CH646414A5 - Purified pancreatic spasmolytic polypeptide, process for its isolation, and pharmaceutical composition - Google Patents

Description

Die Erfindung liefert also ausserdem ein Verfahren zur Herstellung gereinigten PSP's, wobei dieses Verfahren das Isolieren von PSP aus Schweinepankreasgewebe, bevorzugt aus dem Insulinsalzkuchen durch eine Kombination von Chromatographie- und Ausfällverfahrensschritten, beinhaltet.

Der Insulinsalzkuchen kann wie folgt hergestellt werden: Ganze, sauber entfettete Schweinepankreasdrüsen werden gefroren fein zerteilt und sodann dem konventionellen Extraktionsprozess für das Gewinnen von Insulin unterworfen, nämlich mittels einer Mischung aus Wasser und einem organischen wassermischbaren Lösungsmittel, wie einem niedrigen aliphatischen Alkanol - beispielsweise Ethanol oder Isopropanol - in einem sauren Medium, beispielsweise einem Medium mit einem pH im Bereich von etwa 1,5 bis 5, gemessen mit einem pH-Meter in der Mischung, extrahiert. Der saure pH wird durch Zugabe einer Säure erreicht. In der fertigen Mischung aller Komponenten ist das organische Lösungsmittel in einer Konzentration im 30 Bereich von etwa 40 bis 80 Vol.% vorhanden. Die resultierende Aufschlämmung wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa 5°C bis zu Umgebungstemperatur, gerührt, gefolgt durch Abtrennen der Drüsen-Reste, beispielsweise durch Zentrifugieren. Der Extrakt wird sodann auf einen pH-Wert 3s im Bereich von etwa 5 bis 9 neutralisiert und geklärt, beispielsweise durch Zentrifugation. Der Extrakt wird auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis 4 angesäuert, woraufhin der Extrakt von jeglichem organischen Lösungsmittel befreit wird, beispielsweise durch Verdampfen bei reduziertem 40 Druck, gefolgt durch Abtrennen der Lipid-Verbindungen, beispielsweise durch Zentrifugation. Insulin, gemischt mit anderen Proteinen und Polypeptiden, wie PSP, wird aus den derart erhaltenen, konzentrierten Extrakten ausgesalzen, beispielsweise durch Zugabe von Natriumchlorid bis zu einer 45 Konzentration im Bereich von etwa 10 bis 30% (Gew./Vol.), und das derart gebildete Präzipitat - beispielsweise durch Zentrifugation - isoliert, wodurch der Salzkuchen gebildet wird.

Der derart erhaltene Salzkuchen kann daraufhin in Wasser so gelöst und das Rohinsulin durch Ausfällung am isoelektrischen Punkt bei einem pH im Bereich von etwa 4,9 bis 5,7, beispielsweise bei etwa 5,3, wahlweise in Gegenwart von Metallionen, beispielsweise Zinkionen, isoliert und gewonnen werden, üblicherweise durch Zentrifugation. Der 55 pH-Wert des Überstandes wird in den Bereich von zwischen etwa 5,7 bis 7, bevorzugt etwa 6,5, eingestellt. Das gebildete Präzipitat, welches etwas Insulin enthält, wird abzentrifu-giert. Um Hilfssubstanzen, wie Salze, zu entfernen, wird ein EDTA-Überschuss zum obigen Überstand dazugegeben, 60 gefolgt durch Zugabe eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels, bevorzugt von Ethanol (üblicherweise zwischen 5 bis 20 Vol. Teile). Die Mischung wird über Nacht bei etwa 4°C stehengelassen, um Präzipitat zu bilden und anschliessend zentrifugiert. Das Präzipitat wird vakuum-65 getrocknet und liefert ein trockenes Pulver, welches im weiteren hier als «Überstands-Protein» bezeichnet wird. Durch dieses Verfahren kann praktisch das gesamte Proteinmaterial des «Überstands-Proteins» gewonnen werden.

646 414

PSP kann in einer rohen, kristallinen Form aus einer Lösung von «Überstands-Protein» in Wasser (etwa 10 Teile) gewonnen werden. Die Lösung wird leicht gerührt, während Säure, beispielsweise Essigsäure, über etwa 3 Stunden zugegeben wird, bis ein pH-Wert im Bereich von etwa 3,8 bis 4,8, bevorzugt etwa 4,3, erreicht wird. Die Mischung wird daraufhin gekühlt und weitere drei Tage, bevorzugt bei etwa 4°C, weitergerührt. Eine Ausbeute relativ grosser, stäbchenförmiger, doppelbrechender Kristalle wird isoliert, beispielsweise durch Zentrifugation, und vakuum-getrocknet.

Das derart erhaltene Material kann weiter gereinigt werden, bevorzugt durch Anwendung aufeinanderfolgender Schritte von Anionen- und Kationenaustauschchromatogra-phie.

Zur Erläuterung des Verfahrens kann beispielsweise Anio-nenaustauschchromatographie auf einer Säure von «QAE-Sephades A-25» (geliefert durch Pharmacia AB, Schweden) unter Verwendung des in Figur 1 der begleitenden Zeichnungen gegebenen Elutionsmittels (TRIS ist dabei tris-Hydroximethyl-Aminomethan) durchgeführt werden. Das bei Überwachung der optischen Dichte von Fraktionen bei 276 nm erhaltene Chromatogramm zeigt einen Hauptpeak. Die gesammelten Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprechen, werden auf pH 7,4 eingestellt und anschliessend mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol (4 Vol.-Teile) gemischt. Nach zweitägigem Stehen bei 4°C wird das Abgeschiedene durch Zentrifugation gewonnen und vakuum-getrocknet.

Das so erhaltene Material kann weiter durch Kationenaus-tauschchromatographie, beispielsweise auf einer Säule von «SP-Sephadex C-25» (geliefert durch Pharmacia) gereinigt werden. Elution kann mit dem Elutionsmittel, das auf Figur 2 der begleitenden Zeichnung angegeben ist, durchgeführt werden. Das in der gleichen Weise wie oben beschrieben erhaltene Chromatogramm zeigt einen Hauptpeak. Die gesammelten, diesem entsprechenden Fraktionen werden zur Trockenheit abgedampft, der Rückstand in Wasser bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis etwa 8 gelöst, beispielsweise bei etwa 7, mit einem Überschuss (etwa 12 Vol.-Teile) eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, beispielsweise Ethanol, gemischt, und über Nacht unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben gehalten. Gereinigtes PSP, welches sich aus der Lösung abscheidet, wird durch Zentrifugation isoliert, mit Ethanol gewaschen und vakuum-getrocknet.

Alternativ dazu kann PSP-haltiges Protein aus der Mutterlauge erhalten werden, die entsteht, wenn der Salzkuchen unter Verwendung von Natriumchlorid in einer Konzentration von 10 bis 20% (Gew./Vol.) durch einen zusätzlichen Aussalz-Verfahrensschritt isoliert wird. Das Präzipitat wird beispielsweise durch Zentrifugation gewonnen. Gereinigtes PSP kann aus diesem Präzipitat durch Verwendung von Anionen- und/oder Kationenaustauschchromatographie in beliebiger Reihenfolge gewonnen werden.

Ein weiteres Verfahren zur Isolation von PSP-haltigem Protein aus dem obigen Extrakt der Pankreasdrüsen verwendet eine Mischung von Wasser und einem organischen, wassermischbaren Lösungsmittel durch Adsorption an einem Kationen- oder Anionenaustauscher, beispielsweise Alginin-säure, sulfoniertes Polystyren oder Aminoethylcellulose. Anschliessend wird der Ionenaustauscher gewaschen und das Protein mit einem wässrigen Medium eluiert. Die Isolation mit Hilfe eines Ionenaustauschers wird nach Verfahren durchgeführt, die bekannten Verfahren analog sind.

PSP, das nach einem der oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, besitzt folgende charakteristischen Eigenschaften:

Molekulargewicht, berechnet aus der Aminosäurezusammensetzung: etwa 11.700.

Molekulargewicht, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (Neville: J. Biological Chemistry 246 (1971) 6328): etwa 10.700.

Elektrophorese-Charakteristika: Basische DISC-Elektro-phorese (basische DE) in Polyacrylamid-Gel, wie durch J. Schlichtkrull et al. (Horm. Metabol. Research, Suppl.

Series 5 (1974) 134) beschrieben, zeigt im wesentlichen eine einzige Bande mit einem Rt von 0,65 bis 0,75. Ein ähnliches Muster wird bei analytischer Elektrofokussierung in Polyacrylamid-Gel erhalten, wodurch der Pi (isoelektrischer Punkt) auf etwa 4,4 bestimmt wird.

Die Produkte, die bei Behandlung von PSP mit Trypsin, a-Chymotrypsin, CNBr, Säure oder Pyroglutamat-Amino-peptidase wie weiter unten beschrieben, enthalten werden, haben eine spasmolytische Aktivität gleicher Grössenord-nungwiePSP.

Trypsinbehandlung

20 mg PSP wurden in 20 ml 0,01 M NHtHCCb-Lösung (pH: 7,8) gelöst und 5 Minuten bei 37°C präinkubiert. Nach Zugabe von 100 jxl 0,001 M HCL, welche 0,4 mg TPCK-Trypsin enthielt (erhältlich von Worthington Biochem. Corp.), wurde die Mischung bei 37°C weitere 15 Minuten inkubiert und anschliessend lyophilisiert.

a-Chymotrypsinbehandlung

20 mg PSP wurde in 200 jil 0,1 M NaOH gelöst und 1800 jxl 0,05 M NH4HCO3 (pH: 8,0) zugegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten bei 37°C präinkubiert und anschliessend 50 jxl 0,001 M Salzsäure, welche 100 (ig a-Chymotrypsin enthielt (erhältlich von Sigma Chemical Company) zugegeben. Die Inkubation wurde 1 Stunde bei 37°C fortgesetzt und die Reaktion durch Zugabe von 50 [al konzentrierter Essigsäure abgebrochen, woraufhin die Lösung lyophilisiert wurde.

CNBr-Behandlung

20 mg PSP wurden in 2 ml 70 Vol.-prozentiger Ameisensäure, welche 72 mg CNBr enthielt, gelöst. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 40 Stunden gehalten und anschliessend lyophilisiert. Das Lyophilisieren wurde anschliessend nach Zugabe von 2 ml Wasser wiederholt.

Säurebehandlung

1 mg PSP-Proben, in 100 ul 0,5 N Salzsäure gelöst, wurden bei 37°C 2,10 und 21 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Protein jeder Probe quantitativ durch Zugabe von 2 ml Aceton ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation isoliert, mit 2 ml Aceton gewaschen und vakuum-getrocknet. Die derart erhaltenen Proben und eine Probe unbehandeltes PSP wurden durch basische DISC-Elektro-phorese (s. oben) analysiert, wobei die Zeit der Elektrophorese reduziert wurde, so das ein Rf = 0,53 für PSP resultierte. Bei der 2 Tage inkubierten Probe zeigte sich eine Serie von Banden, deren Rf zwischen 0,53 bis 0,86 lag. Bei den Proben, die 10 und 21Tage inkubiert wurden, trat lediglich eine einzige Bande mit Rf = 0,86 auf. Diese Resultate zeigen, dass eine teilweise Deamidierang von PSP nach 2 Tagen auftrat und dass eine vollständige Deamidierang nach 10 Tagen der Inkubation stattgefunden hatte.

Pyroglutamat-Aminopeptidase-Behandlung

Eine 6 mg Probe PSP wurde in 2 ml eines Puffers mit 50 m M Natriummonohydrogenphosphat (Na2H PO4), 30 m M p-Mercaptoethanol, 1 m M EDTA und einem pH-Wert von 7,8 gelöst. Eine Lösung von 2,5 mg Pyroglutamat-Aminopep-

4

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

646 414

tidase (Boehringer Mannheim) in 0,5 ml desselben Puffers wurde zugegeben. Die Mischung wurde 16 Stunden bei 37°C inkubiert und lyophilisiert (2,5 mg der eingesetzten Pyroglu-tamat-Aminopeptidase zeigten eine enzymatische Aktivität von 10 mu). Die Reinheit des endgültigen PSP-Produktes kann durch analytische isoelektrische Fokussierung (analy-tical isoelectric focusing, IEF) und basische DISC-Elektro-phorese (basic DE, s. oben) überprüft werden. Das Produkt wandert im wesentlichen als einzelne Bande in beiden Systemen. IEF wird entsprechend dem in der LKB-Bro-schüre I-1804-E02: «LKB Ampholin PAG», beschriebenen Verfahren, mit Platten für analytisches Elektrofokussieren auf Polyacrylamid-Gelen (LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden) durchgeführt. Bei Gelfiltration des Polypeptids auf «Bio-Gel P-30» (Biorad Laboratories, Richmond, California, USA) wird lediglich ein einziger Peak bei Verwendung von 1 M Essigsäure als Elutionsmittel gefunden.

PSP ist mit einer Anzahl allgemein bekannter Immun-Reaktivitäts-Reaktionen untersucht worden. Die Resultate ' sind in Tabelle 1 aufgeführt:

Tabelle 1

Immunoreaktant

Gehalt (ppm)

Insulin (IRI)

3-6

Gesamtglukagon (totales GLI)

<

0,02

Pankreatisches Glukagon (pankreatisches

0,02

GLI)

<

Gefässaktives intestinales Peptid (VIP)

<

0,02

Pankreatisches Polypeptid (Schwein)

~

0,08

C-Peptid (Schwein)

<

0,1

Somatostatin

0,002

Die Immunreaktion von PSP wird durch ein hochspezifisches Radioimmunassay-Verfahren gemessen, welches derart entwickelt ist, dass es bis zu 250 pico g pro ml aufspürt.

Antikörper wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit «Überstandsprotein», gemischt mit Freund'schem Zusatz (0,5 ml) 26 Wochen lang jeweils 2 mal pro Woche (0,5 ml einer Lösung, die etwa 4 mg Protein pro ml enthielt) hergestellt.

Vom 13. Tag nach der ersten Immunisierung wurde eine Gesamtmenge von 10 Blutproben (10 ml) von jedem Tier genommen, und diese in regelmässigen Intervallen über einen Zeitraum von 172 Tagen fortgesetzt und gesammelt. Die erhaltenen Antisera wurden auf Affinität und Kapazität geprüft und ein geeignetes Antiserum wurde für die Verwendung in den Radioimmunassay-Verfahren ausgewählt.

1251-PSP wurde nach der Lactoperoxidasemethode hergestellt, entwickelt von Thorell und Johansson (Biochim. Bio-phys. Acta 251 (1971) 363). Das mit radioaktivem Jod markierte PSP wurde durch an sich bekannte Anionenaustausch-chromatographie gereinigt und für die Polypeptid-Radioim-munoessay-Methode, entsprechend dem von L.G. Heding entwickelten Verfahren verwandt (Diabetologica 7 (1971),

10).

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Salze von PSP und, als Beispiele für derartige Salze, Salze mit Kationen wie Natrium, Kalium, Magnesium, Kalzium und Zink sowie Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren wie Ameisensäure, Methansulfonsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, um nur einige zu nennen.

Aus Gründen der Kürze wird die Bezeichnung «PSP-Verbindungen» verwandt, um sowohl PSP als auch physiologisch akzeptable Salze desselben zu benennen.

Es wurde gefunden, dass PSP-Verbindungen und Glukagon etwa gleich wirksam bei der Verringerung der Amplitude von Kontraktionen elektrisch angeregten Guinea-Schwein-Ileums in vitro sind, s.a. Tabelle 2. PSP und Glukagon wurden in 0,9%igem Natriumchlorid mit 0,1% menschlichem Serum Albumin gelöst.

Tabelle 2

Konzentration im Bad des Organs, Molar

Inhibitions-Effekte in Prozent

PSP

Glukagon

10-5

89

89

10-6

49

51

10-7

21

24

Diese Auswirkungen von PSP-Verbindungen konnten durch Phentolamin, aber nicht durch Naloxon blockiert werden. Die Spontan-Motilität isolierten Ileums aus Reserpin-behandelten Guinea-Schweinen wurde durch PSP inhibiert.

PSP-Verbindungen wurden ebenfalls als etwa genauso wirksam wie Glukagon in bezug auf die Inhibition der Peristaltik von Mäusen in vivo befunden, s. Tabelle 3, ein Effekt, der wiederum durch Phentolamin unterbunden werden konnte.

Tabelle 3

Substanz (50 mg/kg Subkutan)

Prozent Darm, der von Holzkohle zurückgelegt wird, verglichen mit einer Kontrolle

PSP

78

Glukagon

66

Atropinsulfat

64

PSP reduziert die intestinale Motilität in Kaninchen nach intravenöser oder intraluminaler Gabe in den Darm. Die Motilität wurde mit Hilfe eines Ballonkatheters im Darm, angeschlossen an einen Druckumwandler, aufgezeichnet. Bei fünf von fünf Kaninchen (Körpergewicht 2,5 bis 3,0 kg) verursachten 400 |i,g PSP, intravenös oder 5 cm vom Ballon in das Lumen des Darmes gegeben, eine deutliche Reduktion der Darmmotilität, fast eine Atonie.

200 ng übten einen deutlichen Effekt bei drei von fünf Kaninchen aus. Glukagon hatte die gleiche Wirkung, jedoch nur, wenn es intravenös gegeben wurde. Es wurde gefunden, dass PSP die Absorption von [U-14C]-Proteinhydrolysat in Schweinen und Hunden, denen das Pankreas entfernt worden war, und von [U-14C]-Ovalbumin in Hunden mit entfernter Pankreas verzögerte, wenn die Verbindung per os in einer Kapsel mit 3 mg PSP gegeben worden war. Die Schweine und die Hunde wogen etwa 30 kg. 100 |xCi U-I4C-Protein-Hydrolysat oder 5 jj,Ci [U-14C]-Ovalbumin wurden mit einer Suspension von 1 g/kg Idon (Warenzeichen) vermischt und durch Magensonden gegeben. Maximale Plasma dpm-Werte wurden 30 bis 40 Minuten nach Gabe von PSP, verglichen mit einem Placebo, erreicht. Dieser Absorptions-Aufschub, der durch etwa 100 [ig/kg PSP oral bewirkt wird, bedeutet wahrscheinlich eine reduzierte gastro-intestinale Motilität.

Es ist gefunden worden, dass PSP-Verbindungen keinerlei in vitro-Effekt auf die Freisetzung von Glukagon oder Insulin oder auf die Lipolyse haben, und auch in vivo keine Wirkung auf den Blutglukosegehalt ausüben. Genauso wenig übte eine intravenös injizierte Dosis bis zu 1 mg/kg irgend-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

646 414 6

einen bemerkenswerten Effekt auf den Blutdruck einer anäs- Wenn versucht wird, sicherzustellen, dass das erwünschte thetisierten Ratte aus. Resultat nach Gabe einer PSP-Verbindung erreicht wird,

Diese oben angegebenen pharmakologischen Daten zeigen empfiehlt es sich, ein Startmaterial für die Herstellung von den potentiellen Wert von PSP-Verbindungen für das Ver- PSP-Präparationen zu verwenden, welches eine Reinheit von hindern und die Behandlung von Krampfzuständen glatter s mindestens 50%, bevorzugt eine Reinheit von mindestens

Muskulatur, beispielsweise im Intestinaltrakt. Aufgrund des 90% einer PSP-Verbindung besitzt.

Fehlens metabolischer Auswirkungen können PSP-Verbin- Nach bisher nicht veröffentlichten Daten enthalten Pan-dungen vorteilhaft als Ersatz für Glukagon in der Endo- kreatin-Tabletten PSP (beispielsweise 1 pro tausend). Aufskopie und bei Röntgenuntersuchungen eingesetzt werden. grand ihres Enzym-Gehaltes sind Pankreatin-Tabletten für

Neben dem spasmolytischen Effekt zeigt PSP auch inhibi- io Patienten verwandt worden, denen die Pankreas entfernt torischen Effekt auf die Sekretion von gastrischer Säure. Das wurde und für Patienten mit chronischer Pankreasentzün-

Befinden von Patienten von Zwölffingerdarmgeschwüren dung. Ausserdem ist nun gefunden worden, dass kommerziell wird verbessert durch die Behandlung von Wirkstoffen, die erhältliches Insulin etwa 30 ppm PSP enthält.

die Sekretion von gastrischer Säure inhibieren. Die gleichen Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben

Patienten leider aber an erhöhter gastrointestinaler Motilität, is sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden

PSP kombiniert nun beide Effekte, die sehr wichtig sind für Beschreibung, in der Ausführangsbeispiele an Hand der die Behandlung von Patienten von Zwölffingerdarmge- Zeichnung erläutert sind. Dabei zeigt:

schwüren, nämlich den inhibierenden Effekt auf die gastrointestinale Motilität und den inhibierenden Effekt auf die Fig. 1 ein Beispiel eines Chromatogrammes einer Anionen -Sekretion von gastrischer Säure. 20 Austauschchromatographie von «Überstands-Protein»; und

Als Beispiel eines bekannten Medikamentes, welches die Fig. 2 ein Beispiel eines Chromatogrammes einer

Sekretion von gastrischer Säure inhibiert, kann Cimetidin Kationen-Austauschchromatographie der gesammelten genannt werden. Cimetidin aber zeigt unerwünschte Neben- Fraktionen des Haupt-Peaks der Figur 1.

erscheinungen wie Diarrhoea, Exanthemae, Erhöhung der

Anzahl der Leberenzyme und Gynecomastie. Da PSP ein 25 In den nun folgenden Ausführungsbeispielen, welche kei-

Polypeptid ist, welches oral verabreicht wird und daher nur neswegs den Erfindungsgedanken eingrenzen sollen, wird zu geringen Ausmassen im gastrointestinalen Trakt absor- mit «hochgereinigtem PSP» PSP bezeichnet, welches im biert wird, ist es sehr unwahrscheinlich, dass es systematisch wesentlichen als einzige Bande in den oben beschriebenen ungewünschte Effekte zeigt. Isoelektrofokussing und basischen DISC-Elektrophorese-

Es ist nachgewiesen worden, dass PSP die Pentagastrin-sti- 30 Verfahren wandert.

mulierte Sekretion von gastrischer Säure in Ratten und

Katzen mit chronischen gastrischen Fisteln inhibiert. Bei- Beispiel 1

spielsweise zeigten 10 (ig PSP, die während einer Stunde an Ein aus 94 kg Schweinepankreasdrüsen gebildeter Salz-

Ratten verabreicht wurden, die gleiche inhibierende Wirkung kuchen wurde in Wasser auf ein Volumen von 3,21 gelöst,

auf die Säuresekretion nach der Verabreichung von 5 [ig Pen- 35 Der pH-Wert der Lösung wurde auf 5,3 eingestellt, wor-

tagastrin s.c., wie diejenigen von 1 (ig Somatostatin. Das aufhin das Präzipitat durch Zentrifugation abgetrennt wurde,

bedeutet, dass die Peptide auf molarer Basis äquipotent sind. Der pH-Wert des Überstandes wurde auf 6,5 eingestellt und

10 [ig/kg PSP s.c. und 250 [ig PSP oral verabreicht in Kapseln die dabei gebildete Suspension zentrifugiert. Die Lösung zeigten analoge Wirkungen bei Katzen. wurde mit 32 ml 0,5 M Na4EDTA und 351 Ethanol gemischt.

PSP-Verbindungen können intravenös als Bolus oder als 40 Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen und Infusion gegeben werden. Wenn ein verlängerter Effekt, der anschliessend zentrifugiert. Das Präzipitat wurde vakuumlangsamer eintritt, erwünscht wird, können PSP-Verbin- getrocknet und lieferte 50 g trockenen «Überstands-Protein»-dungen als Depot gegeben werden, von welchem sie langsam Pulvers.

durch den Blutstrom mobilisiert werden, beispielsweise Sub- Eine Lösung des Pulvers in 500 ml Wasser wurde leicht kutan oder intramuskulär in einem Bereich guten peripheren 45 gerührt, während langsam mit Hilfe einer peristaltischen

Kreislaufes. Die Tatsache, dass die biologische Aktivität und Pumpe 1 M Essigsäure zugegeben wurde, bis ein pH-Wert die Immunreaktionsfähigkeit aufrechterhalten werden, von 4,3 erreicht war (nach etwa drei Stunden pumpen). Das nachdem PSP Magensaft, Trypsin, Chymotrypsin und den Rühren wurde daraufhin drei Tage bei 4°C fortgesetzt,

oben beschriebenen Experimenten unterworfen wurde, wodurch Kristallisation eintrat. Die Kristallernte (bei erstem wobei verlangsamte Absorption nach oraler Gabe von PSP so.Hinsehen stäbchenförmig, möglicherweise orthorhombisch beobachtet wurde, weist auf den oralen Weg als mögliche Art und Doppelbrechung zeigend) wurde durch Zentrifugation der Gabe hin. Dementsprechend kann PSP durch ein Endo- geerntet, in 500 ml Wasser bei 4°C durch Rühren über Nacht skop während der Endoskopie gegeben werden oder mit dem suspendiert, zentrifugiert und vakuum-getrocknet. Die AusKontrastmittel, beispielsweise Bariumsulfat, während dem beute war 5,2 g.

Röntgen-Verfahren gemischt werden. ss 4 g dieses Materials wurde in 50 ml von 50%igem (V/V)

Die Dosierangsgeschwindigkeit von PSP-Verbindungen Ethanol und 50 ml Elutionsmittel (s. Figur 1) bei pH-Wert 8,6

können entsprechend der Grösse des erwünschten Antwort- gelöst. Die Lösung wurde Anionenaustauschchromatogra-

verhaltens und anderer Faktoren eingestellt werden, die rou- phie, wie in Figur 1 gezeigt, unterworfen. Die vereinigten tinemässig berücksichtigt werden, wenn die Dosierung Fraktionen des Haupt-Peaks wurden auf einen pH-Wert von bestimmt wird. 60 7,4 eingestellt, mit 4 Volumen 96%igem (V/V) Ethanol ver-

Als Beispiel eines Dosierangsbereichs kann 10 bis 200 [ig mischt und sodann bei 4°C zwei Tage gelagert. Das Präzipitat pro kg Körpergewicht angegeben werden, obwohl auch eine wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml höhere oder niedrigere Dosis gegeben werden kann. 96%igem (V/V) Ethanol gewaschen und vakuumgetrocknet.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeu- Die Ausbeute betrag 2,6 g.

tische Zusammensetzung, welche PSP-Verbindungen und 65 2,5 g dieses Materials wurde in 125 ml 50%igem (V/V)

eine oder mehrere andere pharmazeutisch akzeptable Träger- Ethanol und 125 ml Elutionsmittel (s. Figur 2) bei pH 4,7

substanz(en) aufweist. Als Beispiel derartiger Träger können gelöst und anschliessend Kationenaustauschchromatogra-

Konservierungsmittel und Natriumchlorid genannt werden. phie, wie in Figur 2 dargestellt, unterworfen. Die vereinigten

646 414

Fraktionen des Haupt-Peaks (lediglich «sichtbare») wurden zur Trockenheit abgedampft. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und der pH der Lösung auf 7,1 eingestellt (das Endvolumen war etwa 90 ml). Die Lösung wurde mit 1200 ml 96%igen (V/V) Ethanols gemischt und bei 4°C über Nacht s stehengelassen. Das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96%igen (V/V) Ethanols gewaschen und vakuum-getrocknet. Die Ausbeute war 1,8 g hoch gereinigtes PSP, welches die in Tabelle 1 zusammenge-fassten Reinheitsanforderungen erfüllte. io

Beispiel 2

20 g des «Überstands-Protein»-Pulvers, welches, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt worden war, wurde in 200 ml Wasser gelöst. 208 ml 96%igen (V/V) Ethanols is wurden zugegeben, gefolgt durch Einstellung des pH-Wertes auf 4,6 mit Essigsäure. Eine geringfügige Menge Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand, welcher langsam trüb wurde, wurde Kationenaus-tauschchromatographie auf einer 2,5 cm Durchmesser 20

x 80 cm Länge-Säule «SP-Sephadex C-25» unterworfen, im Elutionsmittel 1 (0,4 M Essigsäure, 0,05 M Natriumacetat, 50% (V/V) Ethanol, pH: 4,6) äquilibriert. Elution mit einem linearen Gradienten wurde zwischen 31 des Elutionsmittels 1 und 31 des Elutionsmittels 2 (0,3 M Natriumacetat, 50% 25 (V/V) Ethanol, pH: 8,7) durchgeführt. 10-ml-Fraktionen wurden bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 40 ml pro Stunde gesammelt. Die Fraktionen, die dem grossen Peak, der zwischen den Fraktionen 100 bis 130 auftritt, entsprechen, wurden vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen 30 wurden auf einen pH-Wert von 8 gebracht und anschliessend mit 1,8196%igen (V/V) Ethanols gemischt. Die Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C stehengelassen. Das abgeschiedene Protein wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96%igen (V/V) Ethanols gewaschen und vakuum-getrocknet. Ausbeute: 2,8 g. 2,5 g dieses Materials wurde in 250 ml eines TRIS-Puffers (0,0575 M TRIS, 0,05 N HCL, pH: 7,4) gelöst. Die Lösung wurde Anionenaustauschchromato-graphie auf einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, 50 cm Länge mit «QAE-Sephadex A-25», äquilibriert in einem TRIS-Puffer (0,115 M TRIS, 0,1 N HCL, pH: 7,4), unterworfen. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert.

Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen, die dem zentralen Hauptanteil des Peaks entsprechen, der ein 45 Maximum bei Fraktion 225 besitzt, wurden vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen (620 ml) wurden mit 60 ml einer 5 M Natriumchloridlösung und 12196%igen (V/V) Ethanols gemischt.

Die Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C stehengelassen, so Das abgeschiedene Protein wurde durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit 150 ml 96%igen (V/V) Ethanols gewaschen und vakuum-getrocknet. Ausbeute: 1,7 g hochgereinigtes PSP.

35

40

Beispiel 3

Zu 1501 einer wässrigen Lösung, die durch Abdampfen eines Extraktes aus 250 kg Schweinepankreasdrüsen erhalten wurde, und die von unlöslichem Material befreit worden war, wurden 22,5 kg Natriumchlorid zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, um das zugegebene Salz zu lösen, das entstess

60

hende Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt und lieferte derart den Salzkuchen. Zur Mutterlauge (1621) wurden 34 kg Ammoniumsulfat unter fortgesetztem zweistündigen Rühren bei Raumtemperatur gegeben, wodurch ein Präzipitat gebildet wurde, das durch Zentrifugation isoliert wurde. 223 g des feuchten Produktes wurden durch Zugabe von 500 ml eines Puffers (0,05 M Ameisensäure, 0,01 M Natriumhydroxidpuffer, pH: 3,2) gelöst. Die Leitfähigkeit der Lösung wurde auf 4 mS durch Dialyse gegen Wasser reduziert. Die Lösung wurde auf eine 5 cm Durchmesser x 50 cm Säule von «SP-Sephadex C-25», äquilibriert mit Puffer I (0,1 M Ameisensäure, 0,02 M Natriumhydroxid, pH: 3,2) gegeben. Nach Auftragen der Lösung wurde die Säule mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,27 M in Puffer I eluiert. Das gesamte Volumen des eluierten Materials betrug 5,51. Anschliessend wurde die Säule weiter mit Puffer I eluiert, der 0,27 M Natriumchlorid enthielt. Der Durchfluss während dem Aufbringen und Elution betrug 100 ml pro Stunde, und es wurden Fraktionen von 15 ml gesammelt. Das durch Überwachen der optischen Dichte der Fraktionen bei 276 nm erhaltene Chromatogramm zeigte einen Haupt-Peak von der Fraktion 420 bis 530. Die dem Haupt-Peak entsprechenden vereinigten Fraktionen wurden auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und anschliessend mit 20 Volumenteilen 96%igen (V/V) Ethanols gemischt. Nach 48stündigem Stehenlassen bei 4°C wurde Abgeschiedenes durch Zentrifugation gewonnen und vakuum-getrocknet. Ausbeute: 6 g. Das derart erhaltene Material wurde weiterhin durch Anionenaustauschchromatographie auf einer «QAE-Sephadex A-25 »-Säule gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Ausbeute: 3,4 g hochgereinigtes PSP.

Beispiel 4

Eine Präparation zur parenteralen Gabe, welche 1 mg PSP pro ml enthält, kann wie folgt hergestellt werden:

1 g PSP und 99 g Laktose werden in 11 destilliertem Waser gelöst und der pH auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wird anschliessend steril gefiltert. Die sterile Lösung wird in 10 cm3 Ampullen derart abgefüllt, dass jede Ampulle 10 ml der Lösung enthält. Anschliessend werden die Lösungen lyophilisiert und die Ampullen unter aseptischen Bedingungen verschlossen.

Die Präparation in jeder der Ampullen soll vor der Gabe in 10 ml sterilen Wassers gelöst werden.

Beispiel 5

Präparationen für orale Gaben können wie folgt hergestellt werden:

100 mg PSP werden mit 9 g Mais-Stärke, 8 g Laktose und 180 mg Magnesiumstearat gemischt, bis eine homogene Mischung erhalten wird. Die Mischung wird in Hart-Gelati-nekapseln Nr. 3 derart eingefüllt, dass jede Kapsel 1 mg PSP enthält.

Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

B

2 Blatt Zeichnungen

Claims (13)

1. 646 414 2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Gereinigtes pankreatisches spasmolytisches Polypeptid (2), Ile (3), Leu (1), Tyr (2), Phe (7), wobei die Bestimmungen (PSP) folgender Aminosäurezusammensetzung: den Fehler von ± 10% der in Klammern angegebenen Anzahl der betreffenden Aminosäuren aufweisen, und ein Teil der Trp (2), Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9), 5 Aminosäuresequenz, bestimmt vom N-terminalen Ende des Glx (12), Pro (12), Gly (6), Ala (6), Cys 1/2 (14), Val (7), Met Peptides, folgendermassen sein soll:

   Pyr-Glu-Lys-Pro-Ala-Ala-Cys-Arg-Cys-Ser-Arg-Glx-Asx-Pro-Lys-Asx-Arg-Val-Asx-Cys-Gly-Phe-Pro-Gly-Ile-Thr-Ser-Asx-

   1 5 10 15 20 25

   Glx-Cys-Phe-Thr-Ser-Gly-Cys-Cys-Phe-Asx-Ser-Glx-Val-Pro-Gly-Val-Pro-Trp; wobei pyrGlu am Aminosäurerest

   30 35 40 45

   1 Pyroglutaminsäure sein soll oder ein physiologisch akzeptables Salz davon.
2. 2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, einer Konzentration zwischen 0,1 bis 200 mg/ml, bevorzugt dass es eine höhere Reinheit als 50 Gew.% besitzt, bevorzugt zwischen 0,5 bis 25 mg/ml enthält.

   höher als 90 Gew.%.
3. 3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass es in kristalliner Form vorliegt. 20
4. 4. Verfahren zum Isolieren eines gereinigten pankreati-

   schen spasmolytischen Polypeptids nach Anspruch 1, Die Erfindung betrifft ein gereinigtes pankreatisches spas-

   gekennzeichnet durch Isolieren des Polypeptids aus Schwei- molytisches Polypeptid, ein Verfahren zum Isolieren des-nepankreasdrüsen durch eine Kombination von Chromato- selben sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, graphie und Ausfällen. 2s Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass das
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch erfindungsgemässe gereinigte Polypeptid, welches aus Extraktion der Drüsen mit einer Mischung von Wasser und Schweinepankreas gewinnbar ist, entspannende oder spas-einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel in molytische Effekte auf glatte Muskulatur bewirkt. Aus saurem Medium, Abtrennen des Ausgefällten, Neutralisieren diesem Grunde wurde es mit dem Trivialnamen pankreati-des Extraktes und Isolieren des PSP aus dem derart erhal- 30 sches spasmolytisches Polypeptid, welcher im weiteren aus tenen Extrakt unter Einsatz von Chromatographie und Aus- Gründen der Bequemlichkeit zu PSP abgekürzt wird,

   fällen, wonach das isolierte PSP, wenn erwünscht, in ein Salz bezeichnet. PSP zeigt interessante pharmakologische Eigen-desselben umgewandelt wird. Schäften.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Iso- Spasmolytische Agenzien oder Antispasmolytika, wie lieren des Polypeptids aus einem Insulinsalzkuchen. 35 Atropin, mit diesem verwandte Verbindungen und synthe-
7. 7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, tische Medikamente mit atropinartigem Effekt, werden weit-dass die Chromatographie mit den gesammelten Funktionen verbreitet für die Behandlung einer Vielzahl von des Hauptteiles des Haupt-PSP-Peaks durchgeführt wird. Beschwerden, insbesondere von Krämpfen glatter Musku-
8. 8. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch Iso- latur und Hypermotilitätszuständen, verwandt. Nichtsdesto-lieren von PSP aus der Mutterlauge, die entsteht, wenn ein 40 weniger wird die beabsichtigte Wirkung derartiger Stoffe Insulinsalzkuchen hergestellt wird, durch weiteres Aussalzen, üblicherweise von einer Anzahl Nebeneffekte begleitet, gefolgt durch Chromatographie unter Verwendung eines welche ihrem allgemeinen Charakter als Anticholinergika Anionen- und/oder Kationenaustauschers. zuzuschreiben sind.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn- Als diagnostisches Hilfsmittel beim Röntgen des Gastroin-zeichnet, dass der Salzkuchen im wesentlichen von Insulin 45 testinal-Traktes, insbesondere zusammen mit einem Rönt-befreit wird, durch Abtrennen des in einer Lösung des Salz- genkontrastmittel zur Verbesserung der Darstellung des kuchens, die auf einen pH-Wert im Bereich von 4,9 bis 5,7, Gastrointestinal-, Gallen- und Ausscheidungstraktes sind bevorzugt bei etwa 5,3, eingestellt wurde, gebildeten Ausge- bisher allgemein atropinähnliche Anticholinergika verwandt fällten, und dass ein Präzipitat, das im Überstand nach dem worden. Derartige Medikamente werden üblicherweise Ausfällen bei einem pH-Wert im Bereich von 5,7 bis 7,0, 50 parenteral gegeben und aufgrund der Dosis, die notwendig bevorzugt bei etwa 6,5, gebildet wird, gegebenenfalls entfernt ist, um vollständige Entspannung zu erreichen, werden wird, bevor die Chromatographie durchgeführt wird. üblicherweise auch die klassischen Nebenwirkungen dieser
10. 10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, Substanzen angetroffen.

    dass die Ausfällung durch Kristallisation durch Einstellen Kürzlich wurde die parenterale Gabe des Peptidhormons des pH-Wertes der Lösung auf einen Wert im Bereich von 3,8 ss Glukagon, welches aus 29 Aminosäuren besteht, als alterna-bis 4,8, bevorzugt etwa 4,3, durchgeführt wird. tives Mittel zur Reduktion der gastro-intestinalen Motilität in
11. 11. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekenn- Zusammenhang mit radiologischen Untersuchungen eingezeichnet, dass sie eine wirksame Menge eines gereinigten führt (s. US-Patent Nr. 38 62 301). Glukagon zeigt aber ausPolypeptids, entsprechend Anspruch 1, aufweist, gemeinsam serdem eine Vielzahl weiterer Wirkungen im menschlichen mit einem geeigneten physiologisch akzeptierbaren Träger 60 Körper, eingeschlossen einen starken Einfluss auf die meta-oder Exzipienten. bolischen Regelfunktionen, wobei die deutlichste Wirkung
12. 12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch das Hervorrufen von Hyperglykämie und Lipolyse ist. Daher gekennzeichnet, dass es eine wässrige sterile Lösung eines konnten, obwohl der Einsatz von Glukagon in der Endo-gereinigten Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, skopie bestimmte Vorteile brachte, die unerwünschten die etwa 0,9 Gew.% Natriumchlorid und gegebenenfalls Kon- 6s Nebenwirkungen nicht vollständig ausgeschaltet werden, servierungsmittel enthält, ist. Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Spasmolytikum zu
13. 13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch liefern, welches, während es antispasmische und entspan-gekennzeichnet, dass die Lösung das gereinigte Polypeptid in nende Wirkungen auf glatte Muskulatur - ähnlich denen

    3

    646 414

    bekannter Agenzien - besitzt, wesentlich geringere Nebenwirkungen zeigt.

    Die Aufgabe wird erfindungsgemäss durch ein gereinigtes pankreatisches spasmolytisches Polypeptid folgender Aminosäurezusammensetzung gelöst:

    Trp (2), Lys (4), His (1), Arg (5), Asx (10), Thr (3), Ser (9),

    Glx (12), Pro (12), Gly (6), Ala (6), Cys 1/2 (14), Val (7), Met (2), Ile (3), Leu (1), Tyr (2), Phe (7), wobei die Bestimmungen den üblichen Fehler von ± 10% der in Klammern angegebenen Anzahl der betreffenden Aminosäuren aufweisen, s wobei ein Teil der Aminosäuresequenz, bestimmt vom N-ter-minalen Ende des Peptides, folgendermassen sein soll:

    pyrGlu- Lys- Pro-Ala- Ala-Cys-Arg-Cys-Ser-Arg-Glx-Asx-Pro-Lys-Asx-Arg-Val-Asx-Cys-Gly-Phe-Pro-Gly-Ue-Thr-Ser-Asx-

    Glx-Cys-

    5 10 15 20 25

    Phe-Thr-Ser-Gly-Cys-Cys-Phe-Asx-Ser-Glx-Val-Pro-Gly-Val-Pro-Trp-, wobei pyrGlu am Aminosäurerest 1 Pyroglutamin-30 35 40 45

    säure sein soll oder ein physiologisch akzeptables Salz davon. Die Abkürzungen für die Aminosäuren sind aus J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558, ersichtlich.

    Die vollständige Aminosäuresequenz wurde nachträglich bestimmt und lautet:

    pyr-Glu-Lys-Pro-Ala-Ala-Cys-Arg-Cys-Ser-Arg-Gin-Asp-Pro-Lys-Asn-Arg-Val-Asn-Cys-Gly-Phe-Pro-Gly-Ile-Thr-Ser-Asp-Gln-

    1 5 10 15 20 25

    Cys-Phe-Thr-Ser-Gly-Cys-Cys-Phe-Asp-Ser-Gln-Val-Pro-Gly-Val-Pro-Trp-Cys-Phe-Ser-Pro-Leu-Pro-Ala-Gln-Glu-Ser-Glu-

    30 35 40 45 50 55

    Glu-Cys-Val-Met-Gln-Val-Lys-Ala-Arg-Lys-Asn-Ser-Gly-Tyr-Pro-Gly-Ile-Cys-Pro-Glu-Asp-Cys-Ala-Ala-Arg-Asn-Cys-

    60 65 70 75 80

    Cys-Phe-Ser-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Val-Pro-Trp-Cys-Phe-Phe-Pro-Met-Ser-Val-Glu-Asp-Cys-His-Tyr. 85 90 95 100 105

    Weiterhin liefert die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines gereinigten Polypeptids, gekennzeichnet durch Isolieren des Polypeptids aus Schweinepankreasdrüsen durch eine Kombination von Chromatographie und Ausfällen und ein weiteres Verfahren, gekennzeichnet durch Isolieren des Polypeptids aus einem Insulinsalzkuchen. Ein weiteres Verfahren zum Isolieren eines derartigen Polypeptids ist gekennzeichnet durch Isolieren von PSP aus der Mutterlauge, die entsteht, wenn ein Insulinsalzkuchen hergestellt wird, durch weiteres Aussalzen, gefolgt durch Chromatographie, unter Verwendung eines Anionen- und/oder Kationen-Austauschers. Die erfindungsgemässe pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine wirksame Menge eines gereinigten Polypeptids enthält, gemeinsam mit einem geeigneten physiologisch akzeptierbaren Träger oder Exzipienten. Eine erfindungsgemässe wässrige sterile Lösung eines gereinigten Polypeptids ist dadurch gekennzeichnet, dass sie etwa 0,9 Gew.% Natriumchlorid und gegebenenfalls Konservierungsmittel wie Hydroxibenzoesäureester oder Phenol enthält. Weiterhin wird die Aufgabe durch die Verwendung des gereinigten Polypeptids als Medikament gelöst.