JPS6117519A - 輸血用血液の選別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、輸血後肝炎の発症を防止又は抑制しうる血液
の選別方法、殊に自動分析法を用いて輸血用の崩液試料
を短時間内に選別する方法に関する。

軸道後肝炎の発生は、近年における困難な医学的問題の
一つである。この病気は輸血と疫学的に相関しているの
で、外科手術の発展による輸血量の増加に比例して増え
る、傾向がある。そして禾症の発生は、被輸血者の回復
を遅延させるのは無論、彼を長く後遺症に苦しめるのみ
でなく、ときにはその生命さえ危険に陥れることさえあ
るので、社会的にも山々しい問題である。

現在、日本赤十字血液センターでは、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ（以下ＧＰＴという）、梅毒反応およ
びＨＢｓを指標として異常車のスクリーニングを行って
おり、上記検査で異常とされた血液を除外している。し
かし現実には。

ＧＰＴ　３５１０／文以下、梅毒反応（−）およびＨＢ
ｓ（−）の正常輸血液でも術後肝炎の発生がみられ、こ
こに発生した肝炎の大部分は非Ａ非Ｂ型肝炎である。従
って、術後肝炎の発症を絶対的に防止するためには、血
液の使用を中止して人工血液に頼らざるを得ないが、実
際問題として天然血に代りうる程の人工血液は未だ出現
していないから、現状では多少の危険を覚悟で天然血液
を使用しているのが実情である。故に現状では、肝炎に
対してより信頼性の高い輸血用血液のスクリーニング法
を開発することが関係者に課せられた重大な使命である
と言える。

本発明基らは、非Ａ非Ｂ型肝炎の指標となる物質を検索
する過程で、多数の血液サンプルにつき血清グアナーゼ
活性値を測定し、進んで該活性値と肝炎の発生率との関
係を統計学的に追求したところ、両者間に非常に良好な
相関の存することを発見した。周知のように、グアナー
ゼはプリン塩基の代謝に関係する酵素であるが、本酵素
量の消長が非Ａ非Ｂ型肝炎とどのような生化学的関連を
有するにせよ、この知見は実際上極めて興味深いもので
ある。

しかるに、発Ｊらが別途このグアナーゼ活性値と正常面
のスクリーニングに通常用いられているＧＰＴ活性との
相関を検討した結果によれば、両者間には殆ど相関が存
しないことが解った（第１図参照）。このことは、グア
ナーゼ活性による輸血用血液のスクリーニングが、従来
の方法とは異なる疫学的意義を有することを示すもので
ある。

本発明者らは、以上の知見を踏まえて先に特開昭５７−
６４６１６号の発明を出願し、アンモニア直接比色法を
用いたグアナーゼの用手法による測定が輸血用血液の選
別方法として特に有用である事実を発表したか、この先
願発明方法は何分用手法であったため、多ｊ、ｌの試料
血液を急速に検査しなければならないマス検査手段とし
ては充分に活用できない憾みがあった。本出願は、上記
先発間の方法を発展させて自動分析法による検査を可能
ならしめることにより、多量の血液試料を高速かつ正確
に選別する方法を提供するものである。

本発明者らは、先ず用手法により、日本赤十字侮液セン
ターより正常面として送られて来た血液について、これ
に８−アザグアニンを基質としてグアナーゼを反応させ
たとき副生ずるアンモニアを定量する比色〃：を用いて
グアナーゼ活性値を測定し、ここに測定され、たグアナ
ーゼ活性値と輸血後肝炎の発生状況との相関を２箇所の
医療施設における輸血後の所見を基に検討した。結果を
以下表１及び表２として示す。

（以−ト余白） 表−１ ｘ　　　＝　１８．８）　　（１，０，００１）　　＝
　　１０．８３０．１％水準で有意差あり。

表−２ χ２＝　１７．５）　（２，０，００１）・１３．８２
０、１％水準で有意差あり。

上表の示すように、グアナーゼ活性を標準とする輸血３
用血液の選別が術後肝炎の発生率を著しく低下させうる
ことは明らかとなったが、問題は用手法と自動分析法と
の間に果して相関関係が存在するか否やである。上の用
手法と、自動分析に適用される初速度測定法又は終濃度
測定法とは、互いに基質を異にしていることに加え、こ
れまでグアナーゼ活性を自動分析法で行なった実績とい
うものが殆ど存しない。従って、用手法の結果がそのま
ま自動分析法の結果にあてはまると即断するのは危険で
ある。

しかるに実験の結果、第２図及び第３図に示されるよう
に、自動測定手段として初速度測定法又は終濃度測定法
のいずれを用いても、夫々相関係数ｒ＝０．９９３７及
びｒ＝０．９９１２と、予想以上に良好な相関関係の存
在が認められた。この結果は、自動分析法による輸血用
血液のグアナーゼの測定結果には再現性があり、それ故
、当該方法による正常面の選別が術後肝炎、殊に非Ａ非
Ｂ型肝炎の予防のため極めて有効に利用されうＬ るである可能性を強く示唆するものである。

以上の如く、用手法による結果と自動分析装置による結
果との間には明瞭な相関が認められ、この結果、自動分
析装置を用いて大量の血液のグアナーゼ活性値を迅速に
検査することが可能となったが、問題は良否の基準とな
るグアナーゼ活性値（最大値）をどの辺におくかである
。周知の如く、各医療機関における個々の血液の需給状
態は、各機関固有の事情に加え輸血を必要とする外科手
術の多少などの要因により経時的に変化するから、−律
に基準値（上限値）を決定するのは不可能である。しか
しながら、通常はグアニンを基質としてｐＨ８，ｏで測
定したとき、血液１文当り１゜８国際単位を基準とする
のが適当と思われる（４）。

注）この値は、特開昭５７−８４８１ｆ３号発明におけ
る用手法での基準値が２．ｌ３ＩＵ　／ｌを基準として
、用手法と、初速度測定法及び終濃度測定法との相関式
から求めた値である。

周知の如く、正常血中におけるグアナーゼの活性値は極
めて低く、精々数国際単位／Ｊｌ以下である。従って、
測定に際しては充分精度及び感度の高い方法を使用しな
ければならない。しかるに本発明者は別途研究の結果、 ａ）初速度測定法では、■キサンチン生成反応を非イオ
ン界面活性剤の存在下に実施すること及び■尿酸生成反
応をフェナジンメトサルフェートのような電子伝達剤の
存在下に実施することにより、測定精度を高めうると同
時に感度を著しく向上せしめうることを見出した。

［測定原理］ グアナーゼ グアニン　　　　　　キサンチン＋アンモニアキザンチ
ンオキシダーゼ ｍＰＭＳ：１−メトキシフェナジンサルフェートＮＢＴ
：２，２−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５−ジフェニ
ル−３，３−（３，３−ジメトキシ−４，４−ジフェニ
ル）ジテトラゾリウム ［試薬処方例］ １、　グアニン溶液：グアこン１２ｍｇを１２ｏＭ　　
ＮａＯＨ２５ｍ１に溶す。

２、　酵素剤：キサンチンオキシダーセ”４００Ｕ、ウ
シ梅漬アルブミン１８０ｍｇを１１の蒸留水に溶かし、
凍結乾燥する。

３、緩衝液：　Ｎ８７２３１ｍｇ、　ｒｎＰＭ５１０ｍ
ｇを凡の０．　ＩＭ　）リスマレ−斗緩衝液に溶かす。

４、標準グアナーゼ：ウサギ肝由来の精製グアナーゼを
凍結乾燥する。

［試薬の調製法］ １）　　１００ｍ１基質緩衝液の調製 ２．５ｍｌのグアニン溶液に９７．５ｍｌの緩衝液を加
えよく混和した液に、酵素液ｌバイアルの内容物を溶か
す。

２）標準グアナーゼ溶液 標準グアナーゼｌバイアルの内容物を純水１０ｍ１に溶
かして使用する。

［測定操作法］ ２０ＩＬｌの試料を３８０！ｌの基質緩衝液と混ぜ、３
７℃、３分間前加温後、　主ｓ長５３０　ｎｍ、　１ｉ
ｉ１１波長７００　ｎｍで吸光度の変化を測定する。

ｂ）　また終濃度測定法では、反応をキサンチン生成反
応、二段階の過酸化水素生成反応及び発色反応の四段階
に分けて行わせることが操作の迅速性及び精度の向」二
に有益であることが発見された。

Ｅ測定原理フ グアナーゼ グアニンーーーーー→キサンチン＋アンモニアキサンチ
ンオキシダーゼ キサンチンー−−一→尿酸＋過酸化水素ウリカーゼ 尿酸　　　　　　　アラントイン＋過酸化水素ペルオキ
シダーゼ 過酸化水素＋ＭＢＴＨ＋ＤＥＡ →インタ５フ色素（５８０ｒ＋ｍ） ＭＢＴＨ：　３−メチル、２−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾン ＤＥＡ　：　Ｎ　、Ｎ−ジエチルアニリン［試薬処方例
］ １）酵素混合剤（凍結乾燥品） ウシ血清アルブミン１５０ｇを０．２Ｎ水酸化ナトリウ
ム液４００１　に溶解し、ＩＮ水酸化ナトリウム試薬で
ｐ）Ｉを８．０に調製する。このウシ血清アルブミン溶
液に、以下各酵素活性に相当する量の各酵素を加えて溶
かす。

ウリカーゼ８ＫＵ　、カタラーゼ８０ＫＵ、スーパーオ
キサイドディムターゼ２１８０ＫＵ、キサンチンオキシ
ダーゼ３．６ＫＵ 全量を精製水で８（１０ｏｌ　とし、この溶液を１０＋
＋Ｉずつ５０ｍ１のバイアルに分注し凍結乾燥する。

２）グアこン溶液 グアニン０．７３ｇ及びアジ化ナトリウム４．２４ｇを
、水酸化ナトリウム０．８ｇを含・む少量の精製水に完
全に溶かして２】とする。

３）緩衝液Ｉ リン醜−カリウム１０．０８ｇ、リン酸二カリウム１６
１．８ｇ及び塩化ベンザルコニウム液５．０ｏｌ　を精
製水に溶かし、２０］　とする。

４）緩衝液ｒｔ リン酸−カリウム３６８ｇ、リン酸二カリウム３０３ｇ
及び塩化ベンザルコニウム液１’０．ｌ１ｏｌを精製水
に溶かし、２０１　とする。

５）発色漆工 ３−メチル、２−ベンゾチアゾリンノンヒドラゾン塩酸
ａ１４．３１４ｇ、クエン酸２２２ｇ及びリン酸二ナト
リウム１２６ｇを精製水に溶かす。これに塩化ベンザル
コニウム液１０．（１ｏｌを加え、精製水を加えて２０
１　とする。

６）発色液ＩＩ Ｎ、Ｎ−グアチルアニリン塩酸塩２２２．８ｇ　、クエ
ン酸−水塩２２２ｇ及びリン酸二ナトリウム１２６ｇを
精製水に溶かす。これに塩化ベンザルコニウム液１０．
０ｏｌを加え、精製水を加えて２０１とする。

７）ペルオキシダーゼ ウシ血清アルブミン１２ｇを精製水３００１　に溶かし
、ＩＮ水酸化すトリウム試薬でｐＨを８．０に調製する
。これにペルオキシダーゼ２ａｏｏＫｕｌ。

え、精製水を加えて４０ｏ１　とする。この液を５ｏｌ
ずつ５０１のバイアルに分注し、凍結乾燥する。

８）標準グアナーゼ ウサギ肝由来のグアナーゼより調製する。

［試薬の調製法］ ｌ）前処理緩衝液 酵素混合剤ｌバイアルの内容物を緩衝液Ｉ２５ｍ１に溶
かす。調製後、冷蔵庫に保存すれば５日間は使用可能。

２）基質緩衝液 グアニン溶液５１に緩衝液１７４５膳ｌを加える。

保存中グアニンが析出した場合は、加温して溶解する。

３）゛発色液 発色漆工とＩＩを各々５０１ずつ混合し、ペルオキシダ
ーゼｌバイアルの内容物を溶解する。調製後はアルミホ
イル等で遮光する。

４）標準グアナーゼ溶液 標準グアナーゼｌバイアルの内容物を精製水１０１に溶
かして使用する。

〔測定操作法ｊ ８５ＩＬｌの試料を（１，２５ａ＋Ｉの前処理緩衝液に
加え４０℃、２分間加温後、０．５０＋ａｌの基質緩衝
液を添加し、さらに４０℃、１２分間加温する。

以上の試料液に、次いで１．０１の発色液を加え、４０
℃にて２分間加温後、主波長５７０　ｎｒｘ、副波長７
１０　ｎｍで吸光度の変化を測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＧＰＴの測定値とグアナーゼ測定値との相関
を示すグラフ、第２図は、用手法と自動分析法（初速度
測定法）によるグアナーゼ測定値の相関を示すグラフ、
第３図は、用手法と自動分析法・（終濃度測定法）によ
るグアナーゼ測定値の相関を示すグラフである。 図面の浄噛罰内容ｌ−変更なし） Ｏ１２，θ Ｙ−％Ｉ−Ｌ０９Ｘ＋、４６２１５７９Ｒν、９９３７ ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ａｔｏ、　。 手操作法 手操作法 昭和５９年１１月２８日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）自動分析法により測定したグアナーゼ活性の値が
   基準値以下の血液を選別することを特徴とする輸血用血
   液の選別方法。
2. （２）グアナーゼ活性の基準値が、グアニンを基質とし
   て測定して１．８ＩＵ／ｌである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。