JPS609799B2 - アミラ−ゼ活性の新規な測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は総臓機能の検査における血清や尿中のアミラー
ゼ活性測定その他に便利に用いられる新規なアミラーゼ
活性測定法に関する。

従釆のアミラーゼ活性測定法としては概ね、‘１｝ デ
ンプン溶液に検知アミラーゼを添加してデンプンの加水
分解によるその溶液の粘度の低下を測定する方法、■
デンプン溶液に検体アミラーゼを添加してその溶液の混
濁度の低下を測定する方法（３’デンプン溶液に検体ア
ミラーゼを添加して残存デンプン量をョ−ドデンプン反
応によって呈色させて吸光度を測定する方法、｛４）デ
ンプン溶液に検体アミラーゼを添加してその溶液の還元
糖量を測定する方法、及び【５ー 色素を交差結合させ
たデンプンの溶液に検体アミラーゼを添加して遊離した
色素を比色する方法、があるが、粘度計を用いる（１｝
の方法或いは濁度計を用いる｛２１の方法は精度よくな
いという欠点がある。

また、ヨードデンプン反応を利用する｛３｝の方法では
アミラーゼ活性によるデンプン分解過程の連続的把握が
困難で用いるデンプンの質によって活性値が異なって表
れる欠点がある。還元糖量を測定する（４）の方法もデ
ンプン分解過程の連続的把握が困難で検体中のグルコー
スの影響で活性値に狂いが生じ易く「また基質と検体と
の反応後に除タンパク、除デンプンの手数がかかる。更
に遊離した色素を比色する【５｝の方法もデンプン分解
過程の連続的把握が同様に困難であると共に測定操作が
遠心分離などを必要として面倒である。本発明はそのよ
うな従来の各種の方法の困難、欠点を除いて精度が高く
、再現性がよく、且つ操作が容易であると共に、特に基
質と検体間の反応過程の連続的追跡が容易であって検体
中のグルコースとかタンパク質などによる妨害を受け驚
くなるうえに、１０分程度で測定結果を得ることもでき
る新規なアミラーゼ活性測定法を提供することを目的と
する。

本発明は、基質としての重合度が５以上のＱ−グルコシ
ド結合物の溶液に検体であるアミラーゼと補助酵素であ
るグルコシダーゼ及びムタロターゼを添加するときには
そのＱ−グルコシド結合物が加水分解し、最終的にＱー
グルコースと８−グルコースの平衡混合物を生成し、そ
の平衡混合物の比旋光度が基質のＱーグルコシド結合物
のそれの約１／４と低く且つＱ−グルコシド結合物から
のその平衡混合物の生成度合が検体ァミラーゼの活性値
の如何に応じて正確に変化することに塞き、その基質溶
液の旋光度変化を追跡してその結果を活性既知の試料を
用いて得た結果と対応させることによって検体アミラー
ゼの活性を知り得るようにするのは勿論「その旋光度変
化を正確に測定することのみによっても酵素活性の国際
単位を決定し得るようにしたものである。

以下に本発明をその実施例に基いて詳述する。

重合度が５以上のＱ−グルコシド結合物としてマルトベ
ンオースを用いる。マルトベンタオースはＱ−アミラー
ゼによって加水分解されてマルトース（重合度２）とマ
ルトトリース（重合度３）の当量づつを生成するが、ま
たこのマルトースをマルトトリオースはＱ−グルコシダ
ーゼの作用によってＱ−グルコースに分解され、更にそ
のＱ−グルコースはムタロターゼの作用によって速かに
Ｑーグルコースと８−グルコースの平衡混合物に変化す
る。それらの物質の水溶液の比旋光度を例えば波長が５
８軌ののナトリウム○線を用いて３７℃で測定するとマ
ルトベンタオースが十１７８．３０、マルトトリオース
が十１６００トマルトースが十１１２．５０、Ｑ−グル
コースが十１０〆 、Ｑ−グルコースと８ーグルコース
との平衡混合物が十４７．９０と夫々表わされるので前
記の各反応段階の水溶液の前記条件での比旋光度は夫々
、十１７８．３０、十１３６．３ｏ（即ち、１１２．球
０．５十１６０ＸＯ．５）「 十１０２０及び十４７．
９０と夫々計算される。このように比旋光度は開始段階
から最終段階まで低下方向のみに変化しつつ最終段階で
は最初の約１／４倍という顕著な低下が現れる一方で、
アミラーゼ活性の差異に応じてマルトベンタオースの分
解反応度合に差異が生じ、それに応じてその反応溶液の
旋光度変化にも差異が生じるものであるから、その旋光
度変化を測定することによってアミラーゼ活性の正確な
測定が可能となるものである。そしてこの測定法は旋光
計による観察、記録で済むのでマルトベンタオースの反
応経過を連続的に追跡、記録することが容易であり且つ
前述のごとく比旋光度が反応の開始段階から最終段階ま
で低下方向のみに変化するものであることによって旋光
度変化量が反応時間の経過と直線的比例関係となるため
に一定時間後の旋光度変化量を見る方法のほかに旋光度
の変化速度を連続的に見る方法でもまたアミラーゼ活性
を知ることが可能となり、また検体ァミラーゼ中のグル
コース（例えば血清中のアミラーゼ活性を検べるときの
血清中のグルコース、この種のグルコースは既に変旋光
が完了している）による測定値の変動を単に旋光度測定
に際して数値補正を行うだけで解消できて検体の前処理
という面倒な化学操作を不要とし、検体中のタンパク質
による妨害も４０仇肌以上の長波長で測定することによ
って解消でき、測定結果を１０〜２び分以内という短時
間で求めることもでき、同時に基質となるマルトベンタ
オースは品質の一定したものが得られ易くて測定結果の
再現性がよいなどの優れた効果を奏するものである。ま
た補助酵素として用いるＱーグルコシダーゼ及びムタロ
ターゼも商業製品として容易に入手可能という便利さも
加わる。重合度が６以上である適宜の数Ｑーグルコシド
結合物或いはデンプンを基質に使用してもアミラーゼの
作用によってマルトトリオース及びマルトースが生成さ
れ、マルトベンオースを基質として使用する場合と同様
に、補助酵素を用いるとＱ−グルコースと８ーグルコー
スの平衡混合物となり、大きな旋光度変化を起すのでア
ミラーゼ活性は容易に測定できる。実際の試験結果から
それらの感度をマルトベンタオースの場合と比較すると
次のようになる。

このように旋光度変化の感度は多少低下するが必要に応
じて重合度が適宜に６以上のＱ−グルコシド結合物を基
質として用いても充分にアミラ−ゼ活性の測定は可能と
なるものである。以下に試験例により更に本発明の測定
法を説明する。 ・試験例 ｐＨ６．９の緩衝液を用いてマルトベンタオースの１％
溶液を作る。

ついで４５０ユニット／の‘のＱ−グルコシダーゼ溶液
の０．１叫と２５００ユニット／私のムタロターゼ溶液
の０．１の‘を前記マルトベンタオース溶液の３．８の
‘と合して混合し、３７℃にセットし、旋光計の光路長
５０柵のセル内に入れた後、２４唯国際単位（ロッシェ
・Ｒ比ｈｅ）のアミラーゼ活性をもつ血清の５０ムぐ、
１００Ａそ、１５０〃〆、２０山そ及び２５０仏そを夫
々混合し、セル内被検液の各総量を４．２５の‘に統一
したうえで温度：３７０、波長：聡軌肌の条件下で旋光
度変化を連続的に測定、記録させた結果、各被検液の旋
光度変化はその変化速度においては相互に異なったもの
となるが各旋光度変化量と経過時間との間には第１図の
ごときほぼ完全に直線的比例関係が成立し、またその測
定開始後１０分間を経過したところでの各被検液の旋光
度変化量と添加血清量との関係図は第２図のごとく直線
となるので本発明に係る旋光度測定法によって検体アミ
ラーゼの活性値が第２図のような検童線図を介して容易
に且つ正確に知り得ることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明一試験例の試験結果図表。 豹１図 多２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 基質としての重合度が５以上のα−グルコシド結合
   物を含む溶液に検体としてのアミラーゼ並びに補助酵素
   としてのグルコシダーゼ及びムタロターゼを加えてその
   溶液の旋光度変化を測定することを特徴とするアミラー
   ゼ活性の測定法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載のアミラーゼ活性の測定
   法において、該α−グルコシド結合物がマルトペンタオ
   ース（重合度５）であるもの。