JPS61135581A - シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラ−ゼ活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ポリペプチド、とシわけシクロマルトデキス
トリン　グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリ
ペプチドに関する。

更に詳細には、シクロマルトデキストリン　グルカノト
ランスフェラーゼ産生能を有する微生物、まｔは、組換
えＤＮＡ技術を用いてシクロマルトデキストリ／　グル
カノトランスフェラーゼ遺伝子を導入しに形質転換微生
物を栄養培地で培養することにより産生されるポリペプ
チドで６って、部分アミノ酸配列として、 （ａ）　　Ａｓｎ−ＬＪｙｓ−１１ｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｇｌ）’−Ｔ）’ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ、（ｂ）　　Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

（ｃ）　　Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−１ｉｅ−Ａｓｐ−
Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−ＡＳＰ−Ａｒｇ−ｐ
ｈｅ　。

（ｄ）　　ｌ１ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｑｌｕ−Ｑｌｎ−Ｔｌｙｒ＋ｆｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ　、および（ｅ）　　Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−’ｒｘｒ−ｃｔｙから選ばれる１種以上
の配列を有していること全特徴とするシクロマルトデキ
ストリン　グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポ
リペプチドに関する。

（従来の技術） ／クロマルトデキストリン　グルカノトランスフェラー
ゼ（以下、本明細書ではＣＧＴａｓｅ　と略称スル。）
は、マセランス　アミラーゼとも言われ、古くカラバチ
ルス　マセランス（Ｂａｃ（１）ｕ８ｍａｃｅｒａｎｓ
　）の産生ずる酵素として知られている。

近年、ＣＧＴａｓｅハ、バチルス　マセランスタケでな
く、バチルス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃ（１）
ｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）、バ
チルス　サーキュランス（１３ａｃ（１）ｕａ　ｃｉｒ
ｃｕｌａｎｓ　）などの微生物によっても産生されるこ
とが知られ、その糖転移作用が工業的に広く利用される
ようになってき友。

例えば、糊化澱粉液にＣＧＴａＳｅ　を作用させてシク
ロデキストリンを製造し、また、液化澱粉とスクロース
との混合溶液にＣＧＴａｓｅ　ｆ作用させ澱粉からスク
ロースへの糖転移反応を利用してグリコジルスクロース
を製造している。最近、シクロデキストリンは、例えば
、酸化又は揮発しやすい有機化合物を包接して：り安定
々包接化合物を形成するためのホストとしての需要が増
大し、また、グリコジルスクロースは、上品な甘味を有
する低う触性甘味料（林原株式会社製造、登録商標カッ
プリングシュガー）としての需要が増大している。

このような需要の増大に応える几めＣＧＴａｓｅの安定
供給が急務になってきた。そこで、ＣＧＴａｓｓｔ安定
供給する几めに、ＣＧＴａｓｅ活性を有するポリペプチ
ド（以下、本明細書では、単にポリペプチドと略称する
。）のアミノ酸配列全解明する必要が生じてきた。

しかしながら、ポリペプチドのアミノ酸配列は、末だ知
られていない。

（発明の解決しようとする問題点） 本発明者等は、ポリペプチドのアミノ酸配列を解明する
とともに、組換えＤＮＡ技術にＬるポリペプチドの広範
囲な給源確保と、ポリペプチドの産生量の向上全目ざし
て鋭意研究１続は友。

その結果、ポリペプチドは、部分アミノ酸配列として、 （ａ）　　Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ＝Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｔ）ｒｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ。

（ｂ）　　Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−（、、ｅｕｌ（ｃ）
　　Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ　
。

（ｄ）　　Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ７
Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−ＧＬ７−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇ　、および（ｅ）　　Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−’ｐｙｒ−Ｇｌｙから選ばれる１種以上の
配列を有していることが判明し、更に詳細には、前記の
部分配列がＮ末端側から近い順に、（ａ）、（ｂ）、（
ｅ）、（ｄ）、（ｅ）の部分配列を有していることが判
明した。

そして、その特徴的性質は、可溶性澱粉からシクロデキ
ストリンを生成し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で７０．０００±１０，０００　の分子量を示
すポリペプチドで６って、比活性２００±３０単位／ｑ
蛋白質である。

Ｉｔ、バチルス　ステアロサーモフィラス由来のポリペ
プチドは、後に説明するように、表２−１に示されるア
ミノ酸配列金有していることが判明し九。

更に、バチルス　賃セランス由来のポリペプチドは、後
に説明するＬうに、表５−１に示されるアミノ酸配列を
有していることが判明し几。

更にま几、ポリペプチドを産生微生物から分必するため
のシグナルペプチドについても、そのアミノ酸配列が判
明した。

以下、本発明の内容を詳述し、併せて本発明の詳細な説
明する。本明細書の記載においてアミノ酸、ペプチド、
その他に関し略号で表記する場合、それらは当該分野に
おける慣用略号に基づくものである。それらの例を以下
に列記する。アミノ酸に関し、光学異性体があり得る場
合には、特に明示しなければ５体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　　　：リボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ｄＮＴＰ　　：デオキシヌークレオチド三す７Ｍ。

ｄｄＮＴＰ：ジデオキシヌークレオチド三リン酸ｄＣＴ
Ｐ　　：デオキシシチジン三すン酸ＳＤＳ　　　ニドデ
シル硫酸ナトリウムＡｌａ　　ニア２二ン Ａｒｇ　　：アルギニン Ａｓｎ　　　：アスパラギン Ａｓ　ｐ　　　：アスパラギン酸 Ｃ７Ｓ　　　ニジスティン Ｇｌｎ　　　：グルタミン Ｇｌｕ　　　：グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　ニゲリシン ）（ｉｓ　　　：ヒスチジン Ｉｌｅ　　　：イノロイシン Ｌｅｕ　　　：ロイノン Ｌ　７　’　　　：リジン Ｍｅｔ　　　：メチオニン Ｐｈｅ　　　：フェニルアラニン ｐｒｏ　　　：グロニン ３ｅｒ　　：セリン Ｔｈｒ　　　：スレオニン ’［’ｒｐ　　　ニトリブトファン Ｔｙｒ　　：チロシン Ｖａｌ’　　：バリン 本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＧ
Ｔａｓｅ産生菌からポリペプチド遺伝子全クローニング
した後、その塩基配列を解読して決定し九〇 一方、ポリペプチドのＮ末端を含有する部分のアミノ酸
配列は、ポリペプチドを高純度に精製しｔ後、気相プロ
ティン　ンークエンサーを用いて調べた。

ポリペプチド′伝子のクローニング 本発明は、ポリペプチド産生能を有する供与体微生物よ
りその微生物のＤＮＡを分離精製し念後、例えば、超音
波、制限酵素などで切断し、得られたＤＮＡ断片と、同
様にしてベクター全切断して得られたベクター断片とを
、例えば、Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガ−ゼなどより結合させ、
ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。

この際、供与体微生物としては、ポリペプチド産生能を
有する微生物、例えば、特開昭４７−２０３７３号公報
、特開昭５０〜６３１８９号公報、特開昭５０−８８２
９０号公報およびハンス　ベンダー（Ｈａｎｓ　Ｂｅｎ
ｄｅｒ）、アーカイブス　オプ　マイクロバイオ０ジー
（Ａｒｃｈｔｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　）　、　Ｍｏ１．１１１．２７１〜２８２（１９７７
年）などに示されているバチルス　マセランス、バチル
ス　メガテリウム、バチルス　サーキュランス、バチル
ス　ぜリミキサ、バチルスステアロサーモフィラスなど
のバチルス属、クレーフンーラ　ニューモニアエなどの
クレーブシーラ属などの細菌が適宜選、ばれる。

また、ポリペプチド産生能を遺伝子組換えにより導入し
た形質転換微生物を供与体微生物として利用することも
できる。

供与体微生物由来のＤＮＡは、供与体微生物を、例えば
、液体培地で約１〜３日間通気攪拌培養し、　′得られ
る培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれ全溶菌させ
ることによって調製することができる。溶菌方法は、例
えば、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解
酵素による処理や超音波処理などが用いられる。また、
必要にニジプロテアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫
酸ナトリウムなどの界面活性剤を併用することも、更に
凍結融解処理を施すことも自由である。

このようにして得られる溶菌物からＤＮＡｔ−分離、精
製するには、常法に従りて、例えばフェノール抽出、除
蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、
アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せる
ことに１って行うことができる。

ＤＮＡｔ−切断する方法は、例えば、超音波処理、制限
酵素処理などに工り行うことができるが、得られるＤＮ
Ａ断片とベクター断片との結合を容易にするためには、
制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、
例えば、ＥｃｏＲＩ　、　［ｉｎｄ　［、ＢａｍＨＩ、
Ｓａｌ　ｌ、Ｓｌａ　Ｉ　、　Ｘ＋ｎａ　ｆ　１Ｍｂｏ
　Ｉ、ＸｂｌＬ　ｌ、３ａｃ　ｌ　、　ｐｓｔ　ｌなど
のＩ型制限酵素が適している。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうる７
アージ又はプラスミドが適している。

ファージとしては、例えば、エッシエリヒアコリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　ｔ−宿主微生物と
する場合には、λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢなどカーバ
チルス　ズブチリス（１３ａｃ（１）ｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ　）　ｔ−宿主微生物とする場合には、ｐＨ、ψ
１、ψ１０５などが使用できる。

また、プラスミドとしては、例えば、エツシェリヒア　
コリ全宿主微生物とする場合には、Ｉ）ＢＲ３２２、Ｐ
ＢＲ３２５などが、バチルス　ズブチリスを１主微生物
とする場合には、ｐＵＢ　１１０．　　ｐ’ｒｚ　４（
ｐＴＰ４）、ｐｃ１９４などが使用でき、更に、例えば
、エッ７エリヒア　コリ、バチルス　ズブチリスなどの
二種以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、
ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ＰＢＳ　７などのベ
クターを利用することも可能である。このようなベクタ
ーを、先きに述べたＤＮＡと同様に制限酵素などで切断
し、ベクター断片を得る。

ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法は、公知
のＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ７ガーゼを用いる方法であればよく、
例えば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングの
後、生体外で適当なりＮＡリガーゼの作用にニジ組換え
ＤＮｌｔ作成する。必要ならば、アニーリングの後、宿
主微生物に導入して、生体内のＤＮＡＩＪガーゼ？利用
して組換えＤＮＡにすることもできる。

宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的増
殖が可能でその形質発現のできるものであれば工い。な
かでも、α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）産生能
を欠いている微生物は、ポリペプチド産生量の測定が容
易であるだけでなく、産生されるポリペプチドの分離、
精製も容易であり有利に利用できる。

宿主微生物に組換えＤＮＡｔ導入する方法は、公知の方
法、例えば、宿主微生物がエッ／エリヒア属に属する微
生物の場合にはカルンユウムイオン存在下で行ない、バ
チルス属に属する微生物の場合にはコンピテントセル法
又はプロトプラスト法などを採用することができる。

組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物の選択方法は
、澱粉を含む平板培地上で生育し、かつ、澱粉からンク
ロデキストリンを生成するものを選択すればよい。

この工うにして一度選択されたポリペプチド遺伝子を含
む組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り出して、他
の宿主微生物に導入することも容易に実施できることが
判明した。またポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡ
？制限酵素などにより切断してポリペプチド遺伝子を含
むＤＮＡ断片とし、これと同様にプラスミドなどのベク
ターを切断して得られるベクター断片とを結合させるこ
とも容易忙実施できることが判明し次。

ま友、本発明のポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡ
は、制限酵素ｐｖｕ　Ｉ＋　（東洋紡績株式会社製造）
にＬる切断部位を有しており、制限酵素ｐｖｕ　１１の
作用を受はポリペプチド遺伝子が切断され、その形質発
現能を失うことが判明した。

ポリペプチド遺伝子の塩基配列 ポリペプチドの遺伝子塩基配列は、ジー７（Ｑｅｎｅ　
）、Ｖｏｌ、９．２５９〜２６８　（１９８２年）に示
されているジデオキシ　チェー／ターミネータ−法で解
読すれば工い。

この方法は、クローニングにより得られたポリペプチド
遺伝子を含むＤＮＡ断片金、グラスミドｐＵｃ１８など
のプラスミドに制限酵素を利用して、そのクローニング
部位に挿入する。得られた組換えプラスミドは、形質転
換によってエッシエリヒア　コリ　ＪＭ８３などに移入
し、次いで組換えプ２スミ、ドを有する微生物を選択す
る。

この微生物全増殖させ友ものを用いて組換えグラスミド
を調製する。

得られｔ組換えプラスミドを合成プライマーとアニーり
ングし、これにフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片を慟ら
かせてプライマー全伸長させ相補ＤＮＡｔ’−生成させ
る。

この反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いで
、ラジオオートグラフィー法を行つｔ後、ポリペプチド
遺伝子の塩基配列を決定する。

ま友、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チド遺伝子の塩基配列も、同様にして決定する。

１．１ペプチ゛　　８−１ ポリペプチドのアミノ酸配列は、塩基配列工り決定する
。

また、ポリペプチドを菌体外に分泌させるシグナルペプ
チドのアミノ酸配列も、同様にして決定する。

ポ１ペプチ゛　Ｎ　　　Ａ　　る部分アミノ酸　タ１ポ
リペプチド産生能を有するバチルス属に属する微生物全
栄養培地で培養してポリペプチドを産生させる。培養終
了後、遠心分離して上清を採取し、これを硫安分画、イ
オン交換りａマドグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィーに：り精製し高純度ポリペプチドとする。この試料
を用いてジャーナル　オプ　バイオロジカル　グミスト
リー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、　Ｖｏｌ、２５６゜７９９
０〜７９９７　（１９８）年）の記載に準じて、気相プ
ロティン　／−クエンサーにエリ分解し、高速液体クロ
マドグ２フイーで固定して、ポリペプチドのＮ末端を含
有する１部分アミノ酸配列を決定する。

転換微生物によるポリペプチドの調製 上述の＝うにして得られ次形質転換微生物を栄養培地で
培養することに↓り多量のポリペプチドを安定して産生
じうろことも見いだした。

栄養培地には、例えば、炭素源、窒素源、ミネラル、更
に必要ならば、アミノ酸、ピタミ／などの有機微量栄養
素などを含有させればよい。

この際、炭素源としては、澱粉、澱粉部分加水分解物、
グルゴース、フラクトース、スクロースなどの糖質が有
利に用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩。

硝酸塩などの無機窒素源、ペプトン、酵母エキス、脱脂
大豆、ゴー／ステイープリカー、肉エキスなどの有機窒
素源が適宜用いられる。

培養方法は、例えと、液体培地をｐＨ４〜ｌＯ１−＠度
２５〜６５℃の範囲に維持しつつ、通気攪拌などの好気
的条件下で約１〜４日間培養し、ポリペプチドを生成蓄
積せしめれば工い。

培養物中のポリペプチドは、そのまま全採取し利用する
こともできるが、一般には常法に従りて、濾過、遠心分
離などによりポリペプチド溶液と微生物菌体とに分離し
た後に利用される。

ポリペプチドが菌体中に存在する場合には、細胞を超音
波、界面活性剤、細胞壁溶解酵素などで処理し、次いで
濾過、遠心分離などしてポリペプチド溶液を採取する。

このようにして得られるポリペプチド溶液を、例えば、
減圧濃縮、膜濃縮し、更に、硫安、硫酸ンーダなどに：
る塩析、メタノール、エタノール、アセトンなどによる
分別沈澱法などを適宜組み合せて精製し、より高純度の
ポリペプチド全採取し、工業用ポリペプチド剤として有
利に利用できる。

本発明でいうＣＧＴ　ａｓｅ活性１単位とは、ｐＨ５，
５，０，０２Ｍの酢酸緩衝液及び２　Ｘ　１０−３Ｍの
塩化カルンウムを含む０．３ｗ／ｗ％のソリュプルスタ
ーチ溶液５−に適当に希釈し次酵素液０．２　ｆＲｔ’
ｉ加え４０℃で１０分間反応し友後、その反応液０．５
　ｄ　ｉとシ、０．０２　Ｎ−硫酸水溶液１５＋ｄｌＣ
！合して反応を停止させ、更にこの反応停止液にＯ，Ｌ
Ｎヨウ素ヨウ化カリウム溶液０．２ｍｔ−加えて発色さ
せ、次いで６６０ｎｍにおける吸光度全測定して、４０
℃で１０分間反応させることによりノリュプルスターチ
１５■のヨウ素の呈色を完全に消失させる酵素量金いう
。

以下、実施例で本発明の詳細な説明する。

実ＭｆｌＨバチルス　ステアロサーモフィラスポリペプ
チド遺伝子のエノ／エリヒア コリへのクロー二／グ ＋１１　　バチルス　ステアロサーモフィラスの耐熱性
ボ、リペプチド遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製バチル
ス　ステアロサーモフィラスの耐熱性ポリペプチド遺伝
子を含む染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法〔ビオキ
ミ力　エト　ビオフイジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａ　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｉｓｉｃａＡｃｔａ　）　、　
Ｖｏｌ、７２．６１９〜６２９　（１９６３年）〕に準
じて調製し比。即ち、バチルス　ステアロサーモフィラ
ス　ＦＥＲＭ−Ｐ　　扁２２２５　ｔ−プレインハート
　イア７ユージヨン培地で５０℃、−夜通気攪拌培養し
た。培養液を遠心分離にて集菌し、得られた菌体ｔ−Ｔ
ＥＳＩ！衝液（ｐＨ８，０、トリスアミノメタ／、塩酸
、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム含有）にｉ濁し、次にリゾ
チームをｄ当り２岬の割合で加え、３７℃で３０分間保
持した。これｔ−１−２０℃で一夜結凍しｔ後、ＴＳＳ
緩ｌＩ液（ｐＨ９，０、トリスアミノメタン、ＨＣＩ、
ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトｌ）ラム含有）ｔ−
加え、６０℃に加温しｔ後、ＴＥＳフェノール混液（Ｔ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）　１容と７エノール４容との
混合液）ｔ″加え、氷水中で冷却後、遠心分離し上溝を
得た。

この上清に２倍容の冷エタノールを加え粗染色体ＤＮＡ
を回収し、これｔ−３ＳＣ緩衝液（ｐＨ７，１、塩化ナ
トリウム、クエン酸３ナトリウム含有）に溶解し、リボ
ヌクレアーゼ（ングマ社裂造、商品名　１Ｎａｓｅ　Ａ
　）おＬびプロテアーゼ（科研製薬株式会社製造、商品
名　ｐｒｏｎａｓｅ、　Ｅ　）　　ｔｌ−作用させ、次
いで、ＴＥＳフェノール混液を加え、冷却し遠心分離し
て、得られる上清に２倍容の冷エタノール全顎え精製染
色体Ｄ　Ｎ　Ａ　ｋ回収し、緩衝液（ｐｆ（７，５、ト
リスアミノメタン、ＨＣＩ、ＥＤＴＡ含有）に溶解して
一２０℃に保存し次。

（２）　　プラスミド　ｐＢＲ３２２の調製プラスミド
　ＰＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）は、ゼイ　メイ
ヤーズ（Ｊ３ＭａｙｅｒＳ　）等の方法〔ジャーナル　
オプ　バクテリオａ　）　−（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ）ｒ　）　、　Ｖｏｌ、　１２７
．１５２４〜１５３７（１９７６年）〕に準じてエツシ
エリヒア　コリから分離、調製した。

（３）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤ　Ｎ　Ａ
の作製 実施例１−１１１で調製し次耐熱性ポリペプチド遺伝子
を含む精製染色体ＤＮＡに対して、制限酵素［ｂｏ　ｌ
　（株式会社二・ノポンジーン製造）を作用させ、ＤＮ
Ａ断片が１〜２０　Ｋｂｐになる：う染色体ＤＮＡｔ一
部分的に切断し比。一方、実施例１−＋２）で調製しｔ
プラスミドｐＢＲ３２２に対し　　　　　　−て、制限
酵素ＢａｍＨＩ　（株式会社ニッポ／ジーン製造）を作
用させ、完全に切断し、次いで、プラスミド断片のセル
フライゲー７ヨン全防止するため、エソシェリヒア　コ
リ由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造株式会社製
造）を作用させ、Ｐ　ＢＲ３２２断片の５′未満を脱り
／酸化した。

両断片の結合は、Ｔ、ＤＮＡＩＪガーゼ（株式会社ニッ
ポ／ジーン製造）を４℃で一夜反応させて行ない、組換
えＤＮＡを作製しｔｏ （、＋＋　　組換えＤＮ４のエノンエリヒア　コリへの
導入宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いている
エツシエリヒア　コリＩ（Ｂｌｏｔ　（ＡＴＣＣ３３６
９４）を用いた。

本機生物’ｔＬ培地で３７℃、４時間培養し集菌した後
、１０ｍＭ塩化ナトリウム、５０　ｍＭ塩化マンガンを
含有する１０　ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐｉ（５，６）べ懸
濁し、遠心分離にて集菌し、続いて２５　ｍＭ塩化カル
／ウム、１２５ｍＭ塩化マンガンを含有する１０　ｍＭ
酢酸塩緩衝液（ＰＩ（５，６）に懸濁しｔものに、実施
例１−＋３１で得九組換えＤＮＡｅ加え、氷水中で３０
分間静置し念。更に、３７℃に加温し、Ｌ培地を加え３
７℃で３０分間保ち、これを抗生物質アンピシリン５０
μｆ／ｍｌｆ含有し、かつ澱粉２　ｑ／ａｔ　を含有す
るＬ−アガー平板培地上に拡け、３７℃で２４時間保ち
、コロニー金形成させた。

本平板から、ヨード呈色法により、澱粉全分解し、サイ
クロデキストリン全生成しているコロニーヲ選択し、ポ
リペプチド遺伝子？含む組換えＤＮＡが導入されている
形質転換微生物？選択し友。本微生物を増殖させ、実施
例１−＋２）のプラスミドの調製方法に準じて組換えＤ
ＮＡを取り出し、これに各種制限酵素全作用させ、その
切断部位全決定した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ（株式会社
二ツボ／ジーン製造）で完全切断し、次いで、実施例１
−＋３１と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させ、組換
えＤＮＡ？作製し、実施例１−（４）の方法に準じてポ
リペプチド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡＴｈ保有す
る形質転換微生物を選択し几。

更に、この小型の組換えＤＮＡ　ｔ−制限酵素５ａｌｌ
（株式会社ニッポ／ジーン製造）で完全切断し、以後、
前記のＥｃｏＲ，Ｉの場合と同様に処理して、ポリペプ
チド遺伝子金含む更に小型の組換えＤＮＡを保有する形
質転換微生物を選択した。

本微生物の一菌株をエッンエリヒア　コリＴＣＨ２０１
（ＦＥＢＭ　　Ｐ−７９２４）と命名し、これが保有す
る組換えＤＮＡ　ｔ　ｐＴＣＨ２０１と命名し組換えＤ
ＮＡ　　ｐＴｃＨ２０１について、バチルスステアロサ
ーモフィラス白米ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を第１
図に示す。

第１図から明らかなように、制限酵素ｐｖｕ　ｌ［（東
洋紡績株式会社製造）、Ｋｐｎ　Ｉ　、　Ｈｉｎｄ　１
（株式会社ニッボンジ−７製造）、Ｘｂａ　ｌ（宝酒造
株式会社製造）で切断を受けることが判明した。

一方、制限酵素ＥｃｏＲＩ　％Ｂ、ａｍＨ［、、ｐｓｔ
　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｂｇｌ　ＩＩ、　Ａｃｅ　Ｉ（以上
、株式会社二ノボンジーン製造）では切断されなかっ九
。

実施例２　バチルス　ステアロサーモフィラスポリペプ
チド遺伝子のバチルス　ズブチ リスへのクローニング （１）組換えＤＮＡ　　ｐＴＣＨ２０１の調製組換えＤ
ＮＡ　　ｐＴｃｆｊ２０１は、実施例１−＋２）の方法
に準じてエッゾエリヒア　コリ　ＴＣＨ２０１（ＦＥＢ
Ｍ　　Ｐ−７９２４）から分離調製し几。

（２）　　プラスミド　ｐＵＢ　１１０の調製プラスミ
ド　ｐＵＢＩＩＯ（ＡＴＣＣ３７０１５）は、グリッガ
ン（ｇｒｙｃｚａｎ　）らの方法〔ジャーナルオプ　バ
クテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）　。

Ｖｏｌ、１３４，３１８〜３２９　（１９７８年）〕か
ら分離、調製し友。

（３）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実施例２−（１１で調製し九耐熱性ボＩＪ、＜プチド
遺伝子を含む組換えＤＮＡ　　ｐＴＣＨ２０１に対して
、制限酵素］：ｃｏＲＩお工びＸｂａ　Ｉ　を同時に作
用させ完全に切断し友。

一方、実施例２−（２＋で調製し之プラスミドｐＵＢ１
１０に対して、制限酵素ＥＣＯＲＩお工びＸｂａ＋を同
様に作用させ完全に切断した。

両断片の結合は、Ｔ、ＤＮＡ　ＩＪガーゼを用いて、実
施例１−＋３１と同様に作用させ組換えＤＮＡｔ作製し
次。

（４）組換えＤＮＡのバチルス　ズブチリスへの導入 宿主微生物として、アミラーゼ産生能金欠いているノＺ
チルス　ズブチリス　７１５Ａ　を用い友。

本微生物をプレイン　／・−ト　　インフュージョン培
地で２８℃、５時間培養し集菌し之後、ゾエ−７７−（
５ｃｈａｅｆｆｅｒ　）等の方法〔プロン−ディング　
オプ　ザ　す／ヨナル　アカデミ−オブ　サイエンンズ
　オブ　ザ　エナイテッドステイツ　オプ　アメリカ（
ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ
　ｏｆ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅ
ｒｉｃａ　）　、　Ｖｏｌ、　７３．２）５１〜２）５
５（１９７，６年）〕に準じてプロトプラスト懸濁液を
調製し之。

水液に、実施例２−Ｊ３１で調製し次組換えＤＮＡを加
え、関口等の方法〔アグリカルチュラルアンド　バイオ
ロジカル　ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　
ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
　。

Ｖｏｌ、４６．１６１７〜１６２）　（１９８２年）〕
に準じて形質転換を行った後、ＨＣＰ培地に抗生物質カ
ナアイノン２５０μＳＦ／ｍｊ　ｔ−含有し、かつ澱粉
１０〜／−を含有するアガー平板培地上に拡げ、２８℃
、７２時間保ち、コロニーを形成させ念。

以後、実施例１−＋４）の方法に臨じて耐熱性ポリペプ
チド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されている形質転
換微生物を選択し次。本微生物の一菌株をバチルス　ズ
プチｌＪスＴＣＵ２）１（ＦＥＢＭ　　Ｐ−７９２７）
と命名し、これが保有する組羨えＤＮＡをｐＴＣＵ２）
１と命名し几。

組換えＤＮＡ　　ｐＴｃＵ２）１について、バチルスス
テ１０サーモフィラス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地
図全第２図に示す、第２図から明らかな工うに、制限酵
素Ｐｖｕ　Ｉ［、Ｋｐｎ　Ｉ　、　Ｈｉｎｄ　１で切断
？受けることが判明した。

一方、制限酵素ＥＣＯＲ［、Ｂ＆ｍｆ（Ｉ　、　ｐｓｔ
　ｌ、ＸｈＯＩ　、　Ｂｇｉ　Ｉｆ、Ａｃｃ　［、Ｘｂ
ａ　Ｉでは切断さｎなかった。

実施例３　バチルス　ステアミサーモフィラス由来ポリ
ペプチドのＮ末端金含有した部 分アミノ酸配列 ｆｌ＋　　ポリペプチドの調製 バチルス　ステアロテーモフイ−ｙｘ　　ＦＥＲＭＰ−
２２２５ｔ−１実施例５に示す方法と同様にして液体培
養し、培地中にポリペプチドを産生させ友。遠心分離に
て上清を採取し、硫安塩析に：９ポリペプチド画分を得
、次いで、陰イオン交換体カラムクロマトグラフィー（
東洋１達株式会社製造、商品名　ＤＥＡＥ・トヨパール
　６５０使用）、タロマド７オーカノ７ング法（ファル
マンア社製造、商品名　Ｍｏｗ　Ｐ使用）により精製し
て、高度に精製され之ポリペプチド全採取し友。

水晶は、ケイ　ウェーパー　アンド　エムオズボ−７（
Ｋ、Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｑｓｂｏｒｎ　）、ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　（’ｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　）＋　Ｖｏｌ、２４４゜４４０６　（＋９
６９年）の記載に準じて行つ友ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で７０　、０００±１０．０００の
分子量を示し比。

ま九、比活性は、２００±３０単位／キ蛋白質？示し飢 （２）Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列実施例３−（
ｔｌの方法で調製したポリペプチド全、気相プロティン
　シークエンサー（アプライドバイオシステム社製造、
商品名　４７０Ａ型）にかけ、次いで、高速液体クロマ
トグラフィーにより分析して、Ｎ末端を含有する部分ア
ミノ酸配列を決定し九。

結果は、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌａｕ−Ａｓｎ−Ｌ
Ｉｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒの配列を有し
ていることが判明した。

実Ｍ例４　　バチルス　ステアロサーモフィラス由来ポ
リペプチド遺伝子の塩基配列お： びポリペプチドのアミノ酸配列 ｉｌ＋　　プラスミド　ｐＵｃ１８の調製プラスミド　
ｐｔｒｃ　ｔｓは、これを導入しｔエンノエリヒア　コ
リ　ＪＭ　８３　（Ａ、ＴＣＣ３５６０７）から、実施
例１−＋２）の方法に準じて調製した。

（２）　　ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作
製実施例１−＋３１の方法に準じて組換えＤＮＡｔ作製
した。

即ち、実施例２−＋３１の方法で調製し几ポリペブチド
遺伝子金含む断片に、更に、各種制限酵素を作用させて
切断し、ま之、実施例４−＋１１の方法で調製したプラ
スミド　ｐＵｃ１８に同様に各種制限酵素で切断し、こ
れら両断片にＴ４Ｄ　Ａ　Ｎ　ＩＪガーゼを作用させて
組換えＤＮＡ’に作製しに０ （３）　　組換えＤＮＡのエツシエリヒア　コリへの導
入宿主微生物として、エノシエリヒア　コリＪＭ８８ｔ
″用い友。

この微生物に、実施例１−＋４）の方法に皐じて、組換
えＤＮＡｔ−移入し、形質転換させた。

次イ’ｔ”、　５−７’ロモー４−クロロ−３−インド
リル−β−ガラクトシド（５−ｂｒｏｍｏ　−４−ｃｈ
ｌｏｒｏ　−３−１ｎｄｏｌｙ−β−ｇａｌａｃｔｏｓ
ｉｄｅ　ｏｒ　Ｘｇａｌ　）を含有する培地に生育させ
、無色のプラークを形成した微生物を形質転換微生物と
して選択した。

（４）　　形質転換微生物からの組換えＤＮＡの調製形
質転換微生物音、抗生物質アンピアリン５０μｆ／ｄｆ
含むＬ−培地で培養し、得られる菌体からアルカリ溶菌
法に工り組換えＤＮＡｔ調製した。

（５）　　組換えＤＮＡの塩基配列 ジデオキン　チェー／ターミネータ法に従って解読した
。

すなわち、実施例４−＋４）で調製し次組換えＤＮＡと
合成プライマー（１７塩基）を加え、６０℃で２０分間
アニーリングした後、ｄＮＴＰ、　ｄｄＮＴＰ〔αＴ　
”Ｐ　）　ｄＣＴＰお工びクレノー断片を加え、３７℃
で３０分間反応させ、プライマー上５′側から３′方向
へ伸長させて相補ＤＮＡｔ−生成させ比。

これに過剰のｄＮＴＰ　ｔ−加えて、さらに３７℃で３
０分間反応させｔ後、ホルムアミド色素溶液を加えて反
応を停止させ比。次いで、′３分間煮沸し、これを６チ
ポリアクリルアミドゲルを用いて、約２，０ＯＯＶ、約
２５　ｍＡで電気泳動し、伸長した相補ＤＮＡｋ分離し
た。電気泳動しｔ後、ゲルを固定し乾燥させ几。

本ゲルを用いて、オートラジオグ２フィー？行ない、オ
ートラジオグラム上の塩基断片の／−フェンス解析を行
ってポリペプチド遺伝子の塩基配列を決定した。

その結果は、第１−１表に示した。

また、それの５′側の上流に続くングナルペプチド遺伝
子の塩基配列も同様にして調べた。

その結果は、第１−２表に示した。

（６）　　ポリペプチドのアミノ酸配列第１−１表の塩
基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列全決定し
、その結果全第２−１表に示し次。

まｔｌそれのＮ末端側の上流に続くングナルペプチドの
アミノ酸配列を決定し、その結果全第２−２表に示した
。

以上の結果から、バチルス　ステアロサーモフィラス由
来ポリペプチドのアミノ酸配列は、第２−１表の配列含
有していることが明らかになり几。

ロ、ζ ← ←　　　　　ゝ　　　　　　　　　ロー仁く　　　　　
　　　　　　　　　　　　−υ−←　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ｆ１０益北ミ市３ココ
ココ具井社＝屈３駐ヨ市月〒−ロー＋ニー＼０へ０フー
〇弓偽−−へ輻噴匂；−一；−φ＞ｊ４）ｔ＋６−１１
ＬＩ為 一：２’２２：ＡＧ：：ａ、、Ｇ：ｉ’：ｔ’Ａ’ｉ”
−２−ｏ−−ｘ＞ｔｓｘ−′：、数２Σ社ミ起；モ豚Ｉ
：工士数ニョｔ５〉蛸−−−り一〉＜Ｉト←−」＜」ζ
Ｌ’Ｊζ＞Ｌ（Ｈ２り＝詫テ計３シ肚ご８８９３吐北８
Ｘ工 く←く」←＜−」Ｌｉ−Ｃ：←く一一哨０←口←ａ＜ｗ
ａ−−−ｋ　Ｃｌ−ｃ　ｔ）　Ｏ−ａｌ　Ｆ　ＣＬ　Ｌ
　’＞　＞　ＯＬ　＞　Ｖ＋　４）１／１４）３−　ａ
−ａ−５Ｆニー；−エエ兵エニ；ε＝；水ＧＧｅごＧ二
ま竺＝二”Ａ２＜＠＜＞ｅＬ　ｌ−）？　ＩＱ　４Ｊ　
４　ｅ　Ｏ−′ｔ）　Ｏ’：Ｉゝ５”１あほま浅；会話
−兵Ｇご：＜（Ｗｉ：と二Ｇ二＝；。８イ＜＜ｈｘｘｅ
−＜ａの４）ａ、糎ａｌｌ−−φ０υαコーｅｆＬｔｌ
らυαＶ−幅ららａｃｂｇ２，５：：、、共ｔ＝；爬数
＝社３（２２：；−：　３４観　　。、ニー１　＆、　
％　−＋　−ａ　ｐニー、２．い。８、−７工、２４−
０゜２い一４）＋４弓づ−い弓二Ａ−Ｌ−４−−弓一蛸
Ｑ句−１１−（＞　Ｖｒζ＞＞＜＜＞←←＝＜　−Ｃ：
ｊ　ＬＪ　）　＜　（ＣＩ’ｌ　哨：ｅ　：）（Ｌ　（
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；−椰＞Ｉ＋１：的島的０−一ら＝らりＣＣ−コｃ＝ｏ
山りλｉＳ士＝；＝Ｇ忙ご銭Ｇμ＝２８止ｔコーＧ二の
ｅ　−ｔ　＞　＞　＝　：、　ｂ　４）幅−；；；笥−
一偽；λ−Ｑ−λ−−αＢＧＧ二Ｃｉ　；　Ｌ２ニアｉ
　５拐Ｈ’ｊ　’Ｌ　：ｌＣＤ　Ｅよ＝＝ざよβ；“二
二七ミミ；目二且：二七−北■＝；；吐；且（ｊ−Ｃｎ
ｕ　Ｉ−＞　Ｆ　Ｑ−＝１−　＜　（ｕ　（ｕ　＞　−
＋６　ＣＩ’ｌ　Ｕ　Ｘ　＞　ｒＪ←Ｉ−＋１ＩＩＩ：
ＯＩ＋蔦口づＯ−町為偽しニーＲ：　ｊ　；劉ζＣシ；
−−−−Ｉ−）１−ａ　Ｌ、−ｈ−。ニー哨−〇−−ｈ
　−１１ＬＩ　−ｍ　ｌ−−’−瞬Ｏ飄υ（ロー←り−
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ｌ　−（０−（０−ｍ　Ｃｏ　−Ｗ　−１４７−ｕ　−
（０−＊　−Ｃｏ−ｅ−ｅ　−４０−の−１″ψトの已
＝ユＱ：ａ：ｅ：　；　ｔ；４　ｚ起宮＝呂；＝；翼さ
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〇−−Ｌ＋−一−い喰い≦−−為二υ−←口φｌｊ　−
（Ｌ　Ｌ　Ｕ　：＞　＜　（（＞　）−←こ哨−瓢ΦＩ
−Ｉ′１ｌ−Ｎ−４−ローｐＵ４Ｊ弓へ一鳥Ｖ２Ｈ：Ａ
７ｔ４Ｇ＝＝二−二二社二；＝二ご＝ご２七〇：ｇｉ、
、ご二七閥「ミ貼工七ミロζψ偽く−りｃｐａ蛸−くく
←−←乙り一栃　　８言１ご１女目七二大ｇ＝；ごばあ
’（’Ｉ　　　Ｌ（＞−ロ〉！＋ズ偏くくりｔｔｓ＜＞
ａイ←も１：　Ｉニー１４−２　＞　Ｏ−）％　：ｌｌ
＋　−＋　１−１−１−　：：　ＨＯＧ　＋−；２；ミ
モにＧ；；よ＝ρ至とざ兵 １ｔΣ；工５は七吐二■ｌヨ＝；詫は −＜−＞−ｕ＜＞＞口←く蛸−に−Ｃ：Ｊ　＜　：＞φ
←くφ龜ら−へ一≧哨らレー＊−帽−〇−山一一！−ｂ
　ｌｌ’ｌ　ＩＪ　ｎ　（１−１−硝二←＊　＋６−ａ
　＞　Ｉ：４）ψλ−味　　（←くりくり（＝＜←〉ζ
〉く←乙ｃＱ＜←（玉託ξ酷話市本５北ｍＥ本ξ １−　Ｈ＞Ｉ：１−−２０１−４）　Ｕ　＆−ａ口α口
ら噴１ら、ｘ；ｌ：Ｇ２こ；ざ＝＝を二＝ｔ；；と二二
＝；起１詫二Σモ＝５二＝２２エエは； 哨りＬ哨←Ｃ（−〉−クー＜＞ａりｍ−＜〉実施例５　
形質転換微生物によるポリペプチドの調製 バチルス　ステアロサーモフィラス由来の耐熱性ポリペ
プチド遺伝子を含む組換えＤＮＡｔ−導入し友形質転換
微生物エンシエリヒア　；すＴＣｔ（２０１（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−７９２４）およびバチルスズブチリス　ＴＣＵ
２）１（ＦＥＢＭ　　Ｐ−７９２７’）ｒ用いてポリペ
プチド金調裏しに０ また、これら形質転換微生物と宿主微生物ならびに供与
体微生物バチルス　ステアロサーモフィラスの産生ずる
ポリペプチド産生量をその活性で比較し友。

液体培地は、コーンステイープリカー１．ＯＷ／ｖチ、
硫酸アンモニウム　Ｑ、１ｗ／ｖ％、炭酸カル／ラム１
、Ｑｗ／ｖチ、澱粉１ｗ／ｖチお工び水からなり、ｐＨ
７，２に調製して１２０℃で２０分間滅菌し、冷却して
調製し友。エツシェリヒア　コリＴＣＨ２０１の場合に
は、この培地に、抗生物質アンピシリ／をｄ当り５０μ
？の割合で加えて植菌し、またエノ７エリヒア　コリ　
ＨＢ　１０１の場合には抗生物質音訓えずに植菌し、そ
れぞれ３７℃、４８時間通気攪拌培養し友。

マタ、バチルス　ズブチリス　ＴＣＵ　２）１６！Ｉｎ
合には、前記液体培地に抗生物質カナマイ７ン１＆：Ｗ
ｔ当り５μｔの割合で加えて植菌し、４）ｔ、バチルス
　ズブチリス　７１５Ａの場合には抗生物質を加えずに
植菌し、それぞれ２８′Ｃで７２時間培養し友。

また、バチルス　ステアミサーモフィラスＦＥＲＭ−Ｐ
　＆２２２５の場合には、前記液体培地に抗生物質を加
えることなく、５０で４８時間培養し次。各培養液を、
遠心分離し、上清と菌体とに分離し、上清はそのまま活
性１１１１１定し、菌体は超音波処理にて破壊し比後活
性測定し、培養液量に換算して活性を求めた。結果は、
第３表に示す。

第　　　３　　　表 第３表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しており、工業的生産方法
として好都合である。

ま之、これら上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペ
プチド剤を調製、採取した。このポリペプチド剤金用い
て、澱粉からスクロースへの糖転移量、澱粉からのシク
ロデキストリン生成量、シクロデキストリンα、β、ｒ
の生成比率、至適温度、至適ｐＨ１安定温度、安定ｐＨ
などの酵素的性質について比較し九ところ、形質転換微
生物のポリペプチドは、供与体微生物ノ（チルス　ステ
アロサーモフィラスのそれと工〈一致し九。

実施例６　バチルス　マセランス　ポリペプチド遺伝子
のエン７エリヒア　コリへのク ローニング ＋１１　　バチルス　マセランスのポリペプチド遺伝子
を含む染色体ＤＮＡの調製 バチルス　マセランスのポリペプチド遺伝子を含む染色
体ＤＮＡは、バチルス　マセランス１７Ａｔ−２８℃で
培養した以外は、実施例ｉ　−ｔｔ＋の方法に単じて調
製し友。

゛（２）ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製
実施例６−ＣＩ＋で調製し次バチルス　マセランス由来
のポリペプチド遺伝子を含む精製染色体ＤＮＡに対して
、制限酵素［１ｎｄｌ（株式会社日本ジーン製造）を作
用させ、実施例１−（３）と同様に部分的に切断し友。

一方、実施例１−１２）の方法で調製したプラスミド　
ｐＢＲ３２２に対して、制限酵素）（ｉｎｄｌ　　’ｃ
作用させ、完全に切断し、次いで、実施例１−（３）で
述べた方法で５′末端の脱リン酸化を行ない、更に両断
片の結合を、実施例１−＋３１の方法に準じて行ない、
組換えＤＮＡｔ−作製し次。

（３）　　組換えＤＮＡのエン７エリヒア　コリへの導
入宿主微生物として、アミラーゼ産生能金欠いているエ
ン７エリヒア　コリ　ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６
９４）　を用いて、実施例１−＋４）の方法に準じて、
組換えＤＮＡが導入されている形質転換微生物を選択し
た。この微生物から組換えＤＮＡを取り出し、これに各
種制限酵素を作用させ、その切断部位を決定した後、制
限酵素５ＡＵ３ＡＩ（株式会社ニッポンジーン製造）で
部分切断し、一方、実施例１−１２）の方法で得友プラ
スミドｐＢＲ３２２ｆ制限酵素ＢａｍＨ■で完全に切断
した後、実施例１−＋３１と同様に５′末端の脱リン酸
化を行い、更に、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを同様に作用さ
せ、組換えＤＮＡｔ−作製し、実施例１−＋４）の方法
に準じてポリペプチド遺伝子を含む小型の組換えＤＮＡ
ｔ−保有する形質転換微生物全選択し友。

本微生物の一菌株をエン７エリヒア　コリＭＡＩ（２（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９２５）と命名し、これが保有する
組換えＤＮＡｔ−ｐＭＡＨ２と命名した。

組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＩ（２について、バチルスマセ
ランス由来のＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を第３図に
示す。

第３図から明らかな：うに、制限酵素ｐｖｕ　ｔｌ、Ｓ
ａｌ　Ｉ、Ａｖａ　ｌ　（株式会社日本ジーン製造）、
ｐｓｔ　ｌ　（株式会社日本ジーン製造）で切断を受け
ることが判明し友。

一方、制限酵素ＥｃＯＲＩ　％Ｈｉｎｄ　ｌ、Ｋｐｎｌ
。

Ｂａｍｆ（Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｓｍａ　ｌで
は切断され　　　　　　−なかった。

実施例７　バチルス　マセランス　ポリペプチド遺伝子
のバチルス　ズブチリスへのク ローニング ｆｌｌ　　組換えＤＮＡ　　ｐＭＡ）（２の調製組換え
ＤＮＡ　　ｐＭＡＨ２は、実施例１−（２）の方法に準
じてエッシエリヒア　コリ　ＭＡＵ２　（ＦＥＢＭＰ−
７９２５）から分離調製し次。

（２）　　ポリペプチド遺伝子金倉む組換えＤＮＡの作
製実施例７−４）１で調製し几ポリペプチド遺伝子を含
む組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＨ２に対して、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍｆ（Ｉ　’ｃ同時に作用させ完全に
切断した。

一方、実施例２−［２）の方法で調製し次プラスミド　
ｐＵＢｌｌｏに対して、制限酵素ＥｃｏＲＩお工びＢａ
ｍＨＩ　ｋ同時に作用させ完全に切断し友。

両断片の結合は、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを用いて実施例
１−＋３１と同様に作用させ組換えＤＮＡｔ＆：作製し
た。

（３）　　組換えＤＮＡのバチルス　ズブチリスへの導
入宿主微生物として、アミラーゼ産生能を欠いているバ
チルス　ズブチリス　７１５Ａｔ用いて、実施例２−＋
４）の方法に準じて、バチルス　マセランス由来のポリ
ペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡが導入されている形
質転換微生物を選択し友。

本微生物の一菌株をバチルス　ズブチリスＭＡＵ２）０
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７９２６）と命名し、これが保有す
る組換えＤＮＡｔｐＭＡＵ２）０と命名した。

組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＵ２）０について、バチルスマ
セランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図を第４図に
示す。第４図から明らかなように、制限酵素Ｐｖｕ　Ｕ
、Ｓａｌ　Ｉ、　Ａｖａ　Ｉ％Ｐｓｔ　Ｉで切断を受け
ることが判明した。

一方、制限酵素ＥｃｏＲｌ　、　Ｈｉｎｄ　ｌ　、　Ｋ
ｐｎ　Ｉ、ＢａｍＨ［、Ｘｂａ　ｌ　、　Ｘｈｏ　Ｉ　
％Ｓｍａ　Ｉでは切断されなかった。

実施例８　バチルス　マセランス由来ポリペプチドのＮ
末端を含有する部分アミノ酸配 列 ＋１１　　ポリペプチドの調製 バチルス　ズブチリス　ＭＡＵ　２）０　（ＦＥＲＭＰ
−７９２６）　！−１実施例１０に示す方法と同様に液
体培養して培地中にポリペプチドを産生させ友。

次いで、実施例４−ｆｉｌの方法に準じて精製し、きわ
めて高純度のポリペプチドを採取し乏。

水晶は、ＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動法で７０．００
０±１０，０ＯＯＣＩ分子量を示し、比活性２００±３
０単位／岬蛋白質を示した。

（２）Ｎ末端を含有する部分アミノ酸配列実施例８−ｆ
ｉｌの方法で調製したポリペプチドを用いて、実施例３
−（２＋と同様にしてＮ末端金含有する部分アミノ酸配
列を決定し比。

その結果は、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ
−Ｖａｌ　−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔ、’１ｓ−Ｌｌｌｕの
配列を有していることが判明した。

実施例９　バチルス　マセランス由来ポリペプチド遺伝
子の塩基配列およびポリペプチ ドのアミノ酸配列 （１１ポリペプチド遺伝子を含む組換えＤＮＡの作製実
施例４−１３１の方法に準じて組換えＤＮＡｔ−作成し
次。

すなわち、実施例７−＋２）の方法で調製し几ポ＋７　
＜プチド遺伝子を含む断片に、更に各種制限酵素全作用
させて切断し、また、実施例４−＋２）の方法で調製し
たｐＵＣ１８ｋ同様に制限酵素で切断し、これら両断片
ＫＴ４ＤＮＡ！ｊガーゼを作用させて組換えＤＮＡを作
製し友。

（２）　組換えＤＮＡのエッシェリヒア　コリへの導入
宿主微生物として、エッンエリヒア　コリＪＭ３８ｉ用
いて、実施例４−（３＋の方法に単じて組換えＤＮＡ全
移入し、形質転換微生物を選択し九。

（３）　　形質転換微生物からの組換ＤＮＡの調製実施
例４−＋４）の方法に準じて、組換えＤＮＡを調製した
。

（４）組換えＤＮＡの塩基配列 実施例４−（５１の方法に準じて、ポリペプチド遺伝子
の塩基配列ｔ−決定し比。

その結果は、第４−１表に示した。

マ之、それの５′側に続くシグナルペプチド遺伝子の配
列も、同様にして調べ比。

その結果は、第４−２表に示し次。

（５）　　ポリペプチドのアミノ酸配列第４−１表の塩
基配列を用いて、ポリペプチドのアミノ酸配列？決定し
、その結果を第５−１表に示した。

ま之、それのＮ末端側に続く７グナルペプチドのアミノ
酸配列を決定し、その結果を第５−２表に示し九〇 以上の結果から、バチルス　マセランス由来のポリペプ
チドのアミノ酸配列は、第５−１表の配列を有している
ことが明らかになつ几。

なお、第２−１表と第５−１表の結果から、いずれのポ
リペプチドにも共通な部分アミノ酸配列として、 （ａ）　　Ａｓｎ−Ｌ）ｒｓ−１１ａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　。

（ｂ）　　Ｐｒｏ−ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　。

（ｃ）　　Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−
ｚｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ　。

（ｄ）　　ｌ１ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｌｙｒ−Ｇｌ）’−Ｔｈ
ｒ−Ｑｌｕ−Ｑｌｎ−Ｔｙｒ＋１ｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ　、および（ｅ）　　Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ１１Ｌ
−Ｌｅｕ−ＡＩ＆−Ｔｙｒ−Ｇｌｙの配列を有している
ことが判明し、しかも、これら部分アミノ酸配列は、Ｎ
末端側から近い順に（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、（ｄ）、
（ｅ）の部分配列を有していることが判明し友。

≧　　　　　　　　　　　　　　　　　の；；Ｃへ　　
　−一 と ｗ＆ｆ　　　　　　　　　　　　　　派　　　な−＝ Ｍ）ｊニーＪ：的ＡＪ＋亀）Ｊ：Ａムエｈムー為−一；
輻ムム、Ｕキムーい−ｔｒ＋　ａ　ｎ飄ムル＋Ｉ：ｉ−
υ−−飄為一）１咋−１飄Ｑ工島い島（り（−←ＬｒＪ
Ａ＜＜Ｋｎいり←←Ｃ−←（（←←；ζ←く−−Ｊニー
１　＆＋＞↓−ΔムｆＪ＋飄的−−：　ｃ　ｇ−２八ム
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　１＋り乙−一）　Ｉ−ＣＣ！Ｊ←くト←Ｃ実施例１０
　形質転換微生物ＫＬるポリペプチドの調製 バチルス　マセランス由来ポリペプチド遺伝子を含む組
換えＤＮＡ？導入し次形質転換微生物エツジ算すヒア　
コリ　ＭＡｔ（２（ＦＥＢＭＰ−７９２５）およびバチ
ルス　ズブチリス　ＭＡＵ２）０（ＦＥＢＭ　　Ｐ−７
９２６）用いてポリペプチド遺伝子製した。また、これ
ら形質転換微生物と宿主微生物ならびに供与体微生物バ
チルス　マセランスの産生ずるポリペプチド産生量をそ
の活性で比較した。液体培地は実施例５の方法で調製し
九。

エッシエリヒア　コリ　ＭＡＨ２の場合には、この培地
に抗生物質アンピシリンｔ″−当９５０μＶの割合で加
えて植菌し、ｔｅ、エツシエリヒアコＩＪ　　ＨＢＩＯ
Ｉの場合には抗生物質を加えずに植菌し、それぞれ３５
℃で２４時間通気攪拌培養し几。

マ几、バチルス　ズブチリス　ＭＡＵ２）０の場合には
、前記液体培地に抗生物質カナマイシンチー当り５μ２
０割合で加えて植菌し、ま九バチルス　ズブチリス　７
１５Ａの場合には抗生物質？加えず釦植菌し、それぞれ
２８℃、７２時間培養した。

ｆ７ｔ、バチルス　マセランス　１７Ａの場合ニは、前
記液体培地に抗生物質を加えることなく、２８℃で７２
時間培養し比。

各培養液は、実施例５の場合と同様に処理して活性を測
定し友。結果は第６表に示す。

第６表の結果から明らかなごとく、形質転換微生物から
のポリペプチド産生量は向上しており、工業的生産方法
として好適である。

ま几、これら上清を硫安０．６飽和で塩析して粗ポリペ
グチド剤を調製採取し次。

このポリペプチド剤を用いて、実施例５の場合と同様に
各種の酵素的性質について比較し友ところ、形質転換微
生物のポリペプチドは、供与体微生物バチルス　マセラ
ンスのそれと二く一致し九。

発明の効果 上記しｋことがら明らかなように、本発明は、ポリペプ
チドのアミノ酸配列およびそれのシグナルペプチドのア
ミノ酸配列を解明し、また、ポリペプチド産生能を有す
る供与体微生物から生体外遺伝子組換えの技術に工り、
制限酵素Ｐｖｕ　Ｉｆ　Ｋよる切断部位を有するポリペ
プチド遺伝子を含む組換えＤＮＡを作製し、更に、この
組換えＤＮＡｔ−宿主微生物に導入し友形質転換微生物
？得、この物質転換微生物中で組換えＤＮＡが安定かつ
自律的に増殖しつること金見いだし元。

また、本発明は、ポリペプチドを安定供給するという見
地から、より広範な給源を確保するとともにポリペプチ
ド産生量の向上が容易に達成しうろこととなり、その工
業的意義は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換えＤＮＡ　　ｐＴｃＨ２０１について、
バチルス　ステアロサーモフィラス由来Ｄ　Ｎ　Ａｍ分
の制限酵素切断地図を示す。 第２図は、組換えＤＮＡ　　Ｉ）ＴＣＵ２）１について
、バチルス　ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡ部分の
制限酵素切断地図を示す。 第３図は、組換えＤＮＡ　　ＰＭＡＨ２について、バチ
ルス　マセランス由来　ＤＮＡ部分の制限酵素切断地図
を示す。 第４図は、組換えＤＮＡ　　ｐＭＡＵ２）０について、
バチルス　マ七ランス由来ＤＮＡ部分の制限酵素切詰地
図を示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、（ａ
   ）Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
   Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ、（ｂ）Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈ
   ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ
   −Ｌｅｕ、（ｃ）Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａ
   ｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒ
   ｇ−Ｐｈｅ、 （ｄ）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
   ｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
   −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、
   および（ｅ）Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
   −Ｔｙｒ−Ｇｌｙから選ばれる１種以上の配列を有して
   いることを特徴とするシクロマルトデキストリン　グル
   カノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
2. （２）ポリペプチドが、部分アミノ酸配列として、Ｎ末
   端側から近い順に、 （ａ）Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ、（ｂ）Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
   Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｐ
   ｈｅ−Ｌｅｕ、（ｃ）Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ
   −Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
   Ａｒｇ−Ｐｈｅ、 （ｄ）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
   ｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
   −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、
   および（ｅ）Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
   −Ｔｙｒ−Ｇｌｙの配列を有していることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載のシクロマルトデキストリン
   グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
   。
3. （３）ポリペプチドが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法で７０，０００±１０，０００の分子量を
   示すことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２
   項記載のシクロマルトデキストリングルカノトランスフ
   ェラーゼ活性を有するポリペプチド。
4. （４）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分アミ
   ノ酸配列として、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒの配列
   を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項または第３項記載のシクロマルトデキストリン　
   グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
   。
5. （５）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【アミノ
   酸配列があります】 を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項または第４項記載のシクロマルトデキス
   トリン　グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリ
   ペプチド。
6. （６）ポリペプチドが、それが分泌されるためのシグナ
   ルペプチドとして、Ｎ末端側上流に、 −Ｐ【アミノ酸配列があります】のアミノ酸配列を有し
   ていることを特徴とする特許請求の範囲第４項または第
   ５項記載のシクロマルトデキストリン　グルカノトラン
   スフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
7. （７）ポリペプチドが、そのＮ末端を含有する部分アミ
   ノ酸配列として、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓ
   ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕの配列
   を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項または第３項記載のシクロマルトデキストリン　
   グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
   。
8. （８）ポリペプチドが、アミノ酸配列として、【アミノ
   酸配列があります】 を有していることを特徴とする特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項または第７項記載のシクロマルトデキス
   トリン　グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリ
   ペプチド。
9. （９）ポリペプチドが、それが分泌されるためのシグナ
   ルペプチドとして、Ｎ末端側上流に、 【アミノ酸配列があります】のアミノ酸配列を有してい
   ることを特徴とする特許請求の範囲第７項または第８項
   記載のシクロマルトデキストリン　グルカノトランスフ
   ェラーゼ活性を有するポリペプチド。
10. （１０）ポリペプチドが、シクロマルトデキストリン　
    グルカノトランスフェラーゼ産生能を有する微生物由来
    のポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第
    ７項、第８項または第９項記載のシクロマルトデキスト
    リン　グルカノトランスフェラーゼ活性を有するポリペ
    プチド。
11. （１１）ポリペプチドが、バチルス　ステブロサーモフ
    ィラス由来のポリペプチドであることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項ま
    たは第６項記載のシクロマルトデキストリン　グルカノ
    トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
12. （１２）ポリペプチドが、バチルス　マセランス由来の
    ポリペプチドであることを特徴とする特許請求の範囲第
    １項、第２項、第３項、第７項、第８項または第９項記
    載のシクロマルトデキストリン　グルカノトランスフェ
    ラーゼ活性を有するポリペプチド。
13. （１３）ポリペプチドが、シクロマルトデキストリン　
    グルカノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを導入
    した形質転換微生物由来のポリペプチドであることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
    項、第５項、第６項、第７項、第８項または第９項記載
    のシクロマルトデキストリン　グルカノトランスフェラ
    ーゼ活性を有するポリペプチド。