JPS6098991A - 発酵法によるｌ―フェニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるし一フェニルアラニン（以下単に
フェニルアラニンという。）の製造法の製造法としては
ブレビバクテリウム属又はミクロコツカス属細菌のチロ
シン要求菌を使用する方法（特公昭３７−６３４５）、
生育にチロシンを要求しカ１つ５−メチルトリブトファ
ンに耐性を有する変異株を使用する方法（特公昭５ｌ−
２１０７９）、フェニルアラニンアナログに耐性を有す
る変異株を使用する方法（特公昭５ｌ−２８７１２）、
更にはデコイエン感受性変異株を使用する方法（特公昭
５６−６４７９３）等が知られている。

本発明者等は更に効率良くフェニルアラニンを発酵生産
する方法を開発することを目的として研究を重ねた結果
、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属等の
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌に唯一の炭素源
としてグロトカテク酸では生育できるがキナ酸では生育
できない変異株の中によシ多量のフェニルアラニンを生
成、蓄積する菌株が存在することを見い出した。

本発明はこの知見に基づいて完成されたものであス、 本発明において、フェニルアラニン生産能を有する微生
物はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属等
のコリネ型細菌に属し、フェニルアラニン生産に必要な
性質、例えばＬ−チロシン要求性又はフェニルアラニン
アナログ耐性、もしくはＬ−チロシン要求性でかつトリ
シトファンアナログ又はフェニルアラニンアナログ耐性
を有する微生物である。

本発明において使用される変異株はブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属等のコリネ型細菌に属し、
上記フェニルアラニン生産能を示す性質を持ち、かつ唯
一の炭素源としてグロトカテク酸では生育できるが、キ
ナ酸では生育できない性質ヲ有する微生物である。この
ような性質を有する微生物はフェニルアラニン生産能の
他に、Ｌ−）リプトファン生産能およびＬ−チロシン生
産能を有する。

Ｔｙｒ−＝　Ｌ−チロシン要求性 ５−ＭＴｒ＝　５−メチルトリシトファン耐性ｐＦＰｒ
＝ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性ＤＳＤＴａｇ＠＝
デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ欠損これら本発明の変
異株は、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム
属のフェニルアラニン生産菌を親株として、これに通常
の変異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−
メチル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジノ（ＮＴ
Ｇと略ｆ）。

亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理した菌体を唯
一の炭素源としてグロトカテク酸では生育できるが、キ
ナ酸では生育できないようなコロニーを分離することに
よって得られる。上記ブレビバクテリウム属又はコリネ
バクテリウム属等のコリネ型細菌のフェニルアラニン生
産菌は公知のものを使用すれば良いが、具体例としては
次のような変異株が使用される。

親株としてはこの他、ブレビバクｆ’）ラム属又はコリ
ネバクテリウム属のコリネ型細菌特にグルタミン酸生産
性細菌として知られている微生物を使用し、唯一の炭素
源としてグロトカテク酸では生育できるがキナ酸では生
育できない（デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ欠損）性
質、及びフェニルアラニン生産性を付与することによっ
て誘導することができる。このような親株の例としては
、ブレビバクテリウム・デパリヵタムＡＴＣＣ１４０２
０゜ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼラムＡＴＣＣ
１４０６６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグ
ルタミクムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・
グルタミクムＡＴ（’！（’！１１１Ｑ？毎−１’＋（
イー１’＋１次に本発明で使用する変異株の変異誘導法
及び薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。

実験例１ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１
３８６９よシ誘導したチロシン要求性で５−ＭＴ　ｒの
フェニルアラニン生産菌ＡＪ　３４３２　ＦＩＲＭ　Ｐ
−１８４４をイーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、
生育した菌体を集めて１１５０ＭＩＪン酸緩衝液（Ｐ’
（７，０）に懸濁しく１０８〜１０９個／　ｍｌの菌体
を含む）、これにＮＧを加え（ＮＧ濃度は２００μｍ１
／ｍｌ）、室温で３０分間保持した。このようにしてＮ
Ｇ処理した菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、菌
液を適当に希釈して、完全培地を含む寒天平板上でコロ
ニー数が２００コ位になるように塗布する。

そして次に唯一の炭素源としてプロトカテク酸及びキナ
酸を各々含む第１表に示す最少寒天平板培地上にレプリ
カし、キナ酸では生育できないが、プロトカテク酸では
生育できるコロニーを分離する・このようにして得られ
たコロニーの内には親株よりフェニルアラニン生産能の
優れたものが多〈見い出された。

グルコース　１０１１／１ （又はグロトカテク酸、キナ酸　０．４％）硫酸アンモ
ニウム　５　〃 尿素　２〃 ＫＨ２ＰＯ４１ｔｔ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１＃ Ｆｅ＋＋ｅ　Ｍｎ”＋イオン　２　ｐｐｍビオチン　５
０μ、９／ｌ サイアミン塩酸塩　２００　＃ ＤＬ−メチオニ７　２００Ｔｎ９／Ｉ Ｌ−チロシン　１００／／ この内生産能の最も高い菌株ＡＪ　１２１０３を選んだ
。

同様の変異操作によシ、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンタムＡＪ　３４３５　を親株として同様の方法
によりＡＪ　１２１０２　ｆ、選んだ。

全く同様の方法でコリネバクテリウム・アセトアシドフ
ィラムＡＪ　３２４４を親株としてＡＪ　１２１０４を
誘導した。

次にこのよう圧して得々変異株のグルコース及びキナ酸
、グロトカテク酸を各々唯一の炭素源とした場合の生育
の結果を第２表に示す。

実験方法は、各変異株の菌体を第−表の最少培地で良く
洗浄した後、小型試験管に入れた第２表に示す所定量の
炭素源を含む最少培地（４１１１１）Ｋ一定量接種し、
３１．５℃で２４時間振盪培養を行い、培養液の５６０
　ｎｍに於る吸光度を測定して生育度をめた。第２表に
はその相対生育値を示した。

本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、そ
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸等の有機微
量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素
源としては使用する変異株の利用可能なものであれば良
く、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース
、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、そ
の他、エタノール、ソロノやノール等ノアルコール類、
酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によってはノル
マル・ぞラフイン等も単独あるいは他の炭素源と併用し
て使用される。

窒素源として祉硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミ
ン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプト
ン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用
する場合には要求される栄養素を補添することが必要で
ある。

培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培
地のＰＨを５ないし９、温度を２０℃ないし４０℃に制
御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることにょジフェニルアラニンが多量培養液中に蓄積さ
れる。培養液からフェニルアラニンを採取する方法は公
知の方法に従って行えば良く、培養液から菌体を分離除
去した後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を
用いる方法等によシ採取される。

以下、実施例にて説明する。

実施例１ 下記第３表に示すフェニルアラニン生産用培地を調製し
、５００Ｔｎｌ容振盪フラスコに２０ｄ宛分注し、１２
０℃で１０分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺菌した
炭酸カルシウム粉末１．０Ｆｔ補添した。

グルコース　１３ｊ）　ｇ／ｄＡ’　Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４
・４　Ｈ２０１Ｄ　ｍ９／ｄＪ硫酸アンモニウム　１Ω
　〃　Ｌ−チロシン　４０　Ｉ／ＫＨ２ＰＯ４１５／／
　ＤＬ−メチオニン　４０　１ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００
，０４／／　大豆蛋白分解液　３７）　ｍＶｄ１ビオチ
ン　５．０１４ＡＩ　フマール酸　１．２．９／ｄＪサ
イアミン塩酸塩　２０〃　酢　酸　０．３〃ＦｓＳＯ４
’７Ｈ２０１Ｄｍ９／ｄｌ この培地に第４表に示すフェニルアラニン生産菌を１白
金耳接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養液中
のフェニルアラニン生成量を測定し、その結果を第４表
に示した。

第４表　フェニルアラニンの蓄積量

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ブレビバクテリウム属又はプリネパクテ゛リウム属
   に属し、唯一の炭素源としてグロトカテク酸では生育で
   きるがキナ酸では生育できない変異株でかつＬ−フェニ
   ルアラニン生産能を有する微生物を培養して、Ｌ−フェ
   ニルアラニンを培地中に生成、蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とする発酵法によるＬ−フェニルアラニ
   ンの製造法。 ２）ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に
   属し、唯一の炭素源としてグロトカテク酸では生育でき
   るがキナ酸では生育できない変異株０