プラスミドYRp7（Struhl等Proc.Natl.Acad.
Sci.USA76 1035−39、1979）５マイクログラ
ムを制限酵素Salで分解した。野生株クルイ
ベロミセス ラクテイス（K.lactis）CBS2360
からのDNA14マイクログラムを酵素Xhoで
分解した。プラスミドの断片とクルイベロミセ
ス ラクテイス（K.lactis）のDNAをモル比
１：３の割合で混合し、DNA断片混合物を得
た。 制限酵素を失活後、溶液をDNA濃度25マイ
クログラム／mlにし、標準条件（ベーリンガ
ー）の下でT4−リガーゼと共にインキユベー
トした。 通常条件下で、リガーゼ処理混合物によるエ
シエリヒア コリー（E.coli）DG75の形質転
換により4.5×105AmpR形質転換物の混合物を
生じ、そのテトラサイクリンに対する感受性か
ら推論して、その中９×103はクルイベロミセ
ス ラクテイス（K.lactis）挿入物を含んでい
た。 テトラサイクリン−感受性細胞の割合はサイ
クロセリン処理により85％迄増加させ得る
（Bolivar Ｆ及びBackman K.Method in
Enzymology、68、1979、245〜267）。Katz等
の方法に従い（Ex.1参照）、14の異なつたプラ
スミドを分離した、これ等をpKARS1−14と
称する。これ等のすべてはクルイベロミセス
ラクテイス（K.lactis）SD11lac−4trp−１株
をDNAマイクログラム当り103〜104の頻度で
Trp+発現型に形質転換する能力があつた。プ
ラスミドpKARS−12はDNAマイクログラム
当り３×104の形質転換頻度を示したが、プラ
スミドpKARS−２の方がその後の工程におい
てもつと便利であることが分つた。 得られた組み換えプラスミドは又エシエリヒ
ア コリー（E.coli）JA221（trpE5、leuB6、
lacY、recA、hsdM+、hadR-）にも転移する
ことが出来るであろう。 Ｂ プラスミドpKARS−12によりTrp+に形質転
換されたクルイベロミセス ラクテイス
SD11lac−4trp−１ クルイベロミセス ラクテイス（K.lactis）
SD11lac−4trp−１株の菌体を酵母エキス１
％、ペプトン２％及びグルコース２％を含む生
育培地（PH6.8）中に懸濁させた。指数期（３
〜５・107細胞／ml）に達する迄生育を続けた。
酵母菌体を遠沈により集め、水洗し、
1.2mol／のソルビトール、25ｍmol／の
EDTA及び0.2mol／の新しいメルカプトエ
タノールを含む溶液（PH8.0）中に再懸濁した。 10分間30℃でインキユベートした後、菌体を
遠沈、1.2mol／のソルビトール溶液で２度
洗滌し、1.2mol／のソルビトール、10ｍ
mol／のEDTA、0.1mol／のクエン酸ソー
ダ及び10mgのヘリケースを含む溶液（PH5.8）
20ml中に懸濁した。 プロトプラストが生じ、15〜20分後、これ等
を遠沈し、1.2mol／のソルビトールで３回
洗滌し、10ｍmol／のCaCl2と1.2mol／の
ソルビトールを含む溶液0.1ml中にml当り約
5.1010菌体の濃度で再懸濁した。 10マイクログラムのpKARS−12のDNAを
加え、混合物を25℃で15分間インキユベートし
た。その後、10ｍmol／のトリス、10ｍ
mol／のCaCl2及び20％（ｗ／ｖ）のポリエ
チレングリコール4000を含む溶液0.5mlを加え、
其後20分間インキユベートした。 プロトプラストを遠沈で沈澱させ、７ｍ
mol／のCaCl2、1.2mol／のソルビトール、
0.5mg／mlの酵母エキス、１mg／mlのペプトン
及び２mg／mlのグルコースを含む溶液（PH6.8）
中にml当り約5.1010プロトプラスト濃度で再懸
濁させた。 Trp+形質転換を選択可能にするため、1.109
プロトプラストをグルコース２％、
KCl0.6mol／を含む２％寒天最小平板培地
（３％の寒天重層）上に移した。 ４〜５日中にコロニーが現れた。グルコース
を炭素源とする0.6mol／のKCl平板上でのプ
ロトプラストの再生は通常0.5〜1.5％である。
pKARS12DNAのマイクログラム当り、3.4×
104Trp+形質転換物が得られた。 DNAの調製はStruhl等（Proc.Natl.Acad.
Sci.USA76 1035〜1039、1979）に従つた。 Ｃ KARS−型プラスミドによるTrp+に形質転
換されたクルイベロミセス ラクテイスSD11
lac−４ trp−１ Ｂに記載された方法と類似した方法により他
のKARS−型プラスミドについての形質転換
実験を行うことが出来る。実験の結果を以下の
表に要約する。
【表】
【表】 菌株 遺伝子型 プラスミド
当りの形質転換物 の大きさ
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