JPS61144561A - 酵素機能電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ピ）産業上の利用分野 この発明は、酵素機能電極、すなわち、電解質中に存在
するグルコース、ガラクトース等のオキシダーゼ酵素の
基質となりうる物質や乳酸。

アルコール、グリセロール等のデヒドロゲナーゼ酵素の
基質となりうる物質の濃度をアンペロナトリブクに測定
する電極に関する。

（ロ）従来技術 最近、酸化還元酵素固定化電極が注目されるようになっ
てきた。この電極は酵素反応器こ対する化学的な電子運
搬体の代わりとして挙動するもので、酵素電極、フロー
システムの検出器。

生物化学的燃料電池、酵素反応器等の新しい用途に使用
できることが提案されている。

そして、この電極のうち、オキシダ°−セ”酵素の基質
となりつる物質の濃度を測定する電極としては、酸素電
極や白金電極等の感応面に酵素固定化膜を積層し、酵素
反応で生じる物質例えば過酸化水素の発生量を測定して
間接的に酵素反応に寄与する基質を定量する方式のもの
がある。

更に、デヒドロゲナーゼ酵素の基質となりうる物質の濃
度を測定する電極としては、ＮＡＤにコチンアミドアデ
ニンジヌ・クレオチド）を酵素と共に固定化したもの、
具体的には■ＮＡＤをアガロースやデキストラン等の高
分子化合物をζ化学結合させｆ：ＮｋＤ−高分子化合物
を酵素と共に適当な基質透過性膜内面にトラップし白金
や黒鉛電極に固定したもの、■基質透過性膜（こＮＡＤ
を直接化学結合させ、この膜内憂こ同時に酵素をトラツ
プして白金や黒鉛電極に固定したもの、■基質透過性膜
に化学処理を施してＮＡＤの透過が生じ難い膜とし、こ
の膜の内面に酵素をトラツプして白金や黒鉛電極に固定
したものがある。

また、上記の電極以外のものとして本件出願人は、昭和
５９年８月３１日に、黒鉛ペースト中に電子受容性化合
物を含有させたペースト状電極と、該ペースト状電極の
表面に固定化されたオキシダーゼ酵素又はデヒドロゲナ
ーゼ酵素及びその外面を被覆するオキシダーゼ酵素又は
デヒロゲナーゼ酵素の基質の透過性薄膜、とから構成さ
れた基質感応部を備えてなるオキシダーゼ電極又はデヒ
ドロゲナーゼ電極を出願している。

ｅ→　発明が解決しようとする問題点 上述した電極のうち、酸素ＷＬ極や白金電極等を用いる
ものは被測定液中の酸素分圧の変動に影響されるという
問題点を有しており、また。

ＮＡＤ　　を酵素と共Ｃζ固定化したものは、ＮＡＤの
漏れ出し等の問題点を有していた。

更に１本件出願人の先願に係る発明では、酵素を固定化
する電極は黒鉛ペースト電極−こ限られている。

に）問題点を解決するための手段 この発明は、被測定液中の酸素分圧の変動に影響されず
、また、電極材料も黒鉛ペーストに限定されない等を目
的としてなされたもので。

その構成は、固定化酵素層での基質の変化を電子運搬体
を介して電極へ伝達する酵素機能電極において、電子運
搬体が固定化酵素層に常に一定濃度で供給されるように
電子運搬体の貯蔵層を固定化酵素層に接して設けたこと
を特徴とする。

電子運搬体の貯ａ層としては１例えば多孔質電極のすき
間に電子運搬体を倉浸しｔこものと。

間隙を有する金属ミニグリヴド電極上に電子運搬体をペ
ースト状、ゲル状にして接触させたものがある。

（ホ）作用 この発明の電極では、電子運搬体の貯蔵層から電子運搬
体が徐々に溶は出し固定化酵素層に供給されて、固定化
酵素層と１ｉｌ極との間の電子授受を仲介する。

（へ）実施例 以下に、この発明の実施例について説明する。

実施例１ （電子運搬体含浸多孔質電極） まず９ｗｔ子運搬体の貯蔵層として多孔質電極のすき間
に電子運搬体を含浸させたものを使用する酵素機能電極
について説明する。

（Ａ）　　電極の作製 次に述べるのはグルコース測定用の電極をｆ′Ｔ−製す
る場合の一実施例である。

試薬 ０グルコースオキシダーゼ（Ｃ０Ｄ）・−・・・・・・
・・・・Ｔｙｐｅｌ、シグマ社製（アスベリギルス。

ニガー由来のＦＣｌ、１．３・４） ｏｐ−ベンゾキノン（ＢＱ）・・・・・・和光紬薬社製
（使用前に昇華して精製） ０コロジオン液（５％）・−・・・・・・・和光紬薬社
製 ０流動パラフイン・・・・・・・・・・・・・・・・・
・メルク社製電極社料 Ｏ多孔質グラファイト板・・・・・・ＲＶＣ２Ｘ　１−
１００、ＩＮＦ　　ケモトロニクス社 マス、多孔質グラファイト板からコルクポーラ−で直径
３．４　ｍ　ｍの円柱を切り抜きその一端に伝導性接着
剤を用いてリード線を接続し７：、接着面は溶媒の浸入
を防ぐため全面にエポキシ接着剤を塗布し、同時Ｇζ内
径３．４　ｍ　ｍのガラス管に接着した。その上から熱
収縮チューブを用いて電極側面の絶縁と電極固定を行っ
た。このようＧζして調製された多孔質電極の大円に、
キノン含有物を含浸させ貯蔵層ｆｔ（キノン含浸多孔質
電極片作製した。キノン含有物はＰ−ベンゾキノン４ｏ
ｍｇｔ流動パラフィン０．３ｍｅとめのう乳鉢上で混合
することにより調整した。

次１．’　テＣＯＤ　（１ｍｇ／ｍｅ１１０μｅを貯蔵
層（キノン含浸多孔質電極）表面上にのせ水を蒸発させ
た。その後、ナイロンネットで表面をおおい、２０μｅ
コロジオン−エタノール（容量比１：４）混液を流延、
乾燥させ電極表面にニトロセルロース薄膜を形成した。

ナイロンネットはパラフィルムで電極に固定し、その際
ナイロンネットの電極表面以外の部分はグリースを塗布
した。

以上のようにして得られたグルコースは測定用の電極（
１）を第１図Ｅこポす。図中（２）は貯蔵層、（３）は
固定化ＧＯＤ　層、（４）はニトロセルロース薄膜、（
５）はリード線（白金線］。

（６）はガラス管、（７）はナイロンネット、（８）は
熱収縮チューブ、（９）は伝導性接着剤、（１旧よエポ
キシ樹脂をそれぞれ示すものである。

なお、この電極（１°）を使用に供するまで蒸留水で数
回洗浄し、ｐＨ５，０の酢酸塩バッファー中に一晩浸漬
保存した。

（Ｂ）　　サイクリックポルタンメトリー上記グルコー
スオキシダーゼ電極についての三極法によるポルタンメ
トリーを行なった。測定条件は以下の通りである。

装置 ０ポテンシヨスタブト（扶桑社製） Ｏ信号発生器（ＨＢ−１０４ｉ北斗電工社製）０対極（
白金板） Ｏ参照電極（飽和カロメル電極］ ０記録計（Ｘ−Ｙレコーダー；横開電機社製）電解質 Ｏ脱酸素したｐ　Ｈ５，０の０．ＩＭ酢酢酸塩バッファ
湿温度・・・・・・・・２５±１℃ Ｏ攪拌速度・・・・・・５００ｒ−９−ｍ結果 この発明の電極を、上記酢酸塩パブファーに浸漬し、　
５ＱｍＶ／ｉの電位走査速度でサイクリックボルタンモ
グラムを記録した。

第２図の実線に示すよう（ζカソード波及びアノード波
についてそれぞｔＮ−０，０７Ｖ及び十０．４０Ｖ（ｖ
ｓ　ＳＣＥ　１　にピークが認められた。サイクリック
な電位走査を更に連続して数時間行なったが電流の減少
は見られなかった。ｐ−ベンゾキノンを含有していない
同様な電極について同様な評価を行なったが第２図の破
線のごとくポルタンメトリックなピークは生じなかった
。　　　　　″このように、ポルタンメトリックなピー
クは、キノン含浸多孔質電極とニトロセルロース薄膜と
の境界領域（こ貯蔵層から桜肉したｐ−ベンゾキノンの
電気化学的な還元及び再酸化反応に基づいておりｐ−ベ
ンゾキノンが電子運搬体として作用していることが判明
した。

（Ｃ）　　グルコースの電気触媒的酸化ｐ−ベンゾキノ
ンの酸化還元電位より電位を十分正（ＦＪ＝＋〇、５Ｖ
ｖｓ、　ｋｇ／ｋｇｃＩ２）　ｌζ設定し上記パブファ
ー中にグルコースヲ順次濃度を増加させて（０−１００
ｍＭ　］添加し。

ヘースからの電流の増加を測定した。この結果を第３図
に示す。

この結果よりこの発明の電極がグルコース濃度の微小な
変化にも対応できグルコース測定用の１！ＩＬ極として
有用なことが判明しＴこ。

なお９以上の説明では、貯蔵層に用いるキノン含有物と
してｐ−ベンゾキノンと流動パラフィンを混合しｔこも
のについてだけ説明したが、これ以外でも勿論よく下表
に示すもの表 でも同様な結果が得られることが確かめられた。

まＴコ、貯蔵層に用いる電子運搬体もＰ−ベンゾキノン
に限られずフェリシアン化カリウム、ジブロモイドサリ
シリツクアシブド、ジクロロフェニールインドフェノー
ル（ＤＣＩＰ）よい。

更に上述の電極はグルコース測定用の電極とができる。

その酵素／基質の組合せとしでは、γルコールデヒドロ
ゲナーセ／エタノール、グルコースデヒドロゲナーセ／
グルコース、グルタメートデヒドロゲナーゼ／グルタミ
ン酸、乳酸デヒドロゲナーゼ／乳酸、グリセロールデヒ
ドロゲナーセ／グリセロール、カラクトースオキシダー
セ／ガラクトース、アルコールオキシダーゼ／エタノー
ル、コレステロールオキシダーゼ／コレステロール、ア
ミノ酸オキシダーゼ／アミノ酸、尿酸オキシダーゼ／尿
酸等が挙げられる。

実施例２ （電子運搬体接触１ニゲリツド電極） 電子運搬体の貯蔵層として間隙を有する金属ミニグリッ
ド電極上に電子運搬体をペースト状、ゲル状にして接触
させたものを使用する酵素機能電極について説明する。

込）　電極の作製 次に述べるのはグルコース測定用の電極を作製する場合
の一実施例である。

試薬は実施例１と同じものを使用した。

電極材料 ０金ミニグリツド電極・・・・・・５００１ｐ　；バブ
クビーメアーズ社製 まず５００ｆｆ１ｇグラファイト粉末憂こ０．３ｍｅ流
動パラフィンを加え乳鉢上で混合し、さらに４０ｍｇの
Ｐ−ベンゾキノンを加え均一に混合した。これを内径３
．４ｍｍのガラス管に充てんし表面をワックスペーパー
上で平滑にし貯蔵層を作製した。次いで、貯蔵層上にＧ
ＯＤ　液（ｌｒｒ＋＄／ｍｊ７１を１０μ！のせ溶媒を
蒸発させた後、金ミニグリッド電極をのせナイロンネッ
トで固定した。ナイロンネットはパラフィルムで固定し
た。更に、ナイロンネブトの上から、金Ｅニゲリッド電
極上にＣＯＤ　液（１ｍｇ／ｍ／）を１０μｅのせ溶媒
を蒸発させた。そしテ、ソの上かう、コロジオン−エタ
ノール液（１：４）ｔ２０μｅのせ乾燥させてから、伏
導性接着剤でミニグリブト電極とリード線の接続を行い
第４図の電極（１１）を得た。

図中、第１図と同じものには同じ番号が付しである。（
１２は貯蔵層１口３は金ミニグリッド電極、　Ｑ４１は
コロジオン膜である。

なお、この電極ｌを使用に供するまでの保存は実施例１
と同様である。

（Ｂ）　　サイクリックポルタンメトリー実施例１と同
様の測定条件でサイクリックポルタンメトリーを行っ１
こところ第５図の結果ｌｔ得た。第５図に示す如くこの
実施例ｆこ係る電極においても貯蔵層からＰ−ベンゾキ
ノンが桜肉して電子運搬体として作用して０ることが判
明した。

Ｃ）　グルコースの電気触媒的酸化 実ＭＡ例１と同様にバブファー中にり°ルコースを順次
濃度を増加させて添加しベース力）らの電流の増加を測
定した。

この結果を第６固着こ示す。この結果より。

上述の電極がグルコース濃度の微小な変化Ｇζも対応で
き、グルコース測定用の電極として有用なことが判明し
た。

なお９以上の説明では、貯蔵層としてＰ−ベンゾキノン
をペースト状にしたものを用（することだけ説明が、こ
れ以外でも勿論よく１例えば［Ｆ］ Ｐ−ベンゾキノンをゲルオールＤで調整し１こキノンゲ
ルでも同様な結果が得られた。

また、ｇ極阿料も並ミニグリブト電極（こ限定されず、
白金ミニグリッド電極など全ての金属ミニグリッド電極
が使用できる。

更ｆこ、貯蔵層に用いる電子運搬体がＰ−ベンゾキノン
に限定されないこと、グルコース測定以外の電極にも作
製できることは実施例１と同様である。

なお、電極全体の構成も実施例１．実施例２のものに限
定されず１例えば炭素繊維、グラブンーカーボングレイ
ン（東海電極製）、６０〜１００メツシユのビーズを束
ねたものの間に電子運搬体をつめて貯蔵層を作製し、こ
の表面に酵素を固定化させても同様な作用を示す電極が
できる。

（０効果 この発明の酵素機能電極は、被測定溶液中に他のいかな
る電子運搬体を加えることなくグルコース、エタノール
等の基質に対する大きな電流応答を示すという効果を有
するとともに、電極は料も任意のものが選択できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、電子運搬体含浸多孔質電極の一実施例、第２
図は第１図の電極を用いてバッファー中でサイクリック
ポルタンメトリーを行っ１こ図、第３図は、第１（２）
の電極を用いてグルコース応答を測定して作成した検量
線、２官４図は電子運撥体接触ミニグリッド電極の一実
施例、第５図は第４図の電ｉｔ用いてバッファー中でサ
イクリックポルタンメトリーを行った図、第６図は＠４
図の電極を用いてグルコース応答を測定して作成した検
量線である。 ２．１２・・・・・・貯蔵、１　３・・・・・・面定化
ＧＯＤ層５・・・・・・リード線　　６・−・・・・ガ
ラス管１３・・・・・・ミニグリブト電極 ・Ｉｔ−＋、ｊ、’−Ｊ 電　ンｆｆ１−イｆ１２／ンｌＡ °１覧７Ｗ、、イ直　、／ン屹４ 泄呻→

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、固定化酵素層での基質の変化を電子運搬体を介して
   電極へ伝達する酵素機能電極において、電子運搬体が固
   定化酵素層に常に一定濃度で供給されるように電子運搬
   体の貯蔵層を固定化酵素層に接して設けたことを特徴と
   する酵素機能電極。