JPH0530437B2 - - Google Patents
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- JPH0530437B2 JPH0530437B2 JP58043992A JP4399283A JPH0530437B2 JP H0530437 B2 JPH0530437 B2 JP H0530437B2 JP 58043992 A JP58043992 A JP 58043992A JP 4399283 A JP4399283 A JP 4399283A JP H0530437 B2 JPH0530437 B2 JP H0530437B2
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- Japan
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- cells
- medium
- human
- cell
- agr
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規なヒト培養株化細胞に関する。
更に詳細には、コロニー形成刺激因子（Colony
−stimulating factor；CSF）を産生し、且つ永
代培養可能な、ヒト白血病Ｔ細胞由来の培養株化
細胞に関する。 骨髄係幹細胞に由来する顆粒球、マクロフアー
ジ系幹細胞に作用し、これを成熟血球、すなわち
顆粒球及び／又はマクロフアージに分化させる体
液性因子としてCSFが知られている〔Journalof
Immunological Methods，42，253−284（1981）
及び「血液の病態生化学」第１〜３頁、1979年６
月25日株式会社朝倉書店発行参照〕。 該CSFは、その活性に基づき、例えば癌治療中
の患者等における顆粒球、マクロフアージの減少
症、あるいは種々の感染症の予防及び治療薬とし
て、並びに骨髄移植治療用薬剤として有用な物質
である。 本発明者等は、ヒトCSFの持続産生能を有する
細胞株の検索につき種々研究を重ねる過程におい
て、本発明者の山村及び岸本によりすでに確立さ
れたヒトＴ細胞株CEN−AGR〔Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA Vol.78 No.12，pp7717〜7721
（1981）〕の培養上清中にはCSF活性が認められる
場合があることを見出し、このCSF活性を指標に
して更に選別培養（クローニング）を繰返した結
果、CSF産生能を有する細胞を新たに単離するこ
とに成功し、これを培養株化細胞として確立し
た。また上記細胞株は、生体外で長期安定に継代
培養でき、よつて該細胞株を培養することによ
り、CSFを均質な状態で多量生産することが可能
となることを見出した。本発明は、これら新知見
に基き完成されたものである。 すなわち本発明はヒト白血病Ｔ細胞由来の下記
特性を有するヒト培養株化細胞「AGR−ON」に
係る。 ａ 形態；リンパ様細胞 ｂ 増殖性；100μM8−アザグアニン、（８−
AG）、10％牛胎児血清（FCS）、５×10-5M2−
メカルカプトエタノール、100μｇ／mlストレ
プトマイシン、100単位／mlペニシリンＧ、
50μｇ／mlゲンタマイシン及び１ｍＭグルタミ
ンを含むRPMI−1640培地において良好に増殖
する。 ｃ 継代培養；限界なく継代培養が可能である ｄ 凍結保存；液体窒素中で容易に長期保存でき
る ｅ 酸素欠損；HGPRT酸素欠損株であり、１×
10-4Ｍヒポキサンチン、４×10-7Ｍアミノプテ
リン及び1.6×10-5Ｍチミジンを含むRPMI−
1640培地で死滅する ｆ 染色体数；43〜54本 ｇ 物質産生能；コロニー形成刺激因子（CSF）
の持続産生能を有する。 上記本発明の細胞株は、ヒトCSFの製造に有用
であり、これを純度よく大量に製造することがで
きる。更に本発明の細胞株のCSF産生能は長期に
わたり安定であり、低下が認められていない。ま
た本発明細胞株はHGPRT欠損株であり、ヒトＴ
細胞の細胞融合の親細胞としても有用であり、殊
にその細胞表面表現型が明確であることより、該
細胞より誘導された融合細胞の選別時に該表現型
を利用することができ、好適なものである。 本発明の細胞株は、上記により特徴づけられる
が、その細胞学的及びその他の諸性質について詳
述すれば次の通りである。 (1) 形態学的特徴 リンパ様細胞；径は正常ヒト末梢血Ｔ細胞の約
２〜３倍であり、ほぼ球形をなす。細胞内におけ
る核の占める割合は大で、原形質が僅かに認めら
れる。原形質内には僅かの顆粒が認められる。時
として変形した細胞が存在する。 (2) 染色体数 本発明「AGR−ON」の染色体数を以下の方法
により計算した。即ち対数増殖期にある細胞の培
地にコルセミド（シグマ社製）を0.1μｇ／mlとな
るように添加した。２時間後、細胞浮遊液を遠心
管に移し、1000r.p.mで５分間遠心し、沈査細胞
上に１％のクエン酸ナトリウム溶液約１mlを加
え、ゆるやかに混ぜ合せた後、室温で約15分間放
置した。固定液（メタノール；氷酢酸＝３：１）
を静かに上層していき、約10mlとなつたとき、静
かに攪拌した。そのままで５分間放置後、遠心
し、新しい固定液に細胞を懸濁した。同様な操作
を３回繰り返し、最後に固定液１〜２mlに細胞を
懸濁し、その細胞浮遊液をスライドグラス上に２
〜３滴づつ落とし、空気乾燥させた。１／15Mリ
ン酸緩衝液（PH6.8）で約２％に稀釈したギムザ
（Giemsa）液（メルク社製）で15〜20分間染色
し、水洗後乾燥した。顕微鏡下で60倍のノーカバ
ー用レンズを用いて、良く拡がつた中期分裂像50
個を観察し、染色体数を計数した。 その結果は、下記第１表に示す通りであり、本
細胞の染色体数は43〜54本の間にあり、平均45本
である。
更に詳細には、コロニー形成刺激因子（Colony
−stimulating factor；CSF）を産生し、且つ永
代培養可能な、ヒト白血病Ｔ細胞由来の培養株化
細胞に関する。 骨髄係幹細胞に由来する顆粒球、マクロフアー
ジ系幹細胞に作用し、これを成熟血球、すなわち
顆粒球及び／又はマクロフアージに分化させる体
液性因子としてCSFが知られている〔Journalof
Immunological Methods，42，253−284（1981）
及び「血液の病態生化学」第１〜３頁、1979年６
月25日株式会社朝倉書店発行参照〕。 該CSFは、その活性に基づき、例えば癌治療中
の患者等における顆粒球、マクロフアージの減少
症、あるいは種々の感染症の予防及び治療薬とし
て、並びに骨髄移植治療用薬剤として有用な物質
である。 本発明者等は、ヒトCSFの持続産生能を有する
細胞株の検索につき種々研究を重ねる過程におい
て、本発明者の山村及び岸本によりすでに確立さ
れたヒトＴ細胞株CEN−AGR〔Proc.Natl.Acad.
Sci.，USA Vol.78 No.12，pp7717〜7721
（1981）〕の培養上清中にはCSF活性が認められる
場合があることを見出し、このCSF活性を指標に
して更に選別培養（クローニング）を繰返した結
果、CSF産生能を有する細胞を新たに単離するこ
とに成功し、これを培養株化細胞として確立し
た。また上記細胞株は、生体外で長期安定に継代
培養でき、よつて該細胞株を培養することによ
り、CSFを均質な状態で多量生産することが可能
となることを見出した。本発明は、これら新知見
に基き完成されたものである。 すなわち本発明はヒト白血病Ｔ細胞由来の下記
特性を有するヒト培養株化細胞「AGR−ON」に
係る。 ａ 形態；リンパ様細胞 ｂ 増殖性；100μM8−アザグアニン、（８−
AG）、10％牛胎児血清（FCS）、５×10-5M2−
メカルカプトエタノール、100μｇ／mlストレ
プトマイシン、100単位／mlペニシリンＧ、
50μｇ／mlゲンタマイシン及び１ｍＭグルタミ
ンを含むRPMI−1640培地において良好に増殖
する。 ｃ 継代培養；限界なく継代培養が可能である ｄ 凍結保存；液体窒素中で容易に長期保存でき
る ｅ 酸素欠損；HGPRT酸素欠損株であり、１×
10-4Ｍヒポキサンチン、４×10-7Ｍアミノプテ
リン及び1.6×10-5Ｍチミジンを含むRPMI−
1640培地で死滅する ｆ 染色体数；43〜54本 ｇ 物質産生能；コロニー形成刺激因子（CSF）
の持続産生能を有する。 上記本発明の細胞株は、ヒトCSFの製造に有用
であり、これを純度よく大量に製造することがで
きる。更に本発明の細胞株のCSF産生能は長期に
わたり安定であり、低下が認められていない。ま
た本発明細胞株はHGPRT欠損株であり、ヒトＴ
細胞の細胞融合の親細胞としても有用であり、殊
にその細胞表面表現型が明確であることより、該
細胞より誘導された融合細胞の選別時に該表現型
を利用することができ、好適なものである。 本発明の細胞株は、上記により特徴づけられる
が、その細胞学的及びその他の諸性質について詳
述すれば次の通りである。 (1) 形態学的特徴 リンパ様細胞；径は正常ヒト末梢血Ｔ細胞の約
２〜３倍であり、ほぼ球形をなす。細胞内におけ
る核の占める割合は大で、原形質が僅かに認めら
れる。原形質内には僅かの顆粒が認められる。時
として変形した細胞が存在する。 (2) 染色体数 本発明「AGR−ON」の染色体数を以下の方法
により計算した。即ち対数増殖期にある細胞の培
地にコルセミド（シグマ社製）を0.1μｇ／mlとな
るように添加した。２時間後、細胞浮遊液を遠心
管に移し、1000r.p.mで５分間遠心し、沈査細胞
上に１％のクエン酸ナトリウム溶液約１mlを加
え、ゆるやかに混ぜ合せた後、室温で約15分間放
置した。固定液（メタノール；氷酢酸＝３：１）
を静かに上層していき、約10mlとなつたとき、静
かに攪拌した。そのままで５分間放置後、遠心
し、新しい固定液に細胞を懸濁した。同様な操作
を３回繰り返し、最後に固定液１〜２mlに細胞を
懸濁し、その細胞浮遊液をスライドグラス上に２
〜３滴づつ落とし、空気乾燥させた。１／15Mリ
ン酸緩衝液（PH6.8）で約２％に稀釈したギムザ
（Giemsa）液（メルク社製）で15〜20分間染色
し、水洗後乾燥した。顕微鏡下で60倍のノーカバ
ー用レンズを用いて、良く拡がつた中期分裂像50
個を観察し、染色体数を計数した。 その結果は、下記第１表に示す通りであり、本
細胞の染色体数は43〜54本の間にあり、平均45本
である。
【表】
(3) Ｔ細胞特異抗原発現性
本発明「AGR−ON」の細胞表面表現型を、公
知のヒト白血病Ｔ細胞株CCRF−CEM（ATCC寄
託No.CCL119），CEM−AGR〔ATCC寄託No.CRL−
8081；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，Vol.78，No.
12，pp.7717−7721（1981）〕及びヒト末梢血Ｔ細
胞と対比して検討した。 即ち、各細胞を５×105個／ml濃度に調整し、
100μの適当なモノクローナル抗体〔オーソミ
ユーニOKシリーズモノクローナル抗体（Ortho
Pharmaceutical Co；Raritan，Newjersey，
USA）及びベクトン デイツキンソン Leuシリ
ーズモノクローナル抗体（Becton ＆
Dickinson；Sunnyvale.California，USA）〕と
４℃で30分間反応させた後、細胞を５％FCSを含
むMEM培地で２回洗浄し、FITC（fluoressein
isothiocyanate）結合−ウサギ抗マウス免疫グロ
ブリン（マイルス−イエーダー社（イスラエル）
製）と反応させ、Ｔ細胞表面の特異抗原発現性を
間接免疫蛍光抗体法により測定した。100個の細
胞について調べた結果を下記第２表に示す。第２
表より、本発明の「AGR−ON」はT4，Leu1及
びLeu3a抗体に対して100％陽性であり、T3，T8
及びLeu2a抗体に対して陰性であつた。 Leu1陽性であることより、本細胞はＴ細胞株
であり、またT4及びLeu3a陽性であることより、
本細胞はヒトインデユーサー／ヘルパーＴリンパ
球サブクラスに属することが証明された。
知のヒト白血病Ｔ細胞株CCRF−CEM（ATCC寄
託No.CCL119），CEM−AGR〔ATCC寄託No.CRL−
8081；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，Vol.78，No.
12，pp.7717−7721（1981）〕及びヒト末梢血Ｔ細
胞と対比して検討した。 即ち、各細胞を５×105個／ml濃度に調整し、
100μの適当なモノクローナル抗体〔オーソミ
ユーニOKシリーズモノクローナル抗体（Ortho
Pharmaceutical Co；Raritan，Newjersey，
USA）及びベクトン デイツキンソン Leuシリ
ーズモノクローナル抗体（Becton ＆
Dickinson；Sunnyvale.California，USA）〕と
４℃で30分間反応させた後、細胞を５％FCSを含
むMEM培地で２回洗浄し、FITC（fluoressein
isothiocyanate）結合−ウサギ抗マウス免疫グロ
ブリン（マイルス−イエーダー社（イスラエル）
製）と反応させ、Ｔ細胞表面の特異抗原発現性を
間接免疫蛍光抗体法により測定した。100個の細
胞について調べた結果を下記第２表に示す。第２
表より、本発明の「AGR−ON」はT4，Leu1及
びLeu3a抗体に対して100％陽性であり、T3，T8
及びLeu2a抗体に対して陰性であつた。 Leu1陽性であることより、本細胞はＴ細胞株
であり、またT4及びLeu3a陽性であることより、
本細胞はヒトインデユーサー／ヘルパーＴリンパ
球サブクラスに属することが証明された。
【表】
(4) ロゼツト形成
抗体補体感作ヒツジ赤血球（EAC）における
ロゼツト形成を、200個の細胞につき、400倍の顕
微鏡下で測定した結果、１％以下が陽性である。 (5) Ｂ細胞、マクロフアージマーカー発現性 (a) FITC−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリ
ン（Behring werke AG.Marhurg）を用い
た直接免疫蛍光抗体法により解析した表面免
疫グロブリン（Ig）は、１％以下陽性であ
る。 (b) モノクローナル−抗−DR抗体 （Becton−Dickinson Co.）を用いた間接免疫
蛍光抗体法により解析したヒトHLA−DR抗原
（DR）は、１％以下陽性である。 (c) またビールス（Epstein−Barr virus）で
トランスフオームしたヒトＢ細胞株（CESS.
スローン、ケタリング癌研究所のピーターラ
ルフ博士より入手）により免疫されたマウス
脾細胞とミエローマP3U1（Elbert Einstein
College of Medicineより入手）との細胞融
合株から得た〔Miki.Y.et al.，Journal of
Immunology，129，1921（1982）参照〕モノ
クローナル抗体ヒトＢ細胞抗体を用い、間接
免疫蛍光抗体法により解析した、ヒトＢ細胞
特異抗（Ｂ抗原）の表現性は、１％以下が陽
性である。尚上記抗体はＢ細胞乃至そのライ
ンとは反応するが、Ｔ細胞乃至そのラインと
は反応しない。 (d) ヒトマクロフアージ腫瘍細胞株U937細胞
をBALB／ｃマウスに免疫し、この
BALB／ｃマウスより得た脾Ｂ細胞とミエ
ローマ細胞P3U1とをポリエチレングリコー
ルを用いて細胞融合させ、ヒトマクロフアー
ジに対するモノクロナル抗体を産生するメウ
スＢハイブリドーマを得た〔Maruyama S.
et al.，Journal of Clinical Immunology，
３，57（1983）参照〕。この抗体はU937や正
常ヒトマクロフアージには特異的に結合する
が、正常ヒトＴ細胞やＢ細胞或いはヒトＴ細
胞ラインやヒトＢ細胞ラインとは反応しない
ものである。この抗体を用い、同様に間接蛍
光抗体法により解析したヒトマクロフアージ
抗原の表現性は、１％以下が陽性である。 (6) 増殖性 ８−アザグアニン（８−AG，100μM）、100μ
ｇ／mlストレプトマイシン、100単位／mlペニシ
リンＧ，50μｇ／mlゲンタマイシン、10％牛胎児
血清（FCS），５×10-5M2−メルカプトエタノー
ル及び1mMグルタミンを含むRPMI−1640培地
（フロ− ラボラトリー社製）において良好に増
殖する。 (7) 増殖条件 一般に36〜38℃の温度条件下及びpH7.2〜7.3の
条件下で良好に増殖する。また５％炭酸ガス及び
95％空気のインキユベーター内での培養が好適で
ある。 (8) 継代培養 限界なく継代培養が可能である。 (9) 凍結保存 20％FCSを含むRPMI−1640培地90％、ジメチ
ルスルフオキシド（DMSO）10％の条件で凍結
し、液体窒素中で容易に長期保存できる。 (10) ８−アザグアニン（８−AG）耐性100μMの
８−AGに耐性があり、ヒポキサンチン（１×
10-4Ｍ）、アミノプテリン（４×10-7Ｍ）及び
チミジン（1.6×10-5Ｍ）を含む培地（HAT培
地）で死滅する。この結果より「AGR−ON」
は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフエラーゼ（HGPRT）欠損株である
ことが明白である。 (11) マイトジエン反応性 コンカナバリンＡ（ConA）10〜100μｇ／mlの
添加及び植物性赤血球凝集素、フイトヘモアグル
チニン（PHA）の１〜10％添加により、分裂増
殖は部分的に抑制される。ポツクウイードマイト
ジエン（PWM）及びプロテインＡ（ProA）は、
いかなる濃度においても本細胞株の分裂増殖に影
響を与えない。 本発明細胞株「AGR−ON」は、８−AG耐性
ヒト白血病Ｔ細胞より、常法に従つて、前記した
特性を有する「AGR−ON」をクローニングする
ことにより収得できる。上記８−AG耐性ヒト白
血病Ｔ細胞は、常法、例えば特開昭57−206383号
に記載の方法に従つて製造され、これは公知のヒ
ト白血病Ｔ細胞、例えばCCRF−CEM〔J.Kaplan
et al.，Exp.Med.，139，1070〜1076（1974）〕を
起源とし、これを10％FCS含有RPMI−1640培地
に８−AGを添加した培地で培養し、８−AG添
加量を順次増加させていくことにより取得するも
のである。より具体的には例えばまず2μMの８
−AGを添加した培地で１週間培養し、生存細胞
を次に16μMの８−AGを含む培地で１週間培養
し、その後同様に８−AG濃度を２倍づつ増加さ
せた培地で順次培養し、最終的に８−AG濃度を
100μMとした培地に生存する８−AG耐性細胞株
を使用すればよく、該細胞株の代表例としては、
例えば前述のCEM−AGR〔ATCC寄託No.CRL−
8081〕を挙げることができる。 上記「AGR−ON〕のクローニングは、常法に
従つて行なえばよく、より詳細には、例えばソフ
トアガー法〔Methods in Enzymology，Vol.73.
p1〜45（1981）〕に従い実施できる。即ち200〜
2000／mlに希釈した細胞浮遊液を、２倍濃度の培
養液（８−AG添加RPMI 1640等）で作製し、直
ちに、37℃に加温した0.3％ソフトアガー（Difco
Lab.，Detroit.Ml.）液を等量に混ぜ合せ、プラ
ストツクデイツシユにプレーテイングする。その
量はデイツシユの大きさによりまちまちである
が、直径３cmのデイツシユに対しては１〜1.5ml、
５〜６cmのものには２〜2.5ml加えるのがよい。
培養開始後10〜14日位で肉眼でも分るコロニーを
形成してくる。この時点で、先を細くしたバスツ
ールピペツトを用いて、倒立顕微鏡下で１個のコ
ロニーだけを吸引でひろいあげ、予め用意してお
いた96穴平底培養プレート内の培養液に移して培
養する。 得られた各コロニーは、そのCSF産生能を通常
の方法〔例えばJournal of Immunological
Methods，42pp253〜284（1981）〕に従い検索し
て本発明の「AGR−ON」を単一の細胞株として
分離する。 かくして得られる本発明の細胞株「AGR−
ON」は、前述の諸特性を有し、これは、出願人
によつて、1983年１月24日に、アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン（ATCC）に
「ATCC寄託No.CRL−8199」として受託されてい
る。 上記本発明の細胞株「AGR−ON」からのCSF
の製造は、これを常法に従つて、組織培養し、培
養上清から分離する方法により実施される。 上記組織培養は、通常の栄養培地中で行なわれ
る。栄養培地としては、特に限定なく、この種の
細胞培養に頻用される、例えばRPMI−1640，
MEM等をFCSで改質した培地等を挙げることが
できる。培養条件としても特に限定されず、例え
ば細胞濃度１〜10×105個／ml程度で、前記した
増殖条件に従つて通常３日程度培養すればよい。
かくして培養液中に、CSFが生産される。該CSF
は常法に従い例えば、塩析、クロマトグラフイ
ー、電気泳動法、透析等の物理化学的手段により
更に精製することができる。 かくして本発明細胞「AGR−ON」の利用によ
れば、非常に容易に高収率、高純度で所望のCSF
を収得でき、該CSFの大量生産が工業的規模で実
施できる。しかもかくして得られるCSFは活性が
強く、毒性が低く、更にその製造工程での活性低
下もなく、従来公知のCSFと同様の用途に、より
有利に利用できるものである。 以下、本発明を詳しく説明するため、実施例及
び試験例を掲げる。 実施例１ 「AGR−ON」の製造 CEM−AGR〔ATCC寄託No.CRL−8081〕を、
100μM8−AGを含む同一培地にて1000個の／ml
に希釈して細部浮遊液を作成し、直ちに、37℃に
加温した0.3％ソフトアガー（デイフコ社製）液
に混合し、プラスチツクデイツシユ（φ3cm）に
約１mlずつプレーテイングする。培養14日後に形
成してくるコロニーをパスツールピペツトを用い
て、倒立顕微鏡下にひろいあげ、96穴平底培養プ
レート内の上記培養液に移して培養した。得られ
た各クローンは、後記試験例に基づき、その培養
上清のCSF活性を測定して、本発明の細胞株
「AGR−ON」を得た。この株はその後同濃度
（100μM）の８−AGを含むRPMI−1640＋10％
FCS培地にて強い増殖を示し、この培地で継代培
養により維持されている。またその脂肪学的及び
その他の特性は前述した通りであつた。 試験例 (1) 上記実施例１で得た「AGR−ON」を、
RPMI−1640＋10％FCS培地を用いて５×105
個／ml濃度に調整し、これをプラスチツク細胞
培養液用フラスコ（コーニング社製、25cm2／70
ml）にて３日間、37℃下、５％炭酸ガスインキ
ユベーター内で培養した。遠心分離して得た培
養上清10mlを、80％の飽和硫安処理後、沈澱物
を遠心分離して採取し、これを１mlの生理食塩
水に溶解した。これを以下の試験に供した
（AGR−ONサンプル）。 (2) CSF活性 上記AGR−ONサンプルのCSF活性を、イアン
（Ian）等の方法に準じて試験した〔Ｊ
Immunol.128.p168（1982）〕。 下記培地を使用した。 Γ 培地Ｉ（２倍濃度MEM培地）； MEM粉末（フロー社製） 2.68ｇ メイロン （大塚製薬社製） 10.6ml ペニシリンＧ 20000単位 ストレプトマイシン 20mg ゲンタマイシン 10mg ２−メルカプトエタノール ５×10-5Ｍ 蒸溜水 全体を100mlとする量 Γ 培地（MEM培地）； MEM粉末 13.4ｇ メイロン 52.9ml ペニシリンＧ 100000単位 ストレプトマイシン 100mg ゲンタマイシン 50mg ２−メルカプトエタノール ５×10-5 蒸溜水 全体を1000mlとする量 Γ 培地； 培地 30ml 培地 20ml FCS（イルビン サイエンテイフイツク社、
USA製） 20ml １％アガー（デイフコ社製）をオートクレーブ
中溶解し、43℃に保温する。この10mlを37℃に保
温した上記培地23.3mlに加え混和した後37℃に
保温する。 BALB／ｃ系マウス大腿骨より採取した骨髄
細胞（BMC）を、ハンクス液で２回洗浄後、こ
れを前記培地を用いて107個／mlに調整し、そ
の１mlを上記寒天培地に加え、混和した後37℃に
保つ（2.9×105個／ml）。この１mlを段階希釈し
たAGR−ONサンプルの0.1mlを入れたシヤーレ
（φ＝3.5cm；Falcom 3001）に加え手早く混和
し、室温で培地が固まるまで放置後、37℃で炭酸
ガスインキユベーター内で培養を開始する。培養
10日後に形成されたコロニー数を計測した。結果
を第１図に示す。図中、横軸は、サンプルの最終
希釈を、縦軸はプレート当りのコロニーを示す。
尚図中の各折れ線は、夫々以下のことを示す。 ●−●；AGR−ONサンプル ■−■；ヒト脾細胞より調製されたサンプル（脾
臓摘出手術を受けた患者より供与されたヒト脾臓
より浮遊細胞を作製し、これを１×108個／ml培
地（１％FCS加RPMI−1640培地）の細胞濃度に
調製し、0.1％PHA−Ｐ（デイフコ社）にて２日
間刺激し、位後前記(1)と同様にして得たコントロ
ールサンプル。 ▲−▲；ヒト末梢血単核球より調製されたサンプ
ル（健常人末梢血より、比重密度遠心分画法によ
り、単核球に分離精製し、これを１％FCSを加え
たRPMI−1640培地に１×106個／mlの脂肪濃度
に調製し、0.1％PHA−Ｐにて２日間刺激し、以
後前記(1)と同様にして得たコントロールサンプ
ル）。 第１図より、AGR−ONの培養上清はCSF活性
を有することが判る。尚、計測したコロニーは、
形態学的観察の結果、顆粒球及びマクロフアージ
であつた。 (3) 親細胞との比較 前記(1)と同様にして得たサンプルの0.2ml及び
CCRF−CEM（ATCC，CCL119）を用いて同様
にして得た対照サンプルの0.2mlの夫々を用いて、
上記(2)と同様にしてCSF活性を測定した。 結果を下記第３表に示す。 第３表 セルライン コロニー数／プレート AGR−ON 307 CCRF−CEM ０ (4) ゲル過 前記(2)の各サンプルをウルトロゲルACA54
（2.2×90cm、LKB社、ストツクフイルム、スウ
エーデン）カラムにて分画した。カラムは0.5M
NaCl，0.01Mリン酸緩衝液、0.05％ポリエチレン
グリコール−6000であらかじめ平衡化した。19
ml／hrの流速で２mlづつの分画を行ない、蛋白の
分離状況を280mμでの吸光度を測定することによ
りモニターした。各分画のCSF活性は前述の方法
で測定した。 結果を第２〜４図に示す。 各図中、縦軸は、CSF活性（コロニー数／プレ
ート）を、横軸はフラクシヨンNo.を示す。また第
２図はAGR−ONサンプルを、第３図はヒト末梢
血単核球より調製したサンプルを、及び第４図は
ヒト脾臓細胞より調製したサンプルを夫々示す。 標準分子量キツト（フアルマシア社製）より測
定したAGR−ON由来のCSFの分子量は、約
84000であり、これは、正常ヒト末梢血単核球及
びヒト脾臓細胞由来のCSFの分子量とほぼ一致し
た。
ロゼツト形成を、200個の細胞につき、400倍の顕
微鏡下で測定した結果、１％以下が陽性である。 (5) Ｂ細胞、マクロフアージマーカー発現性 (a) FITC−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリ
ン（Behring werke AG.Marhurg）を用い
た直接免疫蛍光抗体法により解析した表面免
疫グロブリン（Ig）は、１％以下陽性であ
る。 (b) モノクローナル−抗−DR抗体 （Becton−Dickinson Co.）を用いた間接免疫
蛍光抗体法により解析したヒトHLA−DR抗原
（DR）は、１％以下陽性である。 (c) またビールス（Epstein−Barr virus）で
トランスフオームしたヒトＢ細胞株（CESS.
スローン、ケタリング癌研究所のピーターラ
ルフ博士より入手）により免疫されたマウス
脾細胞とミエローマP3U1（Elbert Einstein
College of Medicineより入手）との細胞融
合株から得た〔Miki.Y.et al.，Journal of
Immunology，129，1921（1982）参照〕モノ
クローナル抗体ヒトＢ細胞抗体を用い、間接
免疫蛍光抗体法により解析した、ヒトＢ細胞
特異抗（Ｂ抗原）の表現性は、１％以下が陽
性である。尚上記抗体はＢ細胞乃至そのライ
ンとは反応するが、Ｔ細胞乃至そのラインと
は反応しない。 (d) ヒトマクロフアージ腫瘍細胞株U937細胞
をBALB／ｃマウスに免疫し、この
BALB／ｃマウスより得た脾Ｂ細胞とミエ
ローマ細胞P3U1とをポリエチレングリコー
ルを用いて細胞融合させ、ヒトマクロフアー
ジに対するモノクロナル抗体を産生するメウ
スＢハイブリドーマを得た〔Maruyama S.
et al.，Journal of Clinical Immunology，
３，57（1983）参照〕。この抗体はU937や正
常ヒトマクロフアージには特異的に結合する
が、正常ヒトＴ細胞やＢ細胞或いはヒトＴ細
胞ラインやヒトＢ細胞ラインとは反応しない
ものである。この抗体を用い、同様に間接蛍
光抗体法により解析したヒトマクロフアージ
抗原の表現性は、１％以下が陽性である。 (6) 増殖性 ８−アザグアニン（８−AG，100μM）、100μ
ｇ／mlストレプトマイシン、100単位／mlペニシ
リンＧ，50μｇ／mlゲンタマイシン、10％牛胎児
血清（FCS），５×10-5M2−メルカプトエタノー
ル及び1mMグルタミンを含むRPMI−1640培地
（フロ− ラボラトリー社製）において良好に増
殖する。 (7) 増殖条件 一般に36〜38℃の温度条件下及びpH7.2〜7.3の
条件下で良好に増殖する。また５％炭酸ガス及び
95％空気のインキユベーター内での培養が好適で
ある。 (8) 継代培養 限界なく継代培養が可能である。 (9) 凍結保存 20％FCSを含むRPMI−1640培地90％、ジメチ
ルスルフオキシド（DMSO）10％の条件で凍結
し、液体窒素中で容易に長期保存できる。 (10) ８−アザグアニン（８−AG）耐性100μMの
８−AGに耐性があり、ヒポキサンチン（１×
10-4Ｍ）、アミノプテリン（４×10-7Ｍ）及び
チミジン（1.6×10-5Ｍ）を含む培地（HAT培
地）で死滅する。この結果より「AGR−ON」
は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフエラーゼ（HGPRT）欠損株である
ことが明白である。 (11) マイトジエン反応性 コンカナバリンＡ（ConA）10〜100μｇ／mlの
添加及び植物性赤血球凝集素、フイトヘモアグル
チニン（PHA）の１〜10％添加により、分裂増
殖は部分的に抑制される。ポツクウイードマイト
ジエン（PWM）及びプロテインＡ（ProA）は、
いかなる濃度においても本細胞株の分裂増殖に影
響を与えない。 本発明細胞株「AGR−ON」は、８−AG耐性
ヒト白血病Ｔ細胞より、常法に従つて、前記した
特性を有する「AGR−ON」をクローニングする
ことにより収得できる。上記８−AG耐性ヒト白
血病Ｔ細胞は、常法、例えば特開昭57−206383号
に記載の方法に従つて製造され、これは公知のヒ
ト白血病Ｔ細胞、例えばCCRF−CEM〔J.Kaplan
et al.，Exp.Med.，139，1070〜1076（1974）〕を
起源とし、これを10％FCS含有RPMI−1640培地
に８−AGを添加した培地で培養し、８−AG添
加量を順次増加させていくことにより取得するも
のである。より具体的には例えばまず2μMの８
−AGを添加した培地で１週間培養し、生存細胞
を次に16μMの８−AGを含む培地で１週間培養
し、その後同様に８−AG濃度を２倍づつ増加さ
せた培地で順次培養し、最終的に８−AG濃度を
100μMとした培地に生存する８−AG耐性細胞株
を使用すればよく、該細胞株の代表例としては、
例えば前述のCEM−AGR〔ATCC寄託No.CRL−
8081〕を挙げることができる。 上記「AGR−ON〕のクローニングは、常法に
従つて行なえばよく、より詳細には、例えばソフ
トアガー法〔Methods in Enzymology，Vol.73.
p1〜45（1981）〕に従い実施できる。即ち200〜
2000／mlに希釈した細胞浮遊液を、２倍濃度の培
養液（８−AG添加RPMI 1640等）で作製し、直
ちに、37℃に加温した0.3％ソフトアガー（Difco
Lab.，Detroit.Ml.）液を等量に混ぜ合せ、プラ
ストツクデイツシユにプレーテイングする。その
量はデイツシユの大きさによりまちまちである
が、直径３cmのデイツシユに対しては１〜1.5ml、
５〜６cmのものには２〜2.5ml加えるのがよい。
培養開始後10〜14日位で肉眼でも分るコロニーを
形成してくる。この時点で、先を細くしたバスツ
ールピペツトを用いて、倒立顕微鏡下で１個のコ
ロニーだけを吸引でひろいあげ、予め用意してお
いた96穴平底培養プレート内の培養液に移して培
養する。 得られた各コロニーは、そのCSF産生能を通常
の方法〔例えばJournal of Immunological
Methods，42pp253〜284（1981）〕に従い検索し
て本発明の「AGR−ON」を単一の細胞株として
分離する。 かくして得られる本発明の細胞株「AGR−
ON」は、前述の諸特性を有し、これは、出願人
によつて、1983年１月24日に、アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン（ATCC）に
「ATCC寄託No.CRL−8199」として受託されてい
る。 上記本発明の細胞株「AGR−ON」からのCSF
の製造は、これを常法に従つて、組織培養し、培
養上清から分離する方法により実施される。 上記組織培養は、通常の栄養培地中で行なわれ
る。栄養培地としては、特に限定なく、この種の
細胞培養に頻用される、例えばRPMI−1640，
MEM等をFCSで改質した培地等を挙げることが
できる。培養条件としても特に限定されず、例え
ば細胞濃度１〜10×105個／ml程度で、前記した
増殖条件に従つて通常３日程度培養すればよい。
かくして培養液中に、CSFが生産される。該CSF
は常法に従い例えば、塩析、クロマトグラフイ
ー、電気泳動法、透析等の物理化学的手段により
更に精製することができる。 かくして本発明細胞「AGR−ON」の利用によ
れば、非常に容易に高収率、高純度で所望のCSF
を収得でき、該CSFの大量生産が工業的規模で実
施できる。しかもかくして得られるCSFは活性が
強く、毒性が低く、更にその製造工程での活性低
下もなく、従来公知のCSFと同様の用途に、より
有利に利用できるものである。 以下、本発明を詳しく説明するため、実施例及
び試験例を掲げる。 実施例１ 「AGR−ON」の製造 CEM−AGR〔ATCC寄託No.CRL−8081〕を、
100μM8−AGを含む同一培地にて1000個の／ml
に希釈して細部浮遊液を作成し、直ちに、37℃に
加温した0.3％ソフトアガー（デイフコ社製）液
に混合し、プラスチツクデイツシユ（φ3cm）に
約１mlずつプレーテイングする。培養14日後に形
成してくるコロニーをパスツールピペツトを用い
て、倒立顕微鏡下にひろいあげ、96穴平底培養プ
レート内の上記培養液に移して培養した。得られ
た各クローンは、後記試験例に基づき、その培養
上清のCSF活性を測定して、本発明の細胞株
「AGR−ON」を得た。この株はその後同濃度
（100μM）の８−AGを含むRPMI−1640＋10％
FCS培地にて強い増殖を示し、この培地で継代培
養により維持されている。またその脂肪学的及び
その他の特性は前述した通りであつた。 試験例 (1) 上記実施例１で得た「AGR−ON」を、
RPMI−1640＋10％FCS培地を用いて５×105
個／ml濃度に調整し、これをプラスチツク細胞
培養液用フラスコ（コーニング社製、25cm2／70
ml）にて３日間、37℃下、５％炭酸ガスインキ
ユベーター内で培養した。遠心分離して得た培
養上清10mlを、80％の飽和硫安処理後、沈澱物
を遠心分離して採取し、これを１mlの生理食塩
水に溶解した。これを以下の試験に供した
（AGR−ONサンプル）。 (2) CSF活性 上記AGR−ONサンプルのCSF活性を、イアン
（Ian）等の方法に準じて試験した〔Ｊ
Immunol.128.p168（1982）〕。 下記培地を使用した。 Γ 培地Ｉ（２倍濃度MEM培地）； MEM粉末（フロー社製） 2.68ｇ メイロン （大塚製薬社製） 10.6ml ペニシリンＧ 20000単位 ストレプトマイシン 20mg ゲンタマイシン 10mg ２−メルカプトエタノール ５×10-5Ｍ 蒸溜水 全体を100mlとする量 Γ 培地（MEM培地）； MEM粉末 13.4ｇ メイロン 52.9ml ペニシリンＧ 100000単位 ストレプトマイシン 100mg ゲンタマイシン 50mg ２−メルカプトエタノール ５×10-5 蒸溜水 全体を1000mlとする量 Γ 培地； 培地 30ml 培地 20ml FCS（イルビン サイエンテイフイツク社、
USA製） 20ml １％アガー（デイフコ社製）をオートクレーブ
中溶解し、43℃に保温する。この10mlを37℃に保
温した上記培地23.3mlに加え混和した後37℃に
保温する。 BALB／ｃ系マウス大腿骨より採取した骨髄
細胞（BMC）を、ハンクス液で２回洗浄後、こ
れを前記培地を用いて107個／mlに調整し、そ
の１mlを上記寒天培地に加え、混和した後37℃に
保つ（2.9×105個／ml）。この１mlを段階希釈し
たAGR−ONサンプルの0.1mlを入れたシヤーレ
（φ＝3.5cm；Falcom 3001）に加え手早く混和
し、室温で培地が固まるまで放置後、37℃で炭酸
ガスインキユベーター内で培養を開始する。培養
10日後に形成されたコロニー数を計測した。結果
を第１図に示す。図中、横軸は、サンプルの最終
希釈を、縦軸はプレート当りのコロニーを示す。
尚図中の各折れ線は、夫々以下のことを示す。 ●−●；AGR−ONサンプル ■−■；ヒト脾細胞より調製されたサンプル（脾
臓摘出手術を受けた患者より供与されたヒト脾臓
より浮遊細胞を作製し、これを１×108個／ml培
地（１％FCS加RPMI−1640培地）の細胞濃度に
調製し、0.1％PHA−Ｐ（デイフコ社）にて２日
間刺激し、位後前記(1)と同様にして得たコントロ
ールサンプル。 ▲−▲；ヒト末梢血単核球より調製されたサンプ
ル（健常人末梢血より、比重密度遠心分画法によ
り、単核球に分離精製し、これを１％FCSを加え
たRPMI−1640培地に１×106個／mlの脂肪濃度
に調製し、0.1％PHA−Ｐにて２日間刺激し、以
後前記(1)と同様にして得たコントロールサンプ
ル）。 第１図より、AGR−ONの培養上清はCSF活性
を有することが判る。尚、計測したコロニーは、
形態学的観察の結果、顆粒球及びマクロフアージ
であつた。 (3) 親細胞との比較 前記(1)と同様にして得たサンプルの0.2ml及び
CCRF−CEM（ATCC，CCL119）を用いて同様
にして得た対照サンプルの0.2mlの夫々を用いて、
上記(2)と同様にしてCSF活性を測定した。 結果を下記第３表に示す。 第３表 セルライン コロニー数／プレート AGR−ON 307 CCRF−CEM ０ (4) ゲル過 前記(2)の各サンプルをウルトロゲルACA54
（2.2×90cm、LKB社、ストツクフイルム、スウ
エーデン）カラムにて分画した。カラムは0.5M
NaCl，0.01Mリン酸緩衝液、0.05％ポリエチレン
グリコール−6000であらかじめ平衡化した。19
ml／hrの流速で２mlづつの分画を行ない、蛋白の
分離状況を280mμでの吸光度を測定することによ
りモニターした。各分画のCSF活性は前述の方法
で測定した。 結果を第２〜４図に示す。 各図中、縦軸は、CSF活性（コロニー数／プレ
ート）を、横軸はフラクシヨンNo.を示す。また第
２図はAGR−ONサンプルを、第３図はヒト末梢
血単核球より調製したサンプルを、及び第４図は
ヒト脾臓細胞より調製したサンプルを夫々示す。 標準分子量キツト（フアルマシア社製）より測
定したAGR−ON由来のCSFの分子量は、約
84000であり、これは、正常ヒト末梢血単核球及
びヒト脾臓細胞由来のCSFの分子量とほぼ一致し
た。
第１図は本発明「AGR−ON」細胞から得られ
るサンプルのCSF活性を示すグラフ及び第２〜４
図は、上記サンプル及びコントロールサンプルの
ゲル過による溶出パターンを示す。
るサンプルのCSF活性を示すグラフ及び第２〜４
図は、上記サンプル及びコントロールサンプルの
ゲル過による溶出パターンを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来の
ヒト培養株化細胞「AGR−ON」。 ａ 形態；リンパ様細胞 ｂ 増殖性；100μM8−アザグアニン、10％牛胎
児血清、５×10-5M2−メルカプトエタノール、
100μｇ／mlストレプトマイシン、100単位／ml
ペニシリンＧ、50μｇ／mlゲンタマイシン及び
１ｍＭグルタミンを含むRPMI−1640培地にお
いて良好に増殖する ｃ 継代培養；限界なく継代培養が可能である ｄ 凍結保存；液体窒素中で容易に長期保存でき
る ｅ 酸素欠損；HGPRT酸素欠損株であり、１×
10-4Ｍヒポキサンチン、４×10-7Ｍアミノプテ
リン及び1.6×10-5Ｍチミジンを含むRPMI−
1640培地で死滅する ｆ 染色体数；43〜54本 ｇ 物質産生能；コロニー形成刺激因子の持続産
生能を有する。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58043992A JPS59169489A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト培養株化細胞 |
| US06/586,558 US4675291A (en) | 1983-03-15 | 1984-03-06 | Human cultured cell line |
| EP84102681A EP0118915B1 (en) | 1983-03-15 | 1984-03-12 | Human cultured cell line |
| DE8484102681T DE3482843D1 (de) | 1983-03-15 | 1984-03-12 | Gezuechtete menschlische zellinie. |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58043992A JPS59169489A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト培養株化細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59169489A JPS59169489A (ja) | 1984-09-25 |
| JPH0530437B2 true JPH0530437B2 (ja) | 1993-05-10 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58043992A Granted JPS59169489A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト培養株化細胞 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0118915B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59169489A (ja) |
| AU (1) | AU561081B2 (ja) |
| CA (1) | CA1218616A (ja) |
| DE (1) | DE3482843D1 (ja) |
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| US6254861B1 (en) | 1989-05-23 | 2001-07-03 | Chandra Choudhury | Hematopoietic growth factor derived from T lymphocytes |
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| US5686578A (en) | 1994-08-05 | 1997-11-11 | Immunomedics, Inc. | Polyspecific immunoconjugates and antibody composites for targeting the multidrug resistant phenotype |
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- 1983-03-15 JP JP58043992A patent/JPS59169489A/ja active Granted
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