JPS6098000A - 抗ヒト癌モノクロナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト陥細胞由来の特定の７コシルラクトサミン
型糖脂質と選択特異的に反応する新規表モノクロナル抗
体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ　）に関す
る。

本明細蕾において、糖質、脂質及びそれらの結合様式等
は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ、この釉の分野における通称名
あるいは慣用に従い示す。

細胞の癌化に伴って細胞表層の複合糖質のノＱターンが
変化することが知られており、これらの糖鎖変化の原因
として、糖脂質の糖鎖合成不全及び特異な糖鎖構造を有
する糖脂質の出現等が示唆されている。

本発明者叫は、かねてより上記事項について種々研究を
重ねてきたが、その過程において、ヒト癌細胞から特定
の糖鎖構造を有する糖脂質が分離されること、そしてそ
の糖鎖構造はヒト癌細胞に共通に懺現される抗原構造で
あることを見出し先に特許出願した（％願１１１８５７
−１９８４３３号）。すなわち、ヒト癌細胞Ｆｉ瘤化が
進むにつれて、次の一般式（１）％式％ （１１ 〔式中、Ｇａｔはガラクトース、ＧｔｅＮＡＣｉｌｔ、
Ｎ　−アセチルグルコサミン、Ｆｕｅはフコース、Ｏｌ
ｅはグルコース、Ｃｅｒはセラミド、ｎはｌ又は２を示
す〕 で表わされるフコシルラクトサミン型糖脂質を蓄積する
ことを見出した（以下、ｎ＝”ｌのものをｌ”■”Ｆｕ
ｅ２ｎＬｅ６　、ｎ　＝　２　（Ｄ　モ（Ｄ　’ｊ：ｌ
”Ｖ３ｖｌｌ”Ｆｕｃ、ｎＬｃ８と示す）。また、既に
ある種の楠細胞はラクトーフコペンタオシル（１）セラ
ミ　ド　（Ｌａｅｔｏ　−ｆｕｅｏｐ＠ｎｔａｏｓｙｌ
　（１）　ｅ　＠ｒａｍｌｄ・；１１１ＦｕｃｎＬｅ４
　）を蓄積することが知られている（　Ｊ、　Ｄｉａｌ
、　Ｃｈｅｍ、、　２４６．１１９２−１２００４− （ｉ７ｉ）’：ｌ。これに対し、第近正常なヒト細胞か
らモノフコシル　ネオラクト−ノルへキサオシルセラミ
ド（ｍｏｎｏｆ　ｕｅｏ　ｉｙｌ　ｎｅｏｌａｃｔｏ　
−ｎｏｒｈｅｘａｏ＊ｙｌｃｓｒａｍｌｄｓ＋　；　Ｖ
３ＦｕｃｎＬｃ６　）　、モノフコシル　ネオラクトー
ノルオクタオシルセラミド（ｍｏｎｏｆｕａｏ＠ｙｌ　
ｎｅｏｌａａｔｏ　−ｎｏｒｏｅｔａｏａｙｌ−ｃｏ　
ｒａｍｉ　ｄｏ　；　■ｌ”ＦｕｅｎＬｃｇ　）及びゾ
フコシルネオラクトー４玉オクタオシルセラミド（ｄｉ
ｆｕｃｏｓｙｌ　ｎ＠ｏｌａｃｔｏ　−ｎｏｒｏｅｔａ
ｏｓｙｌｃｃ＋ｒａｍｉｄｅ；　ｖＳＶＩＦｕｃ２ｎＬ
ｃＢ　）が単離された［　Ｊ、Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５７．１４８６５−１４８７４（１９８
２））。

斯かる結果に基き、癌化に伴ない出現する特異な糖鎖構
造に特異的に反応性を有する抗体を得んと鋭意研究を行
ったところ、ヒト瘤細胞由来の特定のＳ脂質と選択特異
的に反応し、正常細胞とは反応しガいモノクロナル抗体
ＹＳａ　、ｙｓａ　、　ＹＳｅ及びＹＳｆを得ることに
成功し、本発明を完成した。

スナワち、本発明は、上記１３■３Ｆｕｃ２ｎＬｃ６及
び／又はＭ３Ｖ”Ｖ１３Ｆ　ｕｃｌｎＬｅｇで免疫し九
咄乳動物の免役細胞と骨髄肺細胞との融合によって得ら
れるハイプリドーマより生成され、ヒト陥ｉ４＋＋　ｋ
由来のフコシルラクトサミン型糖脂質であるｌ”！１／
”Ｆｎｅ２ｎＬｃ６及び／又はｌ１ｌｊＶ”ＶＩＦＦｕ
ｅ３ｎＬｃ４と特異的に反応するモノクロナル抗体を提
供するものである。

因みに、上記を目的として製造されたモノクロナル抗体
はすでに数種が報告されており、例えばａｎｔｉ　−５
ＳＥＡ　−１［旧ｏｃｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙｍ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　１００　、１５７８−１５
８６　（ｔ９８ｉ）；　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ
、Ｓｃｌ　、Ｕ８Ａ　７５　＊　５５６５−５５６９（
１９７８）；　Ｎａｔｕｒｅ　２９２．１５６−１５８
（１９８１）’３、ｗＧｕｓ　２９、ＺＷＧ１３、ＺＷ
Ｇ１４、ＺＷＧ　ｌ　１１　［Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｅｈｅ
ｍ、旧ｏｐｈｙｍ−２１７＋６４７−６５１（１９８２
）’）、５３８　Ｆ１２．５３８ＦＢ　［Ａｒｃｈ、Ｂ
ｉｏｅｈｅｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、２２０　＊　３１８−
３２０　（１９８３）　］　、ＶＥＰ８　、ＶＥＰ９　
（Ｉ８．ｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３，３０６−３１２（１９８３））
、Ｍ、−１［Ｂｌｏｏｄ　６１．１０２０−１０２３（
１９８３）：）等が知られている。然しなから、これら
モノクロナル抗体はいずれも糖鎖末端のＸ決定基（Ｇａ
ｔβｌ　−＋　４　［Ｆ　ｕ　ｅαｌ−＋３　］　Ｇｔ
ｅＮＡＣ）を認識するものである。従ってこれらの抗体
は正常細胞成分を含むいずれのフコシルラクトサミン型
糖脂質とも反応するため、これら糖脂質を識　７− 別することはでき々い。

本発明のモノクロナル抗体は、ヒト瘤細胞由来の１３Ｖ
３Ｆｕｅ２ｎＬｃ６及び／又は量３ＶＢ■’Ｆｕｅ３ｎ
Ｌｅｌで免疫した哨乳動物の免疫細胞を骨髄肺細胞と融
合させてハイプリドーマを生成させ、これより上記特性
を有するモノクロナル抗体を分離することにより製造す
る。

本発明において、ハイプリドーマの調製は、自体公知の
方法、例えはＮａｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７（
１９７５）に記載の方法及びその変法（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、　ｌ　５０１１００８−１０１９（１９７９）〕
咎に準じて行なわれる。

免疫原である１３■”ＦｕｅｌｎＬｃ６及び／又ハｍ３
■ｓ■３Ｆｕｃ３ｎＬｅｇとしては、コレラヲ表現スル
種々の培養ヒ）＆細胞及び手術片よシ得られ　８− る癌細胞自体、該帰細胞より常法罠従い分離した細胞膜
成分及び該膜成分より更に分離した１ｌＩ３Ｖ”Ｆｕｅ
２ｎＬｃ６及び／又はｌｔ”Ｖ”Ｖｎ３Ｆ　ｕ　ｃｓｎ
Ｌｅｓ（Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｇ、Ｒａｍ、Ｃ
Ｏｍｍｕｎ、＋　１０９　ｍＮａ１１ｐ３６−４４（１
９８２））のいずれも使用することができる。

ヒ）Ｍ細胞を免疫する喘乳動物は特に限定されないが、
細胞融合に使用する骨髄肺細胞との適合性を考慮して選
択するのが好ましく、一般にはマウス、ラット等が使用
される。

免役は一般的方法によって行われ、上記の免疫原を生理
食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）等に適当微塵に
希釈後、これを動物に静脈内もしくは腹腔内注射郷によ
って投与すれはよい。より具体的には、例えは精製した
ｌ’Ｖ３Ｆｕｃ２ｎＬｅ６及び／又は１３Ｖ３■”Ｆｎ
ａ３ｎＬｅｇを用いる場合は、これをＰＢＳ％で適当濃
度に希釈し、サルモネラ　ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎａｌ
ｌａｍｉ　ｎｏ　ｍ　ＯｔｌＬ　）　、牛血消アルブミ
ン（ＢＳＡ　）　尋の通常の担体圧損時させ、これを動
物に２〜１４日毎に数回投与し、総投与量が糖脂質とし
て１〜１００μｆ／マウス程度になるようにするのが好
ましい。免疫原として膜成分もしくは細胞自体を用いる
場合も同様にして行なわれ、例えは膜成分を用いる場合
は総投与量が１〜１００η／マウス程度、細胞自体を用
いる場合は総投与量がＩ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’〜ｌ　Ｏ’個／
マウヌ程度となる様にするのが好ましい。

免役細胞としては、最終免疫約３日後に摘出した牌臓細
胞を使用するのが好ましい。

次いで、かくして得た免疫細胞と骨髄肺細胞を融合する
。骨髄肺細胞としては、すでに公知の塊々の細胞、例え
ばマウスにおけるＮ５−１．Ｐ３、Ｐ３−Ｕｌ、Ｘ４５
、ＳＦ３、Ｘ６３．６゜５．３、ラットにおけるＹ３．
Ａｌｌ　、２．３等が使用される。融合反応は公知の細
胞融合方法に準じて行われ、例えば融合促進剤の存在下
培地中でインキュベートすることによって行われる。

融合促進剤としては、例えは放りエチレングリコール（
ＰｋＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）尋が使用され、
更に所望により融合効率を高めルタメにジメチルスルホ
キシド尋の補助剤を冷加することができる。免疫細胞と
骨髄肺細胞との使用比は一般の方法と変りがなく、　１
１− 例えは骨髄腫細献一対し、免疫細胞を約１〜１０倍程度
用いればよい。上記融合時の培地としては、例えは骨髄
腫細胞株の増殖に用いられるようなＭＥＭ培地、そのダ
ルベツコ改質培地、ＲＰＭＩ　−１６４０培地、その他
この種の細胞培養に利用される通常の各種培地を利用で
き、通常はＦｅ２等の血清補液を抜いておくのがよい。

融合は、上記免疫細胞と骨髄肺細胞との所定量を上記培
地内でよく混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７℃程度
に加温したＰｉＧ溶液、例えは平均分子量１，０００〜
６，０００程度のものを通常培地に約３０〜６０ｗ／マ
％の濃度で加えてませあわせることにより行なわれる。

以後、適当な培地を逐次添加して遠沈し、上１２− 消を除去する操作を繰り返すことによりハイシリドーマ
が形成される。

所望のハイブリドーマの分離は、上記細胞融合後の細胞
を、通常のハイブリドーマ選別用培地で培養することに
より行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はヒーキサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（ＨＧＰ
ＲＴ）欠損株であ抄、シたがってＩ（ＡＴ培地（ヒボキ
サンチン、アミノゾテリン及びチミジンを含む培地）中
では生育できない。従ってＨＡＴ培地中で生育してくる
細胞を選択すれはよい。

該ＨＡＴ培地での細胞の培養は、目的とするハイブリド
ーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な
時間、通常数日〜数週間行えはよい。

かくして得られるハイプリドーマは通常の限界希釈法に
従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン
化が行ガゎれる。

該産生株の検索は、例えはＥＬＩ　ＳＡ法［Ｅｎｇｖａ
ｌｌ、Ｅ、　；　Ｍ＠ｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０　
＃　４１９−４３９（１９８０）：ｌ及びプラーク法、
ヌ赦ット法、凝集反応法、Ｏｕｅｈｔｅｒｌｏｎｇ法、
ＲＩＡ法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の
方法によって行われる〔［ハイプリドーマ法とモノクロ
ナール抗体」、（株）Ｒ＆Ｄプランニング発行、昭和５
７年３月５日〕。より具体的には、布製した膳”Ｆｕｅ
ｎＬｃ４、ｌ”Ｖ”Ｆｕｅ２ｎＬｅ６又は１ｉ１３Ｖ３
■”Ｆｕｃ３ｎＬｅｇを、例えはコレステロール及びレ
シチン等によりコーティングしたプレートを用い、これ
を被検ハイプリドーマの培養上清と反応させ、該精製糖
脂質に結合する抗体の存在を常法に従い、例えは、抗マ
ウス免疫グロブリン（融合罠マウスを用いた場合）次い
で１２５ニープロテインＡ（シグマ社）を反応させるこ
とによ抄確認し、所望の抗体産生株を選択する。（Ｊ、
Ｂ、Ｃ６，２５７，１４８６５−１４８７４（１９８２
）；　Ｖｌｖｏｌｏｇｙ、９３，１１１−１２６（１９
７９）：］。

斯くシて得られる本発明のモノクロナル抗体を産生ずる
ハイプリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液
体窒素中で容易に長期間保存が可能である。本発明者は
、このハイプリドーマの代表として、後記実施例によっ
て得られたものを自ら分陰可能な状態に保持している。

　１５− 上記のようにして得た特定のハイプリドーマから本発明
のモノクロナル抗体Ｙ８ａ、ＹＳｄ。

ＹＳｅ、ＹＳｆを得る罠は、ハイプリドーマを常法に従
って組織培養し、培養上清から分離する方法、あるいは
ハイプリドーマをこれと適合性のある咄乳動物に投与し
増殖させ、その腹水から分離する方法等が採用される。

前者の方法は高純度のものを得るのによく、後者の方法
は大量生産に優れている。

斯くして得られる本発明のモノクロナル抗体は、ヒ）Ｍ
細胞由来の特定の７コシルラクトサミン型糖脂質と選択
的に反応するので、ヒ）＆の診断、治療及び研究に極め
て有用なものである。　、 次に、実施例及び試験例を挙けて脱明する。

　１６− 実施例及び試験例で使用した培養癌・細胞株は全て公知
のものであり、次に示す文献に記載されている。

（１）　非悪性細胞株 ＷＩ　−３８ａ　Ｅｘｐ、Ｃａ１ｌ　Ｒｓｓ、、２５．
５８５（１９６１） Ｌ−５：（株）日本抗体研究所より入子Ｃｒｏｗ、Ｆ同
　上 Ｐｒｅｎｔ、Ｂ同　よ Ｃｒｏｗ、Ｂ同　上 Ｋａｓｎ＠ｒ、Ｂ同　上 （２１急性細胞 ＭＫＮＩ　：　Ｌａｎｃｅｔｓ３．Ｊｕｌｙ＋７〜ｌ　
Ｏ（１９８２）Ｃａ−ｎｃｅｒ　Ｒ６１１，Ｃ４２＃　
６０　１〜６０８　（１９８２）ＭＫＮ２同上 ＭＫＮ２８同　上 ＭＫＮ４５同　上 ＭＫＮ７４同上 ＰＣＩ：亀新医学、旦五、１８６１（１９７３）ＰＯ２
：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４２，６０１〜６０８（
１９８２） ＰＯ７同　上 ＰＯ２同　上 ｐｃ１０１町上 ＱＧ　５６同　上 ＱＧ９０同　上 ＲＴ４：　Ｉｍｍｕｎｏｅｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ＋　１５　
＋　４２９〜４３６（１９７８）　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａ
ｎｃ＠ｒ　Ｉｎ＠ｔ、　リ＊２０９〜２１４（１９７７
） ＨｅＬａＮ　よ ５ＫＯＶ３同　上 ２１０２：Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４０，７９６〜８０
２（１９８０） ＫＧＩ：Ｂｌｏｏｄ、、６１／１．１７１−１７９（１
９８３）ＨＬ６０　：　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍ、１３．３
０６−３１２（１９８３） Ｋ５６２：　ｌｉｐ、Ｃ＠ｌｌ　Ｒｅ１，１４６／２　
＊　４２８−４３５（１９８３） ＴＨＰＩ　：　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒｓ　２６　ｓ
　１７１−１７６（１９８０） ＬＸＩ　：Ｃａｎｅｓｒ、４２．２２６９−２２８１　
（１９７８）１１Ｊ２３：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｅａ
ｄ、５ｃｉｏｎ　７９　ｓ　３６３７−３６４０（１９
８２） ＴＧ１１５：患者の肝癌組織を用いた。

実施例１ １９− ｆＰｉｈしたグリコリピッド、１３Ｖ”Ｆｕｅ２ｎＬｅ
６［Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｐｈｙＳ、Ｒａｍ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ＊＋　１０９　ｍｐ　３６−４４　（１９８２
））２０μｆを含有する５０μｔエタノール溶液をリン
酸緩衝食塩水（ｐＨ４，０）８００μｌと混合した。史
にこの溶液を、酸で処理したサルモネラミネソタ［Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、１２４　ｅ　ｐ　１１６−１
２２（１９７１））２５０μ２を懸濁した２５０μｔリ
ン酸緩衝食塩水と混合した。混合は４０℃で行った。次
いで得られた懸濁液を轟該グリコリピッド５μＶ含有分
だけ取り、これをＢａ１ｂ／ｃマウスに静脈内投与する
。投与は、以後４日毎に合計３回、同量をグリコリピッ
ド２μ？含有分ずつ投与し、最終免疫の３日後に牌臓を
摘出し、牌細胞をＲＰＭＩ　−１６４０培２０− 地で３回洗浄する。マウス骨髄腫細胞株ｓｐ２〔臨床免
疫１３巻、１１号、Ｐ９１２−９１９　（１９８１）：
］を同様に洗浄後、このＳＦ３　１ＸＩＯ’個と上記牌
細胞４　Ｘ　ｌ　Ｏ’個を５０−遠心管に入れ混合する
。２００×？、５分遠心後、上清を／ｅスツールピペッ
トで除去する。３７℃に保温した、？リエチレングリコ
ール１５００　（Ｂａｓｔｍａｎ、Ｉｎａ、　）　５０
　ｗ／マ％のＲＰＭＩ　−１６４ｇ溶液１−を滴下し、
２分間ゆっくり混合する。３７℃に保温した１５％ＦＣ
８、ｌ　ｍＭピルベートのＲＰＭＩ　−１６４０（以下
［完全ＲＰＭＩ　−１６４０Ｊとする）ＩＷＬｌを加え
１分間、更に同量の完全ＲＰＭＩ−１６４０を加え１分
間、次いで８−の完全ＲＰＭＩを滴下し、２分間ゆっく
りと攪拌する。

２００Ｘｆ、５分遠心後、上清を除去し、３７℃保温完
全ＲＰＭＩ　−１６４０に細胞１×１０’個／−となる
様に懸濁し、マイクロテヌ）−ＩＩ・プレート（ファル
コン社）に１００μｔずつ接種し、３７℃、５％炭酸ガ
ヌインキュペーター内で培養する。２４時間後１．０Ｘ
　ｌ　Ｏ−’Ｍヒボキサンチン、４．　ＯＸ　１０−７
Ｍアミノプテリン、１．６　Ｘ　ｌ　０−５Ｍテミゾン
を君む上記完全ＲＰＭＩ　−１６４０（以下「ＨＡＴ培
地」とする）１００μｔを各ウェルに添加する。以後上
清の半分を第２．３．５．８及び１１日目に、夫々、新
しいＨＡＴ培地に換え、１４日目に同様に上清の半分を
、１．０Ｘ１０’Ｍヒ？キサンチン、１．６　Ｘ　１０
−’Ｍチミゾンを含む完全ＲＰＭＩ　−１６４０（以下
Ｉ　ＨＴ培地」とする）に換える。同様に第１８．２２
．２５及び２６日目に上清の半分を屑培地に換え、第２
８日月に上清の半分を完全ＲＰＭＩ−１６４０に換える
。以後、この完全ＲＰＭＩ−１６４０で増殖維持する。

かくして得られるハイプリドーマは、これを限界希釈法
によりクローニング化した。即ち、ハイプリドーマ２．
５ＸｌＯ個／　ｄ　、Ｂａ１ｂ　／　ｃ　Ｙウス胸腺細
胞４Ｘ１ｇｌｌ／ｍｌとなる様に完全ＲＰＭＩ　−１６
４０に調製し、これをハイブリドーマ５個／ウェルとな
る様に２００ウエルのプレートにまき培養した。増殖し
てくるハイプリドーマを更に同様にハイプリドーマ０．
２５個／ウェルとしてクローニング化した。目的の抗体
を産生ずるクローンの検索は、精製した２３− １３ＦｕｅｎＬｅ４、ｌ”Ｖ’Ｆｕｅ２ｎＬｅ＠又は閂
３Ｖ３■”Ｆｕｅ３ｎＬｅｇの１Ｑｎｆ／ウエル、コレ
ヌテｏ−ル３０　ｎ、ｆ／ウェル、レシチン５０ｎｆ／
ウエルヲコートした９６−ウェルプレート（ダイナチッ
クラボラトリ−社）を用い、ウサギ抗マウス免役グロブ
リン（カッベル社）及び１２５ニ一プロテイン人（シグ
マ社）を使用した同相法によ抄行った。斯くしてクロー
ンｍｙｓａで表わされる所望のハイプリドーマを得た。

実施例２ ■　腫瘍組織又は瘤細胞（ＴＧ　ｌ　ｌ　５肺瘍細胞又
ＦｉＭＫＮ７４細胞）１．５ｆをｌＯゴ蒸留水に［アプ
ロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ　；ゾロテアーゼ阻害剤
；シグマ　ケミカル株式会社＃）　Ｊ　１０キロ国際単
位混ぜたものに加え、ドンス（Ｄｏｕｎｅ・）２４− ホモゾナイザーでホモジナイズする。氷−水浴中で約５
０ストークスした後、ホモジナイズした混合液を２００
０　ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を分離後、更に３５
．００　Ｏｒｐｍで１時り遠心した。得られたペレット
をアプロチニン含有蒸留水ｌＯ−に懸濁し、プロティン
濃度が２，５■／−となるように調整した。

■　上記■で得たＴＧ　ｌ　ｌ　Ｓ膜成分の０．５−（
プロティン１．２５　Ｍ含有）をＢ　ａ　１ｂ　／　１
！　マウスに腹腔内投与する。投与は４日毎、合計４回
行ない、最終投与の３日後に牌臓を摘出した。

■　上記■においてＴＧ１１５展成分を１回投与後３日
目に牌臓を摘出した。

■　上記■で得たＭＫＮ　７４層成分の０．５ｍ（ゾロ
チイン１．２５■含有）を用いて、上記■と同じヌケジ
ュールにて静脈内投与により免疫し、牌臓細胞を得た。

■　上記Ｃ）〜■で得た牌細胞を用い、前記実施例１と
同様にして所、望のハイブリドーマを得た。その代表ク
ローンをクローンＮｕ　ｙｓ　ａ　（ＴＧ１ｉ５膜Ｊｌ
ｉｌｌ、分４回免疫群より選別したもの）、ＹＢｔ　（
ＴＧ　１１５　Ｍ成分１回免疫群より選別したもの）及
びｙｓｆ（ＭＩＧＪ　７４　膜成分免疫群より選別した
もの）と標示する。

実施例３ 実施例１及び２で得たクローンＮｎ　Ｙ３ａ　。

ＹＳｄ、　ＹＳｅ及びＹＳｆの各ハイブリドーマを完全
ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％炭酸ガスインキュベー
ター中で、３７℃にて４８時間培養した。培＊撤を遠心
分離（３，ｏｏｏｒｐｍ、１０分）して、本発明のモノ
クロナル抗体（順次ＹＳａ　ＸＹＳｄ　、　ＹＳｅ及び
ＹＳｆと示す）を含む培養上清を取得した。

（２）　実施例１及び２で得たクローンＩｍＹＳａ。

ＹＳｄ、ＹＳ・及びＹＳｆの各ハイブリドーマｌ×１０
６個をＲＰＭＩ　−１６４０培地０．５−に懸濁し、Ｂ
ａ１ｂ　／　ｅマウスに腹腔内投与した。２〜３週間後
、蓄積した腹水を採取し、夫々抗体Ｙ８ｃ　、ＹＳｄ　
、　ＹＢｔ及びＹＳｆを含む腹水２〜５−／マウスを侍
た。これらの抗体＆度は倒れも０．２〜１■／−であっ
た。

・、試験ψ」１ （１）　免役グロブリンクラス： 各種マウス免役グロブリンクラスに対する２７− ウサギ抗体（Ｌｉｔｔｏｎ、Ｅｉｏｎ＠ｔｉｅｏ、Ｉｎ
ｃ、Ｋｅｎｍｉｎｇｔｏｎ。

ＭＤ２０７９５）及び１２Ｊ標識プロティン人を使用し
てＹｅｈ等の方法に準じて行った［　Ｍｉｎｇ　−Ｙａ
ｎｇ　Ｙｓｈ　ａｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　７６、Ｎｎ６　、、ｐ
ｐ、　２９．２７−２９３１　。

（１９７９：）、、　）。

結果を下記第１−ｉに示す。

（２）抗体Ｙ８ａ、ｙｓａ　−、ＹＢｔ、ＹＢｔの各種
グリコリピッド抗原に対する反廃憔： ■　ｈａ抗原としてｌ”Ｆ’ａｃｎＬ；４　、ｌ”％”
Ｆｕ、ｅ２．ｎＬｃ６、２８− ［３■！■”、ＦｕｃｌｎＬｅ４　＞　■”ＦｕｅｎＬ
ｅ６又は１３ＦｕｅｎＬｃ６ｃ、Ｂｉｏｅｈ＊ｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、ＲＯｌＣｏｍｍｕｎ、＋　１１３　＊ｐ７
９１−７９８（１９８３））を用い、その１Ｏｎｆ　／
ウェル、コレステロール（３０ｎｆ／ウエル）及ヒレシ
チン（５０ｎｆ／’ｙエル）テコードンタビニルストリ
ッフ（コヌ）−社）に、前記実施例３（１）で得た本発
明抗体（及びそれを段階希釈したもの）を反応させた。

ＰＢ８にてよく洗浄後、第２抗体としてウサギ抗マウス
免疫グロブリン、次いで１１５　■−プロティン人を用
いて精製抗原に結合した抗体を測定し１、結合率を放射
カウントによりめた。

抗体ＹＳａ　、　ＹＳｄ及びＹＳｅ１７）結果を、それ
ぞれ第１．２及び３１図に示す。尚図中、縦軸は、結合
した１２６１−プロティン人の放射カウント数（ＣＰＭ
　Ｘ　１Ｏ−３）を、横軸は、抗体の希釈倍を示す。又
、各符号は次のものを示す。

・−・；　ｌｌ”Ｖ”Ｆｕｅ２ｎＬｅ６△−△；　■３
ＦｕｅｎＬｅ６ ０−〇：　ｌ３ＦｕｃｎＬｅ４ ０Ｈコ；１１１■３■”Ｆｕｅ３ｎＬｅＢム−ム：　ｌ
３ＦｕａｎＬｃ６ ■　イニシャルとして精製抗原の３０ｎｆ／ウエル、コ
レステロール（９０ｎｆ　／ウェル）及ヒレシチン（１
５０ｎｆ／ウエル）でコートしたビニルス）　ＩＪツブ
及びその抗原濃度を段階希釈したビニルストリップを用
いて、上記■と同様にして、本発明抗体との反応性を調
べた。

尚、各抗体は、前記実施例３（１）で得た抗体を１００
倍希釈して使用した。抗体Ｙ８ａ　、　Ｙ８ｄ　％ｙｓ
・及びＹＳｆの結果を、それぞれ第４．５．６及び７図
に示す。尚、各図において、縦軸は結合した１２＋１１
−プロティンＡの放射カウント数を、横軸は抗原のイニ
シャル濃度に対する希釈倍を示す。又、各図中の符号の
意味は前記に同じであ沙、第７図中のＸ−Ｘは■”Ｆｕ
ｃｎＬｅＨを示す。

第１〜７図から明らかな如く、本発明抗体Ｙ８ａ　％　
Ｙ８ｄ　ＸＹ８＠及びＹＳｆは鳳”％ｌ”ＦｕｅｌｎＬ
ｃ６及び／又は１３Ｖ８■”Ｆｕｃ３ｎＬｃｇに対して
反応性を有し、これはｌ”ＦｕｅｎＬｅ４に対する反応
性と明確に区別されるものである。上記試験結果より推
定される本発明抗体の認識部位を第８図に示す。

（３）　各稚ヒト細胞との反応性： ３１− プレート上に固定した細胞を５％ウシ血清アルブミン含
有リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４）で１時間処理し、次
いで抗体ｙｓａ（前記実施例３（２）で得た抗体を１０
０倍に希釈したもの）を加え１８時間インキュベーショ
ンした。更に、プレート上の細胞を、第２抗体としてマ
ウスＩｆＧ３と反応するウサギ抗体を１０００倍に希釈
したもので処理した後、、、１２１Ｓ１−標識　。

プロティンＡで処理した。尚、ａｎｔｊ　−８８１ｉｉ
ム−１を比較例とした。ただし１．この場合第２抗体と
してはマウスエｔｙと反応するウサギ抗体を１０００倍
に希釈したものを使用した。

結果を第９図に示す。尚第９図中、横軸はＭＫＮ　７４
を用いた時に結合した１！！ｉ工標識プロテインＡの放
射活性を１００％とした結合率３２− ％で示した。

第９図に示す如く、ａｎｔｌ　−５ＳＥＡ　−１は種々
の細胞と反応し、非悪性Ｂセルラインとも反応してしま
うのに対し、本発明抗体ＹＳａ　Ｆｉ特定の癌細胞、例
えば冑癌セルラインＭＫＮ７４、肺癌セルラインｐｃ７
及び単球白血病セルラインＴＨＰ　−１郷と選択特異的
に反応する。

【図面の簡単な説明】

第１，２及び３図は、それぞれ本発明抗体ＹＢａ　ＸＹ
Ｓｄ及びＹＳｅの各種グリコリピッド抗原に対する反応
性を示す図面で抗体濃度を種々変えた場合のもの、第４
．５．６及び７図は、それぞれ本発明抗体Ｙ８ａＸｙｓ
ａＳｙｓ・及びＹＳｆの各種グリコリピッド抗原に対す
る反応性を示す図面で抗原濃度を変えた場合のもの、第
８図は本発明抗体ＹＳａ、ＹＳｄ　−ｓ　ＹＳｅ及びＹ
Ｓｆの推定認識部位を示す図面、第９図は本発明抗体Ｙ
８ｄの各種ヒト細胞との反応性を示す図面である。 以上 出願人　大塚製薬株式会社 ３５− への寸ｏ＜Ｄへ へ　−−− 、−０１Ｘ八−〇 別　ｃｏｅｏ　＜Ｄ　へ 、−０１Ｘ八−〇 〜　ｏｃｏ　ψ　寸　へ Ｑ　＜Ｄ　へ 沼　ａ：＋ｖｏ　ψ　へ 、０ＩＸｌ／ｌＪｄ：） ０　ＣＤ　へ 、−０１Ｘ人ｄつ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ％式％ 〔式中、Ｇａｔはガラクトース、ＧｔｅＮＡＣはＮ−ア
   セチルグルコサミン、Ｆ■は７コース、Ｇｔｃはグルコ
   ース、Ｃ＠ｒはセラミド、ｎはｌ又は２を示す〕 で表わされるヒト癌細胞由来のフコシルラクトサミン屋
   糖脂質であるシフコシル　ネオラクト−４空へキサオシ
   ルセラミド（ｄｉ　ｆｕｅＯ璽ｙｌｎｅｏｌａｅｔｏ　
   −ｎｏｒｈ＊ｘａｏｍｙｌｅｅｒａｍｉｄｅ　）及び／
   又はトリフコシル　ネオラクトーノルオクタオシルセラ
   ミド（ｔｒｉｆｕｅｏｍｙｌ　ｎｅｏｌａｃｔｏ　−ｎ
   ｏｒｏｃｔａｏ−ｓｙｌｃｅｒａｍｌｄ・）で免疫した
   哨乳動物の免疫細胞と骨髄腫細胞との融合によって得ら
   れるハイプリドーマより生成され、 （１）　次の一般式 ％式％ 〔式中、ＧａＬ　、　ＧｔａＮＡＣ、Ｆｕｃ　、　Ｇ１
   ．ｅ　ＳＣ＠ｒ及びｎは前記した意味と同じ〕 で表わされるヒト癌細胞由来の７コシルラクトサミン盤
   糖脂質の１種又は２種と反応し、（２）　次式 ＧｉＬ１９１→４ＧｔｅＮＡＣ＃ｌ−＋３Ｇａｔβｌ−
   ＋４Ｇ４ｃβｌ−＋ｌＣ＊ｒ３ ↑ Ｆｕｅα１ 〔式中、Ｇａｔ、　ＧｔｅＮＡＣ、Ｆｕｅ　５Ｇｌａ及
   びＣａｒは前記した意味と同じ〕 で衣わされるラクト−フコペンタオシｙ（１）セラミド
   （Ｌａｅｔｏ　−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｙｌ　（１）
   　ｃｅｒａｒｎｉｄ・）と反応しないことを特徴とする
   モノクロナル抗体。