JPS6097272A - 免疫螢光法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試験体中における問題の物質の存在を検知する
ための組成物及び方法に関する。

試験体（試料）中の問題の物質（被検体）の存在を決定
するために免疫螢光技術が使用されている。多くの問題
の物質は生物学的試験体中、例えばａ１胞、１）ＮＡグ
ローブ（ｐｒｏｂｅ）などのような巨大分子の表面上に
存在する。特異的な免役螢光技術は螢光抗体染色を含む
。一般にこれに対して３種類の技術、即ち直接法、１１
５接法及び補体染色法が存在する。

直接法では、一般に問題の物質である試剤に対して特異
的な抗血′？＾會芙験励物において準備し、或いは試剤
に特異的なモノクローナル抗体を準備する。蛋日質又は
史にしばしばＩＩＩＬ清のγ−グロブリン画分を螢光化
合・吻、普通フルオレセイン誘導体で標識する。次いで
フルオレセインで標識した選択試剤に刈する抗体を用い
て試験体又は組織培養中の試剤を検知する。試倹体のス
ライド調製物を適当な条件下にフルオレセインで標識し
た抗血清共役体で処理する。この場合同族の抗原が存在
するならば抗原−抗体反応が起こるであろう。次いで試
販体を非特異的に結せした共役体がなくなるまで洗浄し
た。螢光顕微鏡又は固体を読みとる螢光計のような装置
のもとて螢光を示す調製物の面積は、結合が％異的であ
るということを保証するために適当な対照法を用いるな
らば、同族の抗原の存在を示すことになる。

間接的な螢光抗体技術の場合には、特別ガ抗原に体して
判、異的な標識されてない抗体を抗原と一緒にして、抗
原−抗体錯体を生成せしめる。抗抗体（抗体に対する抗
体）を常法に従って生成させ、螢光化合物で標識する。

抗原が分析すべき試料中に存在するならば、この共役体
（ｃｏｘｊｕｒｔαｔｅ）を、上に生成させた抗原−抗
体錯体の抗体部分と一緒にする。適当に洗浄した後、試
料を螢光の存在に関して検査する。

補体染色法では、問題の物質を含む試料を、特別な抗原
に対して特異的な標識されてない抗体と、次いで不活性
化された標識されてない抗血清及び袖体（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔ　）　の混合物で処理し、次いでゆすいだ。こ
れに続いて、いずれかの補体の部位に結合する、例えば
フルオレセイン共役の抗−（モルモットの補体）を適用
して、抗原−抗体反応を固定する。試験体における螢光
領域は抗原の存在する部位を表わす。

上述の技術を使用する者が直面する１つの問題は、ある
試験の有効性を減する又は無効にする傾向のある非特異
的な螢光である。一般に分析すべき試験体は、組織、細
胞、微生物例えばバクテリア及び關、細胞成分及び破片
を含む。多くの場合、これらの物質の存在は螢光抗体法
において非特異的染色（非特異的螢光）を生じさせ、疑
わしい正の或いは疑わしい負の結果なもたらす。同業者
は王にこの非特異的効果ば（１）分析すべき試験体中の
蛋白質及び共役体に用いる蛋白質間の電荷相互作用によ
る、（２）非特異的染色に係わる蛋白質間の他の物理化
学的相互作用、例えば水素結合及び物理的捕捉による、
そして（３）非特異的免疫反応による、と考えている。

非特異的染色の問題はウィルス抗原の検知及び・ぐクチ
リア又は菌の検知の場合に深刻である。

ウィルスで遭遇する問題の例として、ヘルペスウィルス
群の負に関して経験する問題である。感染に対して試験
すべき試験体は特異的細胞ばかりでなく、細胞の断片、
バクテリヤ及び菌（ｆｕ？Ｚｇｊ）も含有する。これら
の物質の存在は特異的螢光を隠ぺいするかも知れない非
特異的螢光を生ずる。

結果として試験の精度は低下し或いは失なわれる。

免疫螢光法における非特異的染色を制御するために、種
々の方法、例えば抗血清の希釈；ｐＨの調節；抗血清の
組織調製物での吸着；抗血清のカラムでの精製；特異的
染料、例えばエバンス／ルー　（Ｅｖａｎ’ｓ　ｂｌｕ
ｅ）　と対照する染料での対照染色；そして螢光剤とし
てフルオレセインを用い且つローダミン又はローダミン
の共役体のような非特異的染料及び蛋白質を用いる方法
が開発されてきた。ローダミンは、約５１５及び５５２
′ｎｍに最大吸収をもち且つ正の電荷をＭしている。こ
れらの方法のいずれもが、すべての免疫螢光法に対して
有効でないことがわかった。

免疫螢光の適用法は、Ｇａｒｄｎｅｒら、”Ｒａｐｉｄ
Ｖｉｒｕｓ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　”、Ｂｖ、ｔ　ｔ　
ｅｒｗｏｒｔｈ（ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）Ｉｎｃ、、Ｂ
ｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕ−ｓｅｔｔｓ　（１９
８０）及びＧｏｌｄｍａｎ、　”Ｆｌｖ、ｏｒｅ−ｓｃ
ｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ″、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　（１９６８）に記述されている。固定され
た組織調製物における対照染色に対照螢光染料（ローダ
ミン共役血清）を使用する方法は、Ｓｍ１ｔｈら、ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏ
ｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　、　１０２．１７９〜１８１　（
１９５９）に記述されている。螢光顕微鏡法における対
照染料としてのローダミン共役・リヤインはＡｌｇｚａ
ｎｄｅｒら、Ｉｍｍｗｘｏ　ｌ　ｏｇｙ、６．４５０〜
４５２（１９６３）に議論されている。螢光免疫分析に
有用である新規な双極子−双極子でカップルする螢光エ
ネルギ移動受体　４　／　、　５　／−ジメトキシ−５
−（６）　−カルブキシ−フルオレセインはＫｈａｎｎ
ａら、ＡＩｒＬα１ｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃんｅ　ｍｉ
　ｓ　ｔτＶ。

１０８．１５６〜１６１　（１９８０）に議論されてい
る。米国特許第４，３１８，８４６号及び第４，３５１
、７６０号には、普光体及び消光剤としてのフルオレセ
イン−ポリ　（アミノ酸ン共役体が開示されている。

本発明は、固体表面上における試験体中の問題の物質例
えばウィルスの存在を検知するだめの新規な組成物及び
方法を提供する。従って試験体中の問題の物質の存在を
検知するのに有用な組成物は、（１）問題の物質のエピ
トープ（ｅｐｉｔｏｐｔｔ　）部位と結合しうる化合物
に結合した螢光残基を含んでなる検知体共役体、及び（
２）ポリ　（アミノ酸）、及び螢光化合物に対する実質
的な構造及び電荷類似性を有し且つ螢光化合物の螢光領
域において観察しつる螢光を示さないまたは螢光化合物
と異なった波長で低量でしか螢光を示さない模擬化合物
を含んでなる、但し問題の物質又はその誘導体に特異的
に結合しえない非検知体共役体、を含んでなる。この非
検知体共役体は、問題の物質と特異的に結合できないが
、試験体の他の成分とは検知体共役体と実質的に同一の
具合に、競争的に且つ非特異的に結合することができる
。

本発明方法は、試験体中の問題の物質の存在を決定する
だめの改良された免疫螢光法である。表面上の試験体を
検知体共役体及び非検知体共役体と一緒にし、組合せ物
を保温する。次いで問題の物質に特異的に結合しない検
仰体共役体及び問題の物質以外の試験体の成分に非特異
的に結合しない非検知体共役体を組合せ物から除去する
。続いて組合せ物に、検知体共役体によって吸収される
波長の光を照射し、試料中の問題の物質の存在を示す螢
光に対して検査する。

上述のように、試験体中における問題の物質の存在を検
知するための本発明の組成物は、問題の物質と特異的に
結合できる化合物又はその誘導体及び螢光化合物を含ん
でなる検知体、及び問題の物質と％異的に結合できない
ポリ　（アミノ咳）及び螢光化合物に対する実質的な構
造及び電荷類似性を有し且つ螢光化合物の螢光領域にお
いて観察しうる螢光を示さないまた螢光化合物と異なっ
た波長で低量でしか螢光を示さない模擬化合物（ｍｉｍ
ｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　）　を含んでなる共役体であ
ってよい非検知体を含んでなる。ここに「特異的結合」
とは、化合物が問題の物質の１つ又はそれ以上のエピト
ープ部位を認識し且つ結合しうることを意味する。

問題の物質は、一般に特異的結合対のｌ員、普通抗原又
は抗体である。本発明は一般に例えば感染物例えばウィ
ルス、バクテリア、菌、クラミジア（ｃｈｌａｍｉｄｉ
ａ　）、ガン抗原、表面抗原の存在の検知；血清試験；
などにおいて、螢光を抗原−抗体反応と組合せて用いる
いずれかの技術に適用できる。

本方法で検知しうる感染をもたらすウィルスの代表例は
、以下の通りであるが、これは例示でおって限定するも
のではない：ミクソウイルス（ｔｎｙｗｏｖｉｒｕｓ　
）、例えば風疹ウィルス、犬のジステンパーウィルス、
牛疫ウィルス、呼吸シンシシャルウイルス（ｒｅｓｐｉ
ｒａｔｎｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａＬ　ｖｉｒｒｂｓ）、
インフルエンザ（，４，Ｂ及びｃ）　ウィルス、ハライ
ンフルエンザウィルス、おたふくかぜウィルス、及び麻
疹ウィルス１ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒ％α−υｉ
ｒｕｓｇｓ　）　；灰白炎ウィルス、例えばコックスサ
ラキーウィルｙ、　（ｃｏｚｓａｃｋｉｅｖｉｒｗｓ　
）、工＝＋−ウィルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ　）、及び
リノウイルス（ｒｈｉｎｏ−ｖｉｒｕｓ　）　；　狂犬
病ウィルス；アデノウィルス；ヘルペスウィルス・ホミ
ニス（ｈｅｒｐｇｓ　ｖｉｒｕ、ｓ五〇′ｒｒＬ′ｉ′
ｒＬ８）（ヘルペス夏及び■）、ヘルペスウィルス群＋
７）　種々（７）’）イルス例えば単純庖疹ウィルス、
ウィルスＢ１ヘルペスパリセラ（ｈｅｒｐｅｔｔταｒ
ｉ−ｃｅｌｌａ）−帯状庖疹ウィルス、及び巨大細胞ウ
ィルス；エプスタイン−パール（Ｅｐｓｔバｎ−Ｂαｒ
ｒ）ウィルス；天然痘ウィルス例えば庖疹（ｓｍαｔｌ
ｐｏｚ）、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス−ボ
ビス（ｐｏｚｖｉｒｗｓ　ｂｏｖｉｓ）、及びＡｔ　ラ
フクシニアウィルス；アルボウィルス（αｒｖｏｖｉｒ
ｓｓｅｓ　）例えばイースタン・イクイネ・エンセファ
リチスウイルス　（ｅａｓｔｅｒｎ　５ｑｕｉｎＩｌ　
ｇｎａｅｐんａＬｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、ウェスタン
・イクイネ・エンセファリチスウイルス、シンドビスウ
イルス（５ｔｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ　）、セントルイ
ス・エンセファリチスウイルス、カリフォルニア・エン
セファリチスウイルス、コロラド・チックフィーバ−ウ
ィルス（Ｃｏｌｏｒαｄ。

ｔｉｃｋ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ）、イエローフィー
／？−ウィルス（ｙｅｌｌｏｗ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕ
ｓ）、及びデヌーウイルス（ｒｉｅｎｇｕｅ　ｖｉｒｕ
ｓ　）　；　ｖオウイルス（ｒｇｏ−ｖｉｒｕｓｔ、ｔ
　）（１〜３型）；肝炎Ａ及び肝炎Ｂウィルス；ガンウ
ィルス；ラウシャ（Ｈａｕｓｃｈｅｒ　）　白血病ウィ
ルス；ダａｙ、ウィルス（ｇｒｏｓｓ　ｖｉｒｕｓ）Ｈ
マロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）　白血病ウィルスなど。本
発明は、他の方法がバックグラウンドの干渉を必要なだ
け減少させないから、ヘルペスウィルス・ホミニスによ
る感染の検知に特に重要である。

本方法で検知しうる感染をもたらす・マクテリアの代表
例は次の通シであるが、これは例示であって限定するも
のではない：コリネ／々クチリア属（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉａ　）例えばジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｔｎ　ｄｉｐｔｈｇｒｉａｅ　）；連鎖
球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ＜　）例えば化膿連鎖
球菌（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｇ
ｓ　）、肺炎菌（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｗｓ　ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｓ　）　；ストレプトコックス・サリバ
リウス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｗｓｓａｌｉｖａｒ
ｉｗｓ　）　；ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏ
ｃｃｉ）例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏ−ｃ
ｏｃｃｒｂｓ　ａｌＬｒｅｕｓ）、白色ブドウ球菌（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｕｓ　）　；ナ
イセリア属（Ｎｅｉｓｔｔｅｒｉａｅ）例えば髄膜炎菌
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉａ）、
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　
）　；パスツレラ属（ｐａｓｔｔｔｕｒｅｌ　ｌａｅ　
１例えばペスト菌（ｐａｓ　ｔｇｕ−ｒｅｌｌａ　ｐｅ
ｓｔｉｓ）、ノウサギ病菌（ｐａｓｔｅｗｒｅＬｌａｔ
ｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）　：　プルセラ属（Ｂｒｕｃｅ
ｌｌａｇ）例えばマＡ／タ熱菌（Ｂｒｒｂｃｅｌ　ｌａ
　ｍｔｔｌｉｔｅｎａｉｓ　）、ウシ型苗（Ｂｒｕｃｅ
ｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ　）、豚温菌（Ｂｒｕｃｔｔｌ
Ｌａ　ｔｔｒｂｉｓ）Ｈ好気性の胞子形成バチルス属（
１３ａｃｉｌｌｉ）、例えば炭痕菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｎｔｈｒａｃｉｓ　）、枯草醒（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
５ｕｂｔｉｌｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌ　ｌｕｓ
　ｃｅｒｅｒｂｓ　）　；　嫌気性の胞子形成バチルス
ＩｆｓＣｂαｃｉｌｌｉ）ＰＪ工ｔｄ？ツリヌス菌（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｗｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風
菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｗｍ　ｔｇｔａｎｉ）、ウエル
チ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ　）、ノーヒ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｎｏｖｙ
ｉ　）、セプチツクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｗｍ　ｓ
ｅｐｔｉｃｕｍ）、ヒストリチフス菌　（（１’　ｌ　
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　んｉｓｔｏｌｙｔｉｃｔｂｍ）、
第３型ロデラ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｑｔｍ　ｔｅｒｔ
ｉｕｍ）、ヒフ　ニルメンタンス菌（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｔｎ　ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、スポロゲネス
菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｏｇｔｔｎｅｓ
　）　Ｆミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
α）例えば大型結核菌（Ｍｙａｏｂａｃｔｅｒｉｗｍ　
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｈｏｍｉｎｉｓ　）、ミコバ
クテリウム・ボビス（ＡｆｙＣｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウム−７ビウム（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｗｍ）、ライ菌（Ａｆｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｅ７ｙｒａｅ　）、パラ結核
性腸炎菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　）　；放線菌属（Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ　）（菌株バクテリア）例えばアクチノ
マイシス・イスラエ＋Ｊ　（Ａｃｔｉｎｏ−ｍｙｃｅｓ
　１ｓｒａｅｌｉｉ　）、十数線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｓｂｏｖｉｓ　）、アクチノマイシス・ネスランジ
（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ　）
、好気抗酸性ノカルジ７　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔ
ｅｒｏｉｄｅｓｌ、ノヵルジ７−７”ラシリｘンシｙ、
　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｂｒａｓｉｌｉｇｎ−ｓｉｓ）
；　ｙ、ヒロヘ−１−）Ａ　Ｃ３ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ
）　例えば梅毒トレポネー−ｖ　（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
　ｐａｌｌｉｄｗｒｎ）、フランペジア・トレポネーマ
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｒｔｅｎｕｅ　）、　ピンタ
ートレポネ−？　（ＴｒｔｌｐＯ−ｎｅ脩α　ｃａｒａ
ｔｅｒｂ兜）、ボレリア争しクレンッ（Ｂｏｒｒｅｌｉ
ａ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｓ　）、負角出血病レプトスピ
ラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ　１ｃｔｅｒｏｈ、ａｅｍｏ
ｒｒｈａｇｉａｅ　）、犬レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ　ｄａｎｉｃｏｌａ　）、小スピリルム（Ｓｐ
ｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｎｉｎｗｓ）、ストレプトハシルス
・モニリホルミ、Ｘ　（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｇｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ　）　；ミコプラズマス
属（Ｍｙｃｏ−ｐｌａｓｍα８）例えばミコプラズマ・
ニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｒｎａ　ｐｎｅｒｂ
ｍｏｎｉａｅ　）　；　他の病原菌例えば即球症リステ
リア（Ｌｉｓｔｔｔｒｉａ　ｍｏｎｏ−ｃｙｔｏｇｅｎ
ｅｓ　）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｗｒ
ｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ　）、　鼠径肉芽肺菌（Ｄｏ
ｎｖａｎｉａｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ　）、バチルス
形ハルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ　ｂａｃｉｌｌｉ
ｆｏｒｍｉｓ）　＋リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ
ａ６）（バクテリア様寄生虫）例えば発疹熱リケッチア
（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｐｒｏｗａｚｅ−ｋｉｉ　）
、発疹熱リケン−ｔ−７（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｍｏｏ
ｓｇｒｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
ｒｉｃｋｔｒｔｔｓｉｉ　）、コノリ・リケッチア（Ｒ
ｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｃｏｎｏｒｉｉ　）、　リケッチ
ア・オーストラリス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ａｗｓｔ
ｒａｌｉｓ）、リケッチア・シヘリク、Ｘ　（Ｒｔｃｋ
ｅｉｔｓｉａ　５ｉｂｃｒｉｃｕａ　）、リケッチア・
アラキ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ａｋａｒｉ）、恐虫リ
ケッチア　（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｔｓｕｔｓｕｇａ
ｍｓｓｈｉ）、Ｑ熱すケッチア　（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ
ａ　ｂｕｒｎｇｔｉｉ）、ｑｔｊＪ熱リケッチア　＜Ｒ
ｉｃｉｃｅｔｔｓｉａ　ｑｕｉｎｔａｎａ）。

本方法を用いて検知しつる感染をもたらす菌（ｆｖｂｎ
ｒｙｉ）の代表例は次の通シであるが、これを例示であ
って限定するものではない：酵母症病原菌（Ｃｒｙｐｔ
ｏｃｏｃｃｒｂｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ　）　Ｈ北米
分芽菌（Ｂｌａｓｔｏｍ、ｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａｔｉｄ
ｉｓ　）　；　ヒストプラズマ症病原菌（Ｈｉｓｔｏｐ
ｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｒｂｍ）　；コクシジオ
イデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｔｌｉｏｉｄｅｓｉｍｍ
ｉ　ｔ　ｉ　ｓ　）　；ブラジル・バラコクシジオイデ
ス（ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｂｒａｓｉｌ
ｉｅｎｓｉｓ　）　；　鵞口痢カンジダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　）　；　明色麹菌ケムカヒ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｌｂｓ　ｆｕｒｎ、ｉｇａｔＬＬｓ　
）　；傘状ケカビ［Ｍｕｃｏｒ　ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ
　（Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｒｙｍ−ｂｉｆｅｒ（Ｌ）〕
ｉｉ菌類（ｐｌｒ、ｙｃｏｍｙｃｅ　ｔｅｓ　）　例え
ばりゾプスオリザエ（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ
　）、　リゾプス−アリジス（Ｒｈｉｚｏｐｕａ　ａｒ
ｒｈ、１ｚｕａ）、クモ７スカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　
ｎｉｇｒｉｃａｎｓ　）　；スポロトリニア　−−７ｘ
病原菌（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　５ｃｈｅｎｋｉｉ
）Ｈ潰瘍性糸状菌（Ｆｏｎｓａｃａｅａｐｅｄｒｏｓｏ
ｉ　）　Ｈフォンセセア・コンパクタ　（Ｆｏｎｓａｃ
ａｅａ　ｃｏｍｐａｃｔａ）　１フオンセセア・デルマ
チジス（Ｆｏｎｓａｃａｅａｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ　）
　；クラトス；バリウム・カリオニｊＣ１ａｄｏ、ｑｐ
ｏｒｉｒｂｍ　ｃａｒｒｉｏｎｉｉ　）　；　色累分芽
菌（ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ　ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）　
；為柔性細菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａ
ｎｓ　）　；　−ｑズラ足放線菌（Ｍａｄｒｂｒｅｌｌ
ａ　ｒｎｙｃｅｔｏｍｉ　）　Ｈ−ｒズレラ・グリセア
　（Ｍａｄｖｓｅｌｌａ　ｇｒｉｓｅａ）　；糸状菌肺
病原菌（Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ　ｂｏｙｄｉｉ）；　
フイ７　Ｃ１スｙｆ！う・ジーンセルメイ　（ｐｈｉａ
ｌｏｓｐｈｏｒａ　ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ　）　；石膏
状小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｗｔｎ　ｇｙｐｓｅｖ
、ｍ、）　；毛（所白賽菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ
　ｔｎｅｎｔａｇｒｏ７＞ｈｙｔｅｓ　）　；ケラチノ
マイシス・アジエｏ　イ（Ｋｅｒａｔｉｎｏ−ｍｙｃｅ
ｓ　ａｊｇｌＬｏｉ　）　；　大小胞子菌（Ｍｉｃｒｏ
ｓｐｏｒｕ、ｍｃａｎｉｓ）；猟紅色白害菌（Ｔｒｉｃ
ｈｏｐんｙｔｏｎ　ｒｖ、ｂｎｙｎ　）及びオーズアン
小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒ１Ｌｍαｎｄｏｗｉｎｉ
　）。

本方法で検知しうる問題の物質には、細胞の表面上の抗
原、例えば血液群抗原例えばＡ−Ｂ−０ハプテｙ　（ｈ
ａｐｔｅｎ）、Ｍ　−Ｎ　−ハプテン、Ｒｈ−Ｈｒハプ
テン及び赤血球表面に見られることのある他の特異性の
ハゲテンも含まれる。

試験体は一般に問題の物質の存在が疑わしい部位から取
られる生物起源のものである。一般に試験体の成分は、
普通全細胞を含んでなる本質的に巨大分子である。免疫
螢光による検査のだめに試験体を採取し且つ準備する方
法は技術的によく知られている。問題の物質な含む試験
体は、他の物質例えば細胞の断片、／々クチリア、菌、
粘液及び膿を含んでいてもよい。試験体は固成、粘液、
又は他の体液のような組織並びに器官に由来していてよ
い。

検知体共役体は、問題の物質或いは問題の物質の誘導体
を認識する共役体である。慣仰体共役体は問題の物質又
はその誘導体と特異的に結合しうる化合物を含んでなる
。ここに「問題の物質の誘導体」とは、結合した問題の
物質を有する基質を意味する。この基質は螢光抗体法で
認識でき、例えは間接的な螢光抗体技術において生成せ
しめられる如き抗原−抗体錯体或いは補体染色螢光抗体
技術における抗原−抗体−補体錯体である。

一般に上述したように、問題の物質は特異的結合対の１
員である。即ち問題の斂簀た結合しうる化合物は特異的
結合対の他の負である。「特異的結合対」は、分子の１
つが他の分子の特別な空間的な又は極性の構造に特異的
に結合する領域を表面上に又は空洞内に有している２つ
の異なる分子を意味する。特異的結合対の員は配位体（
ｌｉｇαｎｄ）及び受体（抗配位体）として百及される
。音道特異的結合対の負は抗原及び抗体である。受体の
例は抗体、酵素、天然受体などを含む。検知体共役体の
部分として待に好適なものは、主に免疫原物質を生きた
動物の血液流中に導入することによって生産される抗体
又は生物工学例えばモノクローナル抗体技術によって生
産される抗体である。このように生産されるポリクロー
ナル又はモノクローナル抗体は試験体中の問題の物質に
対して特異的であるであろう。

更に螢光部分も検知体共役体の一部として含有される。

一般に螢光残基は約４５０ｎｍ以上の波長で光を吸収し
且つ５００ｎｍ以上の波長で光を放射する螢光化合物で
ある。好適な螢光化合物はフルオレセイン又はフルオレ
セイン誘導体で６９、そのような物質は文献に報告され
ている。この親分子はフルオレセイン又は３／、６／−
ジヒドロキシスピロ−〔（イソベンゾフラン−１−３Ｈ
）、９’−（９Ｈ）キサンチンクー３−オンである。

フルオレセインは螢光抗体技術に対して厳もしはしは使
用される。一般にフルオレセインは蛋白に結合するため
にイソチオ７アネート　（ＦＩＴｃ）の形である。適轟
な吸収及び放射特性を有するフルオレセイン誘導体が入
手でき、使用されてきた。

例えば（親分子に基づく番号系を用いると）公知の誘導
体のいくつかは次の通りである：２　／　、　７　／−
ジ（ｎ−へキシルン又はジ（ｎ−ヘプチル）　−４７，
ｓｌ−ジブロム−４，７−ジクロル−はＣ，Ａ、３１．
１６２１に報告； ２　／　、　７　／−ジ（？Ｌ−ヘキシ＃）−１Ｃ，Ａ
、３１．１６３１１； ２’、７’−ジ（アルキル）＋、Ｃ１Ａ、３１．１３８
８； ２　／、　７／−ジエチル又は２’１７’−ツブチル−
１Ｃ０Ａ、２７．５０５６： ２′、７′−ジメチル−１Ｃ，Ａ、８３．１８９７ＳＨ ２’　＋　４　’１５　’４７′−テトラブロム−５又
は６−カルボキシ−、Ｃ，Ａ、６ａ、ｘａ２ｔ（Ｂ７０
本発明で使用しうる他の螢光化合物は、米国特許第４．
３５１．７６０号の特に第１欄６１〜６８行及び第２欄
１〜３２行に開示されている如き２゜７−ジ脂肪族−６
−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンチン−３−オンを含む（該
特許の開示は本明細書に参考文献として引用される）。

本発明て使用しうろことのわかった他の組のフルオレセ
イン誘導体は、米国特許第４．３１８，８４６号の第２
＄４１〜６８行〜第１欄１〜３４行に教示されている（
この特許の開示は本明細書に参考文献として引用される
）。これらの化合物は普通４Ｊ、　ｓ　／−位が未置換
の２，７−ジ（脂肪族エーテル）置換−９−フェニル−
６−ヒドロキシ−３Ｈキサンチン−３−オンであり、或
いは４１．ｓｌ−位がオキシ置換以外で置換されている
。

ローダミン及びローダミン訪導体も、検知体共役体にお
ける螢光化合物として本発明において使用しうる。

上述のように、試験体中の問題の物質の存在を検知する
ための組成物は、問題の物質又はその誘導体と或いは検
知体共役体と特異的に共役しえ々い共役体を意味する非
検知体共役体を含んでなる。

非検知体共役体はポリ（アミノ酸）及び模擬化合物を含
んでなる。一般にヘルペスウィルスの検知に用いるため
の非検知体共役体における模擬化合物と蛋白質の割合は
約１０：１〜３０＋１、好ましくは約２０：１〜２５：
１であろう。各有機体に対する模擬化合物と蛋白質との
最適な比は、本明細書に開示する教示に従って場合場合
によシ決定できる。

抗体、酵素、及び抗原を含めてポリ（アミノ酸）は約２
０００〜１×１０丁、普通約５０００〜１×１０６の分
子量を有するであろう。一般にポリ（アミノ酸）はグロ
ブリン、特に免疫グロブリン、更に特にＩｇＧ又はＩｇ
Ｍである。ぼり（アミノ酸）は好ましくは検知体共役体
の一部をなす問題の物質又はその誘導体と結合しつる化
合物と構造的に同様である。非検知体共役体におけるポ
リ（アミノ酸）は、一般に検知体共役体の蛋白部分と同
１−の具合に、電荷−電荷相互作用、水素結合、及び物
理的捕捉によって試験体と相後作用できるべきである。

ポリ（アミノ酸）は試験体中の問題の物質と或いは検知
体共役体又はその成分と結合できるべきでない。普通検
知体共役体の一部を形成する問題の物質又はその誘導体
と結合しうる化合物が抗体である場合、非検知体共役体
のポリ（アミノ酸）は問題の物質と或いは検知体共役体
と結合しえない免疫グロブリン例えばＩＱＧ又はＩｃ１
Ｍであるであろう。

非検知体共役体は、螢光化合物に対して実質的な構造及
び電荷類似性を有する化合物を含んでなり、従って螢光
化合物の「模擬」化合物である。

この模擬化合物は螢光化合物の螢光領域において、観察
しうる螢光を崩さない或いは螢光化合物と異なる波長の
螢光を低程度で示すにすぎない。

ここに「実質的な構造及び電荷類似性」とは、非検知体
共役体の一部としての模擬化合物が、檜知体共役体の螢
光化合物の、水素結合、電荷−電荷相互作用及び物理的
捕捉による試験体の成分との相互作用と実質的に同一の
具合に、水素結合、電荷−電荷相互作用及び物理的捕捉
によって問題の物質以外の試験体中の成分と相互作用す
ることで、模擬化合物の構造及び電荷が螢光化合物のそ
れに十分類似しているということを意味する。

例えば螢光残基が検知体共役体において抗体に結合した
フルオレセインである場合、非検知像共役体においてＩ
ＱＧに結合した模擬化合物はフルオレセインに構造的に
類似し、負に荷電しているであろう。例えば模擬化合物
は　４Ｆ、５１−位において、アルコキシ基普通メトキ
シ基の存在によりフルオレセインと異なる４′、５′−
ヅ（脂肪族エーテル）ｆ換−９−フェニル−６−ヒドロ
キシ−３Ｂ−キサンチン−３−オンであってよい。その
ような化合物は９−位がフェニル基の存在又は不存在に
よって更に異なっていてもよい。

４１．５１−位におけるオキシ基、例えば炭素数１〜８
、普通１〜６、好ましくは１〜３のアルコキシ基の存在
は、フルオレセインの構造及び電荷類似性を十分保持さ
せ、この化合物は本発明の非検知像共役体に使用しうる
。そのような非検知像共役体は、その能力において、ヘ
ルペスウィルスに対する免疫螢光抗体におけるパックグ
ラウンドの螢光を実質的に減少させることに十分機能す
る。

今回、模擬化合物が４′、５′−位でのメトキシ基の存
在によってフルオレセインと異なる場合、検知体共役体
及び非検知像共役体の合計はヘルペスウィルスの免疫螢
光抗体試験において効果的であることが発見された。

従って非検知像共役体に使用される模擬化合物は、検知
体共役体に用いる螢光化合物に依存する。

螢光化合物が、その２２７／−位が米国特許第４、３１
８．８４６号の教示に従って普通対称的にオキシ置換基
で置換されている場合、本発明に従って使用しうる模擬
化合物は上記特許の、特に第２９４１〜６８行、第３’
ｍｓ　及ヒ第４欄１〜２２行に記述され且つ螢光化合物
に対して実質的な構造及び電荷類似性を有するものであ
る。上記特許に記述されている模擬化合物は、オキシ置
換された、即ち４Ｚ５／−位が炭素数約１〜８、普通１
〜６、好ましくけ１〜３のアルコキシ基で置換されてい
る、また１／、８／−及び２Ｚ７／−位が未置換であり
又はオキシ置換基以外で置換されていてもよいフルオレ
セイン誘導体である。これらの化合物は実質的に螢光を
示さず且つ負に荷電して、螢光化合物に対して実質的な
構造類似性を示す。好適な検知体共役体は、本明細書に
具体化された教示に従い、上記特許に開示された化合物
から適当に選択してよい。

螢光化合物がローダミンである場合、本発明による非検
知像共役体の一部としての模擬化合物はローダミンに対
して実質的な構造類似性を有し、正に荷電しているであ
ろう。

試験体において問題の物質の存在を検知する好適な組成
物は、フルオレセイン誘導体と共有結合したモノクロー
ナル抗体を含む検知体共役体を含んでなる。本組成物の
一部を形成する好適な非検知像共役体は　４１．５１−
位がアルコキシ、好ましくはメトキシ基で１針換された
フルオレセイン誘導体である模擬化合物に共有結合した
免疫グロブリンを含んでなる。

非検知像共役体は、検知体共役体と類似の構造、空間、
極性及び電気的特性を有すべきである。このようにして
、螢光抗体試験における非特異的パックグラウンドが最
高に減少せしめられる。

本発明の組成物中における検知体共役体の資は正の試験
において許容しうる螢光量をもたらすのに十分であるべ
きである。本発明における非検知体共役体の州・は、非
特異的螢光を実質的に減するのに十分であるべきである
。ヘルベルウイルスの検知の場合、検知体共役体及び非
検知体共役体は、一般に検知体共役体１部当り約１〜４
（重量）部の非検知体共役体の割合で本発明の組成物中
に存在するであろう。一般に本発明の組成物は普通緩衝
化された水性媒体中で調製される。媒体中の検知体共役
体及び非検知体共役体の濃度は行なうべき特異的試験及
び用いる試験体の量に依存する。

一般に、ヘルペスウィルスに対する標準的な抗体螢光技
術の場合、媒体中の検知体共役体の濃度は約１０〜７５
μＦ／／ｍｌ、好ましくは約２５〜５０μ／ｌ　／　ｖ
ｎｌであろう。非検知体共役体の濃度は、検知体共役体
の濃度、試験体の種類、細胞の数、細胞断片の存在、バ
クテリア及び菌などと関連する。

一般にヘルペスウィルスに対する標準的な抗体螢光体法
に対して使用される非検知体共役体の濃度は約２５〜２
００μ／ｌ／ｍｌ、好廿しくけ約５０〜１００μＩ／ｍ
ｌである。例えばヘルペスウィルスＩ及び■に対する非
検知体共役体の濃度は５０〜１００μｇ／罰である。上
述の割合及び濃度範囲はヘルペスウィルスに対する単な
る例示であって、制限を意味しない。有機体に対する特
異的試験に使用される特別な濃度は上記量をガイドライ
ンとして用いることにより、試行的に決定することがで
きる。非検知体共役体のγへ度は検知体共役体からの信
号をかカシ減するほど大きくてはいけない。

組成物のｐＨけ普通的５〜１１、好ましくは６〜９、更
に好ましくけ７〜８である。上述したように、緩衝剤は
水性ｌ洋体中に存在していてよい。

この目的のために、燐酸地、トリス、炭酸塩、ホウ酸塩
などを用いることができる。

本発明に従い、試験体中の問題の物質の存在を決定する
方法においては、試験体を、普通水性媒体中に含まれる
検知体共役体及び非検知体共役体と一緒にする。普通試
験体は、感染源からの試験体をスワブ（ｓｗａｂ　）上
に付け、そして試験体を表面に適用することによって表
面、例えばガラススライドに結合せしめられる。次いで
検知体及び非検知体共役体を含む組成物をスライドに適
用する。

この時適用される組成物の量は一般にスライドの寸法及
びそこに存在する試験体の量に依存しよう。

本技術で使用されるスライドは、プラスチック層の中間
面によって形成された表面上に凹み又は小さい井戸を含
む、即ち複数の孔をガラススライド表面と共に有してい
ても或いはいなくてもよい。

凹みを有するスライドの場合には、スライドの表面上の
井戸当り例えば約２〜５０μ！、好ましくは約２０〜３
０μｌの本水性組成物が１ψ用できる。

一般に約１０個の井戸（直径約６ｆｉｌ＋）を有するス
ライドでは井戸当り約２５μｌの組成物が使用され、約
３〜４個の井戸（直径約８〜１　（ｌｔ／）を有するス
ライドでは井戸当り約３０μｌの組成物が使用されるで
あろう。この場合にも上述の惜はヘルペスウィルスの検
知に対して単なる例示であり、他の有機体に対する最適
量は本明細書の教示に従って同業者が決定することがで
きる。凹みのないスライドの場合には、単に本発明の組
成物を全スライドに溢れさせてよい。

試験体と検知体及び非検知体共役体を含有する組成物を
一緒にした後、この表面上の組合せ物を、試験体の成分
及び上記共役体間で結合を起こさせる期間に亘り、ある
温度で保温する。普通組合せ物を、約５〜６０分間、好
ましくは約１５〜４５分間、約１５〜４０℃、好寸しく
は室温〜３７℃に保温する。保温は湿った算囲気で、例
えば付湿室で行なうことが普通望ましい。

保温後、組合せ物を有する固体表面を穏やかな条件下に
処理して結合してない共役体を除去する。

この目的には、結合してない共役体を除去するのに十分
な期間、スライドを水、普通は蒸留水又は脱イオン水或
いはｐＨ約６〜９の水性緩衝媒体と接触させ或いは洗浄
する。一般に組合せ物を約１０秒ないし３分間水と接触
させる。通常組合せ物を上述の期間水中に浸すことによ
って水と接触させる。結果として、試験体をスライドに
適用し、続いて上述の共役組成物で処理し、保温した後
のスライドが水中に適当な期間浸されて、結合してない
共役体が除去される。一般に上述の洗浄後、残存する液
体をスライドから除去することが望せしい。従ってスラ
イドを吸水材料で吸い取るか、それに対して圧着させて
吸水する。水をスライドから除去するための他の手段も
同業者が想起しうるのは明白である。試験体試料は乾燥
せしめることが望ましい。

捷だ少量のマウンテインダ液体（ｍｏｗｎ　ｔ　ｔ　ｎ
ｇｌｉｑｕｉｄ）全添加し、次いでスライドをカッ４−
グラス（＠２のスライド）で覆って、技術的に通常のよ
うに、試験における光学的性質を改善することも望まし
い。

次に表面上の組合せ物に、検知体共役体の一部を形成す
る螢光化合物によって吸収される波長の光を照射する。

組成物によって放射される螢光の量及び形態（形）を観
察する。検知される螢光は試験体に存在する問題の物質
の惜の関数である。

スライドを用いる場合、上述の如く調製したスライドを
螢光顕微鏡のもとで検査する。

上述の方法は、螢光抗体染色法に含まれる直接的方法に
対して特に適用しうる。ここに記述する本発明は間接的
な螢光抗体法にも適用できる。しかしながらこの場合に
は、検知体共役体は、螢光化合物及び問題の物質の誘導
体と結合しうる化合物を含むであろう。例えば、問題の
物質はウィルス抗原であってよい。間接的技術において
は、最初にウィルス抗原をウィルス抗原に対する標識し
てない特異的抗体と一緒にする。このために検知体共役
体は今やウィルス抗原に結合している抗体に対する抗体
及び螢光化合物を含んでいよう。

更に本発明は、勿論検知体共役体が螢光化合物及び抗原
−抗体−補体錯体と結合しうる化合物を含んでなる補体
染色法にも使用することができる。

本発明の１つの利点は、この種の螢光技術例えば螢光体
技術において起こる非特異的パックグラウンドの螢光が
実質的に減ぜられるということである。結果として、本
発明の方法及び組成物を用いて達成される精度は、これ
らの分析における非特異的パックグラウンドの螢′光を
除去するための公知の技術で得られた精度よりも実質的
に高められる。

本発明の他の利点は、非検知体共役体が殆んど又は全熱
観察しうる螢光ケ翁さないということである。非検知体
共役体がいくらか低量の又は観察しうる螢光を有する場
合、そのような螢光は螢光化合物と異なる波長のもの、
即ち色であり、容易に区別しうる。このことは、検知体
共役体によって発生せしめられる螢光シグナルが容易に
観察でき、妨害されないから車要であり、結果として正
確なシグナルが与えられる。

本発明の成功は、非常Ｖこ関連する化合物が非特異的な
バックグラウンドの螢光の除去が必要なく、誤った正の
試駆結果を与えることがないので篤くべきことである。

例えば、非検知体共役体の成分、例えばポリ（アミノ酸
）及び模擬化合ｑｖｔｒは、試験体中の問題のＶ質の存
在を検知するための組成物中においてそれぞれ別々に或
−は組合せて用いる場合、非特異的パックグラウンドの
螢光を適尚には減少させないから、正確な試験は達成さ
れない。

史にローダミンイソシアネート及び蛋白質例えばＩｇＧ
又はアルブミンの共役体は、（１）ローダミンが正の電
荷の分子であり、一方フルオレセインが負に荷電してお
り、（２）ローダミンが螢光体であって、検知を妨書し
、そして（３）約１０：１以上のローダミンと蛋白質の
比が水性環境においてローダミン−蛋白質共役体を得る
のに困難である、理由のために、フルオレセイン又はフ
ルオレセイン誘導体を用いる螢光抗体分析法による本発
明の物質はど有効でない。

今回本発明による非検知体共役体の模擬化合物は、螢光
化合物の螢光領域において殆んど又は全熱螢光を有すべ
きでなく、また非検知体共役体の蛋白部分と一緒になっ
て、検知体共役体と実質的に同一の具合に、問題の物質
以外の試験体の成分と非特異的に、即ち構造及び電荷的
に相互作用できねばならないということが発見された。

即ち、模擬化合物は螢光化合物と同一の電荷及び疎水性
を有することが重要である。この場合、試験体及び検知
体共役体間の非特異的相互作用はかなシ減ぜられ、試験
の精度は標準的な集磁装置を用いても高められる。

実施例 次の実施例は本発明を￥に例示する。

すべての温度は断らない限りセラ氏である。またパーセ
ント及び部は液体の混合物が容量による以外、断らない
限り重量によるものとする。用いる略号は次の通りであ
る：ＮＨ３−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド；ん一時、
ＰＢＳ−燐酸塩緩衝の食塙水；ＩｇＧ−免疫グロブリン
ＧｊＤＭＳＯ−ツメチルスルホキシド、ＦＩＴＣ−フル
オレセインイソシアネートｌＵＶ−紫外線。

Ａ、４’＋　ｓ’−ジメトキシ−５−カルボキシ−３′
。

６′−ジヒドロキシスピロ〔イソベンゾフラン−ＩＣ３
Ｂ”）、ｔａ’−Ｃ９Ｅ）キサンチン〕−３−オン（４
’、　５’−ジメトキシ−５−カルボキシフルオレセイ
ン）（６−カルがキシ異性体との混合物で使用）及びウ
サギのＩｇＧＯ共役体（非検知体共役体）の製造。

４１　、　ｓ　／−ジメトキシ−５−カルボキシ−フル
オレセイン及びそのＮＨＳエステルの製造を、Ｋｈａｎ
ｎａらの教示（上述）に従って行なった。

０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，２）中のウサギのＩ
σＧ’（５η）を上記ＮＨＳエステル２■と混合し、混
合物を室温で１時間攪拌した。次いで混合物を、００５
Ｍ燐酸塩緩衝液ＣｐＨ８）を用いることによりＳｇｐｈ
ａｄｇπＧ−２５カラムに適用した。

５１８　ｎｍ及び２８０ｓｙｙｃでのＵＶ吸収に基づい
て、模擬化合物と蛋白の比は蛋白の分子当シ模擬化合物
約２０〜３０モルであると推定できた。

Ｂ、フルオレセイン及びヘルペスウィルスＩ及び可に対
するモノクローナル抗体の共役体（検知体共役体）の製
造。

ヘルペスウィルス■及び■に対するモノクローナル抗体
を常法に従って製造した。

フルオレセインと上記モノクローナル抗体の共役化法は
本実施例のＡに用いた方法と同様であった。即ち上述の
ヘルペスウィルス■のモノクローナル抗体の、ｏ、１Ｍ
炭酸ナトリウム（ｐＨ９，２）中調製物をＤＭＳＯ中Ｆ
’１ＴＣＣｘｏ〜／−）と混合した。一般にＦ’　Ｉ　
Ｔ　Ｃとモノクローナル抗体の比は５０μ１１７■であ
った。この混合物を室温で１時間攪拌し、次いでｏ、　
ｏ　Ｉ　Ａｉ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，２）を用いてＳｅ
ｌｙｈａｄｇｘ　Ｇ　−２５カラムに適用した。４９６
　ｎｍ及び２８０　ｎｍでのＵＶ吸収に基づいて、フル
オレセイン／蛋白質の比は蛋白質の分子当りフルオレセ
イン約５分子であると推定できた。

同様にして、ヘルペスウィルス■に対するモノクローナ
ル抗体調製物をＦＩＴＣと共役させた。

Ｃ，スライド試験 Ａの非検知体共役体とＢの検知体共役体をｐＨ７，２に
おいて水性媒体中で一緒にした。検知体共役体は２５μ
７７７　ｍｌの濃度で存在した。非検知体共役体の濃度
を次のように変化させた：３００μ／ｉ　／　ｍｅ、１
００　Ｉｔ　ｉ　／　ｍ／、３０μ、９／ｄ、１０μ９
　／　ｍｌ、そしてｏμｇ／ｍｌｃ対照）。

ヘルペスウィルスで感染されてない又は感染すれた頚部
又は病巣のかき取り物から々る試験体を得た。試験体を
４つの井戸を有する標準的なガラススライドの表面に適
用した。各スライドを組成物１　、’２　、３父は４或
いは対照物３０μｌのいずれかと接触させた。接触後、
各スライドを３０分間室温（２０〜２５℃）下に保温し
た。次いで各スライドを蒸留水で洗浄し、残存組成物を
除去し、吸取り紙で水を除いた。

得られたスライド上の試験体を螢光顕微鏡下に置いた（
励起４７（＋−４９０ｎｍ、放射５２０ｎｍ）。試料を
螢光染色九対して観察した。各スライドを螢光顕微鏡下
に肉眼で検畳し、正の試験結果を示す螢光抗体染色の程
度及びパックグラウンドの染色の強度に関して評価した
。結果を下表■に要約する。この螢光の強度は次のよう
に推定した（（α）特異的試験体染色を表わす表Ｉの値
に対する評価、４＋：最高の螢光、明黄緑色、明白なる
細胞の外囲、はっきり区別できる細胞の非染色ｔ３＋：
明るさの弱い黄緑色の螢光、明白なる細胞の外囲、ばつ
きシ区別できる細胞の非染色中心；２＋！明るさは弱い
が、区別できる螢光、少しはつきすしてない細胞の外囲
、非染色中心域が不明確；１＋：非常に弱い細胞壁の螢
光、細胞中心が細胞壁から区別できない。（ｂ）パック
グラウンド染色に対する表１の値に対する評価；マイナ
ス←）２パツクグラウンドの染色が不存在；±：低強度
の全般に亘るパックグラウンドの染色。

上記データは、本発明による適当な濃度での検知体及び
非検知体共役体の組合せ物が螢光抗体技術におけるパッ
クグラウンドの螢光を減少させる又は排除するのに有効
であることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、螢光化合物と、問題の物質又はその誘導体のエピト
   ープ部位と結合しつる化合物とを含んでなる検卸体共役
   体、及び ポリ　（アミノ酸）、及び螢光化合物に対する実質的な
   構造及び電荷類似性な有し且つ螢光化合物の螢光領域に
   おいて観察しうる螢光を示さないかまたは螢光化合物の
   波長と異なった波長において低量でしか螢光金示さない
   模擬化合物を含んで力る非検知体共役体、但しこの非検
   知体共役体は問題の物質又はその誘導体に特異的に結会
   しえない、を含んでなる試験体中における問題の物質の
   存在を検知するだめの組成物。 λ　水性媒体中の特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、　問題の物質が抗原である特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 本　問題の物質が、ウィルス、バクテリヤ、菌、クラミ
   ジア、表面抗原、及びガン抗原からなる群から選択され
   る特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、螢光化合物がフルオレセイ・才である特許請求の範
   囲第１項記載の組成物。 ＆　問題の物質又はその誘導体と結合しうる化合物が問
   題の物質又はその誘導体に特異的な抗体である特許請求
   の範囲第１項記載の組成物。 ７、　ポリ　（アミノ酸）がグロブリン、血液血漿蛋白
   、免疫グロブリン、又は酵素である特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ８、螢光化合物がフルオレセインであシ、そして模擬化
   合物が４／、５／−位がオキシ置換基で置換されたフル
   オレセイン誘導体である特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。 ９、　オキシ置換基が炭素数１〜８のアルコキ７である
   特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １０、螢光化合物がフルオレセインであシ、そして模擬
   化合物が４／、５／−ジメトキシ−５−カルボキン−３
   ′、６、′−ジヒドロキシスピロ〔インベンゾフラン−
   １（３Ｈ）、９’−（ｅＨ＞　キサンチン〕−３−オン
   である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １１、螢光化合物が２７，７／−位がオキシ置換基で置
   換されたフルオレセイン誘導体であシ、そして模擬化合
   物が４７．５　／−位がオキシ置換基で置換されたフル
   オレセイン誘導体である特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。 ｌＺ　間［ｆの物質がヘルペスウィルスの抗原である特
   許請求の範囲第１項記載の組成物。 １１　問題の物質と結合しうる化合物がヘルペスウィル
   スに対する抗体である特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。 １４、問題の物質と結合しうる化付物がヘルペスウィル
   スに対するモノクローナル抗体である特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 １５、検知体共役体の重量部当り約１〜４重量部の非検
   知体共役体を含肩する水性鞍衝謀体中の特許請求の範囲
   第１項記載の組成物。 １６、模擬化合物対ポリ　（アミノ酸）の比が約ｌＯ：
   １〜３０：ｌである特許請求の範囲第１項記載の組成物
   。 １７、（（Ｚ）　試験体及び特許請求の範囲第１項記載
   の組成物を一緒にし； （ｂ）この組合せ物を保温し； （Ｃ）　この組合せ物に、螢光化合物によって吸収され
   る波長の光を照射し；そして （め　この組合せ物の放射する螢光の量及び形態を観察
   し、但し放射される螢光は試験体中の問題の物質の存在
   と関係がある、 ことを含んでなる試験体中の問題の物質の存在を決定す
   る方法。 ｌａ　問題の物質が、ウィルス、バクテリア、菌、クラ
   ミジア、表面抗原、及びガ／抗原からなる群から選択さ
   れる特許請求の範囲第１７項記載の方ｆ：。