JPS61100191A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）！業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための培養方法Ｖｃｌｌ
するものである。さらに詳しくは、大規模にかつ高密度
に細胞培養を行う目的で作られだザスベンジョン聾細抱
培養システムにおける細胞培養方法に関するものである
。

（ｂ）　　従来技術 ＃Ｉ胞大１培養は例えばつづルス、ワクチンｔインター
フェロンなどの抗ウィルス剤、多るいはホルモンなどの
生物薬品の工業的製造に重要な技術である。殊に近年峙
定のタンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の
生産は抗体産生細胞とξエローｉ細胞の配合によるハイ
プリドーマ細胞の大量培養によるものであり、その技術
の解決は工業的に不可人な問題である。

また、大規模でおり、かつ高密度に細胞を培養すること
は上り有用物質を低コストで生産するために必須の技術
であり、その技術の急速な解決、が望まれている。

従来、サスペンジョン型の細胞培養は一般に培養びんや
スピンナーフラスコを用いて実験室的規模で行なわれ℃
いる。

しかＬながら、上記の方法では一定量の栄養分の中で培
養されるため細胞の生長増殖は比較的低い濃度で停止す
る。

近年、サスペンジョン型の高密度細胞培養方法およびそ
のための装置としていくつかの提案がなさ幻ている。た
とえば、マグネチツクスターラーもしくはモーターで駆
動される回転軸に平行な面にフィルターを有する筒形回
転体を回転させてフィルターのりまりを遠心力で防ぎな
がら培養液を人ねかえる高密度培養装置が提案されてい
る。（米国特許第３．６４７．６３２号明細書参照）。

しかＬながら上記の方法では、単位細胞歯シまたは、培
養液あたりの濾過面積を成る一定以上大きくすることに
制約があるため、スケールアップが非常に困難である。

（ｅ）　　発明の構成 そこで本発明者らは前記のような従来法における欠点を
克服し、サスペンジョン型の細胞培養法によって大規模
かつ高密度の培養が可能な培養方法について研究を進め
た結果、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、サスペンショアｍ細胞培養方法で
あって、該方法の細胞培養槽としてサスペンジョン液中
に培養液は透過するが細胞は透過しないフィルター領域
を少な（とも部分的に有する盤状体の少なくとも１個が
培養液を培養槽外へ取り出す導管に該導管と同軸で回転
し得るように取りつけられた回転型フィルターが収納さ
れた培養槽を用、い、かつサスペンジョン液中の培養液
を盤状体の該フィルターを介して回転軸と同軸の導管を
通じて培養槽外へ排出することを特徴とする細胞培養方
法である。

さらに、前記本発明方法は、培養槽外から細胞に悪影響
を与えない水性液体媒体を該導管を通じて該盤状体のフ
ィルターを介してサスペンジョン液中に記入させ、前記
排出と流入とを交互に繰返すことによって一層有利に培
養することができる。

かくして、□本発明の培養方法忙よれば、サスペンジョ
ン型の培養槽におけるサスペンジョン液中に少なくとも
１個の前記盤状体よシなる回転型フィルターが沈められ
ており、細胞が産出した老廃物９代謝産物、その他生前
阻害物質を含んだ古い培′菓液が、サスペンジョン液か
ら盤状体のフィルターを介して導管を経て、培養槽外へ
排出され、成る時間経過すると、この排出を停止し１次
いで培養槽外から細胞培養に悪影響を与えない水性液体
媒体を導管を通じて盤状体へ供給して該液体媒体をフィ
ルターを介してサスペンジョン液へ流入せしめられる。

従って、本発明方法においてサスペンジョン液中に沈め
られた盤状体によってそれに設けられたフィルターを介
して水性液体媒体のサスペンジョン液中への供給とサス
ペンジョン液中からの古い培養液の排出とが交互に繰返
され、かつ盤状体が回転する回転軸の方向とフィルター
領域の面を垂直にすることにより、遠心力が生ずるため
フィルターの細孔に細胞やその地固型物が詰り、実質的
なフィルター面積の効率低下をきたすことはなく、有利
に水性液体媒体の供給と古い培養液の排出とをスムース
に行うことができ、極めて容易に高密度の細胞培養が可
能となる。

特に本発明方法においては、盤状体を２個以上簡単に直
列に連結して使用することもできるので、細胞の種類と
密度、培養条件、培養の規模の変化に応じてフィルター
の面積を適応させることが可能である。

本発明の細胞培養方法はサスペンジョン型の細胞培養に
適用されるが、サスペンジョン型とは、水性媒体中で細
胞上ね自体が浮遊しながら或いは細胞を微小担体（マイ
クロキャリアー）Ｋ担持して浮遊しながら、またマイク
ロカフセル中で細胞が生育されるような種々の浮遊培養
をいう。殊に本発明は細胞自体を浮遊させながら培養す
る方法に有利に用いられる。

本発明の細胞培養方法を用いて培養される細胞は、植物
細胞、動物細胞、微生物細胞などであってもよ（、また
人為的、或いは遺伝子操作によシ質注された細胞でむっ
てもよい。

殊に本発明の培養方法は動物ＭＪｌ胞の培養に適してい
る。

本発明忙おけるサスペンジョン型の細胞培養槽中におい
ては、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態
で培養されるう培養液は実質的に水よりなる水性媒体に
、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ糖、アミ
ノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される怒加成
分が加えられている。また培養液には血清を加えること
もできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することもできれ 本発明方法において、培養槽外からサスペンジョン液中
に供給される「細胞培養に悪影響を与えない水性媒体」
としては滅菌水を主体としてこの中に前記添加成分の一
種又はそれ以上を加えて使用することができる。この水
性媒体は培養に必要な全ての添加成分な含んでいる新し
い培養液であってもよく、また、これら成分を全℃含ん
でいる必要は７孟い。また、水性媒体とじＣ＆工、本発
明方法に従って盤状体を通じ℃培養槽外へ排出された培
養液（以下これな「古い培養液」ということがある）を
一部として使用することも可能である。

本発明における盤状体のフィルター領域には培養液は透
過するが、細胞あるいはそれが付着した微小担体又はそ
れが中に入ったマイクロカプセルは透過しない大きさの
細胞が多数設けられている。細胞自体を浮遊させて培養
させる場合、細孔の大きさは細胞の大きさによって左右
ぼれるが、一般に平均孔径が１０μ以下、好ましくは８
μ以下が適当である。一方微小担体（マイクロキャリア
ーＪの表面に細胞を付着させ℃培養させる場合、又はマ
イクロカフセル中 合にはそれらが透過しない大きさの細孔である必要があ
る。

また、該フィルターは、水を成る程度透過する能力を有
することが望ましい。すなわち該フィルターは水の透過
係数Ｃｍ１７．、（、ｈ、・ｍＨ９）が１０以上、好ま
しくは１００以上であるのが有利である。一方上限は特
にないが、２０．０００以下、好ましくは１０．０００
以下が望ましい。

さらに該フィルター領域には栄養分や細胞の老廃物９代
謝生産物などの如き分子量の小さい化合物は透過するが
分子量の大きい化合物（例えば分子ｆＪ　１．０００以
上、好ましくは５．０００以上）は透過しない膜、例え
ば限外濾過膜を使用することも可能でちる。

本発明でいう盤状体とは、回転軸に垂直な面の径を１１
回転軸方向の長さをｂとしたとぎ、ａ　／　ｂの比が２
以上１００以下のものが適当であり、と＜Ｋ２以上３０
以下のものがよい。

また、培養槽における回転軸に垂直な培養槽の断面積る
たり盤状体のしめる面積比は１０チ以上９５％以下が好
ましく、＃に２０チ以上８０％以下のものがよい。

盤状体の回転軸方向の断面の形状は薄い長方形、′に形
、三角形、楕円、半楕円などが適当である。

かかる盤状体Ｖコは前記フィルター領域か少くとも部分
的に設けられており、そのフィルター領域は盤状体のほ
ぼ全面に設けられてもよく、一部であってもよい。一部
である場合には、上面或いは下面、又はそれら面の一部
であってもよい。

以下、添付図面により本発明の細胞培養方法を更に詳細
に説明する。

添付第１図は、本発明の細胞培養方法な実施するための
概略図の一例を示すものであり、第２−Ａ図は本発明の
方法に使用される盤状体の一例の外観図で、第２−Ｂ図
はその盤状体の断面構造を示すもので、また第３−Ａ図
は他のＭの盤状体の外観図であり、第３−Ｂ図はその断
面構造を示すものである。また第４図は第１図とは別個
の細胞培養槽の概略図を示したものである。

第１図は盤状体５を回転作動させて培養する場合を示し
たものであり、第１図において、１はサスペンジョン型
培養ｍにおける培養槽本体であり、栄養物などを含む水
性媒体はその供給槽２からポンプ３により供給導管４を
通り、切り換え弁１１を往で培養槽中へ送られる。培養
槽ｌにはフィルタ一部分を有する盤状体５がそのフィル
ター領域がサスペンジョン液につかるよう忙備えられて
おり、この盤状体は駆動部６により回転し、細胞を培養
液中に効果的に浮遊させる。盤状体の上部又は下部又は
中間にとりつけられた攪拌具によって攪拌をさらに効果
的に行うことも可能である。また別途に設けられたマグ
ネチックスターラーでもよい。さらに培養液中の細胞を
効果的に浮遊させることのできる他の攪拌効果な有する
手段であつ℃もよい。

一方、古い培養液はポンプ３′によって盤状体５の下面
に設けられたフィルター領域を透過し、回転軸の中を経
て導管４′を通って培養槽外へ取り出される。

第２−Ａ図の盤状体およびその断面を示した第２−Ｂ図
において、７はフィルター領域でめね１回転軸と同軸の
導管８にとりつけられている。第２−Ｂ図においてフィ
ルターは平面の円型で下面についているが、これは他の
形状であってもよい。例えば第３−枳７図およびその断
面を示す第３−Ｂ図に示されているようにドーナツ型で
上下両面にフィルター領域（斜線部分）があってもよい
。

さらに培養槽には、酸素、二酸化炭素や栄養素の濃度、
ｐＨの値を測定し、それらを成る範囲に維持する装置が
一般に設置されているが、本発明の方法の実施にもこれ
らの装置が備えられていてもよいことはいうまでもない
。

しかし第１図及び第４図にはこれらの付属装置は省略さ
れている。

本発明の方法に用いられる新しい培養液は、この中にブ
ドウ糖、タンパク質の如き栄養源。

種々のアミノ酸、無機塩、抗生物質などの細胞培養に必
要な成分を水浴敵として含むものが使用されるが、さら
に血清を含んでいてもよく、また含んで（・なくてもよ
い。これらの成分は必要なすべてを培養液として供給し
てもよいが、一部の成分は、他の供給手段によって培養
液中へ導入することも可能である。

一般に細胞培養には酸素、二酸化炭素なども必要である
が、これらは新しい培養液に溶存させて供給してもよく
、さらに第１図に示すように弁１２を通してガス供給管
１３より直接サスペンジョン液へ供給してもよい。

本発明方法においてひとつの盤状体は、いずれも水性体
媒体（例えば新しい培養Ｑ）の供給と古い培養液の排出
とを交互に繰返しながら操作されるが、その間隔は細胞
の種類。

密度、培養条件などによって左右されるが、一般には１
分乃至１日、好ましくは５分乃至１０時間の範囲で切り
換えることができる。

第４図は本発明における盤状体の４個を９のように多段
に直列につないだ列を示したものであり、盤状体の数お
よびフィルタ一部分の面積を増減することにより培養槽
に応じた攪拌と濾過面積を容易に得ることが可能でおる
。第４図において、１　、２　、３　、４　、３’およ
び１１．１４は第１図と同様のものを意味する。

以上説明した本発明の方法によれば、サスペンジョン型
の細胞培養において連続的に培養液を供給できかつ連続
的に老廃物９代謝生産物、生育阻害物質などを除去でき
、またフィルターのめづまりもおこらないため、高密度
でしかも大量の細胞を長期間にわたって培養することが
μ１能となか。

以下実施例を揚げて本発明方法を詳述する。

実施例 （１）盤状体の性状； ガラスを用いて、添付図面２−Ａ図、２−Ｂ図に示され
るようなＭＥ状体を作った。フィルター頭載の径ｉ２ｓ
、ｏｃｍであってフィルターは平均孔径が３μの多数の
微細孔を有しており、透水率は４ｄ／ゴ・ｈｒ−正０９
　　であった。

（２）培養槽の形状； 添伺第１図に示したような構造をした内容積が５００−
のガラス容器を培養槽として使用した。この培養槽には
第１図に示さｔｌでいるよ５に１つの盤状体が収納され
ており、盤状体を回転させるモーターがふた上部に装着
されている。また、培養槽内にはＣＯ，ガスおよび０．
ガスの供給導管が挿入されているが、こ第１は第１図の
１ｔｌＫ該当する。

（３）　　培養方法； 前期培養槽に液容積が３００Ｍとなるように新しい培ｑ
＃溶を入れ、その中にひとつの盤状体を入れた。培養液
には１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
を用いた。盤状体には第１図の２に示すような新しい培
養槽が切り換え弁を介して導管で結合されている。

また、古い培養液は、盤状体のフィルターを介して導管
を通って培養槽外へ排出される。

培養槽のサスペンジョン液中には、系内のｐＨが６．５
〜７、浴存散素が３〜４騨と一定になるようにＣＯ，ガ
スおよび０．ガスを供給した。

培養槽の培養液中にマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を親
株とするマウスノ・イブリドーマ４０１０Ｂ６細胞株を
２．ＯＸ　１０“個／−となるように加えた。この細胞
は免疫グープリンＣＩ、９Ｇ　）生産型の株である。

培養中のサスペンジョンｇ、は３７．０℃に保持され、
また盤状体は１００ｒ−の回転数で回転させた。培養開
始後、細胞密度が１．０×１０６個／−になつ℃から、
新しい培養液の供給と古い培養液の排出を行なった。盤
状体における供給と排出の間隔はほぼ１時間単位で行い
、１日における新しい培養液の培養槽への供給量は約３
００ｄであった。しかし、培養開始後５日経過後はこの
新しい培養液の供給量を除々に増加させ、１日あたり最
高６００−とした。

（４）　　培養結果； かくして９日間培養を行った結果蚤よ下記の表の通りで
あった。

なお、新しい培地を全く供給しない以外は全く同一の条
件で培養を行った時の最高の細胞密度は、培養開始後４
日経過後の１．２×１０’個／ｄであった。

【図面の簡単な説明】

第１＠は本発明の細胞培養槽の全体を示す該略図の一例
を示すものである。第２−Ａ図は本発明の細胞培養槽に
使用される盤状体な示すものであり、第２−Ｂ図は、そ
の断面図である。 第３−Ａ図は本発明に使用される盤状体の他の一例の外
観図であり、第３−Ｂ図はその断面図である。第４図は
、該盤状体ケ多段に直列につないだ培養槽の一例の概略
図を示した４）のである。 特許出碩大　帝人株式会社、・− 代理人　弁即士　　前　　１）　純　　博１第４図 第ど−Ａ図　　　　第Ｚ−Ｂ図 第３−Ａ図　　　　第３−Ｂ図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サスペンジョン型細胞培養方法であつて、該方法の
   細胞培養槽としてサスペンジョン液中に培養液は透過す
   るが、細胞は透過しないフィルター領域を少なくとも部
   分的に有する盤状体の少なくとも１個が培養液を培養槽
   外へ取り出す導管に該導管と同軸で回転し得るように取
   りつけられた回転型フィルターが収納された培養槽を用
   い、かつサスペンジョン液中の培養液を盤状体の該フィ
   ルターを介して回転軸と同軸の導管を通じて培養槽外へ
   排出することを特徴とする細胞培養方法。 ２、培養槽外から細胞に悪影響を与えない水性液体媒体
   を導管を通じて該盤状体の該フィルターを介してサスペ
   ンジョン液中へ流入させ、第１項記載の排出と流入とを
   交互に繰り返すことを特徴とする細胞培養方法。