JPS611622A - 細胞毒性複合体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）　　産業上の利用分野 本発明は新規な細胞毒性複合体とその製造法に関する。

更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的細胞という）の
もつ特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン、
あるいはその抗原結合部位を含むフラグメントからなる
構成部分と、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミ
ンからなる構成部分を有する、新規な細胞毒性複合体と
その製造法に関するものである。本発明で得られる細胞
毒性複合体は、例えば、ガン細胞に選択的に作用を発現
する抗腫瘍剤として有用である。

（ｂ）　　従来技術 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的として、そ
の標的細胞と特異的に結合しうる免疫グロブリンを種々
の細胞毒性物質と結合させる試みがなされてきた。例え
ば、免疫グープリン１ｌＣｐ−ジ（２−りｐロエチル）
アミ７−Ｌ−フェニルアラニン認を結合した複合体（特
開昭５ｌ−６１６４０）ｌ免疫グロブリンにメトトレキ
セート等を結合した複合体（４ｉ開昭５６−６５８２９
）ｌ免疫グロブリンにクロラムプシル等を結合した複合
体（特開昭５６　６５８２８）＋免疫グロブリンにマイ
トマイシン−Ｃ等を結合した複合体（特開昭−５５−９
２３２５）ｌ免疫グロブリンにダウノマイシンを結合し
た複合体（特開＠５ｌ−１４４７２３）等が知られてい
る。

（ｃ）　　発明が解決しようとする問題１粍これらの方
法で得られた細胞毒性複合体は、ガン細胞と選択的に結
合しガン細胞に毒性を発揮することが期待されるもので
あり、非常に興味のある複合体である。しかしながら細
胞毒性物質を直接抗体に結合する場合は、免疫グープリ
ンに多数の細胞毒性物質を結合すると、抗体の抗原ｇ識
活性が低下してしまうので、かかる困難を回避するため
には、少数の細胞毒性物質を結合するにととめざるをえ
ない。

（ｄ）　　問題点を解決するための手段本発明者等は、
かかる先行技術の欠点を解決すべく鋭意研究を行なった
結果、先ず血清アルブミンに多数の細胞毒性物質を結合
せしめ、然る後かかる細胞ｌＩ性物質を結合せしめた血
清アルブミン（細胞毒性部）を免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントと結合せしめれば、抗体活性を損うこと
なく多数の細胞毒性物質を結合した免疫グープリン−細
胞毒性物質複合体を製造し得ることを見い出して本発明
に到達した。

すなわち、本発“明は殺すべき細胞のもっている特定の
抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントと、血清アルブミンの分子１個当り細胞毒性
物質が３１〜６０個結合してなる細胞毒性部とが、血清
アルブミン中の硫黄原子を介して結合せしめられてなる
細胞毒性複合体に関するものである。

本発明において、殺すべき細胞のもっている特定の抗原
と特異的に結合しうる免疫グープリン（細胞毒性蛋白複
合体の誘導部）とは次のようなものである。腫瘍細胞あ
るいは特定のリンパ球等の標的細胞あるいはそれらを含
む組絨で免疫されたヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒ
ツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウ
ス等の動物がら分離された抗血清より、エタノール分画
、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラムクルマド
グラフィー等の公知の手段によって１１１Ｍされる免疫
グロブリン、あるいは標的細胞で免疫した動物より採取
された抗体産生細胞を発癌性のある物質で癌化させたり
、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ処したり
することＫよって得られるモノクルーナルな抗体をいう
。また標的細胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤
等で分離して得られる、標的細胞に特異的な免疫グロブ
リンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。

免疫グロブリンにはＩｇＧ　＋　ＩｇＡ　＋　ＩｇＭ　
＋ＩｇＤ　＋　ＩｇＥの５つのクラスが知られており、
さらに各クラスはい（つかのサブクラスから成っている
ことが知られている。しかし、その基本構造は、２本の
重鎮と２本の軽鎖とから成る点、また抗原結合活性をも
つＦａｂ部分とエフェクター活性をもつＦｃ部分から成
る点において一致している。ただし、ＩｇＭは５量体＊
　ＩｇＡは一部２量体で存在する。

細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グロブリン
分子全体を用いてもよいが、その抗原結合部位を含むが
、Ｆｃ部分をもたないフラグメントを用いてもよい。Ｆ
ｃ部分を含む複合体にあっては、Ｆｃ部分による標的細
胞以外の細胞に対する非特異的吸着及び細胞膜上のＦＣ
Ｃリブターとの結合が起こり、細胞毒性蛋白複合体の殺
すべき細胞に対する選択性が減じることがあり、また免
疫グロブリンがヒトにとって異種蛋白である場合、その
抗原性は、Ｆｃ部分において特に強いので、蛋白複合体
の抗原性を低下させるために、Ｆｃ部分のない免疫グロ
ブリンのフラグメントが、細胞毒性蛋白複合体の誘導部
として望ましいことがある。一般に、免疫グロブリンを
パパイン（ｐａｐａｉｎ）　＋　）リブシン（ｔｒｙｐ
ｓｉｎ）　＋キモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓ　
ｉｎ）　＋プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）等の蛋白分解
酵素で分解すると、抗原結合部分を１つもつ、いわゆる
Ｆａｂフラグメントが得られる。またペプシン（ｐｅｐ
ｓｉｎ）分解９条件によってはトリプシン分解によって
も抗原結合部分を２つもつ、いわゆるＦ　（ａ　ｂ’）
２フラグメントが得られる。このフラグメントはさらに
メルカプタンで処理すると、−価のＦａｂ’フラｌメン
トになる。さらに免蛋グｐプリンを変性させつつ分解さ
せると抗原結合部分（バリ７プル・リージョン　ｖａｒ
ｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ　）のみが得られる。免疫グ
ロブリン及び免疫グロブリン由来の例えば上記のフラグ
メントは、免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラ
スであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部として
用いることもできる。

本発明の細胞毒性複合体の他方の成分は、細胞毒性部、
即ち、細胞毒性物質を結合せしめた血清アルブミンであ
るが、かかる細胞毒性物質の押体となる血清アルブミン
としては人及び各種の動物の崩清アルズミンが用いられ
るが、特に好ましくは人及び牛の血清アルブミンである
。また血清アルブミンに結合される細胞毒性物質として
は、例えば各種の抗癌剤が適しているが、特に好ましく
は血清アルブミンの７ミノ基と反応して結合する基を有
する抗癌剤または抗癌剤誘導体であり、その具体例とし
ては、以下の化学式で表わされる化合物を挙げることが
できるが、これらに限られるものではない。

ニドｐンウレ７誘導体 りｐラムブシル誘導体 マイトマイシン−〇誘導体 ダウノマイシン誘導体 Ｉ ５−フルオロ−２′−デオキシウリジン誘導体デスアセ
チルビンブラスチン酸アジド誘導体むＯＮ。

メ））レキセード活性エステル誘導体 アクチノマイシンーＤオキサジノン誘導体本発明の免疫
グルプリンまたはそのフラグメントと、血清アルブミン
の分子１個当り細胞毒性物質が３１〜６０個結合してな
る細胞毒性部とが、血清アルブミン中の硫黄原子を介し
て結合せしめられてなる細胞毒性複合体の中では、その
製造、精製及び活性上、下記式ＣＩ） で表わされる複合体が好ましく、その中でも下記式（Ｉ
Ｉ）または〔■〕 で表わされる複合体が特に好ましい。

上記式ＣＩ）　、、　（［］及び（ｍ）　において、Ｓ
、は）血清アルブミン中の硫＊原子を表わし、シス□ ナインまたはシスチンいずれに由来する硫黄原子であっ
てもよい。

上記式（Ｕ）　Ｋお゛いてｔ、＝０の場合には、Ｓ。

は免疫グルプリンまたはそのフラグメントに由来する硫
黄原子であり、ｔ、＝１の場合には架橋剤により導入さ
れた硫黄原子である。式（Ｉｆ）において１．＝０の場
合には、硫黄原子Ｓ１とＳ、は直接結合しジスルフィド
基を形成する。

一方ｔｓ＝１の場合には、硫黄原子Ｓ１とＳ、は２価の
有機基Ｂ、を介して結合するが、Ｂ、はチオール基と反
応する２個の官能基を有、する架橋剤、例えば下記式（
ＩＸ） （ｎｉは２価の有機基である。〕 で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンに由来する２
価の有機基である。式（ＩＩ）におけるＢ、は、例えば
下記式（Ｘ） Ｘ−８−Ｂ、−Ｃ−Ｙ　　　　　・・・・・・・・・・
・・ＣＸ）ｊ で表わされる架橋剤、下記式（ＸＩ） ＮＨ・ＨＱ で表わされる架橋剤、下記式し■〕 で表わされる架橋剤（２−イミノチオラクトン）下記式
〔■〕 で表わされろ架橋剤（Ｎ−７セチルホモシステイン）、
で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基である。

Ｘで表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ジス
ルフィド基を形成し得る１価の有機基の具体例としては
、例えば２−ビリジ２−ベンゾイミダゾイルチオ基 一フェニルイミノメチルチオ基 Ｂ、またはＢ、で表わされる２価の有機基は、化学的に
不活性であれば特に限定されないが、一般的には分岐を
有するか有しないアルキレン基、フェニレン基等から適
宜選ばれる。Ｙで表わされる活性エステルのアルコール
残基の具体例としては２．４−７ジニトロフエノキシ表
わされるイミドエステルのアルコール残基の具体例とし
てはメトキシ、エトキシ基等を皐げることがでさｒる。

Ｑで表わされるハロゲン原子の具体例としては塩素、臭
素等を挙げることができる。

架橋剤の具体例としては、式ＣＩＸ）で表わされる架橋
剤として、Ｎ、Ｎ’−（１，２−フェニン（１，４−フ
ェニレン）シマレイミド イルアミノ）アゾベンゼン マレイミ　トメチル）エーテル される架橋剤として、Ｎ−サ、クシンイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート。

Ｎ−サクシンイミジル３−　（２１４−ジニトロフェノ
キシ）ズチレートを、式（ＸＩ）で表わされる架橋剤と
して、メチル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンイ
ミデート塩酸塩を挙げることができる。

上記式Ｃ１１ｌ）においてＢ４は、例えば下記式〔■〕
。

で表わされる、マレイミド基を有する架橋剤に由来する
２価の有機基である。Ｂ、で表わされる２価の有機基は
、化学的に不活性であれば４ｉＰＶｃ限定されないが、
一般的には分校を有するか有しない４ルキレン基、フェ
ニレン基等から適宜−ばれる。

〔豆〕□で表わされる架橋剤の具体例としては例えばメ
タ−（Ｎ−マンイミド）安息香酸Ｎ−ヒＦｓ＝キシサク
シンイミドエステル１’　）　安Ｊｉ香酸２，４−ジニ
）ｐフェニルエステル、β−（Ｎ−マレイミド）プｐピ
オンｌｌＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル等を挙
げることができる。

本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンまたはその
フラグメントと、細胞毒性物質を結合せしめた血清アル
ブミンを、血清アルブミン中の硫黄原子を介して結合さ
せること罠より製造することができる。例えば、本発明
の細胞毒性複合体の内式（ｎ−ｉ）で表わされる複何体
は、例えば、発生または導入したチオール基を有する下
記式（ｍＶ） で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
、下記式（Ｖ） ＸＳｒ　　Ａ’　＋ＮＨＣｙ　）ｍ　　　　　・・・・
・・・・・・・・・・・・・・　（Ｖ）で表わされる細
胞毒性物質を結合した活性ジスルフィド基を有する血清
アルブミンを反応せしめるか、または、誘導または導入
した活性ジスルフィド基を有する下記式（Ｖｌ）で表わ
される免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、下記
式〔■〕 Ｈ８＋　　ＡＩ　＋ＮＨＣｙ　）　　　　　・・・・・
・・・・・・・・・・・・・　〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した血清アルブミンを反応せしめること
により製造することかできる。　１ 前記式（ｍＶ）　において、ｔ、＝００場合疋は、式Ｃ
ＩＶ）で表わされる免疫グロブリンまたはそのアラ２メ
ントは、　Ｆａｂ′、ＩｇＭより得られる一量体１　ｇ
Ｍｓによって代表される如くそれ自体チオール基を有す
るか、またはジスルフィド基より発生せしめた千オール
基を有する免疫グロブリン□またはそのフラグメントで
ある。

ｔ！＝１である式（ｍＶ）で表わされる導°入されたチ
オール基を有する免疫グープリンまたはそのフラグメン
トは、例えば免疫グ＝＝プリンまたはそのフラグメント
に前記式（Ｘ）またはＬＸ［）で表わされる架橋剤を反
応させた後、導入された活性ジスルフィド基より還元操
作によりチオール基を発生せしめるか、または、免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメン）Ｋ前記式（ｍ）または
〔思〕で表わされる架橋剤を反応させることにより製造
することができる。

上記式（Ｖｌ）において、１．＝０の場合には、かかる
活性ジスルフィド基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメントは、例えば、それ自体のまたは発生せしめ
たチオール基を梅する免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントに活性ジスルフィド基導入剤を作用させることに
より製造することができる。

上記の目的に用いることができる活性ジスルフィド化合
物としては、例えば、２−ビリリジルジスルフィド（Ｑ
−ｓ−ｓ乃）。

５Ｉ５′−ジチオビス（２−二トロ安息香酸）シー２−
ピリジルジスルフィド ２−ペンゾチ７ゾイルジスルフイド ミタゾイルンスルフイド ７ミノーＮ′−フェニルイミノメチルジスルフことがで
きる。

また、前述のＦ（ａｂ’）、のヒンジ部分のジスルフィ
ド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ化分解して
分子中ＫＳ−スルホ基 （−８−８ｏ、’）を有するＦａ　ｂ’を得ることがで
きるが、この物も、式〔■〕で表わされる細胞毒性物質
を結合した血清アルブミンと好適に反応して、式（ｎ−
１’）で表わされる細胞毒性複合体を生成する。

式〔Ｖ〕または〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合
した血清アルブミンの製造方法については後述する。

また、本発明の細胞毒性複合体の内式 ｃｍ−２）で表わされる複合体は、例えば、前記式［）
で表わされる発生または導入しまたチオール基を有する
免疫りμノリンまたはそのフラグメントと、前記式〔■
〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミン
を、チオール基と反応し得る官能基を２個有する架橋剤
を用いて結合することにより製造することができる。本
反応を行なう場合は、２段階の反応として行なうのが好
ましい。即ち、最初罠、式（ｒＶ）で表わされる発生ま
たは導入したチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメントか、或いは式〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した血清アルブミンに、過剰の、例えば
式（ＩＸ）で表わされる架橋剤を反応させ、精製処理を
ほどこした後、得られた中間体に他方の蛋白を作用せし
める。

以上の反応手順により、目的とする式（ＩＴ−２）で表
わされる細胞毒性複合体を得ることかできる。

さらに、本発明の細胞毒性複合体の内式（ｍ）で表わさ
れる複合体は、例えば、上記式〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した血清アルブミンと、下記式〔■〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントな反応せしめることＫより
製造することができる。

上記式〔■〕で表わされる導入されたマレイミド基をも
つ免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、例えば、
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに前記式〔正〕
で表わされるマレイミド基を有する架橋剤を反応せしめ
ることにより製造することができる。

次に、前記式（Ｖ）または〔■〕で表わされる細胞毒性
物質を結合した血清アルブミンの製造方法につい【述べ
る。かかる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンは各
種の方法により製造できるが、例示すれば以下の通りで
ある。

先ず血清アルブミンが有するチオール基に、前記式（Ｖ
ｌ）で表わされる活性ジスルフィド基を有する免疫グー
プリンまたはそのフラグメントの製造法の項で例示した
２−ピリジルジスルフィド、４−ピリジルジスルフィド
等の活性ジスルフィド化合物を反応させて、下記式〔立
〕 ＸＳ、　−Ａ／　　　　　・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・（ＸＶ）（ＡＡ’、Ｓ、及びＸの定義
は式ＣＩ）に同じ。〕で表わされる活性ジスルフィド基
を有する血清アルブミンを得る。次いでこれを適当な細
胞毒性物質と反応させて、アルブミンの７ミノ基に細胞
毒性物質を結合せしめることＫより、前記式（Ｖ）で表
わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスルフィド基を
有する血清アルブミンを得る。前記式〔■〕で表わされ
る血清フルグミン鰐導体は、例えば、上記の如（して得
た式（Ｖ）で表わされる活性ジスルフィド基を有するア
ルブミン銹導体を還元剤、例えば２−メルカプトエタノ
ールまたはジチオスレイトールで処理することＫより樽
ることができる。

また、下記の方法によっても前記式（Ｖ）または〔■〕
で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンは
製造することができる。

血清アルブミンをそのチオール基を活性ジスルフィド基
に変換することなく、直ちに適当な細胞毒性物質と反応
させて、アルブミンの７ミノ基に細胞毒性物質を結合せ
しめ、次いで、２−メルカプトエタノールまたはジチオ
スレイトール等のチオール試薬で処理し、アルブミンの
ジスルフィド基またはフルフミンのチオール基にシステ
ィンやグルタチオンが結合して生じたジスルフィド基な
切断することＫより前記式〔■〕で表わされる血？１１
フルプ、１１１ ミン誘導体を得る。前記式（Ｖ）で表わされる細胞毒性
物質を結合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブ
ミンは、例えば、上記の如くして得た式〔■〕で表わさ
れる血清アルブミン鰐導体のチオール基に、２−ピリジ
ルジスルフィド、４−ピリジルジスルフィド。

５．５′−ジチオビス（２−ニドｐ安息香酸）等の活性
ジスルフィド化合物を反応させて製造することができる
。

本発明の細胞毒性複合体の製造法を例示すれば次の通り
である。

（１１式（ＩＶ）で表わされる発生または導入したチオ
ール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメント
と式（Ｖ）で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジ
スルフィド基を有する血清アルブミンを反応させるか、
式（Ｖｌ）で表わされる活性ジスルフィド基を有する免
疫グロブリンまたはそのフラグメントと式〔■〕で表わ
される細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを反応さ
せる方法。

これらの方法においては、式（ｒＶ）で表わされるチオ
ール基を有する免疫グープリンまたはそのフラグメント
１モルに対し、式〔Ｖ〕で表わされる細胞毒性物質を結
合した活性ジスルフィド基を有する血清アルブミンを０
．３〜２０モルの割合で使用するのが好ましい。反応は
、両蛋白をＰＨ、ｓ〜１０の緩衝液に合計の蛋白濃度が
０．５〜１００Ｍｇ／―（より好ましくは１〜２０ダ／
ｍｌ　）　Ｋなるように混じ、０〜６０℃で静置、もし
くは反応混液と同じ−の緩衝、液に対し透析することＫ
より行なうことができる。反応時間は反応スケール、反
応条件によるが、−膜圧は４時間〜３日間である。得ら
れた細胞宿性複合体の、反応混合物からの分離。

精製は通常用いられる操作、例えば透析。

分子ふるいのカラムクロマトグラフィーによって行なう
ことができる。

（２）式（ＩＶ）で表わされるチオール基を有する免疫
グロブリンまたはそのフラグメントと式〔■〕で表わさ
れる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを、両者の
チオール基と反応しうる前述した式（ＸＤの架橋剤を用
いて結合する方法。

この方法において、反応はチオール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメント、架橋剤、ＭｆＩ胞毒性
物質を結合した血清アルブミン王者を同時に接触させて
行なうこともできるが、好ましくはどちらか一方の蛋白
に架橋剤を反応させた後、次いで、その生成物に他方の
蛋白を反応せしめることにより製造される。まず架橋剤
を反応させる蛋白１モルに対し、好ましくは、架橋剤及
び他方の蛋白がそれぞれ０．８〜５０モル、０．８〜１
０モル用いられる。反応はまず、チオール基を肩する免
疫グｒａソリンまたはそのノラグメント或いは細胞毒性
物質を結合した血清アルブミンのｐＨ５〜１０　の緩衝
液の浴液（蛋白濃度は好ましくは０．５〜１００〜／威
、より好ましくは１〜２０■／妃に！１ｌｉｌ製する）
に、０〜６０℃で攪拌しながら、少量の溶媒、例えば、
Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、　１．２−ジメトキシエタン、メタノール。

エタノール、アセトン等に溶かした架橋剤を添加し、て
行なわれる。次いで、透析または分子ふるいのカラムク
ロマトグラフィーにより、未反応の架橋剤を除いた後、
もう一方の蛋白のｐＨ５〜ｌＯの緩衝液の溶液（好まし
い蛋白濃度の範囲は上に記載したのと同じである）を添
加して、０〜６０℃で反応せしめる。上記方法によって
得られる細胞毒性複合体の、反応混合物からの分離、精
製は通常用いられる操作、例えば分子ふるいのカラムク
ロマトクラフィーによって行なうことができる。

（３）式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合した血
清アルブミンと式〔■〕で表わされる導入されたマレイ
ミド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメントな
反応させる方法３゜ この方法においては、式〔■〕で表わされろ導入された
マレイミド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ント１モルに対し式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した血清アルブミンを０．３〜１０モルの割合で使
用するのが好ましい。反応は、両蛋白をＰＨ５〜１０の
緩衝液に合計の蛋白濃度が０．５〜１００！！９／氾（
より好ましくは１〜２０■／１）になるように混じ、０
〜６０°Ｃで静置して行なうことができも反応時間は反
応スケール、反応条件によるが、一般には４時間〜３日
間である。得られた細胞毒性複合体の、反応混合物から
の分離。

精製は通常用いられる操作、例えば透析。

分子ふるいのカラムクロマトクラフィーによって行なう
ことができる。

以下実施例により本発明を詳述する。

参考例１ ピ）　抗マウス白血病Ｌ１２１０１ｇＧの精シマウス白
血病Ｌ１２１０細胞Ｉ　Ｘ　１０’個をフロイント完全
７ジユバンドとのエマルジョンとし、家兎に静脈注射し
た。その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約ｉ　ｘ
　ｉ　ｏ’個のＬ１２１０細胞をアジュバントと共に皮
下注射し、最終投与口から８日後に採血した。

得られた血液をプールし、血清を分離し、その血清を５
６℃、３０分間加熱、非動化した。こうして得られた抗
Ｌ１２１０血清２００航に、硫安の飽和水溶液２００　
ａｔを加えて、生じた沈澱を遠心分離によって分取した
。

この沈澱を０．０１　Ｍリン酸緩衡液（ＰＨ７，６）５
０’ｍに溶解し、更に同緩衝液に対して十分に透析した
。この透析内液を同じ緩衝液で平衡化したジエチルアミ
ノエチルセルジー入カラムクロマトグラフィー（カラム
サイズ３　ａｎ　Ｘ　９４　ｍ　）　Ｋかけて、未吸着
分画として抗Ｌ１２１０　ＩｇＧを含む溶液を得た。

（→免疫グロブリンよりＦ（ａｂ’、）、フラグメント
の分離 上記（へ）の如くして得られた抗Ｌ１２１０　ＩｇＧの
１．２ｇを０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，５）４０１
に溶解し、２４〜のペプシンを添加して、３７℃で約１
８時間分解した後、分解生成物を生理食塩水中でセファ
デックス０２００カラムクロマトグラフイー（カラムサ
イズ３．５αＸ　１４０　＞　）　Ｋかけて、分子量約
１０万のところに流出する蛋白として純粋なＦ　（ａ　
ｂ’）ｚフラグメントを得た。

（ハ）　Ｆａｂ’フラグンントの調製 上記（ロ）の如くして得られたＦ（ａｂ’）＊フラグメ
ント１８．４〜を含む９．０１　Ｍ　）リス・塩酸−０
，１４Ｍ塩化ナトリウム（以後Ｎ＆αと省略する）−２
ｍＭエチレンジ７ミン四酢酸（以後ＥＤＴＡと省略する
）溶液（ＰＨ８，３）２、ＯＩＩｔに、１５０ｍＭの２
−メルカプトエタ／−ル水溶液を０．０２１１／加えて
、３７℃で１時間還元した。反応後、その溶液を５ｍＭ
酢酸緩衝液−０，１４，Ｍ塩化ナトリウム−１ｍ　Ｍ　
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ５，５）　（以下、ＡＮＥ緩衡液と
略す）で平衡化したセファデックスＧ２５カラムクｐマ
ドグラフイー（１，０αＸ　２０　ｏｎ　）　Ｋかけて
２−メルカプトエタノールを除去し、チオール基１個を
有するＦａｂ’フラグメントを得た。

に）　ＩｇＭの精製 （イ）の如くして、得られた抗Ｌ１２１０抗血清１００
威に飽和硫安溶液１００ｖを添加し、生じた沈澱を遠心
分離した。沈澱を、少量の０．９％塩化カリウム溶液に
溶解し、遠心分離して生じた不溶物を除いたのち、０．
９％塩化ナトリウム溶液に平衡化したセファデツクＧ・
２００カラムクロマトグラフイー（２，２ｃｍＸ　１０
２３　）　Ｋかけ、第１ピークにｘｇｍ画分をえた。

こうして得たＩｇＭ画分は、同容積の飽和硫安溶液を加
えて生じた沈澱を遠心分離した後、少量の０．９％塩化
ナトリウム溶液に溶かし、０．９％塩化ナトリウム溶液
に充分透析した。

６１’）　　ＩｇＭ、　１７）　ＭＡ　Ｒｏ、９％塩化
ナトリウム溶液に溶解したウサギＩｇＭ　（１０〜／ｍ
）２ｍに、ＩＭ）リス塩酸緩衝液、（ＰＨ８，０）　Ｋ
溶解した０、２Ｍシスティン９．２ｍｌを混合し、室温
４時間還べした後、過剰のヨード７セトアミド ＣＩＣＨ，Ｃ０ＮＨ，）を反応せしめ、次いでセファデ
ックスＧ−２５（０，８Ｘ４３α）を用いるゲルろ過（
５ｍＭＩｌ−酸緩衝溶液−０，１４Ｍ　Ｎａα−１ｍ　
　Ｍ　ＥＤＴＡ　　（ｐＨ５，５）　　）　　　Ｋ　よ
　リ、過剰の試薬を除いた。

（へ）　抗マウス乳癌ＭＭ４６モノクローン抗体の調製 細胞融合法により得られた抗ＭＭ４６　ＩｇＧ’２ｂ抗
体産生性ハイプリドーマ（瀬戸友人ら、ジャーナル　オ
プ　イムノルジ−（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、＄１２８巻
、２０１〜２０５）（，１９８２年参照）を、ヌードマ
ウス１５匹の腹腔に、−匹当り２　Ｘ　１０’個接種し
、１０日＊に腹水液を採取し、得られた腹水液５０−を
５ノの０．１Ｍリン酸緩衡液＜　ＰＨｓ、ｏ　）　Ｋ十
分透析した。透析内液を同じ緩衝液で十分に平衡化され
たプロティン人＠セファ０−スカラム（カラムサイズ１
．５　Ｘ　１２．５ｃｍ　）　Ｋかけて、十分に素通り
蛋白を流し出した後、０．１　Ｍり＝ン酸緩衡液（ｐＨ
５，０，）で不純蛋白を溶出し、その後０．１Ｍクエン
酸緩衝液（ＰＨ３・０）で吸着してゝ゛たＩｇＧ　２ｂ
　　を溶出し、溶出後の−を２ＭＴｒｉｓ、−Ｈα緩衡
液（ＰＨ８，２）で中性にもどじ、その後５１の２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に十分透析し、１０５Ｍ
９（１７，７ｍ１４）の抗ＭＭ４６　　モ／クローン抗
体（ＩｇＧ２ｂ　）を得た。また、正常マウス血清５０
紅より、上記と同様にして非免疫ＩｇＧ２ｂ　２５〜（
７，ＯＮ　）を得た。

実施例１ （１−１）＋（１−２）　　　　　→ １−（イ）　２−ピリジルジチオ基を有する人血清アル
ブミンのｐ４製 人血清アルブミン（以下Ｈ８Ａと省略する）の凍結乾燥
品２００〜を、０．１ＭＩＪン駿緩衡液−０．１　Ｍ　
Ｍａｉｌ　−１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）５．
０　ｄ　Ｋ溶解し、２−ピリジルジスルフィド６．０〜
をＤＭＦ　０．１　ｍに溶解した溶液を添加し、４℃で
１夜反応した。反応液をセファデックスＧ−２５（０，
１Ｍリン酸緩衝液−１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）　
（１ｃｍＸ　４０ｃｍ　）のカラムに通し、蛋白質溶出
部９．２１を得た。回収Ｈ８Ａ量、１８５　Ｎ　（２８
０ｎｍ　の吸光度測定による）。

得られた２−チオピリモル化Ｈ８Ａ上の活性ジスルフィ
ド残基の数は、その平均値を以下の方法により決定した
結果、０．６５であった。即ち１ｓのサンプルに過剰の
ジチオスレイトールを作用させ、遊離したチオヒリドン
の吸収極大値（３４３ｎｍ　）　　における吸光度を測
定して該サンプル中に含有される活性ジスルフィドのｌ
を定量した。

１方、該サンプル中のＨ８Ａの量は、２８０ｎｍにおけ
る吸光度を測定して求めた。Ｂ５Ａ１分子に存生する活
性ジスルフィド残基の数は、これらの測定値の比で表わ
される。

１−（ロ）マイトマイシン−１ｅｃ（以後ＭＭＣと省略
）を結合Ｌ　ｆ、ニー　Ｈ８Ａ（１−２）　ノｖ４Ｉ！
１−（イ）で得られた２−ピリジルジチオ基な有するＨ
８Ａ　２０．１■を溶解した。、ｉＭ−リン酸緩衝液１
　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）　１　、０１Ｌｔ
に、１ａ−（４−サクシンイミジルオキシカルポニルブ
チリル）−７−７ミノー９ａ−メトキシマイトサン５６
４５〜′をＤＭＦ１００μｌに溶解して加え、４°で５
時間攪拌した後、同シハツファーに溶かした１Ｍジチオ
スレイトール１．５ｄを加えて、１．５時間４℃に保っ
た。反応液を０．Ｏ］、Ｍ酢酸緩衝液−０，１４Ｍ　Ｎ
ａ（Ｊ−−０，０１ｒｎ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ５，２
５）に対して４℃で１７時間透析した。回収液１．８ｄ
Ｋ含有されるＭＭＣ結合）ＩＳＡの定量は、Ｌａｖ、＋
　ｒｙ法による蛋白定量により１５■であった。

さらＫ、回収液に含有されるＭＭＣ結合結合Ａ（１−２
）について、回収液の一部を使ってＨ８Ａ分子に結合し
たＭＭＣの数（ＭＭＣ／Ｉ（ＳＡ　）を求めたところ５
２であった。即ち、ＭＭＣの吸収極大３６０　ｎｍにお
ける吸光度よりＭＭＣ＊；基量をＬａｗｒｙ法によりＨ
８Ａ量を求めた。

又、ｆ（ＳＡ分子に再生したチオールの数（Ｈ８−／Ｈ
８Ａ）は、次のように定量した。

反応生成物の１部Ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｍ　！Ｊン酸緩衡液０　
、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ９，１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，
５）の浴液中、過剰の５，５′−ジチオビ・スー（２−
二トμ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）　　を加え、４℃で一
夜反応した。反応液をセファデックスＧ　−２５（０，
０１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液−−０，１４ＭＮａα
　１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　ｐ）（＝　７．６）Ｋ通
し、蛋白部をプールする。このものについて、Ｌｏｗｒ
ｙ法によりＨ８Ａの濃度を求め、さらに、過剰のジチオ
スレイトールを加えることにより遊離した５−メルカプ
ト−２−二）　ｔｙ安息査酸に由来す゛る４１２ｎｒｎ
Ｋおける吸収を測定することによって、　ＭＭＣ結合結
合Ａに含有されるチオール基の浸度を定量できた。これ
らの比を求めると、 （チオール鮎）／　（）（ＳＡ）　＝・０．５５以上の
定量値より、得られたＭＭＣＭＣ結合フルフミン１−２
式で表わされる。

ｌ−（ハ）　ＩｇＧへ活性ジスルフィド基の導入（ｌ−
１の調製） 上記参考例１−０）で得られた、ラビットＩｇＧ抗体２
．ＯＮ９を０．１　Ｍ　！ｊ　７酸緩衡液−０，１ＭＮ
ａα（ｐｌＨ７，５’）　１．Ｏｍに溶解し、Ｎ−サク
シンイミジル−３−（２−ピリジルチ。

オ）プロピオネート（以下５ＰＤＰと１瑞する）の１０
０ｍＭＤＭＦ溶液８．０ｔｔｌを室温下に加え、３０分
間ゆっくり攪拌したのち、セフ７デツｌスＧ−２５のカ
ラＡＣ１，ＯＸ３０ｍ＋０．１Ｍリン酸緩衝液−０，１
ＭＮａα。

ｐＨ６，５）Ｋ通し、低分子を除くと、活性ンスルフイ
ド基が導入されたマウ＝　Ｉｇｃ　（１〜走）の溶液６
．０−が得られた。

かくして得られた溶液中のＩｇＧの量は、２８０　ａｍ
の吸光度よ−り求めたところ１７ＩＩ９であった。Ｉｇ
ＧＫ導入された活性ジスルフィド基の数は以下の手順で
定量した。

溶液の１部を同一緩衝液で希釈した２８０ｎｍの吸光度
より、先づＩｇＧのモル濃度を求めた。次いで、溶液に
過剰の２−メルカプトエタノールを加え、１分間放置の
後遊離した２−メルカプトピリジンに由来する３４３ｎ
ｍの吸光度を測定する′ことＫより、活性ジスルフィド
基の濃度を求めた。これらの比より式１−１で表わされ
る生成物においつよ、４部分千に平均３．５個、）２−
ピリジルジチオ基が導入されていることを決定した。

１−に）　活性ジスルフィド含有ＩｇＧとＭＭＣ結合結
合Ａ（１−２）の反応による複、合体（１−３’）の調
製 上記１−（ハ）で得られた、２−ピリジルジチオ基を平
均３．５個含有するＩｇＧの溶液１．０ｍＫ、１−（ロ
）で調製した式１−芝で表わされるＭＭＣを結合した人
血清アルブミンの溶液１．０−を混合し、４℃で１夜反
応した。反応液をＳＤＳ電気泳動で調べると、生成物は
、ＭＭＣ結合結合Ａが１〜３個結合した式１−３で表わ
される複合体を生成物とすることが判明した。セファデ
ックスＧ　−１５０スーパーフアインのカラム（１，５
Ｘ８０　ａｍ　）を用いることＫより、複合体を精製し
た。

（ｅ）　　発明の作用及び効果（その１）Ｌ１２１０細
胞に対する複合体（１−３）の細胞毒性 上記１−に）の如くして得られた複合体（１−３）の標
的細胞Ｌ１２１Ｇに対する細胞毒性を検討した。

２４穴の培養プレートに、５Ｘ１０’個のＬ１２１０　
ｆｉ胞を含むｐズウエルバー、クメモリアルインステチ
ュート１６４０（以、下ＲＰＭＩ　１６４０と省略する
）培地（１０％牛脂児血清、２０βＭの２−メルカプト
エタノールと０．１４／１１７のカナマイシンを含む）
０．９１１７を分注し、更に種々の濃度の被検サンプル
０．１−を加え、５％Ｃ０２雰囲気下で３７℃で４８時
間培養後、トリバンプルー染色法により生細胞数を測定
した。

その結果、第１表に示す如（、複合体（１−３）は、標
的細胞Ｌ１２１０　Ｋ対し濃度依存的に著しい＃Ｉ胞増
殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はそ
の平均で示した。

第１表 実施例２ 上記参考例１−に）で得られたラビッ）ＩｇＭ抗体と、
実施例１−（ロ）で調製したＭＭＣを結合したＢＳＡ（
１−２）を、架剤５ＰＤＰを用い実施例１と同じ手順に
より結合せしめ、ＩｇＭ　−ＵＳＡ　−ｈｌＪＭｃ複合
体を得た。

実施例３ （３−ｉ　　）＋　　（３−２）　　→３−（イ）　２
−ピリジルジチオ基を含有する牛血清アルブミンの調製 牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）の結晶（市
販品）１３２′Ｍ９を０．１Ｍリン醗ナナトリウム緩衝
液−０，１Ｍ　ＮａＣ１−１ｍ　ＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
７，ｏ　）　ｓ、ｏ配に溶縮し、２−ピリジンジスルフ
ィド４．４■をＤ■゛０．１１に溶解した溶液を添加し
、４°で１夜反応した。反応液をセロファンチューブに
入れ、４℃にて２日間、　０．０１　Ｍリン酸緩衝液−
０，４ＭＮａＣｌ−１ｒｎ　ＭＥＤＴＡ　（ＰＨ７，０
）　Ｋ対して透析した。透析回収液をセファデックスＧ
−２５（０，１Ｍリン酸ｌｌｉ衡液−０，１４ＭＮａＣ
１，ｐＨ７，０）　（１ｍ、Ｘ　４０ｃｍ　）のカラム
に通し、蛋白質溶出部１２凝を得た。回収ＢＳＡｆｔ　
＋　１０４”＆　（２８０ｎｍ０′）吸光度による）。

得られた２−ピリジルジチオ基を有す ＢＳＡ上の活性ジスルフィド残基の数は、実施例１−（
イ）と同じ方法で決定した結果、０．６７であった。

３−（→　ノトトンキセート（以後ＭＴＸと省略する）
を結合したＢＳＡ（３−２’）の調製 実施例３−（イ）で得られた、２−ピリジルジチオ基を
平均０．６７個含有するＢ’５Ａ１７．３■を溶解した
０、１Ｍリン酸ナトリウム−０，１４Ｍ　Ｎａα（ｐＨ
７，０）の緩衝液２．０１に、すでに公知の方法（ビー
　エヌ　クルカルニら（Ｐ、Ｎ、Ｋｕｌｋａｒｎｉ　）
　＋キャンサーリサーチ（’Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　）　＋第４１巻！第２７００〜２７０６頁参照
）に従って調製したＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル１４．４”Ｐを溶解しｆ、：　ＤＭＦ溶液
３００μｌを４℃にて加え、１０時間反応せしめた。

次いで同じ緩衝液に溶かした１Ｍ２−メルカプトエタノ
ール５．０μｌを加え、４℃で１．５時間反応した。反
応液を、セロファンチューブに入れ０．９％食塩水１　
ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡＫ対して４℃で充分透析して、低分子
物質を除くと、ＭＴＸを結合したＢＳＡ（３−２）を含
有する溶液３．２−が得られた。

回収液中に有られたタンパク質量は、 Ｌｏｗ’ｒｙ法にて、又ＭＴＸの量は３’０７ｎｍＫお
ゆる吸収を測定して決定した。

次に、ＢＳＡ分子に再生したチ穿−ル基の数は、実施例
１−（弓の手順に従ってＤＴＮＢ法で決定した。以上の
結果、回収液中忙得られた蛋白質量はＩ　Ｃ１，７Ｗ　
＋　ＢＳＡ分子に結合したＭＴＸは４１分子、Ｔ４生じ
たＢＳＡのチオール基は平均０．６１個と決門され、従
って、得られたＭＴＸ残基な結合したＢＳＡは３−２の
ごとくに表わされる。

３−（ハ）参考例１−（ハ）で得られたウサギＩｇＧの
フラグメントＦａｂ’　１３．０　＃を含む溶液（５ｍ
　Ｍ　Ａｃ０Ｎａ　−０，１４Ｍ　ＮａＣ１ｒｐＨ５，
５，１，５１１７Ｋ％Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレ
イミド（以下ＰＤＡと省略する）の同じ緩衝液中に飽和
溶液１．５１を加えて室温中で３０分間反応させ、 過剰試薬をセファデックスＧ−２５ （１，０Ｘ４０ｃ＋ａ＋同−緩衝液）Ｋより除去して、
弐３−１で表わされるマレ イミド基を含有するＦａｂ’を含む溶液９．２ｊ１ｊを
得た。

３−に）　マレイミド基含有Ｆａ　ｂ’とＭＴＸ結合結
合Ａ（３−２）との反応による複合体（３−３）のｐ４
製、 上記３−←）で得られたＭＴＮ結合結合Ａを６．７９！
有する溶液（−０，９％ＮａＣｌ−１，０ｍ　Ｍ　ＥＤ
ＴＡ　２．Ｏｗｔｔを上記−３−ｆ−）テ得うレタマレ
イミド基を含有するＦａｂ’（１０−１）〜 の溶液２．０１Ｌｔｋ混合し、４℃で一夜反応せしめた
。反応液をＳＯ８電気泳、動により詞、さると、生成物
は、Ｆａｂ’にＢＳＡが結合した式３−３で表わされる
複合体を含有することが判明した。セファデックスＧ−
”１５０スーパーフアインのカラム（１，５Ｘ　１００
ｃｍ）を用いることにより一合体なｎ＋！ｉ、−た。

（ｆ）　　発明の作用及び効果（その２）Ｌ１２１０細
胞に対する複合体（３−３）の細〜 胞毒性 上記３−０の如くして得られた複合体（３−３）の標的
細胞Ｌ１２１０に対する細胞毒性を検討した。　。

２４大の培養プレートに、５　Ｘ　１０’個のＬ１２１
０細胞を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（１０％牛脂児血
清、　２０４Ｍの２−メルカプトエタノールとＯ，１Ｍ
９／−のカナマイシンを含む）０．９１を分注し、更に
種々の濃度の被検サンプル０．１−を加え、５％ＣＯ１
雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリバンプルー染
色法により生細胞数を測定した。

その結果、第２表に示す如く複合体（３−３）は、標的
細胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に著しい細胞増殖抑制
効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその平均
で示した。

＃Ｉ２表 実施例４ 実施例３−（ロ）で得られた、ＭＴＸを結合したＢＳＡ
　（３−２）の溶液（０，９％Ｎａ（’ｌ−１ｍ　ＭＥ
ＤＴＡ溶液）１．０就Ｋ　Ｎ、Ｎ’−ビス（マンイミド
メチル）エーテル（以下ＢＭＥと省略する）の５　ｍ　
ＭＡｃＯＮａ　−０，１４ＭＮａＣｌ　（ｐ）ｆ５．ｓ
　）　Ｍ漬液中飽和溶液１．０紅を加え、３０分間反応
させた。過剰の試薬をセファデックスＧ　−２５（１，
Ｏｘ４０ｃｍ　＋同一緩衝液）Ｋて除去して、式４−２
で示されるマレイミド基を含有するＭＴＸを結合したＢ
ＳＡの溶液４．７縦を得た。この溶液に参考例１−Ｐ−
３で得られたウサギＩｇＧのＦａｂ’　１２．５　Ｍｇ
を含む同一緩衝液１．５威を加え、−夜反応せしめた。

反応液をＳＤＳ電気泳動により調べると、生成物は、Ｆ
ａｂ’にＢＳＡが結合した式４−２で表わされる複合体
を含有することが判明した。

セフ７デンクスＧ−１５０スーパーフアインのカラム（
１，５Ｘ１００ＣＩ＋）を用いることＫより複合体を精
製した。

実施例５ 上記実施例３の反応を、架橋剤としてＮ、Ｎ’−ヘキサ
メチレンビスマレイミド ３と同様の条件下に施行し、Ｆａｂ’　−ＢＳＡ　−Ｍ
ＴＸ複合体を得た。

実施例６ ＴＪ −子 ６〜　４ １−〇） 参考例１−に）で得られた１ｇＭ８１０．０〜を溶解し
た緩衝液（１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液−０．１４Ｍ塩化ナ
トリウム、　’ｐＨ７，０、２，０威に同一の緩衝液に
溶解した、架橋剤Ｎ−サクシンイミジルマレイミドプチ
レート（以下ＳＭＢＥと省略する）の１０ｍＭエタノー
ル溶液０．１１を混合し、１温で３０分反応させた後、
過剰のＢＭＥを、セフ７デツクスＧ−２５（１，ＯＸ４
０傷、溶媒は反応溶媒に同じ）を用いるグルろ一過によ
り除いた。

相当する両分を集め修飾ＩｇＭｓ　１８．９　Ｍｌｌｌ
を含有する溶液４．６−が得られた（６−１）。

この溶媒は、直ちに、６−ｔ→における反応に使用した
。

６−（ロ）　ビンデシンを結合したＨ８Ａ　（６−３）
の調製 一方、公知の方法（シーシェイパ−ネットら（Ｃ，Ｊ、
Ｂａｒｎｅｔｔ　）　＋ジャーナル　オプメデイシナル
　ケミストーリーｒ　（Ｊｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第２１巻、第８８〜
９６頁、１９７８弗参照）Ｋより、式１−２で示される
デス７セチルビングラスチン酸７ジド中間体を得た。即
ち、デス７セチルビンプラスチン酸ヒドラジド１０〜を
、ＩＮ塩酸１．０１１６に溶解し　０１１にて０、ＩＮ
亜硝酸ソーダ溶液なｏ、１ｓＩＩｔ加えた。

５分間反応後θ°にてテトラヒドロフラン０．５−を加
え、ＩＮＮ水化化ナトリウム０５−で中和すると、式１
〜２で示される反応性のデスアセチルビ／プラスチン９
フジド中間体を含む溶液が得られた。上記溶液を上記実
施例１−（１′）で得られた２−チオピリジル化した人
血清アルブミン９．７Ｍｇの０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）　１．５−に加え、室温にで２ｇ＃間攪拌し
た。次いでＩＮのアンモニア　０．１−を加えてさらに
２時間反応せしめた。反応液をセファデックスＧ　−５
（）のカラム（１ａｍ　Ｘ　４０　ｍ　＋溶媒は０．１
Ｍリン酸−０，１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液ＰＨ７，５）
に通して溶媒を交換し、相当する両分を集めた（７．９
ｍ）。　　。

次いで４°にでＩＭジチオ仝レイトール（ＤＴＴ）　（
溶媒は、０．１Ｍリン１ｌｌｌ衝液ｐＨ７Ｊ　）４．０
μｊを加え、１．０時間反応せしめたのち（１−３）、
反応液をセーフ７ンチユーブに入れ、１０ｍＭリン酸ナ
トリウム− 〇、１４　Ｍ　Ｎ５ＣＬ　（ＰＨ’７．０　）に対して
４°にで充分透析した。回収液（８，５ｔ）　Ｋ含有さ
れる生成物の蛋白質量はＬｏｗｒｙ法により求めた。又
、薬剤の童は２７０ｎｍＫおける吸光度を測定して求め
、得られた値を蛋白質量で補正した。人血清アルブミン
蛋白質量は、６．６１１Ｐ、デス７セチルビンプラスチ
ン残基量と、蛋白量の比より１人血清７λブミン１分子
には薬剤が平均３４個結合していることが判明した。又
、人血清アルブミンのチオール基は実施例１−ｆ→の方
法で定量した結果、平均０．６０個であった。

６−Ｇ）で得られた修飾ＩｇＭ、　　の溶液２．０−と
、１−（＋’）で得られたデス７セチルビンプラスチン
を結合した人血清フルズミンの溶液ｓ、ｏＩＬｔを混合
し、４°で一夜反応せしめた。反応液をンデクＡドデシ
ルサルフェート電気泳動により調べると、生成物はＩ　
ｇＭ。

にＨ８Ａが結合した式６−４で表わされる複合体を含有
する事が判明した。セファタックスＧ−１５０スーパー
ファインのカラム（１，５ｘ９０ｃＲ）を用いるゲルろ
過により精製して複合体を得た。

優）　発明の作用及び効果（その３） Ｌ１２１０細胞に対する複合体（６−４）の細胞毒性 上記６−（ハ）の如くして得られた複合体（６−４）の
標的細胞Ｌ１２１０　Ｋ対する細胞毒性を検討した。

２４穴の培養プレートに、５Ｘ１０４個のＬ１２１０細
胞を含むＲＰＭ１１６４０培地（１０％牛脂児血清、２
０μＭの２−メルカプトエタノールとｏ、１ｘｖ／−の
カナマイシンを含む）０．９１Ｌ／！を分注し、更に種
々の濃度の被検サンプル０６１−を加え、５　ＸＣＯ，
雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリバンプルー染
色法により生細胞数を測定した。

その結果、第３表に示す如く、複合体（６−４）は、標
的細胞Ｌ１２１０　Ｋ対し濃度依存的に著しい細胞増殖
抑制効果を示した。尚、培養は２系列行ない、値はその
平均で示した。

第３表 実施例７ 上記参考例１−（へ）で得られた、マウス七ツクローン
ＩｇＧ２ｂ抗体および実施例６−（ロ）で調製したビン
デシンを結合したＨ８Ａ、（６−３）を、架橋剤Ｎ−サ
クシンイミジルマレイミドベンゾエー）　（ＳＭＢＵ　
）を用い、実施例６と同じ手順により結合せしめ、Ｉｇ
Ｇ２ｂ　−Ｈ８Ａ　−ビンクリスチン複合体を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、殺すべき細胞のもつている特定の抗原と特異的に結
   合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、血
   清アルブミンの分子１個当り細胞毒性物質が３１〜６０
   個結合してなる細胞毒性部とが、血清アルブミン中の硫
   黄原子を介して結合せしめられてなる細胞毒性複合体。 ２、血清アルブミンが人または牛の血清アルブミンであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の細胞毒性複合体。 ３、下記式〔 I 〕 Ａｂ−〔Ｂ＿１−Ｓ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）ｍ〕ｎ
   ・・・・・・〔 I 〕〔Ａｂは免疫グロブリンまたはそ
   のフラグメントを、Ａｌは血清アルブミンを、Ｃｙは細
   胞毒性物質を表わす。Ｓ＿１及びＮＨはそれぞれ血清ア
   ルブミン中の硫黄原子及びイミノ 基を表わす。Ｂ＿１は２価の有機基を表わす。 ｍは３１〜６０の整数を、ｎは１〜１０の 整数を表わす。〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項および第２項記載
   の細胞毒性複合体。 ４、下記式〔II〕 Ａｂ〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２−（Ｂ＿３）＿ｔ
   ＿＿３−Ｓ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ〕＿ｎ・・
   ・・・・・・・〔II〕 〔Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は
   式〔 I 〕の場合と同じ。Ｓ＿２は硫黄原子を、Ｂ＿２
   及びＢ＿３は２価の有機基をｔ＿２及びｔ＿３は同一ま
   たは異なつて０または１を表わす。〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
   項記載の細胞毒性複合体。 ５、下記式〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・〔III
   〕 Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は式
   〔 I 〕の場合と同じ。Ｂ＿４は２価の有機基を表わす
   。〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
   項記載の細胞毒性複合体。 ６、発生または導入したチオール基を有する下記式〔I
   V〕 Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２Ｈ〕＿ｎ′・・
   ・・・・・・・・・・〔IV〕〔Ａｂの定義は式〔 I 〕
   に同じ。Ｓ＿２、Ｓ＿２及びｔ＿２の定義は式〔II〕に
   同じ。ｎ′は１〜１０の整数を表わす。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントと
   、下記式〔Ｖ〕 ＸＳ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ・・・・・・・・
   ・・・・〔Ｖ〕〔Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ及びｍの定
   義は式〔 I 〕に同じ。Ｘは隣接する硫黄原子と共に活
   性ジス ルフィド結合を形成し得る基を表わす。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した活性ジスルフィド
   基を有する血清アルブミンを反応せしめることを特徴と
   する、下記式〔II−１〕Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２
   −Ｓ＿２−Ｓ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ〕＿ｎ・
   ・・・・・〔II−１〕 〔Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は
   式〔 I 〕の場合と同じ。Ｓ＿２、Ｂ＿２及びｔ＿２の
   定義は式〔II〕の場合と同じ。〕 で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ７、誘導または導入した活性ジスルフィド基を有する下
   記式〔VI〕 Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２Ｘ〕＿ｎ′・・
   ・・・・・・・・・・〔VI〕〔Ａｂの定義は式〔 I 〕
   に同じ。Ｓ＿２、Ｂ＿２及びｔ＿２の定義は式〔II〕に
   同じ。ｎ′の定義は式〔IV〕に同じ。Ｘの定義は式〔Ｖ
   〕に同じ。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはフラグメントと、下
   記式〔VII〕 ＨＳ＿１−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ・・・・・・・・
   ・・・・〔VII〕〔Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ及びｍの
   定義は式〔 I 〕に同じ。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した血清アルブミンを
   反応せしめることを特徴とする、前記式〔II−１〕で表
   わされる細胞毒性複合体の製造法。 ８、前記式〔IV〕で表わされる発生または導入したチオ
   ール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメント
   と、前記式〔VII〕で表わされる細胞毒性物質を結合し
   た血清アルブミンを、チオール基と反応し得る官能基を
   ２個有する架橋剤を用いて結合することを特徴とする、
   下記式〔II−２〕 Ａｂ−〔（Ｂ＿２）＿ｔ＿＿２−Ｓ＿２−Ｂ＿３−Ｓ＿
   １−Ａｌ−（ＮＨ−Ｃｙ）＿ｍ〕＿ｎ・・・・・・〔I
   I−２〕 〔Ａｂ、Ａｌ、Ｃｙ、Ｓ＿１、ＮＨ、ｍ及びｎの定義は
   式〔 I 〕の場合と同じ。Ｓ＿２、Ｂ＿２、Ｂ＿３及び
   ｔ＿２の定義は式〔II〕の場合に同じ。〕 で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ９、前記式〔VII〕で表わされる細胞毒性物質を結合し
   た血清アルブミンと、下記式〔VIII〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・・・・
   ・・・〔VIII〕 〔Ａｂの定義は式〔 I 〕に同じ。ｎ′の定義は式〔IV
   〕に同じ。Ｂ＿４の定義は式〔III〕に同じ。〕で表わ
   される導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブリンま
   たはそのフラグメントを反応せしめることを特徴とする
   、前記式〔III〕で表わされる細胞毒性複合体の製造法
   。