JPS6112669A - アミノピラゾリノン、その製法およびｈ↓２ｏ↓２検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規アミノピラゾリノン、その製法、およびペ
ルオキシダーゼおよびフェノール性またはアニリン性カ
ップリング成分の存在でのＨ２Ｏ２−検出法に関する。

従来の技術 酵素的に−たとえば酸素またはオキシダーゼを用いる血
清成分の酸化によシー形成された−　　８２０．の分析
定量は、医学的診断にとって非常に重要である。存在す
るオキシダーゼ基質の量に比例する、形成されたＨ２０
□の量は、たとえば色原体をペルオキシダーゼの存在で
８２０２　と反応して測光測定可能な色素を形成するこ
とによシ、酵素的に測定できる。形成された色素の量は
、Ｈ２Ｏ２形成性基質の量の規準として使用される。

Ｈ，０，ｆｆｌ量のための公知の色原体は、発色剤（４
−アミノアンチピリン、４−ＡＡＰ）をカップリング成
分（フェノール）と、ペルオキシダーゼの存在セ、Ｈ２
Ｏ３作用下に、色素に酸化性カンプリングさせて色素を
生成させる、トリンダ−（Ｔｒｉｎｄｅｒ　）　（７ｙ
、／　’）７．Ａイ、ｔ’ｙミスドリー（Ａｎｎ、ＣＩ
　ｉｎ、Ｂｉｏｃｈａｎｌｓｔｒｙ　）第６巻、第２４
〜２．７ページ（１９６９年）〕による指示薬系である
。フェノールの代わシに、他のフェノールまたはアニリ
ン性化合物を使用することもでき、その際たとえばＮ−
エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−′３−メチルアニリン
（ＥＨＴ、西ｒイツ国特許出願公開ｊｉ３１２４５９４
号明細書）またはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニ
ル）−Ｎ′−アセトアミド−エチレンジアミン（ＥＭＡ
Ｅ、茜ドイツ国特許第０００７７８７号明細書）のよう
なアニリン性化合物で形成される色素は、深色方向に約
５０　ｎｍだけずらされた最高波長においてよシ高い分
子吸光係数を有する。

これから、特にたとえば尿素およびクレアチニンのよう
な低濃度血清成分の定量の際、フェノール性カップリン
グ成分に比してアニリン性カップリング成分の使用が有
利であることは明らかである。

発色剤として、４−アミノアンチビリ、ンの他に、他の
アミノアンチピリン誘導体（たとえばジアミノアンチピ
リン、西ドイツ国特許出願公開第３１００８０７号明細
書）、メチルペンズチアゾロンヒＰ２シン（ＭＢＴＨ）
　、スルホン化ＭＯＴＨ（ＳＭＢＴＨ）および同様の反
応をする化合物も使用できる。上述のＨ，Ｏ□定量にお
けるこれら全ての発色剤の欠点は、自動酸化により条件
づけられた、部分的に悪い盲検値安定性のほかに、アニ
リン性カップリング成分で形成される１″九色素の不十
分な安定性である（たとえば西ドイツ国特許出願公開第
３１２４５４９号明細書参、照）。色素安定性の改良は
、たとえばよシ長い読取時間が可能になることによシ大
きな実施上の利点を意味する。

発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の課題は上述の欠点を有せず、Ｈ２Ｏ，
定量の際に発色剤として４−、アミノアンチピリンまた
は他の公知の発色剤の代わシに使用することができ、殊
にアニリンカップリング成分との酸化性カップリングの
際に形成される色素のよシ良い安定性を有する新規化合
物を提供することである。

問題点を解決するための手段 この課題は、本発−明によシ、一般式：〔式中Ｒ１，Ｒ
ｇおよびＲ３は１〜６のＣ−原子を有する直鎖または分
枝アルキル基を表わし、合わせて最高８のＣ原子を含有
する〕で示される新規アミノビグシリノンによ）解決さ
れる。

本発明による化合物の製造は、たとえは自体公知の方法
によシ相当するトリアルキルぎラゾリノンを硝化または
ニトロ化し、引続きたと゛えばＺｎ／ＨＣＩまたは水素
触媒を用いて還元することによシ行なうことができる。

この合成の際出発物質として使用されるトリアルキルビ
２シリノンは、同様に公知方法によシ、たとえば１゜２
−ジアルキルヒドシジンをアシル酢酸エステルと、反応
させるかまたは適尚なジアルキルピラゾリノン−をアル
キル化することによシ得られる。この種の方法は、たと
えばクロース（Ｗ。

Ｋｒ０ｈＳ）、ヘンゼル（０，Ｈｅｎ５ｅｌ）著、”ピ
ラゾロン　カント　ジオキンピラシリジン（Ｐｙｒａｚ
ｏ−Ｉｏｎｅ　ｕｎｄ　Ｄｉｏｘｏｐｙｒａｚｏｌ　１
ｄｌｎｅ）”〔エディティオ　カント−Ａ／　（Ｅｄｌ
ｔｉｏ　Ｃａｎｔｏｒ　）　、７ウレンドＡ／　（Ａｕ
１ｅｎｄｏｒｋ　）　／Ｗｔｔｂｇ、、　１９６１年〕
オヨびウイリイ（Ｒ，Ｈ，ＷｌｌｅｙおよびＰ、ＷＩｌ
ｅｙ）、Ａ、ワイスペルガ−（Ｗｅｌｓ　ｂｅｒｇｅｒ
　）　（Ｅｄ、）、”ピラゾロン、ビラゾリドン　アン
ド　デリペ−）　　（Ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅｓ　、　　
Ｐｙｒａｚｏｌ　１ｄｏｎｅｓ　　ａｎｄＤｅｒｌｖａ
ｔｅｓ　）”インターサイエンス　パゾリツシャー（Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　）　
、ニューヨーク、ロンドン、シトニー、１９６４年）Ｋ
記載されている。

本発明による化合物としては、４−アミノ−１，２，３
−）リメチルピ２ゾリンー５−オ／（ＴＡＰ）が有利で
ある。他の本発明による化合、物の例は、１，２．３−
）リエチルービ２ゾリンー５−オン、１，２−メチル−
３−インプロビル−ビラゾリン−５−オ、ン、１−ブチ
ル−２゜３−ジエチルピンゾリン−５−オン、１−ｔ−
ブチル−２，３−ジメチル−ピラゾリン−５−オン、１
−へキシル−２、３＝ジメチル−ビラゾリン−５−オン
等である。

本発明の他の対象は、発色剤として上記化合物を用いる
アニリンまたはフェノール性成分およびペルオキシダー
ゼを用いる酸化性色素形成反応によるＨ２Ω、定量法で
ある。

メチルフェニル）−Ｎ’−アセトアミド−エチレンジア
ミン（ＥＭＡＥ）が有利である。

本発明による色素形成の範囲内で適邑な他のアニリン性
カップリング成分は、Ｎ−エチル−Ｎ−（４−７０オロ
−３−メチルフェニル）−六Ｎ′−アセトアミドーエチ
レンジアミン（Ｆ−ＥＭＡＥ）、　　ニヨＮ−エチル−
Ｎ−（２−スルホエチル）−ｍ−行すトルイジン（ＥＳ
Ｔ）、Ｎ−エチル−Ｎ　−（３’−性台スルホベンジル
）−ｍ−）ルイジン、他のアニ　　　でタリン誘導体、
ナフチルアミン、ナフチルアミン　　　色斉誘導体、ア
ミノキノリンその他である。　　　　　　　　プアニリ
ン性カップリング成分としてＥＨＴを　　　明ニ用いる
、発色剤として本発明に、よる有利な化合・　　　色環
、とえはフェノール性化合物を用いる本発明る化合物の
色素形成も上述の式と同様に進“る。原則的に、慣用の
発色剤を用いる酸化ｉ素形酸反応においてカップリング
成分とし１用される全ての化合物が、本発明による発１
にも適している。

”ニリン性カップリング成分に属さず、本発：よる化合
物と一緒にＨ，Ｏ□検出の範囲内で：形成のために使用
することのできる他の慣す７トール、ナフトール誘導体
、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸その
他である。

色素形成の際の反応は、緩衝液中で実施される。緩衝剤
およびｐＨ価としては、ペルオキシダーゼにつき公知の
関連する条件が適している。

５〜９のｐＨ価が有利である。その他に、前−されたＮ
２０．形成性酵素反応の場合における緩衝剤およびｐＨ
価の選択は、特にこれに関与する酵素の緩衝剤およびｐ
Ｈ価の要求によって制約されている。これらの条件は全
部当業者に公知であシ、従ってここでは詳述する必要は
ない。

ペルオキシダーゼ、本発明による化合物少なくとも１種
、カップリング成分および緩衝剤少なくとも１種を主成
分とするＮ２０□の定量試薬は、付加的になお常用の溶
剤、安定剤または／および界面活性剤を含有していてよ
い。この場合、この試薬の主要成分の次の量比が特に適
当であることが立証された： ベルオキシダーぜ　　０．１〜１００Ｕ／ゴ本発明によ
る化合物　０．０１〜２０ミリモル／ｌカッブリ／グ成
分　　０．１〜５０ミリモル／１１゜界面活性剤は、添
加された場合、特にすぐ使用できる試薬溶液に対して０
．　ＯＯ１〜０．１１！／ｄの量で使用される。

次の実施例につき本発明を詳述する。

実施例 例　　１ ４−アミノ−１，２，３−トリメチルピラゾリン−５−
オン（ＴＡＰ）の製造 ａ＞　　４−二トロー１．２．３−）ジメチルピラゾリ
ン−５−オン 濃硝酸５．５ｄに、７０℃で１．２．３−）ジメチルビ
ラゾリン−５−オ／・Ｈ，ＯＩ　Ｉ！を少量宛加える。

その際温度は７５℃を越えてはならない。添加終了の３
０分後、反応混合物を真空中で濃縮し、氷１０Ｉ！上に
注ぐ。５Ｎ力性ソ一ダｍ液を用いて冷却下にｐＨ７に調
節し、その際沈殿した粗生成物を吸引濾過する。母液か
ら濃縮によシさらに生成物を得ることができる。

得られた粗製ニトロピラゾリノンを水／イソゾロパノー
ルからの再結晶によシ精製する。

収量：０．９６Ｉ！＝理論値の７１％。

”Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｃ６）：δ＝２６０（ｓ、３
Ｈ）；３．３６（ｓ、３Ｈ）； ３．６５μ（ｓ、３Ｈ）。

元素分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ３０．．１７１．１６）：計算値
：　Ｃ４２，１１Ｎ５．３０　　Ｎ２４５５実測値：Ｃ
４２，２Ｎ５．４２　　Ｎ２５．１８ｂ）　　４−アミ
ノ−１，２，３−）リメチルビ２ゾリンー５−オン 水５ｄ中の亜鉛末６．４９から成る懸濁液に、冷却下に
濃塩酸８．４−および水３ｄ中の４−二トロー１．２．
３−）ジメチルビー２ゾリンー５−オン２．８　ｌＩの
溶液を流加する。その際反応温度は２５〜３０℃に保つ
。６０”Ｃでさらに２時間後攪拌し、引続き反応混合物
を氷上に注ぎ、５Ｎ力性ソーダ溶液でアルカリ性にする
。沈殿した亜鉛塩を吸引濾過し、母液を十分に濃縮し数
回クロロホルムと振とりする。硫酸ナトリウム１で有機
相を乾燥した後、真空中で蒸発濃縮し、その際所望の生
成物が晶出する。

収量：０．９３．９＝理論値の４０％。

”Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ、）　：δ＝１．９８（ｓ
、３Ｈ）；２．８５（ｓ　、３　Ｈ）　ｐ　３．１１　
（ｓ　、３　Ｈ）　ｐ３．６３ｐｐ（ｓ　、　ｂｒ　、
　２Ｈ）。

元素分析（Ｃ６ＨＸＩＮ、０．１４１．１７）：計算値
：　Ｃ５１，０９Ｎ７．８５　　Ｎ２９．７６実測値：
Ｃ４９，５６Ｎ７．９３　　Ｎ２８．９質量スペクトル
：　ｍ／　ｌ　＝　１４１　（Ｍ”）例　　２ ＴＡＰ　、ならびに比較物質として４−ＡＡＰを用いる
種々のカップリング成分の酸化性カップリングの際の色
安定性 試験ノ々ツチ中の濃度： に−ＰＯ４−緩衝液、ｐ）−１７，Ｑ：０．１モル／１
発色剤：　　３Ｘ１０−”ミリモル／ツカツブリング成
分：　３Ｘ１０　　ミリモル／ｌドライドｙ（Ｔｒｌｔ
ｏｎ　）　１００：　５Ｗ４／ｌ／ペルオキシダーゼ：
１．２Ｕ／１４ 過酸化水素：１．５Ｘ１０　　ミリモル／ｌ！。

比較りにシト中に緩衝液が存在する。色安定性の測定の
際の測定波長は５５０ｎｍ、温度は２５℃である。吸光
の経過を１２時間にわたって追跡し、測定は一時間毎に
行なジ。

色安定性の記載は・ぐ−セントで行なわれかつ過酸化水
素の添加の２分後に撮影された最初の測定信号に対する
そのつどの時間における測定色 信号の偏奇関する。

表には同様に、最初の測定信号のλｍａｘ−およびε−
値が一緒に記載されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３は互いに独立にそ
   れぞれ１〜６のＣ原子を有する直鎖または分枝アルキル
   基を表わし、合計して最高８のＣ原子を含有する〕で示
   されるアミノピラゾリノン。 ２、４−アミノ−１，２，３−トリメチルピラゾリン−
   ５−オンである、特許請求の範囲第１項記載のアミノピ
   ラゾリノン。 ３、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３は互いに独立にそれ
   ぞれ１〜６のＣ−原子を有する直鎖または分枝アルキル
   基を表わし、合計して最高８のＣ原子を含有する〕で示
   されるアミノピラゾリノンの製法において、１，２，３
   −トリアルキルピラゾリン−５−オンをニトロ化し、次
   いでニトロ基を還元することを特徴とする、アミノピラ
   ゾリノンの製法。 ４、フェノールまたはアニリン性カップリング成分を用
   いるＨ＿２Ｏ＿２検出法において、発色剤として一般式
   ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３は互いに独立にそれ
   ぞれ１〜６のＣ−原子を有する直鎖または分枝アルキル
   基を表わし、合計最高８のＣ原子を含有する〕で示され
   るアミノピラゾリノンを使用することを特徴とする、Ｈ
   ＿２Ｏ＿２検出法。 ５、アニリン性カップリング成分として、Ｎ−エチル−
   Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチルアニリンまたはＮ−
   エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−アセトア
   ミドエチレンジアミンを使用する、特許請求の範囲第４
   項記載のＨ＿２Ｏ＿２検出法。