JPS6098985A - 固定化された微生物菌体もしくは酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定１１Ｚされた微生物菌体もしくは酵素の製
造法に関し、その目的とするところは、微生物汚染並び
に酵素活性低下の著しく少ない、しかも機械的ゲル強度
の強い球状ゲルの固定化された微生物菌体もしくは酵素
を簡易な操作で、効率良く得る方法を提供することにあ
る。

従来、微生物図体もしくは酵素含有ゲルの包括固定１ヒ
担体としては、有機物質では一般にアルギン酸塩、カラ
ギーナン、ゼラチン、寒天等の天然高分子物質、ポリウ
レタン等の光硬１し性樹脂等が用いられているが、これ
らの担体を用いた場合、ゲル骨格が有機物質であるため
、細菌に汚され易いことの他、ゲルの機械的強度が弱く
、変形膨潤し易い等の欠点がある。

そして固定化担体として、無機物質、特にシリカゲルを
用いる方法としては、次のような方法が知られている。

例えば英国特許第１ユ１，７６ｇ１号の方法は、ケイ酸
ナトリウム水溶液に塩酸を加えＰＨ／　、　＆のシリカ
ゾルを調製し、これを透析により食塩等の塩を除去して
安定なシリカゾルを得、該ゾルのｐＨを！〜ｇ程度に調
整後、これに微生物菌体もしくは酵素を加えてゲル１し
させるものであり、又特開昭！コーｌコ０１９０号及び
特開昭！グー４ｔ９Ｊ９−号の方法においては、コロイ
ド状シリカ（シリカゾル）に酵素を吸着させた後、塩を
加えてゲル化させ、ついで凍結、解凍操作を経て無定形
の破砕状の固定化ゲルを得ている。

しかしながら、これらの方法は、ベースとなるシリカゾ
ルの調製に時間がかかること、包括固定化（ゲル化）操
作が複雑であること、さらにこれらをバイオリアクター
として用いる場合、無定形のシリカゲルであるため、こ
れらを基質反応容器忙光項するには該容器に適した形状
のゲルに調製しなければ充分な充填効果が得られない等
の欠点がある。

一方、ゲル成形を考慮した方法として、特開昭！！−ｌ
コ２タタθ号の方法があるが、これは、ケイ酸す）　Ｉ
Ｊウムと微生物菌体もしくは酵素の混合水溶液をトルエ
ン、シクロヘキサン等の疎水性Ｍ機成体に懸濁させ、そ
の状態でばと接触することによりゲル化させて、微生物
菌体もしくは酵素を包括固定化した球状シリカヒドロゲ
ルを得る方法である。

しかしながら、この方法に用いるトルエン、シクロヘキ
サン等の疎水性Ｍ機成体（懸濁剤）は、微生物菌体もし
くは酵素の活性を低下させ、又このような懸濁剤をシリ
カヒドロゲルから分離除去する操作も著しく繁雑である
ことの他、得られる球状シリカゲルの細孔構造が不均一
であるため、ゲルの機械的強度も弱い等の欠点がある。

又特開昭３３−／３１３り３号の方法は、コロイド状シ
リカ懸濁液、多孔性充填剤及び微生物菌体の混合物を押
出し成型機で成形するものであるが、この方法において
は、工程が複雑であることの他、処理時間も長くなｐ１
又得られるゲルの機械的強度も弱い等の欠点がある。

そこで、本発明者等は、このような従来技術の欠点を解
消すべく鋭意検討した結果、微生物菌体もしくは酵素含
有シリカゾルを気相中に放出することにより瞬時にゲル
化させれば、包括固定化及びゲル成形を同時、かつ効率
的に行なうことが出いものであること等を知り、本発明
を完成した０即ち、本発明は、微生物菌体、酵素、酵素
をタンニンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの
、又は酵素を不溶化担体に吸着したものを水、緩衝液も
しくは親水性有機溶媒に懸濁したものを、ケイ酸アルカ
リ水溶液と酸溶液とを混合して得られるシリカゾルに加
え混合して該混合シリカゾル中のＳｉｎ、濃度を７０−
ユ１０ｆ／Ｊｌ、ｐＩ（を３〜ＩＱとし、ついでこれを
可及的速やかに気相中に放出しきわめて短時間にゲル化
させて球状のシリカゲルとすることを特徴とする固定化
された微生物菌体もしくは酵素の製造法である。

以下、本発明について詳述する。

先ず、本発明に用いられる微生物菌体としては、ｍ菌、
酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の菌体でも良い。又
酵素も如何なる種別のものでも良（、例えばアルコール
脱水素酵素、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素
等の酸化還元酵素、Ｄ−グルタミルトランスフェラーゼ
、グルタミントランスアミネース、ヘキソキナーゼ等の
転移酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキシ！
ペプチダーゼ、ベニンリナーゼ等の加水分解酵素、フマ
ラーゼ、アスパルターゼ、β−チロシナーゼ等のリアー
ゼ酵素、グルコースイソメラーゼ、マンノースイソメラ
ーゼ等の異性化酵素、グルタチオンシンターゼ、ＮＡＤ
シンターゼ等のりガーゼ酵素等が代表例として挙げられ
る。

上記した酵素は、タンニンもしくは多官能性架橋試薬で
不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担体に吸着させて
用いてもよい。

先ず、タンニンで不溶化させる場合は、酵素量に対し／
、−１０倍量（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有する溶液を加
え、ＰＨｇ以下、好ましくはＰＨＪ〜２で攪拌しつつ反
応させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分離、ｒ過
等の通常の分離手段を用いて不溶化酵素を得る。

なお上記タンニンとしては、タンニン酸の他、ピロガロ
ールタンニン例えば没食子タンニン又は五倍子タンニン
、カテコールタンニン例えば茶、カカオ等から得られる
タンニン質分〔カテコール重合体〕等が用いられる。こ
れらのタンニンはタンニン作用を有する限υ精製されて
いないものでも良く、例えは市販の柿渋タンニン等も用
いられる。これらは単独でも１種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。

又、多官能性架橋剤で不溶化させる場合は、前記酵素を
７一−〇％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を含有する液に
加え、！〜ａｏＣでＩＯ分〜１６時間反応させ、得られ
た酵素沈澱物より例えば遠心分離、ｒ過等の通常の分離
手段を用いて不溶化酵素を得る。

なお、多官能性架橋剤としては、ポリアルデヒド類、イ
ンシアネート類等が適しておジ、例えばジアルデヒドデ
ンプングリオキザール、マロンアルデヒド、コハク酸ア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、ピメリジアルデヒド、
ヘキサメチレンインシアネ−）、ｐ−トルイレンジイン
シアネート等が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望
ましい。

そして、酵素を不溶化担体に吸着させる手段としては、
通常の吸着剤、例えば活性炭、シリカゲル、散性白土、
多孔質ガラス等、又ＤＥＡＥ−七ファデツクス、ＣＭ−
セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロ
ース、アンバーライトＩＲ−Ｑｊ、ダウエックス−！θ
等のイオン交換体等の不溶化担体をカラムに詰めて前記
＃紫を通ｉ−ｆるか、又は該不溶化担体を酵素と混合、
攪拌して　“吸着させた後、これを必要により例えば遠
心分離、ｒ過等の分離手段により不溶化担体に吸着した
酵素を得る。なおその後、必要により、該酵素を吸着し
た不溶化担体に前記多官能性架橋剤を加えて反応させて
もよい。

上記した微生物菌体、騨累、酵素をタンニンもしくは多
官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は酵素を不溶化担
体に吸着したものは、水、緩衝液もしくＩＩ′ｉ親水性
有機溶媒に懸濁して使用する。

これに用いる緩衝液としては、例えば酔眼緩衝液、マツ
キルグエイン緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ベ
ロナール緩衝液等が挙げられ、父親水性有機溶媒として
は、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルア
ルコール、アセトン等が挙げられ、これらの有機溶媒は
通常はｉｏ〜コＯ％（％’Ｖ　）程度で用いられる。

一方、ケイ酸アルカリ水溶液と酸溶液とを混合してシリ
カゾルを調製する。

このケイ酸アルカリ水浴液としては、ケイ酸す等の水溶
液が挙げられ、又酸溶液としては硫酸、塩酸−硝＃筒の
慨榊ｉ！＠−酢−笛の窟鳥層丞妨充田いられる。

次に、ケイ酸アルカリ水溶液と酸溶液とを混合して得た
シリカゾルに、上記した微生物菌体、酵素、酵素をタン
ニンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は
酵素を不溶化担体に吸着したものを水、緩衝液もしくは
親水性有機溶媒に懸濁したものを加え、可及的速やかに
微生物菌体もしくは酵素を該混合シリカゾル中で均一と
なるように混合して該混合シリカゾル中のＳｉｎ、濃度
を２０〜コ１０ｉＰ／Ｉ、、好ましくＦｉｉＪｏ−ｉｇ
ｏｙ７！、かつｐＨを３〜ＩＯ１好ましくは６〜ｇとす
る０ なお、上記混合シリカゾルを調製する際、コロイド状シ
リカ、アルミナシリカゾル及びアルミナゾルより撰ばれ
た少なくとも１種のゾルを、上記混合シリカゾルに添加
すれば、シリカゲル構造を補強させる意味で有利となる
。

又、上記の如く混合シリカゾル中のＳｉｎ、濃度を２０
〜コｉｏＰ／ｉ、ｐＨＪ〜１０とすることは、混合シリ
カゾルをきわめて短時間でゲル化させ、かつ微生物菌体
もしくは酵素含有シリカゲルの機械的強度を増大させる
上で、極めて重要である。

ついで、上記の如くして得た混合シリカゾルを、放出口
より可及的速やかに気相中に放出し、きわめて短時間、
通常は５秒以内、好ましくＩ／′ｉλ秒以内にゲル化さ
せることにより、球状の固定化された微生物菌体もしく
は酵素含有シリカゲルを得る。

ここに用いられる気相媒体としては、通常は空気である
が、所望によっては窒素ガスのような不活性ガスを用い
てもよい。

そして、上記気相中におけるゲル化はきわめて短時間で
完了するため、微生物、特に雑菌等に汚染される可能性
が少な（、しかも目的とする微生物菌体もしくに酵素の
活性低下を実質的に防止することが出来る。

なお、上記ゲル化操作によＶ得られるゲルの形状が球形
であるため、ゲルの機械的強度が高まり、該ゲルを基質
接触塔に充填して基質と反応させた場合、ゲル間相互の
空隙率をｔｌぼ一定に保持することが出来、これにより
基質反応効率の低下な実質的に防止し得る等の利点があ
る。

又、本発明により得られる球状の固定化された微生物菌
体もしくは酵素含有ゲルの粒径は、気相中へ放出させる
ための放出ノズルの口径等を調節することにより、ｔｏ
μ〜１ＯＷｒＩｋ程度の粒径のものが得られるが、特に
平均粒子径が！００μ程度以下の細粒のゲルとすれば、
基質との反応効率を著しく高めることが出来、有利とな
る。

なお、上記した固定化された微生物菌体もしくは酵素を
得るのに用いられる装置としては、本発明の目的が達成
されるものであれば、如何なる形状、構造のものでもよ
いが、例えば容器の上部にケイ酸アルカリ水溶液及び酸
溶液の導入口を育し、該容器の下部に微生物菌体もしく
は酵素の導入口を備え、かつ該容器内に混合翼を設け、
又該容器底部より微生物菌体もしくは酵素含有シリカゲ
ルを気相中へ放出するための放出ノズルを具備した容器
が、本発明を効率的に実施する土で望ましい０以上の如
く、本発明によれば、微生物菌体もしくは酵素含有シリ
カゾルの包括固定１１Ｚ及びゲル成形をきわめて短時間
に、同時かつ効率的に行なうことが出来、得られるゲル
は微生物汚染並びに酵素活性の低下が著しく少なく、し
かも機械的ゲル強度の著しく強いものである。

以下、実施例によｇ本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１ ケイ酸ナトリウム水溶液（５ｉ０２／　Ｎａ２Ｏのモル
比＝３．グ、Ｓｉｎ、含有濃度Ｈｉｇ％−Ｗ／Ｖ）及び
＜ｚＮ−硫酸水溶液を、定量用ポンプを用いて攪拌翼並
びに放出口を有する各器内に別個の導入口より夫々圧送
し、更に該容器内の別の導入口よジサツカロミセス・セ
レビシェエＦＯ０−２ａａを培養、集菌、０．０！Ｍリ
ン酸緩衝液（１）Ｈ４，７７）に懸濁させた液（酵母生
菌体数：　／　、　ＯＸ　／　Ｄ′。／ｍｂ　）を一定
の割合で加えて混合しく容器内混合シリカゾル中の５ｉ
ＯＪ１度：　ｌ　、？　ｏｉＰ／Ｌ、　ｐＨニア−ｊ）
、該容器底部の放出口（ノズル口径ニー２１１ＩＩ１１
）より該混合シリカゾルを連続的に空気中へ放出しくゲ
ル化時間：ｌ−５秒）−酢酸綬衝沿（ｎせクク）含有受
皿で酵母菌体含有シリカヒドロゲルを捕集した０ 得られた固定化酵母菌体は、球状で平均粒子径λ〜、７
　ｍ　（ｒ）もの（乾量基準の含水率：エコ〇％）であ
った〇 次にこの固定化酵母菌体のエタノール生産性を次のよう
にして測定した。

上記固定化酵母菌体６！ノを３０Ｃに保温したジャケッ
ト付カラム（内径＝３ｃｍ１高さ：ｉ６ｃｍ）に充填し
、該カラムにグルコースｇ％（Ｗ／Ｖ）、硫安Ｏ１λ％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス。、１％（Ｗ／Ｖ）を含む液体
培地（ｐ、Ｆｉ、７．．７）を上昇法（ＳＶ＝ｏ、λ〕
でコλ日間通過させつつエタノール発酵を行なった。そ
の結果を第１表に示す。

第　１　表 第１表より、実施例１で得た固定化酵母菌体のエタノー
ル発酵能は、長期間の保持にも係らず著しく優れたもの
であることが認められた。

実施例　２ ケイ酸ナトリウム水溶液（５ｉ０２／　Ｎａ２Ｏのモル
比：Ｊ、ｙ、５ｉｎ２含有＊ｐｉ　二ｓ　ｓ％−Ｗ／Ｖ
）及びｇＮ−硫酸水溶液を、定量用ポンプを用いて攪拌
翼韮びに放出口を有する容器内に別個の導入口より夫々
圧送し、更に該容器内の別の導入口よりウレアーゼ（タ
イブタ、シグマ社製）の１％−Ｗ／■水溶液を一定の割
合で加えて混合（容器内混合シリカゾル中の５ｉ０２濃
度：コ。りｆ／ＩＩ、ｐＨ：１．２）、該容器底部の放
出口（ノズル口径ニーｍ）より該混合シリカゾルを連続
的に空気中へ放出しくゲル化時間二ｉ、０秒）、固定１
しウレアーゼ含有シリカヒドロゲルを捕集した。。

得られた固定化ウレアーゼは、球状で平均粒子径！〜４
ｗｍのもの〔乾量基準の含水率：４Ｉ。θ係〕であった
。

実施例　３ ケイ酸ナトリウム水溶液（５１０２／　ＮａｚＯのモル
比：３．グ、５ｔ（ｈ含有濃度：１ｇ％−Ｗ／ＶＬ＆び
ｔＮ−塩酸水溶液を、定量用ポンプを用いて攪拌翼並び
に放出口を肩する容器内に別個の導入口より夫々圧送し
た。

一方、タンニン醒〔オＵ光純薬（株）裂〕コ０θ？をλ
ｏｏｏａｂのｏ、ｏｚＭトリス緩衝７（１（ｐＨ７，０
）に溶解したものと、アスペルギルス・オリゼーＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−ｔ　ｉグ２の皺培養物より硫安分画しＤＥＡＥ
−セルロースを用いてｆ［したロイシン・アミノペプチ
ダーゼ標品ユＯｆをユｏｏｏｍｂの０．０ＩＭｈリス緩
衝液（ｐＨ７−０）に溶解したものとを混合し、これよ
ｐ遠心分離して得た不溶化酵素に、ｏ、ｏｓＭトリス緩
＠液（ｐＨ７，＋１ｔｏｏｍｂを加え、不溶化酵素液を
調装した。

次に上記容器内の別の導入口より、この不溶化酵素液を
一定の割合で加えて混合しく容器内混合シリカゾル中の
５ｉ０２濃度ＨｉＪｏ？／Ａ、ｐＨ：り、り、該容器底
部の放出口（ノズル径：コｔｔｒｒｈ）より該混合シリ
カゾルを連続的に空気中へ放出しくゲル化時間：ｔ、ｚ
秒）、トリス緩衝液（ｐＨ２、θ）含有受皿でロイシン
・アミノペプチダーゼ含Ｍシリカヒドロゲルを捕集しり
Ｏ 得られた固定化ロイシン・アミノペプチダーゼは、球状
で平均粒子径ｌ−コ勧のもの（乾量基準の含水率：１３
０％）であった０ なお、上記操作より得られた固定化ゲル１個（約０　、
　Ｊ　ｊ’　７個）当りのロイシン命アミノペプチダー
ゼ活性に、ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基質として
中台の方法〔中台忠信、日本醤油研究所報告ｊ、９り（
１９７４年）〕で測定した結果、ｌλＯＯθ単位であっ
た。

実施例　４ ケイ酸ナトリウム水浴液（５ｉｆ２／　Ｎａ２Ｏのモル
比：　Ｊ　、　ｌ、　Ｓｉｎ、含有濃度：１ｇ％・Ｗ／
ｖ）及びグＮ−硫酸水溶液を、定量用ポンプを用いて攪
拌翼並びに放出口をＭする容器内に別個の導入口より夫
々圧送し、更に該容器内の別の導入口よりペディオコッ
カス・ハロフィラスＦＥＲＭ　Ｐ−６ａａ。

を培養、集菌し、コロイド状シリカゾル（Ｓｉｎ、濃度
３０％水溶液、スノーテックス３０．日産１ｔＳ学株式
会社製）に懸濁させた液（ＰＨ：　７　、０、乳酸菌生
菌体数：！０×／（１７Ｉ７ｍＪ、）を一定の割合で加
えて混合しく容器内混合シリカゾル中の５ｉＯｚ濃度：
／　Ａ　ｇ　ｓＰ／　Ａ、ｐＨニア、ｊ）、該容器の底
部の放出口（ノズル口径：ｉ、３ｍｘ＋）より該混合シ
リカゾルを連続的に空気中へ放出しくゲル化時間：ｉ、
３秒）、０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）Ｉ７．θ）含有受
皿で乳酸菌画体含有シリカヒドロゲルを捕集した。

得られた固定化酵母菌体は、球状で平均粒子径２〜３謡
−のもの（乾量基準の含水率：ｓｏθ％）であった０ 次に、この固定１し乳酸菌菌体の乳酸発酵性の測定を次
のようにして行った０ 上記固定化乳酸菌菌体１３ＪｆをａｏＣに保温したジャ
ケット付カラム（内径：Ｊｃｒｎ、高さ１３０ｃｍ）に
充填し、該カラムに肉エキス／％（Ｗ／Ｖ）、ポリペプ
トン／％（Ｗ／Ｖ）、Ｉ！母エキス１％（Ｗ／Ｖ）、グ
ルコース１％（Ｗ／Ｖ）、チオグリコレート０．１％（
Ｗ／Ｖ　）、ＮａＣ１／　３％（Ｗ／Ｖ）を含む液体培
地（ｐＨ７，コ）を上昇法（ＳＶ＝ｏ、ｉ）で３０日間
通過させつつ乳散発酵を行なった。その結果を第２表に
示す。

第２表 第２表より、実施例４で得た固定１し乳酸菌菌体の乳酸
発酵能は長期間の保持にも係らず著しく優れたものであ
ることが認められた。

実施例　５ ケイ酸ナトリウム水溶液（５ｉｆ２／　Ｎａ、０のモル
比：３．グ、Ｓｉｎ、含有濃度：１ｇ％・Ｗ／Ｖ）及び
＆Ｎ−硫酸水浴液を定量用ポンプを用いて攪拌翼並びに
放出口を有する容器内に別個の導入口より夫々圧送し、
更に該容器内の別の導入口よりサツカロミセス・セレビ
シェＩＦＯＯ−−ｇ　ヲ培養、集菌し、酢酸緩衝液（ｐ
Ｈｊ、ｔ）に懸濁させた液（酵母生菌体数：　／　、　
ＯＸ　／　０”／１１ｂ）を一定の割合で加えて混合し
く容器内混合シリカゾル中のＳｉｎ、濃度；　ｉ　Ｊ　
ｏ　ｊ’　／　Ｉｋ、ｐＨニア、り、該容器底部の放出
口（ノズル口径：／、ｊｗａ）より該混合シリカゾルを
連続的に空気中へ放出し、該飛翔中のシリカゾルに横方
向より圧縮空気を吹き付けて微粒化しくゲル化時間：１
．！秒）、酢酸緩衝液（ｐＨｊ、ｊ）含有受皿で酵母菌
体含有シリカヒドロゲルを捕集した。

得られた固定化酵母菌体は、球状で平均粒子径ａｏｏミ
クロンのもの（乾量基準の含水率：５２０％）であった
。

出願人　キッコーマン株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物菌体、酵素、酵素をタンニンもしくは多官
   能性架橋試薬で不溶化したもの、又は酵素を不溶１１１
   ．担体に吸着したものを水、緩衝液もしくは親水性有機
   溶媒に懸濁したものを、ケイ醒アルカリ水溶液とｒ１１
   １溶液とを混合して得られるシリカゾルに加え混合して
   該混合シリカゾル中の５ｉｎ２濃度を７０−２　／　ｏ
   　ｆ　／　７、ｐＨを、７−　／　０とし、ついでこれ
   を可及的速やかに気相中に放出しきわめて短時間にゲル
   化させて球状のシリカゲルとすることを特徴とする固定
   化された微生物菌体もしくは酵素の製造法。
2. （２）混合シリカゾルに、コロイド状シリカ、アルミナ
   シリカゾル、及びアルミナゾルより選ばれた少な（とも
   １種のゾルを添加することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）ゲル１１時間が！秒以内である特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。
4. （４）固定化された微生物菌体もしくは酵素のゲル平均
   粒子径が５００ミクロン以下である特許請求の範囲！／
   項記載の方法。 （５〕混合シリカゾル中の５ｉｎ２濃度を１３０〜／ｇ
   Ｏｉ！−／Ａ、ｐＨを６〜ｇに夫々調整することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。