JPS6117518A - ヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マの製法とヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マによる抑制因子の製法 - Google Patents

ヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マの製法とヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マによる抑制因子の製法

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JPS6117518A
JPS6117518A JP60119652A JP11965285A JPS6117518A JP S6117518 A JPS6117518 A JP S6117518A JP 60119652 A JP60119652 A JP 60119652A JP 11965285 A JP11965285 A JP 11965285A JP S6117518 A JPS6117518 A JP S6117518A
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クリス　プラトソウカス
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SUROON KETARINGU INST FUOO KIY
SUROON KETARINGU INST FUOO KIYANSAA RESEARCH
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SUROON KETARINGU INST FUOO KIY
SUROON KETARINGU INST FUOO KIYANSAA RESEARCH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は一部政府の援助で、すなおち国立ガン研究所
（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｒ＋＋
ｔｉｔｕｔｅ）によって認められたＣＡ３２０７０の下
で行われた。
合衆国政府はこの発明に対して権利をもっている。
この発明はヒトの造血幹細胞の雑種細胞、特にＴ　−Ｔ
　ＩＡＩ：種細胞のようなヒトの造血性雑種細胞を製造
する方法に関する。これらＴ−Ｔ細胞雑種のあるものは
、細胞増殖と抗体産生を抑制する抑制因子（Ｓ　Ｆ）を
産生じ、細胞増殖の異常のような障害をコントロールす
るのに有用であろう。ヒ１−のＴ−Ｔ細胞雑種のあるも
のはＢ−細胞成長因子（ＢＣＧＦ）を産生ずる。
！−−−軒 ヒトの造血幹細胞の雑種、特にＨＬＡのタイプを決める
ようなＴ−Ｔ細胞雑種が開発されている。
これらのＴ−Ｔ雑種細胞のあるものは、生物療法、すな
わち特異的な免疫機能を示すのに有用な因子を生産する
。このことは特異的な免疫機能を示すか、あるいは望ま
しい因子を生産するところの適当に合成あるいは誘導さ
れたヒトのＴ細胞と、ヒトから得られるＴ細胞株とを融
合することによってなされる。本発明の方法によれば、
ある種のハイブリドーマに有害なＨＡＴ培地による選択
を必要としない（Ｉ（Ａ　Ｔ−ヒボキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン）。
この方法はＴ細胞系統の細胞のリンパ球を融合するため
に示されているが、ヒトあるいは他のモノクローナル抗
体を産生するＢ細胞ハイブリドーマの生産を可能にして
いる６ 明細な説明 次のような文献がＴ＝Ｔ細胞雑種について扱っている。
＊０．イリゴーイエン等（１９８１年）ジャーナル・オ
ブ・エキスペリメタル・メディシン （Ｉｒｉｇｏｙｅｎ、　Ｏ，ｅｔ　ａｌ、（１９８１）
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）１５４、１８２７゜ ＊Ｍ、オカダ等（１９８１年）プロシーディンゲス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、
Ｕ、Ｓ、Ａ、　（Ｏｋａｄａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　
（１９８１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ、
ｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）　？８．７７１７゜＊Ｊ、Ｌ
、バ１〜う等（１９８３年）ジャーナル・オブ・エキス
ペリメンタル・メディシン（Ｂｕｔｌｅｒ、　Ｊ。
Ｌ、　　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）Ｊ、　Ｅｘｐ、　
Ｍｅｄ、）　＋５７．６０゜＊コバヤシ等（１９８２年
）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｋｏｂａｙａｃｈ
ｉ　；　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）１２８．２７１４゜＊アサダ等ｒ
ｉ’ｑａ３年）セルラーイムノロジー（Ａｓａｄａ　ａ
＋：　ａｌ、、（１９８３）　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　工ｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ）７７、１５０゜ ＊Ｊ、り一等（１９８２年）プロシーディンゲス・オブ
徊ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、Ｕ
、Ｓ、Ａ、　［：Ｌｅｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、（１９
８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、
υ、Ｓ、Ａ、）　７９．７８５７゜＊ファング等（１９
８２）プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
ガデミー・オブ・サイエンス、Ｕ、　Ｓ　、　Ａ　、　
（Ｆｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７９．７４８
４゜＊Ｅ、Ｃ，ドフレイタス等（１，９８２年）プロシ
ーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス、Ｕ　、　Ｓ　、　Ａ　、　（ＤｅＦｒ
ｅｉｔａｓ、Ｅ、Ｃ，。
ｅｔ　ａｌ、（１９８２年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、　）胆、　６６４６゜ ＊Ｍ、トルッコ（１９８４年）ネーチャー（Ｔｒｕｃｃ
ｏ、Ｍ、　。
（１９８４）　　Ｎａｔｕｒｅ）　　３０９．　１６６
゜ＳＦを産生ずるＴ−Ｔ細胞雑種についてもこれまでに
いくつかの記述がある。
＊キャサリン・グリロー−クルバリン等（１，９８１年
）ネーチャー（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｊ、ｎ
、　Ｃａｔｈｅｒｊ、ｎｅａｔ、　ａｌ、（１９８１）
　Ｎａｔｕｒｅ）　２９２．８４４゜＊ワーナー、Ｃ・
グリーン等（１９８２年）ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー（Ｇｒｅｅｎ、　’Ｗａｒｎｃｒ、（、。
ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
　１２９．１９８６゜＊Ｍ、Ｊ、タウジグ等（１９７９
年）ネーチャー（Ｔａｕｓｓｉに、　　Ｍ、　　Ｊ、　
　ｅ七　ａｌ、（１９７９）　　Ｎａｔ、ｕｒｅ１２７
”７．３０５及び３０８゜ ＊シリカ・コンチアネン等（１９７８年）ネーチャー［
Ｋｏｎｔ−ｉａｎｅｎ、　　Ｓｊ、ｒｋｋａ　　ｅｔ　
　ａｌ、　　（１９７８）　　Ｎａｔｕｒｅ］２４７、
４７７゜ この発明における方法は次の点で上のいずれとも異って
いる。すなわち １、’　　ＨＡ　Ｔ培地が使われていない。
２、　リンパ芽球性のＴ−細胞株のＨＧ　Ｐ　ＲＴネガ
ティブあるいは他の薬剤感受性の変異株を必要としない
。
３、　バイブリッドの選択が寒天培地でのクローニング
と限界希釈法によってなされるが、それらの機能的特性
とＨＬＡ抗原の表現にもとづい−Ｃなされ、る。
ヒトの末梢血白血球の細胞増殖をひきおこすマイトジェ
ンあるいは抗原（同種抗原）ばかりでなく、抗体産生を
も抑制する因子が同定されている（アメリカ特許出願節
６０９，２７３号、１９８４年５月１１日出願）。
そのような因子は１例えばガン、移植拒絶疾患、自己免
疫疾患、白血病のようなリンパ球増殖の悪性不順などの
患者の治療に使用しうる。
これまでの抑制因子に次の文献に報告されている。すな
わち、キャサリン・グリロー−クルバリン等（１９８１
年）ネーチャー（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｒａｌｉｎ
、　Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　
Ｎａｔｕｒｅ）２９２、８４４　；ワーナー・Ｃ・グリ
ーン等（１９８２年）ジ専−ナル°オブ°イムノロジー
（Ｇｒｅｅｎｅ、Ｗａｒｎｅｒ　Ｃ，。
ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　
１２９．１９８６　；　Ｍ、Ｊ。
ダウジグ等（１９７９年）ネーチャー［Ｍ、Ｊ、　Ｔａ
ｕｓｓｉｇ＋ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）　Ｎａｔｕｒ
ｅ）　２７７．３０５及び３０８；シルカ　コンチア−
ネル等（１９７８年）ネーチャー（Ｓｉｒｋｋａ　Ｋｏ
ｎｔｉａｎｅｎ、　ａｔ　ａｌ、（１９７Ｂ）　Ｎａｔ
ｕｒｅ）２１４、４７７　；　Ａ　、アイゼンタール等
（１９７９年）アンチ・−ルズ・オブ・ザ・ニューヨー
ク　アカデミ−・オブ・サイエンス［Ｅｉｓｅｒ＋ｔｈ
ａｌ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、（１９７９）Ａｍｍ、　
Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　３２２，３６７
　；ｎ、ｒ、スミス等（１（１７０年）アメリカ・ジャ
ーナル・オブ・パソロジ−［Ｓｍ１ｔｈ、　Ｒ，Ｔ、　
ｅｔ、　ａｌ、（１９７０）　Ａｍ、　Ｊ。
Ｐａｔｈｏｌ、３６０．４９５量Ｙ、ナンバ等（１９７
５年）炎症（Ｎａｍｂａ、　　Ｌ　　ｅｔ　　ａｌ、（
１９７５）　　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）　　Ｌ。
５　：　Ｓ、Ｃ，り一等（１９７７年）ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（１，ｅｅ、　Ｓ、　Ｃ，、ｅｔ　ａ
ｌ、（１９７７年）Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１１８．８８　；　Ｂ　、Ｖ、ジ
エオゴソシー等（１９７９年）ジャーナル・オブ・エキ
スペリメンタルメデイシン（、Ｉｅｏｇｏｓｏｔｈｙ、
　Ｂ、　Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）Ｊ、　Ｅｘｐ
、　Ｍｅ、ｄ、）　１５０．６２２　；　Ｙ、ナンド等
（１９７７年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｎａ
ｍｂａ、　Ｙ。
ｅｔ　ａｌ、（１９７７１Ｌ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．］υ
８．１３７９；　Ｂ、Ｖ。
ジェゴサシー（１９７６年）川、１２６０；１３．８．
ワックスマン等（０１７８年）セル・イムノロジー［Ｗ
ａｋｓｎ＋ａｎ。
Ｂ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９７Ｂ）　Ｃｅ１ｌ　　’
Ｉｍｍｕｎａ１．）　３６．１８０゜ここに記載される
抑制因子は、上に述べた全ての抑制因子と（１）機能的
特性において異なり。
（２）分子量が異なり、（３）構成的に生産され、しか
も本質的に多量に生産される点で相違する。
Ｔ−Ｔ細胞雑種のような安全なコトのハイブリドーマは
、１゛細胞系統（例えばＪｕｒｋａｔ、　Ｍｏ１ｔ−４
）のようなコトのリンパ芽球系統から得た細胞を、ファ
イトへマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃ
ｏｌＡ）、スタフィロコッカスのエンテ・ロトキシンＡ
　（ＳＥＡ）のようなマイトジェンあるいは混合リンパ
球（ＭＬＣ）における同種異遺伝子の細胞で刺激された
末梢血Ｔ細胞のようなヒトのリンパ球と融合することに
よって開発された。
雑種細胞は以下にのべるよ□うに寒天中でクローニング
し、限界希釈法によって選択された。
正常な供血者からとったヒトの末梢血単核白血球（ＭＮ
Ｃ）を２　Ｘ　１０”　ｃｅＮ、ｇｅｍ　Ｑの濃度に調
整し、最適の濃度のＣｏｎＡまたはＰＨＡまたは５ＥＡ
（ＰＨＡ５−１０　ｐ、ｇ／ｍ　Ｑ　、ＣｏｎＡ　２−
２５　μ（５／ｍ　Ｑ　、　ＳＥＡ　０．０１〜０．１
−μｊ／ｍ　Ｑ　）と共に培養した。
細胞は２〜４日間培養した後、１０％の熱で不活性化し
た仔牛脂児血清（Ｆｅ３）を加えたＲ１）ＭＩ−１６４
０で、３回洗って記述のようにリンパ身性Ｔ細胞株と融
合した。
一方、Ｅ−ロゼツト形成細胞を下記の方法によりヒツジ
赤血球とロゼツトを形成させることによって、マイ１ヘ
ジエンで刺激した１化Ｃから分離した。
別の実験では約２　Ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ　Ｑの濃
度にしたヒトの末梢血単核白血球を、２５００ラドの放
射線で照ル１した例えば２　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／
ｍ　Ｑの同種異遺伝子型単核球で刺激した。細胞を３回
１０％の熱不活性化ＦＣ５を加えたＲＰＭＩ−１６４０
で洗い、記述のとおりリンパ芽球性Ｔ細胞系統と融合し
た。
ヒトのリンーノΣ糾並工細胞系統 Ｊ　ｕ　ｒ　ｋ　ａ　ｔ　Ｔ細胞系統の細胞を１０％の
熱で不活化した仔牛脂児血清、２５　ｍ　Ｍのへペスバ
ッファー、２ｍＨのし一グルタミン、１．ＯＯＵ／ｍＱ
のペニシリン、１００μｇ／ｌ１ＩＱＯス１−レゾ１−
マイシンを添加したＲＰ阿ｌ−１６４０培地で生育させ
た。
雑種細り灰塵だ先叫跣企 マイトジェンまたはＭＬＣ中の同種異遺伝子型の細胞で
刺激さｈたヒト末梢血単核白血球あるいは精製されたＴ
ＭＡ胞を、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０で３回洗
滌した。Ｊｕｒｋａｔ　リンパ芽球性Ｔ細胞系統あるい
は他に使われた細胞系統から得た細胞もそのように洗滌
された。
マイトジェンあるいは同種抗原で活性化された単核細胞
あるいはＴ−リンパ球を、Ｊｕｒｋａｔのようなリンパ
芽球性Ｔ細胞系統などのＴ細胞系統から得た細胞と、一
つの試験管内で例えば１０／１のような適当な比率で混
合した。細胞を４００×Ｇで１０分間遠心分離した。上
清を除いて捨て、そして混合された細胞塊をゆっくり攪
拌することでこわして分散させた。
あらかじめ温められた（３７℃）融合用培地（ＲＰＭＩ
−１６４０中５０％のポリエチレングリコールを含む）
１ｍＱを細胞ペレッ１へに湾下して加え、混合液を１分
間手でゆっくりと試験管を揺ることで混合した（約９０
°の円弧を通るように試験管を動かすとうまく行くこと
がわかった）、予め温められた（３７℃）血清フリーの
ＲＰＭＩ−１６４０をゆっくり加え、試験管を約１分間
手にはさんでゆっくりと回転させた。
予湿さ第１、た血清フリーのＲＰＭＩ−１６４０２ｍ　
Ｑを加え試験管を手にはさんでゆっくりと約２分間回転
させた。
１０％の熱で不活性化したＦｅ２を加えた４ｍＱの予湿
されたＲＩ’ＭＩ−１６４０を試験管に加え、それを約
３分間手の間で回転させた。
１０％の熱で不活性化したＦｅ２を添加した８ｍＱの予
湿されたＲｒ’ＭＩ４６４０を試験管に加え、さらに３
分間手でり）つくりと回転させた。
細胞を４００ＸＧで１０分間遠沈し、熱で不活化した仔
牛脂児血清１５〜２０％、ヘベス２５　ｍ　Ｍ、Ｌ−グ
ルタミン２ｍＭ、ペニシリン１０００／ｍ　Ｑ、ス１−
レプトマイシン１００　ｐ　ｇｅｍ　Ｑを添加し７たＲ
ＰＭＴ−１６／１０に穏やかに再懸濁した。
細胞は３７℃で５％のＣＯ２を含む湿潤培養器の中でイ
ンキュベートされた。
選択−列 ３７℃で適当な期間（１〜６０日）培養した後、１０％
の熱失活した仔牛脂児血清（Ｆｅ２）を加えたＲＰＭＩ
４６４０で細胞を２回洗い、この培地において適当な数
の細胞を、１５％の熱失活ＦＣ５，２ｍＭのし一グルタ
ミン、２５ｍＭヘペス、１００Ｕ／ｍ　Ｑのペニシリン
、１００μｇ／ｒｎＱのストレプトマイシンを添加した
ＲＰＭＩ−１６４０中１％の寒天といった半固体培地の
適当量と、約０．３％の寒天濃度になるように混合した
。細胞と寒天を直ちに混ぜ、細胞を１００ｍｍのような
適当なサイズのべ１〜り血に迅速に移した。他の半固体
培地も寒天ど同様に使えよう。（２日間細胞を培養して
から）（Ａ　Ｔ　ＬＪ地に移すのがハイブリドーマ選択
法の標準的方法となっている。この発明ではそのような
培地あるいはその他の有害な培地に全く使われない）。
本発明では、インキュベーション後半固体培地に移すた
めの最適な時は＋　１０．１５．２０日であることをみ
つけた。その他の十分な培養時間は例えば５日あるいは
３日などでもよかろう。
寒天は室温で固まらせ、ペトリ血を３７℃の５％ＣＯ２
下での湿潤培養装置に移した。コロニーの生長は７〜４
０日で拡大鏡または顕微鏡観察により明らかにされた。
個々のコロニーを９６六の平底型ウェルのプレートに移
し、２０％の熱失活させたＦｅ２．２５ｍＮのへペス、
２ｍＭのし一グルタミン、１００Ｕ／ｍ　Ｑペニシリン
、１００ｚｌＨ／ｍΩのストレプトマイシンを添加した
ＲＰＭＩ−１６４０をウェル当り１００μＱ加えた。
ある実験では、これらのウェルに放射線照射（２５００
ラド）さ４ｔしたヒ；〜末梢血単核白血球からなるフィ
ーダ一層が入れられており、そのリンパ球は融合相手と
して使われたかあるいは多分他の供血者からのものであ
った。
細胞の生育がみられたウェルから採った培養上清または
雑種細胞はさらに、以下にのべる方法を用いて機能上の
特性が検定された６機能的特性をもった雑種細胞はＨＬ
Ａタイプ化され、細胞遺伝学的に解析された。あるいは
また、まずＩｔ　１．ＡまたはＴ細胞分化抗原の表現型
によってスクリーニングし、次いで雑種細胞の機能特性
を決めることもできた。生物療法に有用な因子を産生じ
、あるいは興味ある特殊な生物学的機能を示す細胞は、
】５〜２０％の熱不活化したＦｅ２．２５ｍＭのヘペス
、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０００／ｍ　Ｑのペニシ
リン、１００　μｇ／＋ｎ　ｎのストレプトマイシンを
含むＲＰＭＩ−１６４０中、０．２〜０．４ｃｅｌｌｓ
／ウエルのレベルでさらに数回限界希釈法によって再ク
ローン化した。
フィーダーレーヤーはおよそ２５，０００〜ｔｏｏ、ｏ
ｏｏの放射線照射された末梢血単核白血球で、望ましく
は融合相手として使った同じ供血者からのものあるいは
別の供血者のものが使われた。
この雑種細胞の細胞表層の表現型はＴ３゛。
Ｔ４”、Ｔ８−である。しかしながら、この方法を使っ
て他の表現型の雑種細胞を作り出すことができる。上の
例はこの発明を説明するのに用いられたもので、この例
によって本発明が限定されるものでない。
正常供血者から採った単核細胞は、フィコール／ハイバ
ーク密度液による遠心分離を室温で行うことで分離さ九
た゛［Ａ、ボイアム（１９６８年）スカンジナビアン・
ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラ１−リー・イン
ベスティゲーシ目ン（Ｂｏｙｕｎ＋、　Ａ、（１９６Ｂ
）　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ。
Ｉｎｖｅｓｔ、）互、（補遺９７）７７］。細胞をハン
クスの調整塩溶液（１１Ｂｓｓ）で３回洗い、１５％の
熱不活性化したＦｅ２を含むＲＰＭＩ−１６４０に４×
１０″ｃａｌｌｓ／ｍＱの濃度で１！！／ｉｍした。リ
ンパ球分離試薬（テクニコンインス１−ルメン１−社、
ニューヨーク州タリータウン）を雫核細胞Ｗ８濁液に１
；２の容量比で加え、混合液を３７℃で３０分間回転装
置上でインキュベートした。貧食細胞は次に行われるフ
ィコール／ハイバーク密度液上での４００　Ｘ　Ｇ、２
０分間の遠心分離で除かムだ。貧食細胞のなくなったリ
ンパ細胞は中間層から集められ、ハンクスの調整塩溶液
（ＨＢＳＳ）で３回洗い、それから４　Ｘ　１０’　ｃ
ｅｌ、、１．ｓ／ｍ　Ｄ、に再懸濁した。
Ｔリンパ生玖男ｌ Ｔリンパ球はノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球（
５１１１３１０（５％５ＲＢＣのｍｆｌ当り２５単位）
とロゼツトを形成させ、先に述べたようにフィコール／
ハイバーク液で遠心分離することで調製された［プラト
ソーカス等（１９８０年）ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー［Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８
０）Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１２５．１２１６コ、
　ＨＢＳＳ中のリンパ球（４ＸＩＯ’　／＋＋＋Ｑ）の
２＋ｎＱをとり、熱不活性化して５ＲＢＣ吸収した仔牛
脂児血清Ｏ６５＋＋＋Ｑ及び１％ノイラミニダーゼ処理
した５ＲＢＣ２ｍ　Ｑと混合した。
混合液を５分間３７℃でインキュベートシ、２００×Ｇ
で５分間遠心分離後、さらに１時間４℃でインキュベー
トした。ロゼツトを注意深く再懸濁し、さらに１５分間
氷上でインキュベ−（へした。
細胞懸濁液はブイコール／ハイバーク密度液上にのせ、
２２℃にコントロールされた温度で２０分間４００　Ｘ
　にで遠沈した。非Ｔ細胞は中間層から回収し、ＨＢＳ
Ｓで３回洗滌した。ロゼツト・形成するＴ細胞は、トリ
スで緩衝化された０、８３％の塩化アンモニウム（ｐＨ
７，２）によって付着している５ＲＢＣを溶解後、ペレ
ットから回収された。Ｔ細胞はＨＢＳＳで３回洗滌した
。こうして！！［ｆＩ！１されたＥ−ロゼツト形成の細
胞は、非特異的エステラーゼ陽性の細胞を含まない５Ｒ
ＢＣで再びロゼツト形成させることで測定すると、９５
％以上がＴリンパ球であり、２％以下がイムノグロブリ
ンをもった細胞であった。Ｅ−ロゼツト陰性の細胞は免
疫蛍光法で測定すると、７０％以上が表面イムノグロブ
リン細胞で、１％以下がＥ−ロゼツト形成細胞または非
特異的なエステラーゼ陽性細胞を含んでいた。これらの
細胞はＢ細胞として使われた。１３細胞はＢ細胞増殖因
子の分析に使われる。
マイトジェンに対する増殖応答 １０％の仔牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０に２５
ｍＭのヘペス、２ｎ＋ＭのＬ−グルタミン、　１０００
／ｍ　Ｑのペニシリン及び１００μｇａｉｎ　Ｑのスト
レプトマイシンを添加したｊａ地でヒトの末梢血単核白
血球（Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｅｌ、１．ｓ／ｍ　Ｑで）を
培養した。
いろいろな濃度のマイトジェン（ＰＨＡ−Ｐ’、Ｃｏｎ
Ａ。
ＰＷＮ）による１００μＱの細胞ＷＡ濁液への刺激を、
Ｕ型マイクロリッタープレート（サイエンティフィク　
プロダクト社製）上、３７℃５％ｃｏ２．９５％空気の
環境下の湿潤培養器中で行った。培養物は７２時間後に
トリチウムでラベルされたチミジン（比活性６．７Ｃｉ
／＋＋＋ｍｏ　Ｉ）、、ニューイングランドニューフレ
ア社、マサチュセッッ州ボストン）２５μＱでパルスし
、このアイソトープ添加後２４時間に自動細胞回収装置
を使って細胞を集めた。
混合リンパ球培養 いろいろな供血者から採ったヒトの末梢血単核白血球は
上記のようにして調製した。
応答する細胞（ＩＸＩＯ’）を全景で０．２ｍＱになる
ように丸底のマイクロタイタープレー１−でｌＸｌ０”
の刺激細胞と培養した。刺激細胞はＸ線照射（２０００
ラド）で不活化した。培地は１０％の熱で不活化した仔
牛脂児血清、２５ｍＭのヘペス、２ｍＨのし一グルタミ
ン、ペニシリン（１０００／ｍ　Ｑ　）及びストレプト
マイシン（１００μｇ／ｍｕ）＆？ｉ加したＲＰＭＩ−
１６４０テあった。培養物は５％ｃ０２の湿潤環境下３
７℃でインキュベートされ、５０目に１μＣｉ／ウエル
の３Ｈ−チミジン（上記参照）でパルスし、その後−２
４時間目に自動細胞回収装置（スカートン製、ノルウェ
ー）で回収した。全ての培養は４点平行して行った。
ナチュラルｙラー＃ｌｌ胞−障害性 ナチュラルキラー細胞障害性は既述のようにして測定し
た〔プラトソーカス等（１９８０年）ジャーナル・オブ
・イムノロジー（Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ、ｅｔ　ａｌ。
（１９８０）Ｊ、　Ｉｍｍ＋、＋ｎｏ１．）１２５．１
２１６）　、上記のように１０％のＦＣ，Ｓ、グルタミ
ン、抗生物質を補充したＲＰＭＩ−１６４０で維持され
たに５６２及び阿ｏ１．ｔ−４系統の標的細胞は、２Ｘ
１０６細胞当り３００μＱの１Ｃｒ　（Ｎａ（”０ｒ）
Ｏ，、＝ニーイングランｌ−二ュクレアー、マサチュセ
ッッ州ボストン〕で２時間で標識した。標的細胞は３回
洗滌され、同じ培地に５　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍ
　Ｑの濃度で再ｌ＠濁された。エフェクターのリンパ球
は１０％のＦＣ５を補充したＲＩ’ＭＩ−１６４０で３
回洗い、°適当な濃度に８整した後、１００μαをエフ
ェクタ一対標的の割合が１００：１．５０：　１．２５
：　１等になるように、Ｕ底のマイクロタイタープレー
１〜中の標的細胞の１００μＱに添加した。プレートを
２分間４０×Ｇで遠心分離し、次いで５％ｃＯ２の湿潤
にした環境下３７℃でインキュベートした。４時ｒｔ［
＆）Ｉｉ　−トｔｒ５分間５ｏｏｘＧで遠沈し、１００
７ｚｆｌの上清を採り、ウェルタイプのオー１〜ガンマ
シンチレーシヨンカウンターで”Ｃｒの放出を計測した
。
比溶解率（％）は次式で計算される。
ここでＥはエフェクター細胞の存在において遊離するｃ
ｐｍの平均、 Ｓは培地だけでインキュベートすると き標的細胞によって自然に遊離す るｃｐｍの平均、 ＴはトライトンＸ　１’０Ｏ（１：　ｔｏｏ希釈）で標
的細胞を処理した後に遊離する ｃｐｍの平均である。
工」［」Ｌ斐 １０％の熱不活化したＦｅ２．２５＋ａＭのヘベス緩衝
液、２ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生物質としてストレ
プトマイシン１００μＢａｒｎ　Ｑ、ペニシリン１００
０／ｍ　Ｑを加えたＲＰＭＩ−１６４０で、末梢血単核
白血球（ＭＮＩ、）をＩ　Ｘ　１０ｒ′ｃｅｌｌｓ／＋
ｎ　Ｑの濃度で８８時間培養した。
対照試料は上記の培地でインキュベートし、試験試料は
Ｊｕｒｋａｔ、その他の細胞系統によって産生されるＳ
Ｆと共にインキュベートした。試料を２０、４８．６８
．８ａ時間に採取した。細胞は２回洗われ、生細胞率を
トリパンブルー染色法で測定した。
全Ｊジ【曵Ｊｕｔ１ これは笠張のリン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を用い、
ＡＣＡ−４４ウルトロゲル（ＬＫＢ社製）のゲル濾過に
よって実施した。分子量のマーカーとして使われたのは 牛血清アルブミン　　分子量６８　、０００卵　白アル
ブミン　　　　　４３，０００チ１−クロームＣ１１，
７００ であった。
塚影ｑ■ｌ側蜆ゑ分化系におけるヒト末梢直重　白血球
による１０％の熱で不活化したＦｅ２．２ＩＩＩＭのグ
ルタミン、ヘペス及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ−１
６４０中でｌＸｌ０ｒ″ｃｅｌｌｓ／ｍ　Ｑのヒト末梢
血単核白血球を全容量２ＩｌｌＱで３７℃、５％Ｃ０２
の湿潤培養器中に於て７日間培養した。ポークライード
のマイトジェン（１０μｇ／ｍ　Ｑの至適濃度、グラン
ドアイランドバイオケミカル社、ニューヨーク州グラン
ドアイランド）を培養のばしぬがら添加した。７日間培
養後、試験管を４００ＸＧで遠沈し、上清を注意深く取
り出し、イムノグロブリンについて分析するまで一２０
℃で保存した。
これらの定置はエングバルとバールマンがジャーナル・
オブ・イムノロジー（Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄＰｅｒｌ
、ｍａｎｎ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１０９．１２
９（１９７２）に記載した方法の修正法で行われた。ウ
サギの抗ヒトイムノグロブリン抗体で、Ｈ鎖に特異的な
もの（ミュー、ガンマあるいはアルファ）（アキュレイ
トケミカル社製）を、　０．０５％アジ化ソーダを含む
ｐｌｆ９．６の０．１０　Ｍ　Ｎａ２Ｃｏ、で、５ｇ／
ｒｎｌｌの濃度に調整した。ウェル当り２００μＱの抗
体溶液を、９６ウエルの丸底マイクロタイタープレート
に移注し、３７°Ｃで３時間インキュベー１−シた。
プレートを使用するまで４℃に保存したが、２週間以上
安定であった。使用前にプレートを０．０２％のツイー
ン２０を含むＰＢＳで３回洗い、洗。
滌と洗滌の間ではプレートを５分間室温で放置した。未
知のイムノグロブリンを含む培養上清のいくつかの希釈
液を、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳで調製し、
０．２ｍＱをプレー１−に移注した。
そのプレー１〜を５時間室温でロケッ１へ台上でインキ
ュベートした。
上清を吸引して取り除き、０，０２％のツイーン２０を
含むＰＢＳで試験管を３回洗った。アルカリフォスファ
ターゼを結合したウサギの抗ヒトイムノグロブリン抗体
（Ｈ鎖に特異的）は、　ＡＭＦイムツリアジエンド社（
テキサス州、セフイン）から得た（ガンマ、ミューある
いはアルファーのＨ鎖特異的）。使用に先立ち、結合体
は過剰のグルタルアルデヒドを吸収するために、リン酸
塩緩衝化食塩水にとかした１％卵白アルブミン溶液で吸
収された（室温で１時間）。ｐｎｓ−ツイーン２０で１
　：　５００に希釈した結合体のｌ　ｍ　Ｄ、を、抗ヒ
トＸｇ抗体をコーティングした試験管に加え、その試験
管を１６時間室温でインギコベ−１−Ｌ、た。
次いでプレー１−をＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗うこ
とによって結合しなかった酵素結合体を除いた。
Ｍ　ｆｔ、　ニルー二１−ロフェニルフオスフェ−１−
（ＮＰＰ、シグマ製）を使って、結合したアルカリフォ
スファターゼ結合ウサギ抗ヒトＨ鎖特異性抗体の量を定
量した。１．０−”　Ｍ　ＭｇＣ１２２を含む０．０５
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液にＮＰＰ　ｔｉ−濃度１ｍｇ／
Ｑで溶かした溶液１．　ｍ　Ｑ、をプレー１−に加え、
１時間後にタイターチックＥＬＩＳＡリーダーを使って
遊離してくるρ−ニトロフェル−１へを４０５ｎｍで測
定した。ポリクローナルのイムノグロブリン分泌には精
製したＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ　イムノグロブリンを使
って、またイディオタイプのイムノグロブリン分泌の定
量には多発性ミエローマ（骨髄腫）患者からとった精製
標品を使って検量線を作成した。（ＰｎＳ＝ｎＳニリン
衝化食塩水）インターフェロンの定量 α−とγ−インターフェロンは、水痘性口内炎ウィルス
でチＡ・レンジした第２１染色体が三倍体のヒＩ−繊維
芽細胞またはウシの腎細胞（ＭＤＢＫ細胞）を用いた標
？）【！的な細胞変性効果の減少によって測定した、フ インターフェロンのタイターは、細胞変性効果を５０％
に減少させる最高の希釈度の逆数で定量した。他の実験
ではα−またはγ−インターフェロンに特異的なモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体を、Ｉ＋ＩＩ　Ａと
ＳＦを添加する直前に単核細胞に加えた。このモノクロ
ーナル抗体はＰＨＡに対するＭＴＣの増殖応答をＳＦが
抑制するのを妨害しなかった。
リンホトキシンやＴＮＦは、Ｅ、カーズウエル等。
［プロシーディンゲス・オブ・ザーナショナルーアカデ
ミー・オブ・サイエンスＵ、Ｓ、Ａ、　（Ｃａｒｓｗｅ
ｌｌ。
Ｅ、ｅｔａｌ、（１９７５）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｊ　’
　　１．　　Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、、Ｕ、Ｓ、’Ａ、］７
２．３６６６］の方法によって定量シた。
ＢＣＧＦ測定 Δ、ムラグチと゛Ａ、Ｓ、ファウチの方法、［ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（ＭｕｒａＨｕｃｈｉ、Ａ、ａ
ｎｄ　Ａ。
Ｓ、Ｆａｕｃｉ　（１９８２）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、）−１２９，１１０４参照］が使われた。
白血球の増殖応答を抑制する因子が報告され。
同定されている。特にこれらの因子（抑制因子）は、ヒ
トのリンパ芽球細胞系統、特にＴ細胞系統やその他のＢ
細胞系統あるいは赤血球白血病細胞系統のような造血幹
細胞によって作られていることが判った。抑制因子を産
生ずることが知られている特別なＴ細胞系統は、Ｊｕｒ
ｋａｔ。
ＨＰＢ−ＡＬＬ、　　ＴＡＬＩ、−１，ＨＤ−ＭＡＲ，
５Ｋｖ−３，ＤＮＤ　４１．、　　ｌ（ＰＢ−ＭＬＴ、
　ＭＯＬＴ−４などである。Ｋ−５６２のような赤血球
白血病細胞株もＳＦを産生する。ＣＥＳＳのようなり細
胞系統もＳＦを産生する。このデータは１９８４年５月
１１日に出願されたアメリカ特許出願番号第６０９．２
７３号（ＳＫ３Ｌ４）にみられ、その出願はこの明細書
にも引用′されている。
そのような細胞から得た培養上清は、ファイトへマグル
チニン（ＰＩＩＡ）、コンカナベリンＡ（ＣｏｎＡ）及
びホークライードマイトジェン（１’ＷＭ）のようなマ
イｌ−ジエンに対するＴ−リンパ球の増殖応答を抑制す
る（第■〜■表）。
それはまた混合リンパ球培ｉ（ＭＬＣ）における同種異
遺伝子型細胞に対するＴ細胞の増殖応答を抑制する（第
■表）。
この因子Ｉ：Ｉまた、血液細胞の抗体産生、特にＰＷＭ
で誘起される系でのヒト末梢血単核白血球によるインビ
トロの抗体産生を阻害する（第７表）。ＳＦはＩ３細胞
のある細胞増殖応答を阻害するだろうａ　ＳＦの作用は
細胞の働きを抑えるもののようで、細胞障害性ではない
。なぜなら、それは（１）４Ｅ１間の培養の後、培養液
中のヒト末梢血単核白血球の生細胞率に影響を与えず（
第■表）　、　（２）クロムの遊離測定のような分析法
で測定されるに５６２白血病細胞の標的を溶解させず、
そして（３）この因子はに５６２標的細胞に対するナチ
ュラルキラー細胞の細胞障害性に影響を及ぼさない（第
■表）からである。
この因子はまた、ある種のヒト腫ＪＩＢ　、Ｔｉ１ｌ胞
系統（肺、大腸など）からの細胞のインビトロにおける
生育を阻害する（第１表）。
これらの因子はＡＣＡ−４４ゲルｆ過法で測定すると、
５５〜７０　、０００の範囲の相対的分子量を示す、第
■〜■表はＣｏｎＡ　、　ＰＩｌｌＭ　、　ＰＨＡのよ
うなマイトジェンに対する末梢血単核白血球の増殖応答
に及ぼすＳＦの阻害効果を示している。これらの例では
Ｊｕｒｋａｌｚ、Ｍｏ１ｔ−４、Ｋ５６２や１（ＰＢ−
ＡＬＬ細胞のような赤血球白血病細胞系統によって、そ
の他の細胞系統と同様に、ＳＦが産生されている。ｃｃ
ｓｓのＢ細胞系統は一般にＳＦに陽性である。さらに加
えて血球幹細胞ハイブリドーマもＳＦを産生ずる。
ＴＴ細胞ハイブリドーマから得られる培養上清は、ＰＨ
Ａ、　ＣｏｎＡ、　ＰｖＭのようなマイトジェンに対す
るＴリンパ球の増殖応答を阻害する（第■表）。
Ｔ−Ｔ細胞ハイブリドーマのＳ’Ｆはまた、混合リンパ
球Ｊ’ｌ’Ｆ養（ＭＬＣ）での同種異逍伝子型細胞に対
する１゛細胞の増殖応答を明害する（第Ｘ表）。
Ｔ　−Ｔ　細胞ハイブリドーマからのこの因子はまた、
Ｂ　Ｋ（ＩＩ胞、特にＰＷＭでひきおこされる系でのヒ
ト末梢血単核白血球によるインビ１〜口での抗体産生を
阻害する（第ＸＴ表）。ＳＦはＢ細胞のある増殖応答を
阻害するのだろう。
Ｔ−Ｔ細胞ハイブリドーマのＳＦの作用は、細胞抑制的
であり、細胞障害性でない。なぜならそれが４日間の培
養の後培養物中のヒト末梢血単核白血球の生細胞率に影
響しないからである（第ｘｎ表）。
この因子は１（−５６２標的細胞に対するナチュラルキ
ラー（Ｎ１０細胞の細胞障害性に影響を与えない（第Ｘ
ｍ表）。
これらの因子はヒ１−に対してばかりでなく、マウスの
細胞にも作用する（第Ｘ■表）。
ＴＴｊｉ胞のＳＦはα−またはγ−インターフェロンで
なく、またリンボトキシンや腫脹壊死因子１（ＴＮＦ）
でもない。
Ｔ−ＴＪＩ胞ハイ、ブリドーマのＩＩＬＡタイプが第Ｘ
Ｖ表に示されている。
ある種のＴ−Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｂ細胞増殖因子
を産生ずる。これらの結果は第ＸＶＩ表に示されている
。これらのハイブリドーマはＳＦを産生ずる細胞とは異
なっている。
これらの実例は説明を目的とするのみであって、本発明
を限定することを意味しない。
（以下余白）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記のステップ（ａ）〜（ｆ）を包含するＴＴハイ
    ブリドーマ細胞のようなヒトの雑種細胞の製造法 （ａ）ＨＡＴあるいはその他の薬剤に感受性でないリン
    パ芽球細胞系統から得る細胞 を末梢血単核細胞あるいは適当な比率の マイトジェンや同種抗原で刺激された精 製Ｔ細胞と混合する、 （ｂ）ステップ（ａ）からの混合細胞を分離し取り去る
    、 （ｃ）混合細胞にポリエチレングリコールを含む融合培
    地を加える、 （ｄ）ステップ（ｃ）の混合細胞を融合細胞すなわち雑
    種細胞を得るために１日ないし ６０日間インキュベートする、 （ｅ）ステップ（ｄ）で得られる細胞試料を半固体培地
    と混合することによって雑種細 胞を選択する、 （ｆ）得られるＴＴ細胞の雑種細胞の生物学的機能及び
    ＨＬＡタイプの両方またはい づれかを決定する、 ２、ステップ（ｄ）における細胞のインキュベーション
    が１０、１５、２０日からなる群から選ばれる期間であ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、半固体培地が寒天である特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ４、雑種細胞がＳＦを産生する特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ５、特許請求の範囲第１項記載の方法によって生産され
    るヒトの細胞の雑種細胞。 ６、特許請求の範囲第１項記載の方法によって生産され
    る雑種細胞によって生産されるＳＦ。 ７、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、ＰＷＭ及びそれらの混合物から
    なる群から選ばれるマイトジェンに対するＴリンパ球の
    増殖応答をそのＳＦが阻害する特許請求の範囲第６項記
    載のＳＦ。 ８、混合リンパ球培養における同種異遺伝子細胞に対す
    るＴ細胞の増殖応答をそのＳＦが阻害する特許請求の範
    囲第６項記載のＳＦ。 ９、ヒトの血液細胞の抗体産生をそのＳＦが阻害する特
    許請求の範囲第６項記載のＳＦ。 １０、ＰＷＭで誘発される系でのヒトの末梢血単核白血
    球による抗体のインビトロ生産をそのＳＦが阻害する特
    許請求の範囲第６項記載のＳＦ。 １１、Ｂ細胞の増殖応答をそのＳＦが阻害する特許請求
    の範囲第６項記載のＳＦ。 １２、そのＳＦがヒトの末梢血単核白血球の生細胞率に
    影響を与えない特許請求の範囲第６項記載のＳＦ。 １３、そのＳＦがＫ−５６２標的細胞に対するナチュラ
    ルキラー細胞の細胞障害性に影響を与えない特許請求の
    範囲第６項記載のＳＦ。 １４、リンホトキシン、ＴＮＦあるいはα−またはγ−
    インターフェロンを含まない特許請求の範囲第６項記載
    のＳＦ。 １５、相対分子量がゲルろ過で測定して５０〜７０，０
    ００の特許請求の範囲第６項記載のＳＦ。
JP60119652A 1984-05-31 1985-05-31 ヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マの製法とヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マによる抑制因子の製法 Pending JPS6117518A (ja)

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