JPS609760B2 - 膵臓鎮痙ポリペプチド及びその塩 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な精製ポリベプチドまたはその生理的に
許容され得る塩、それらの回収精製法ならびに鎮座剤と
してのそれらの使用に関する。

本発明の精製ポリベプチドは、豚の賭臓から回収でき、
意外なことに平滑筋弛緩または鎮屋作用を有することが
判明した。従って、本発明の精製ポリベプチドに隣豚鎮
塵ポリベプチド（ＰａｎｃｒｅａｔｉｃＳｐａｓｍｏｌ
ｙｔｉｃＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）〔以下、便宜上偽Ｐ
と略す〕という俗名を与えた。ＰＳＰは興味深い薬理学
的性質を示す。ァトロピン、その同族体及びアトロピン
様作用を有する合成薬のような顔塵剤または抗産饗剤は
、種々の病気の治療、中でも特に平滑筋塵縮及び運動冗
進症の治療に広く用いられている。

しかしながら、このような薬の目的とする作用には通常
、抗コリン作動性薬としてのそれらの一般的性質に起因
する多数の副作用が伴う。胃腸放射線医学において、特
に胃腸管、胆道及び泌尿管系をよりよく見えるようにす
るためのＸ線可視化剤に関連して、診断用補助薬として
も、アトロピン様抗コリン作働性薬が常用されてきた。

このような薬は通常は非経口的に投与され、また、弛緩
を惹起するのに必要な投与量が大きいために、通常、こ
れらの薬に典型的な副作用がおこる。最近、放射線透過
写真法に関連して、胃腸の運動性を減退させるための、
これにかわる手段として、２ｇ固のアミノ酸からなるべ
ブチドホルモン、グルカゴンの非経口的投与が導入され
た（米国特許第３８６２３０１号明細書参照）。

かしながら、グルカゴンは代謝調節機能への強い影響を
含む多数の作用を人体に及ぼす。中でも最も顕著なのは
過血糖症及び脂肪分解の誘導である。従って、グルカゴ
ンの内視鏡検査法への導入には多少の利点はあるが、望
ましくない副作用は完全は排除されない。本発明の目的
は、公知の薬に匹敵する抗津蜜作用及び平滑筋弛緩作用
を有する一方、副作用が実質的に低減せしめられた鎮座
剤を提供することにある。本発明の一面によれば、以下
のアミノ酸組成：Ｔｒｐ（２）、Ｌｙｓ（４）、Ｈｉｓ
（１）、Ａｒｇ（５）、船ｘ（１０）、Ｔｈｒ（３）、
Ｓｅｒ（９）、Ｇｌｘ（１２）、Ｐｒｏ（１２）、ＧＩ
ｙ（６）、ＡＩａ（６）、Ｃ＄１／２（１４）、Ｖａｌ
（７）、Ｍｅｔ（２）、ｌｉｅ（３）、Ｌｅｕ（１）、
Ｔの（２）、Ｐｈｅ（７）（上記測定値には、上記数字
の土１０％の誤差がある）を示す新規な精製ポリベプチ
ドが提供される。

Ｎ−末端から合計４９固のアミノ酸を含んでなる部分ア
ミノ酸配列は、ｐｙｒ−ＧＩｕ−Ｌ＄−Ｐｒｏ−ＡＩａ
−ＡＩａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃ＄−Ｓｅｒ−も多−Ｇｉ
ｎ−Ａｓｐ−ず。

−ＬｙＳ−ＡＳｎ１５＝令里−−予軍［全豊こ−Ａきざ
工Ｇ認こ−ぶ普コ母鷲亡三申２５
３０一Ｓｅｒ一〇１ｙ一Ｃｙｓ
一Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ一Ｇｉｎ−Ｖａ．−
Ｐｒｏ−Ｇ．ｙ−Ｖ亀ＬＰｒ。

−Ｔｒｐ−Ｃ＄−Ｐｈｅ４０−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−じｕ−
Ｐｒｏ−ＡＩａ−Ｇ帯章一Ｇ，ｕ−Ｓｅｒ−５０
５５ＧＩｕ−ＧＩｕ−
Ｃ＄−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−６０
山ａ一役ｇ−ＬｙＳ−ＡＳｎ−Ｓｅｔ−ＧＩｙ−Ｔｙｒ
−Ｐｒｅ−ＧＩｙ−ｌｉｅ−ＣｙＳ−Ｐｒｏ−ＧＩｕ−
ＡＳｐ−Ｃ孫−ＡＩａ−７５山ａ−Ａｒｇ−ＡＳｎ−Ｃ
＄−Ｃ＄−課ｅ−Ｓｅｒ−兆Ｐ−８０Ｔｈｒ−ｎｅ−Ｐ
ｒｏ−ＧＩｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−９０
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ・Ｐｒｏ・Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｖａ１−Ｇ
Ｉｕ−Ａ蔓昌一Ｃｙｓ一日ｉｓ−Ｔの。

１００（上記巽ノ酸配列中、ｐｙ℃ｌｕ（残基
１）はピログルタミン酸を表わす）であると考えられて
いる。

アミノ酸の略語はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（１
９６８）、３５５８に従った。

本発明はまた、豚の隣豚組織、好ましくはインシュリン
塩ケーキから、クロマトグラフィー工程及び沈澱工程を
組み合わせることによって、ＰＳＰを単離することを含
んでなる精製ＰＳＰの製造方法を提供する。

インシュリン塩ケーキは次ようにして調製できる。

適切に脱脂した豚の全勝臓を冷凍条件下において微粉砕
し、次いでインシュリン回収のために常用の抽出法を行
なう。すなわち、水と低級脂肪族アルカノール（たとえ
ば、エタノールもしくはイソプロパノール）のような水
混和性有機溶媒との混合物によって、酸性媒体中、たと
えば、混合物中ｐＨメーターで側定た時に約１．５乃至
５のＰＨを有する媒体中において抽出する。このような
酸性のｐＨは酸の添加によって得られる。混合物中、有
機溶媒は、全成分が混合された時に約４０乃至８０％（
ｖ／ｖ）の範囲の濃度で存在する。得られたスラリは約
５℃乃至周囲温度の範囲の温度において蝿拝し、次いで
隣豚残留物をたとえば遠心分離によって除去する。然る
後に、抽出物を約５乃至９のｐＨまで中和し、そしてた
とえば遠心分離によって透明化する。抽出物を約３乃至
４の州まで酸性化し、次いで、抽出物から全有機溶媒を
たとえば減圧蒸発によって除去し、然る後に、脂質化合
物をたとえば遠心分離によって除去する。たとえば塩化
ナトリウムを約１０乃至３０％（ｗ／ｖ）の濃度まで添
加することによって、こうして得られた濃縮抽出物から
、他の蛋白質及びポリベプチド（たとえば、ＰＳＰ）と
混じったインシュリンを塩析せしめ、そして形成された
沈澱物をたとえば遠心分離によって単離し、その結果、
塩ケーキを得る。次いで、こうして得られた塩ケーキを
水中に溶解し、約４．９乃至５．７、たとえば約５．３
のＰＨにおいて、場合によっては金属イオン、たとえば
、亜鉛イオンの存在下、等露沈澱によって粗製インシュ
リンを単離し、そして通常は遠心分離によって回収する
。上清を約５．７乃至７、好ましくは約６．５のＰ印こ
する。若干量のインシュリンを含む、形成された沈澱物
を遠心分離する。塩のような付随的物質を除去するため
に、前述の第２の上清に過剰量のＥＤＴＡを加え、次い
で水温和性有機溶媒、好ましくはエタノール（通常、５
乃至２Ｍ音容量）を加える。混合物を約４℃において一
夜沈澱せしめ、次いで遠心分離した。沈澱物を減圧乾燥
して、乾燥粉末（以下、「上清蛋白」と称する）を得た
。この操作によって、「上清蛋白」の実質的に全ての蛋
白材料が回収される。上蒲蛋白の水溶液からＰＳＰが粗
結晶の形態で得ることができるが、該溶液は水約１の都
‘こ「上清蛋白」１部を熔解することにより調整される
。

溶液をゆるやかに凝拝しながら、ＰＨが約３．８乃至４
．８、好ましくは約４．３となるまで約３時間のうちに
酸、たとえば酢酸を加える。次いで、混合物を冷却し、
３日間、好ましくは約４℃において蝿幹を続ける。比較
的大きい榛形の複屈析性結晶をたとえば遠心分離によっ
て単離し、これを減圧乾燥した。こうして得られた材料
は、好ましくはアニオン及びカチオン交換クロマトグラ
フィーの逐次工程を適用することによって、さらに精製
してもよい。

この操作を説明すると、アニオン交換クロマトグラフイ
ーはＱＡＥ−セフアデツクスＡ−２５」〔フアルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＡＢ、スウェーデンによって供
給のカラムについて、次の条件で行なうことができる〔
ＴＲＩＳはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンで
ある〕。

ベッド；“ＱＡＥーセフアデツクスＡ−２５’ベッド寸
法：２．５×８０伽溶離剤：０．０８ＭＴＲＩＳ ｏ．ｏ２ＮＨＣＩ ０．０狐ＮａＣＩ ５０％（Ｖ′Ｖ）エタノール ＰＨ：８．５ 試料：上情蛋白からの結晶 溶離速度：〜４０机と′ｈ フラクション容積：〜１３の‘ フラクションの２７６ｎのにおける吸光度を監視するこ
とによって得られるクロマトグラムは１つの主ピークを
示している。

主ピークに相当するプールをｐＨ７．４に調整し、次い
で水温和性有機溶媒「たとえば、エタノール（４倍容量
）と混合する。２日間４℃に放置した後、沈澱物を遠心
分離によって回収し、減圧乾燥する。

こうして得られた材料はカチオン交換クロマトグラフィ
ーによって「とえば、「ＳＰ−セフアデツクスＣ−２５
」（ファルマシアにより供給）上でさらに精製すること
ができる。

溶解は次の条件で行なえばよい。ベッド：‘‘ＳＰーセ
フアデツクスＣ一２５”ベッド寸法：２．５×２５伽溶
雛剤：０．４ＭＣはＣＯＯＨ Ｏ．０８ＭＣ比ＣＯＯＮａ ５０％（Ｖ／Ｖ）工タノ−ル ＰＨ：４．７ 試料；プールされた材料（第１図） 溶離速度：〜５０の【′ｈ フラクション容積：〜１５Ｍ 前述と同様にして得られたクロマトグラムは１つの主ピ
−クを示している。

これに相当する、プールされたフラクションを蒸発乾固
し、残留物を約６乃至８、たとえば約７のｐＨにおいて
水中に溶解せしめ、過剰量（約１２倍容量）の水混和性
有機溶媒、たとえばエタノールと混合し、前述と同じ条
件下に一夜放置する。溶液から沈澱した精製ＰＳＰを遠
心分離によって単離し、エタノールで洗浄し、そして減
圧乾燥する。あるいは、ＰＳＰ含有蛋白は、濃度１０乃
至２０％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを用いて塩ケーキ
を単離する時に生ずる母液から、追加塩折プロセスによ
って得ることができる。

沈澱物はたとえば遠心離よって回収する。この沈澱物か
らアニオン及び／またはカチオンクロマトグラフイー（
いずれの順でもよい）の使用によって精製ＰＳＰを得る
ことができる。さらにまた、鴎Ｐ含有蛋白は、水と水温
和性有機溶媒との混合物を用いて得られた騰勝の前記抽
出物から、カチオンまたはアニオン交換体、たとえば、
アルギン酸、スルホン化ポリスチレンまたはアミノェチ
ルセルロースへの吸着によって単離することができる。

然る後に、イオン交換体を洗浄し、そして蛋白質を水性
媒体で溶離せしめる。イオン交換体の使用による単離は
、公知方法に類似の方法によって実施する。前記方法の
いずれによって得られたＰＳＰも以下の特性を有する。

分子量（アミノ酸組成から計算）：約１１７００。

分子量〔ドデシル硫酸ナトリウム ディスクゲル電気泳
動によって測定（Ｎｅｖｍｅ：Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２４６（１９７１）６３２８）：
約１０７００。亀気泳動特性：Ｊ．シユリヒトクラル（
Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｍｌｌ）らによって述べられたポリ
アクリルアミドゲル中の塩基性（ｂａｓｉｃ）亀気泳動
（塩基性ＤＥ）（Ｈｏ肌．ＭｅｔａＭｉＲｅＳｅａｒｃ
ｈ、Ｓｕｐｐｌ‐Ｓｅｒｉｅｓ５（１９７４）１３４）
は、Ｒｆｏ．６５〜０．７５の本質的に単一のバンドを
示す。

ポリアクリルアミドゲル中の分析ェレクトロフオーカシ
ングにおいても同様なパターンが得られる。この方法よ
ればｐｌは約４．４まで測定される。紫外線吸収スペク
トル：本発明の精製ポリベプチド（ＰＳＰ）について紫
外線吸収スペクトル（第３図）を測定した。

このＵＵスペクトルは、水１の‘に対しＰＳＰＯ．５夕
を含有する溶液について測定された。該スペクトルから
明らかなように本発明のポリベプチドは約２８仇肌に最
大Ｅ値を有する。赤外線吸収スペクトル：本発明の精製
ポリベプチドについて赤外線吸収スペクトル（第４図）
を測定した。

このＩＲスペクトルは、ＰＳＰＩ．２地およびＫＢｒ３
００の９を含有する錠剤について測定された。ｍ特性吸
収帯は次の如くである。

べプチド結合：１６４０〜１６６０、１５３０、１２４
０および７００肌‐ＩＯＨおよびＮＨ：３３００肌‐１ 脂肪族ＣＨ：１４５０肌‐１ 芳香族ＣＨ：３０６０肌‐Ｉ ＰＳＰをトリプシン、Ｑーキモトリプシン、ＣＮＢｒ、
醗または後述のピログルタメートアミノベプチダーゼで
処理して得られる生成物はＰＳＰと同程度の鏡達活性を
有する。

トリプシン処理 ２０の９のＰＳＰを０．０１ＭＮＨ４ＨＣ０３（冊：７
．８）２０肌中に溶解せしめ、３７０で５分間あらかじ
めインキユ べ− ト し た。

ＴＰＣＫ − ト リプ シ ン（Ｗｏｒ比ｉｎｇｔｏ
ｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．から入手）０．４の９を
含む０．００１ＭＨＣＩを１００ムク添加した後、混合
物を３７ｑ０で１５分間インキュベートし、次いで凍結
乾燥した。Ｑーキモトリプシン処理 ２０地のＰＳＰを０．１ＭＮａＯＨ２００仏そ中に溶解
せしめ、そして０．０８ＭＮ比ＨＣ０３（餌：８．０）
１８００り〆をこれに加えた。

この溶液を３７０において５分間あらかじめインキユベ
ートし、これにＱ−キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手）１００ムタを
含む０．００１ＭＨＣＩを５０メタ加えた。３７０にお
いて１時間インキュベーションを続け、濃酢酸５０仏〆
の添加よって反応を停止せしめ、次いで溶液を凍結乾燥
した。

ＣＮＢｒ処理 ２０の９のＰＳＰを、ＣＮＢｒ７２雌を含む７０％（ｖ
／ｖ地叢酸２泌中に溶解した。

混合物を室温で４０時間貯蔵し、次いで凍結乾燥した。
然る後に、水２心を添加後、凍結乾燥を繰り返した。酸
処理 ＰＳＰＩの９を０．州塩酸１００メタ中に溶解せしめた
複数のサンプルを３７０において２、１０及び２１日間
インキュベートした。

インキュベーションした後、アセトン２の‘の添加によ
って各サンプルの蛋白質を定量的に沈澱せしめた。沈澱
物を遠心分離よって単離し、ァセトン２の【で洗浄し、
そして減圧燥せしめた。こうして得られた複数のサンプ
ルび未処理ＰＳＰのサンプルを塩基性ＤＥ（前記参照）
によって分析した。ただし、ＰＳＰに対してＲｆ＝０．
５３であるように雷気泳動時間を減じた。２日間インキ
ュベートしたサンプル中には０．５３乃至０．８６の範
囲のＲｆを有する一連のバンドが観察された。

１０日間及び２１日間インキユベートしたサンプルにお
いてはＲｆｏ．８６の単一のバンドのみが観察された。

この結果は、２日後にＰＳＰの部分脱アミノ化が起こり
そして１０日間のインキュベーション後には完全脱アミ
ノ化が起こることを示している。ピログルタメートアミ
ノベプチダーゼ処理ＰＳＰ６の９のサンプルを、５０ｍ
Ｍリン酸−水素二ナトリウム＋３０のＭ ｐ−メルカプ
トエタノール十ｌｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．８）
２の‘中に溶解せしめた。

ピ。グルタメートアミノベプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
鉾ｒＭａｎ皿ｅｉｍから入手）２．５の９の前記緩衝液
０．５叫中溶液をこれに加えた。混合物を３７℃におい
て１即時間インキュベートし、次いで凍結乾燥した。（
使用したピログルタメートァミノベプチダーゼ２．５の
９の酵素活性は約１０のＵであった。）ＰＳＰ最終製品
の純度は、分析アィソェレクトリックフオーカシング（
ＩＥＦ）及び塩基性ディスク電気泳動（塩基性ＤＥ、前
記参照）によってチェックすることができる。

この製品はいずれの系においても本質的に単一のバンド
として移動する。ｍＦはＬＫＢパンフレット１一１８０
４−Ｅ０２の指針に従って実施する：ポリアクリルアミ
ドゲルによる分析ェレクトロフオーカシング用「ＬＫＢ
アンフオリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧ」プレート
〔ＬＫＢ−プロダクター（Ｐｒｏｄ叱ｔｅｒ）ＡＢ、フ
ロンマ（Ｂｒｏｍｍａ）、スウェーデン〕。さらに、
「バイオーゲル（Ｂｉｏ−ＷＩ）Ｐ−３０」〔バイオラ
ド ラボラトリーズ（Ｂｉｏｒａｄ山ｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）、リッチモンド、カリフォルニア、Ｕ．Ｓ．Ａ
．〕について、熔雛剤として１モル酢酸を用いてポリベ
プチドのゲル炉過と行っても単一のピークのみが示され
る。

公知の方法に従ってＰＳＰを多種の免疫活性について分
析した。

得られた結果を第１表に示す。第１表免疫反応体
含有量（肌）インシュリン（ＩＲＩ）
３〜６総グルカゴン（総ＧＬＩ）
＜０．０２礎騰グルカゴン（解豚ＧＬ
Ｉ） ＜０．０２血管活性腸べプチド（ＶＩ
Ｐ） ＜０．０２総臓ポリベプチド（豚）
〜０．０８Ｃ−べプチド（豚）
＜０．１ソマトスタチン
〜０．００２ＰＳＰの免疫反応性は、２５０
ｐｇ／財まで検出できるように開発された非常に特異性
の高いラジオィムノアッセイによって測定する。

抗体は、フロィンドのアシュバンド（０．５叫）と混合
した「上清蛋白」（蛋白質約４の９／の‘を含む溶液０
．５の‘）で家兎を２６週間にわたり週２回免疫するこ
とによって作った。

最初の免疫処理後１３日目から始めて１７２日間にわた
り一定の間隔で、各動物から１の固の血液試料（１０の
と）の総量を回収した。得られた抗血清を親和力及び容
量について試験し、ラジオィムノアッセィに用いるのに
適した抗血清を選択した。１２５１−ＰＳＰは、トレル
（Ｔｈｏｒｅｌｌ）及びジョハンソン（Ｊｏｈａｎｓｓ
ｏｎ）によって開発されたラクトベルオキシダーゼ法〔
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２５１（１
９７１）３６３〕に従って調製した。

放射性ヨウ素化されたＰＳＰを公知の方法に従ってァニ
オン交換クロマトグラフィーによって精製し、これを用
いてＬ．○．へデイング（Ｈｅｄｉｎｇ）〔Ｄｉａはｔ
ｏｌｏｇｉｃａ７（１９７１）、１０〕によって開発さ
れた方法に従ってポリベプチドラジオイムノアッセイを
行なった。さらに、本発明はＰＳＰの塩に関する。この
ような塩の例としては、ナトリウム、カリウム、マグネ
シウム、カルシウム及び亜鉛のようなカチオンとの塩な
らびに蟻酸、メタンスルホン酸、塩酸及び硫酸のような
有機も〈は無機酸との酸付加塩が挙げられる。便宜上、
本明細中において「ＰＳＰ化合物」にＰＳＰ及び生理的
に許容され得るその塩を含ませるものとする。ＰＳＰ化
合物及びグルカゴンは、電気刺激されたモルモット摘出
回腸の収縮幅の抑制に関ては効力が概ね等しいことが判
明した（第２表参照）。

ＰＳＰ及びグルカゴンは、０．１％ヒト血清アルブミン
を含む０．９％塩化ナトリウム中に溶解した。第２表Ｐ
ＳＰ化合物のこの作用はフヱントラミンよっては遮断さ
れるがナロキソンによっては遮断されない。

さらに、ＰＳＰ化合物は、マウス生体における騒動の抑
制に関して効力がグルカゴンと概ね等しかった（第３表
参照）。

この作用もまた、フェントラミンよって遮断できた。第
３表 ＰＳＰは、静脈内または腸管腔内に投与した後、家兎生
体における陽の運動性を減少させる。

運動性は、圧力トランスジューサーに接続する腸内のバ
ルーンカテーテルによって記録した。４００ムタのＰＳ
Ｐを静脈内にまたは腸管腔内のバルーンから５弧の位置
に投与すると、家兎（体重２．５〜３．０ｋ９）５匹中
５匹において、ほとんどアトニーといってよいような腸
運動の著しい減退がおこった。

２００ｖ夕のＰＳＰでは家鬼５匹中３匹に明瞭な作用が
観察された。

ＰＳＰは、ＰＳＰ３の９を含むカプセルの形態で経口投
与した時、豚及び豚切除犬における〔Ｕ−１４Ｃ〕蛋白
水解物の吸収ならびに隣切除犬における〔Ｕ−１４Ｃ〕
オバルブミンの吸収を遅延することが判明した。

豚及び大の体重は約３０ｋ９であった。１００仏Ｃｉ〔
Ｕ−１℃〕蛋白水解物または５ＡＣｉ〔Ｕ−１℃〕オバ
ルブミンを１夕／ｋ９のイドン■（ｌｄｏｎ■）懸濁液
と混合し、胃管を通して投与した。

偽薬と比較すると、俺Ｐ投与後３０乃至４０分遅れて最
大血数ｄｐｍ値に達した。ＰＳＰ約１００山夕／ｋ９の
経口投与によって引き起こされる吸収のこの遅延は、胃
腸の運動性の減退を反映している。ＰＳＰ化合物には、
グルカゴンもしくはインシュリンの遊離または脂肪分解
に対する試験管内における作用及び血中グルコースに対
する生体内における作用が少しもない。そしてまた１雌
′ｋ９以下の静脈注射用量も麻酔ラットの血圧に有意な
作用を及ぼさなかった。前記薬理データは、たとえば陽
における、平滑筋達筆の予防及び治療に対するＰＳＰ化
合物のポテンシャル値を示している。

ＰＳＰ化合物は、代謝作用がないために、内視鏡検査法
及び放射線医学的方法において有利であることがわかる
であろう。ＲＰ化合物は注射薬または注入液として静脈
内投与できる。開始時においてより遅い持続性作用が望
ましい場合には、ＰＳＰ化合物は、血流によってゆっく
りと流動させられるデポ（ｄｅｐｏｔ）として投与でき
る。たとえば、末梢循環供給の良好な領域に筋肉内また
は皮下投与することができる。ＰＳＰを胃液、トリプシ
ン及びキモトリプシンにさらした後も生物活性及び免疫
反応性が保持されるという事実ならびにＰＳＰの経口投
与後における吸収の遅延を示す前述の実験は、経口投与
が可能な投与法であることを暗示している。従って、Ｐ
ＳＰは内視検査法の間に内視鏡を通して投与してもよい
し、放射線医学的方法において造影剤、たとえば、硫酸
バリウムと混合してもよい。ＰＳＰ化合物の投与割合は
、所望の反応の大きさ及び投与量を決める際に考慮すべ
き決まりきった他の要因に従って、調節できる。

投与量範囲の例としては１０乃至２００Ａ夕／ｋ９体重
を挙げることができるが、これより低用量でも高用量で
もよい。本発明のＰＳＰ化合物の急性毒・性をマウスに
ついて観察すると、腹腔内注射の場合、ＰＳＰ２００の
９／ｋ９体重の投与量でさえ有害反応はみられなかった
。本発明はまた、ＰＳＰ化合物及び医薬として許容され
得る１もしくはそれ以上の担体を含んでなる医薬組成物
に関する。このような担体の例としては、保存剤及び塩
化ナトリウムを挙げることができる。ＰＳＰ化合物の投
与後に所望の結果を確実に得ようとする場合には、ＰＳ
Ｐ化合物の純度が少なくとも５０％、好ましくは少なく
とも９０％であるＰＳＰ製剤調製用出発材料を用いるの
が望ましい。

これまで公表されていないデータによれば、パンクレア
チン丸剤はＰＳＰを含んでいる（たとえば約煎。

）。パンクレアチン丸剤は糠が含有されるために、解切
除患者及び慢性癖豚炎の患者に用いられてきた。

本発明者らは市販用インシュリンに約３の血のＰＳＰが
含まれていることを見し、出した。本明細中に述べた新
規な特徴及び特徴の組み合わせは全て本質的であると見
なされる。

ＰＳＰの製造方法を以下の実施例について説明するが、
これらは本発明を何ら限定するものではない。

高度に精製されたＰＳＰは、前記ＩＥＦ及び塩基性ＤＥ
系において本質的に単一のバンドとして移動する。実施
例 １ 豚豚臓９４ｋ９から得られた塩ケーキを容量が３．２〆
となるように水中に溶解せしめた。

溶液のｐＨを５．３に調製し、然る後に沈澱物を遠心分
離によって除去した。上清のｐＨを６．５に調製し、こ
うして形成れた懸濁液を遠心分離た。この溶液を０．９
ＭＮａ４ＥＤＴＡ３２の【及びエタノール３５そと混合
した。混合物を一夜４℃に放置し、次いで遠心分離した
。沈澱物を減圧乾燥して、上清蛋白乾燥粉末を５０タ得
た。この粉末の水５００の上中溶液をゆるやかに蝿拝し
ながら、ＰＨが４−３０となるまで（供給の約３時間後
）べリスタルティックポンプによって徐々に加えた。

次いで４℃において３日間燈梓を続けると結晶化がおこ
った。目的とする結晶（外観は棒状で、おそらく斜方晶
であり且つ複屈析を示す）を遠心分離によって回収し、
これを４℃において一夜燭拝しながら水５００地中に懸
濁せしめ、そして減圧乾燥した。収率は５．２夕であっ
た。この材料４夕を５０％（ｖ／ｖ）のエタノール５０
私及び次の第４表に記載の溶離剤５０必中にｐＨ８．６
において溶解せしめた。

この溶液を次の第４表に記載の条件においてァニオン交
換クロマトグラフィーにかけた（第１図参照）。主ピー
クからのプールをｐＨ７．４にし、４倍容量の９６％（
ｖ′ｖ）エタノールと混合し、次いで４℃で２日間貯蔵
した。沈澱物を遠心分離によって単離し、９６％（ｖ／
ｖ）エタノール１５０仇‘で２回洗浄し、そして減圧乾
燥した。収率は２．６夕であった。４この材料２．５夕
を５０％（ｖ′ｖ）エタノール１２５の【及び次の第５
表に記載の溶離剤１２５机中にｐＨ４．７におて溶解し
、次いで次の第５表に記載の条件においてカチオン交換
クロマトグラフィーにかけた（第２図参照）。

主ピーク（目に見えるもののみ）を蒸発乾固した。残留
物は水中に溶解せしめ、溶液のｐＨを７．１に調整した
（最終容積は約９０の【であった）。この溶液を９６％
（ｖ′ｖ）エタノール１２００の‘と混合し、混合物を
４℃で一夜貯蔵した。沈澱物を遠心分離によって単離し
、９６％（ｖ／ｖ）エタノール１５０の‘で２回洗浄し
、そして減圧乾燥した。その結果、第１表に記載した純
度条件を満たす高度に精製されたＰＳＰが１．８タ得ら
れた。第５表 実施例 ２ 実施例１に記載の方法に従って生成した上清蛋白粉末２
０夕を水２００の‘中に溶解せしめた。

これに９６％（ｖ′ｖ）エタノール２０８の【を加え、
次いで酢酸でｐＨを４．６に調整た。少量の沈澱物を遠
心分離によって除去した。徐々に不透明になる上清を、
綾離剤１（０．４Ｍ酢酸、０．０８Ｍ酢酸ナトリウム、
５０％（ｖ′ｖ）エタノール、ｐＨ＝４．６）中で平衡
化した「ＳＰーセフアデックスＣ−２５」を充填した２
．５×８０伽のカラムのカチオン交換クロマトグラフィ
ーにかけた。溶離剤１ ３〆と溶雛剤２（０．３Ｍ酢酸
ナトリウム、５０％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ＝８．
７）との間で直線的濃度勾配溶雛法を行なった。各１０
ｍ‘のフラクションを溶離速度４０地／時間で回収した
。フラクション番号１００から１３０までの大きなピー
クに相当するフラクションをプールした。このプールを
ｐＨ８にし、次いで９６％（ｖ′ｖ）エタノール１．８
夕と混合した。混合物を４℃で２４時間貯蔵した。沈澱
した蛋白質を遠心分離によって単離し、９６％（ｖ／ｖ
）エタノール１５０肌【で２回洗浄し、そして減圧乾燥
した。収率：２．８夕。この材料２．５夕をＴＲＩＳ緩
衝液（０．０５７ＭＴＲＩＳ「 ０．０即日ＣＩ、ＰＨ
＝７．４）２５０の上中に熔解せしめた。この溶液を、
ＴＲＩＳ緩衝液（０．１１９ＭＴＲＩＳ、０．１ＮＨＣ
１、ｐＨ＝７．４）中で平衡化した「ＱＡＥーセフアデ
ックスＡ−２５」を充填した２．５×５０肌のカラムの
アニオン交換クロマトグラフィーにかけた。このカラム
を３０の‘／時間の速度で平衡化緩衝液によって熔離し
た。各１０の‘のフラクションを回収した。フラクショ
ン番号２２５に吸収極大を示すピークの中心主要部分に
対応するフラクションをプールした。このプール（６２
０の‘）を９Ｍ塩化ナトリウム６０の‘及び９６％（ｖ
／ｖ）エタノール１２そと混合した。混合物を４℃で２
岬時間貯蔵した。沈澱した蛋白質を遠心分離によって単
離し、９６％（ｖ′ｖ）エタノール１５０机上で２回洗
浄しそして減圧乾燥した。収率：高度に精製されたＰＳ
ＰＩ．７夕。実施例 ３ 豚魔臓２５０ｋ９からの抽出物を蒸発せしめることによ
って得られた、不熔分の除去された水溶液１５０とに、
塩化ナトリウム２２．５ｋ９を加えた。

混合物を蝿拝することによって添加された塩を溶解せし
め、得られた沈澱物を遠○分離によって除去して、塩ケ
ーキを得た。室温におて２時間連続的に蝿拝しながら硫
酸アンモニウム３４ｋ９を加え、得られた沈澱物を遠心
分離よって単離した。湿潤生成物２２３９を緩衝液（０
．０Ｍ蟻酸、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム緩衝液、ＦＨ
＝３．２）５００叫の添加によって溶解せしめた。水に
対して透析することによって、溶液の伝導率を４ｍＳま
で低減せしめた。この溶液を、バッファー１（０．１Ｍ
蟻酸、０．０２Ｍ水酸化ナトリウム、斑＝３．２）で平
衡化せしめた「ＳＰーセフアデックスＣ−２５」を充填
した５×５０伽のカラム上に添加した。溶液の添加後、
バッファー１中塩化ナトリウム０乃至０．２７Ｍの直接
的勾配によって溶離した。溶離剤の総容積は５．５そで
あった。次いで、カラムをさらに、０．２７Ｍ塩化ナト
リウムを含むバッファー１で溶離した。添加及び溶離の
間の流量は１００の‘／時間とし、各１５の‘のフラク
ションを回収した。２７６ｎ７ におけるフラクション
の吸光度を監視することによって得られたクロマトグラ
ムはフラクション番号４２０乃至５３０に１つの主ピー
クを示した。

この主ピークに相当するプ−ルをｐＨ７．４に調整し、
次いで２Ｍ音容量の９６％（ｖ／ｖ）エタノールと混合
した。４℃に４８時間放置した後、沈澱物を遠心分離に
よって回収し、減圧乾燥した。収率：６夕。こうして得
られた材料を、実施例２と同様な「ＱＡＥーセフアデツ
クスＡ−２５」のカラムによるアニオン交換クロマトグ
ラフィーによって、さらに精製した。収率：高度に精製
されたＰＳＰ３．４夕。実施例 ４ ＰＳＰを１の９／仇と含む非経口的投与用製剤は、以下
のようにして調製できる。

ＰＳＰＩ夕及びラクトース９９夕を蒸留水１ク中に溶解
せしめ、ｐＨを７．０に調整する。

次いで、溶液を滅菌炉遇する。この滅菌溶液を、各バィ
アルが溶液１０のとを含むように１０ｃｃ／ゞィアル中
に充填する。然る後に、溶液を凍結乾燥し、無菌状態で
バイアルを封止した。いずれのバィアル中の製剤も、投
与前に滅菌水１０必中に溶解するものとする。

実施例 ５ 経口投与用製剤は以下のようにして調製できる。

ＰＳＰＩＯＯ雌をとうもろこし澱粉９夕、ラクトース８
夕及びステアリン酸マグネシウム１８０の９と、均質混
合物が得られるまで混合する。

各カプセルがＰＳＰＩの９を含むように、この混合物を
硬ゼラチンカプセルＮｏ．３に充填した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る精製べプチドの単離方法の一態
様中におてァニオン交換クロマトグラフィーによって得
られたフラクションの２７節ｍにおける吸光度を示すグ
ラフ図であり、第２図は、本発明に係る精製べプチドの
単離方法の一態様中においてカチオン交換クロマトグラ
フィーによって得られたフラクションの２７節肌におけ
る吸光度を示すグラフ図であり、第３図は本発明に係る
精製ポリベプチドの紫外線吸収スペクトルを示すグラフ
図であり、第４図は本発明に係る精製ポリベプチドの赤
外線吸収スペクトルを示すグラフ図である。 第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のアミノ酸組成： Ｔｒｐ（２）、Ｌｙｓ（４）、Ｈｉｓ（１）、Ａｒｇ
   （５）、Ａｓｘ（１０）、Ｔｈｒ（３）、Ｓｅｒ（９）
   、Ｇｌｘ（１２）、Ｐｒｏ（１２）、Ｇｌｙ（６）、Ａ
   ｌａ（６）、Ｃｙｓ１／２（１４）、Ｖａｌ（７）、Ｍ
   ｅｔ（２）、Ｉｌｅ（３）、Ｌｅｕ（２）、Ｔｙｒ（２
   ）、Ｐｈｅ（７）（上記測定値は±１０％の誤差を有す
   る）を示し且つＮ−末端からの部分アミノ酸配列がｐｙ
   ｒＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＡＩａ−Ｃｙｓ−
   Ａｒｇ−Ｃｙｓ ５−
   Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｘ−Ａｓｘ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａ
   ｓｘ−Ａｒｇ １０
   １５−Ｖａｌ−Ａｓｘ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−
   Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
   ２０Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｘ−Ｇｌｘ−Ｃｙ
   ｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−２５
   ３０Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｘ−Ｖａｌ−
   ３５ ４０
   Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−
   ４５〔上記アミノ酸配列中、
   ｐｙｒＧｌｕ（残基１）はピログルタミン酸を表わす〕
   を有し、更に添附の第３図によつて示される紫外線吸収
   スペクトルおよび第４図によつて示される赤外線吸収ス
   ペクトルを示し、更に分子量約１１７００（アミノ酸組
   成から計算）およびＲｆ０．６５〜０．７５の本質的に
   単一のバンドを示す電気動特性を有する精製ポリペプチ
   ドまたはその生理的に許容され得る塩。 ２ 結晶の形態である特許請求の範囲第１項記載のポリ
   ペプチド。 ３ 次のアミノ酸組成： Ｔｒｐ（２）、Ｌｙｓ（４）、Ｈｉｓ（１）、Ａｒｇ
   （５）、Ａｓｘ（１０）、Ｔｈｒ（３）、Ｓｅｒ（９）
   、Ｇｌｘ（１２）、Ｐｒｏ（１２）、Ｇｌｙ（６）、Ａ
   ｌａ（６）、Ｃｙｓ１／２（１４）、Ｖａｌ（７）、Ｍ
   ｅｔ（２）、Ｉｌｅ（３）、Ｌｅｕ（１）、Ｔｙｒ（２
   ）、Ｐｈｅ（７）（上記測定値は±１０％の誤差を有す
   る）を示し且つＮ−末端からの部分アミノ酸配列がｐｙ
   ｒＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
   Ａｒｇ−Ｃｙｓ
   ５−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｘ−Ａｓｘ−Ｐｒｏ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｓｘ−Ａｒｇ １０
   １５−Ｖａｌ−Ａｓｘ−Ｃｙｓ−
   Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
   ２０Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｘ−Ｇｌ
   ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−２５
   ３０Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｘ−Ｖａｌ−
   ３５
   ４０Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−
   ４５〔上記アミノ酸
   配列中、ｐｙｒＧｌｕ（残基１）はピログルタミン酸を
   表わす〕を有し、更に添附の第３図によつて示される紫
   外線吸収スペクトルおよび第４図によつて示される赤外
   線吸収スペクトルを示し、更に分子量約１１７００（ア
   ミノ酸組成から計算）およびＲｆ０．６５〜０．７５の
   本質的に単一のバンドを示す電気泳動特性を有する精製
   ポリペプチドまたはその生理的に許容され得る塩を単離
   する方法であつて、クロマトグラフイーと沈澱操作とを
   組み合わせることによつて豚の膵臓から該ポリペプチド
   を単離することを含んでなる単離方法。 ４ 豚の膵臓を酸性媒体中水と水混和性有機溶媒との混
   合物で抽出し；沈澱物を除去し；抽出物を中和し；そし
   て、こうして得られた抽出物からそれ自体公知の分離方
   法によつてＰＳＰを単離し；次いで、所望ならば、ＰＳ
   Ｐをさらにその塩に変換することを含んでなる特許請求
   の範囲第３項記載の単離方法。 ５ 前記精製ポリペプチドをインシユリン塩ケーキから
   単離することを含んでなる特許請求の範囲第２項記載の
   単離方法。 ６ 前記単離を、カチオン及び／またはアニオン交換体
   を用いてクロマトグラフイーによつて実施する特許請求
   の範囲第４項記載の単離方法。 ７ 結晶化プロセスを含む特許請求の範囲第６項記載の
   単離方法。 ８ クロマトグラフイーを実施して、ＰＳＰ主ピークの
   主要部分を回収する特許請求の範囲第７項記載の単離方
   法。 ９ インシユリン塩ケーキの調製時に生じた母液から追
   加の塩析操作によつてＰＳＰを単離し、次いで、アニオ
   ン及び／またはカチオン交換体を用いてクロマトグラフ
   イーを実施することを含んでなる特許請求の範囲第４項
   記載の単離方法。 １０ ｐＨを約４．９乃至５．７の範囲に調整した塩ケ
   ーキの溶液中に形成された沈澱物を除去し且つ、場合に
   よつてはさらに、約５．７乃至７．０の範囲のｐＨにお
   いて上清中に形成された沈澱物を除去することによつて
   塩ケーキからインシユリンを実質的に取り除き、然る後
   にクロマトグラフイーを実施する特許請求の範囲第５項
   〜第８項のいずれかに記載の単離方法。 １１ ｐＨを約５．３に調整した塩ケーキの溶液中に形
   成された沈澱物を除去し且つ、場合によつてはさらに、
   約６．５のｐＨにおいて上清中に形成された沈澱物を除
   去することによつて塩ケーキからインシユリンを実質的
   に取り除き、然る後にクロマトグラフイーを実施する特
   許請求の範囲第５項〜第８項及び第１０項のいずれかに
   記載の単離方法。 １２ 前記結晶化プロセスを、溶液のｐＨを約３．８乃
   至４．８の値に調整することによつて実施する特許請求
   の範囲第７項記載の単離方法。 １３ 前記結晶化プロセスを、溶液のｐＨを約４．３の
   範囲の値に調整することによつて実施する特許請求の範
   囲第７項または第１２項記載の単離方法。 １４ 次のアミノ酸組成： Ｔｒｐ（２）、Ｌｙｓ（４）、Ｈｉｓ（１）、Ａｒｇ
   （５）、Ａｓｘ（１０）、Ｔｈｒ（３）、Ｓｅｒ（９）
   、Ｇｌｘ（１２）、Ｐｒｏ（１２）、Ｇｌｙ（６）、Ａ
   ｌａ（６）、Ｃｙｓ１／２（１４）、Ｖａｌ（７）、Ｍ
   ｅｔ（２）、Ｉｌｅ（３）、Ｌｅｕ（１）、Ｔｙｒ（２
   ）、Ｐｈｅ（７）（上記測定値は±１０％の誤差を有す
   る）を示し且つＮ−末端からの部分アミノ酸配列がｐｙ
   ｒＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
   Ａｒｇ−Ｃｙｓ ５−
   Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｘ−Ａｓｘ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａ
   ｓｘ−Ａｒｇ １０
   １５−Ｖａｌ−Ａｓｘ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−
   Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
   ２０Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｘ−Ｇｌｘ−Ｃｙ
   ｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−２５
   ３０Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｘ−Ｖａｌ−
   ３５ ４０
   Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−
   ４５〔上記アミノ酸配列中
   、ｐｙｒＧｌｕ（残基１）はピロルグルタミン酸を表わ
   す〕を有し、更に添附の第３図によつて示される紫外線
   吸収スペクトルおよび第４図によつて示される赤外線吸
   収スペクトルを示し、更に分子量約１１７００（アミノ
   酸組成から計算）およびＲｆ０．６５〜０．７５の本質
   的に単一のバンドを示す電気泳動特性を有する精製ポリ
   ペプチドまたはその生理的に許容され得る塩を有効量含
   み、これに適当な生理的に許容され得る担体もしくは賦
   形薬を配合してなる鎮痙剤。 １５ さらにパラベンもしくはフエノールのような保存
   剤を配合してなる、精製ポリペプチドの滅菌水溶液であ
   る特許請求の範囲第１４項記載の鎮痙剤。 １６ さらに約０．９％の塩化ナトリウムを含む、精製
   ポリペプチドの滅菌水溶液である特許請求の範囲第１４
   項または第１５項記載の鎮痙剤。 １７ 該溶液中の精製ポリペプチドの濃度が０．１乃至
   ２００ｍｇ／ｍｌ、である特許請求の範囲第１５項また
   は第１６項記載の鎮痙剤。 １８ 該溶液中の精製ポリペプチドの濃度が０．５乃至
   ２５ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲第１５項ないし第
   １７項のいずれかに記載の鎮痙剤。