JPS6117599A - 抗糖尿病化合物 - Google Patents
抗糖尿病化合物Info
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- JPS6117599A JPS6117599A JP60129742A JP12974285A JPS6117599A JP S6117599 A JPS6117599 A JP S6117599A JP 60129742 A JP60129742 A JP 60129742A JP 12974285 A JP12974285 A JP 12974285A JP S6117599 A JPS6117599 A JP S6117599A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は抗糖尿病活性を有する新規な化合物に関するも
のである。本発明の各化合物は、ヒト−プロインシュリ
ンまたはヒト−プロインシュリンから導かれる中間体か
ら転換反応により、得ることができる。
のである。本発明の各化合物は、ヒト−プロインシュリ
ンまたはヒト−プロインシュリンから導かれる中間体か
ら転換反応により、得ることができる。
発明の目的および構成
ヒト−プロインシュリンは、ヒト−インシュリンに比へ
てはるかに低レベルではあるが、抗糖尿病活性を示すこ
とが知られている。本発明化合物はヒト−プロインシュ
リンよりもかなり高レベルの抗糖尿病活性を有している
。
てはるかに低レベルではあるが、抗糖尿病活性を示すこ
とが知られている。本発明化合物はヒト−プロインシュ
リンよりもかなり高レベルの抗糖尿病活性を有している
。
即ち本発明は、式（Ｉ）：
（式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシスティン、Ｅはグル
タミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
ジン、■はイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、
Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔ
はスレオニン、Ｙはチロシン、■はバリンであり、ｎは
０またはＩである） で示される化合物またはその塩を提供するものである。
ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシスティン、Ｅはグル
タミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
ジン、■はイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、
Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔ
はスレオニン、Ｙはチロシン、■はバリンであり、ｎは
０またはＩである） で示される化合物またはその塩を提供するものである。
本発明は２種類のペプチドを提供することを目的とする
ものであり、それらはいづれも、薬学的に許容し得る塩
の形であってもよい。
ものであり、それらはいづれも、薬学的に許容し得る塩
の形であってもよい。
本発明に係るペプチド配列、および本明細書中で記載す
るのに用いたその省略形を以下に示す（こ（Ｉ） こ
に、ＨＰＩという語句はヒト−プロインシュリンを表す
）： １、（３２−３３スプリツト））ＩＰＩ２、デス（３１
，３２）ＨＰ Ｉ 本発明化合物には、以上の化合物の、薬学的に許容し得
る非毒性酸付加塩および薬学的に許容し得る非毒性カル
ボン酸塩が包含される。
るのに用いたその省略形を以下に示す（こ（Ｉ） こ
に、ＨＰＩという語句はヒト−プロインシュリンを表す
）： １、（３２−３３スプリツト））ＩＰＩ２、デス（３１
，３２）ＨＰ Ｉ 本発明化合物には、以上の化合物の、薬学的に許容し得
る非毒性酸付加塩および薬学的に許容し得る非毒性カル
ボン酸塩が包含される。
本明細書中で“薬学的に許容し得る酸付加塩”という語
句は、有機および無機性両方の酸付加塩を包含し、例え
ば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化
水素酸、ゲルコール酸、クエン酸、マレイン酸、りん酸
、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、
パラ−トルエンスルポン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフ
タレンスルホン酸、プロピオン酸、炭酸等の酸類並びに
重炭酸アンモニウムの如き塩類から調製される酸付加塩
を含む。塩酸、酢酸または炭酸から調製される酸付加塩
が好ましい。上記の塩はいずれも常法に従って製造され
る。
句は、有機および無機性両方の酸付加塩を包含し、例え
ば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化
水素酸、ゲルコール酸、クエン酸、マレイン酸、りん酸
、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、
パラ−トルエンスルポン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフ
タレンスルホン酸、プロピオン酸、炭酸等の酸類並びに
重炭酸アンモニウムの如き塩類から調製される酸付加塩
を含む。塩酸、酢酸または炭酸から調製される酸付加塩
が好ましい。上記の塩はいずれも常法に従って製造され
る。
“カルボン酸塩”という語句は、例えば、亜鉛塩、アン
モニウム塩、並びにナトリウム、カリウムおよびリチウ
ム等のアルカリ金属の塩を含む。好ましいカルボン酸塩
は、亜鉛およびナトリウム塩である。
モニウム塩、並びにナトリウム、カリウムおよびリチウ
ム等のアルカリ金属の塩を含む。好ましいカルボン酸塩
は、亜鉛およびナトリウム塩である。
本明細書中では、便宜上、ペプチド中のアミノ酸を一字
に省略して表すこととする。その様な一般に認められて
いる表示方法を次に示す：Ａ−アラニン、Ｒ−アルギニ
ン、Ｎ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｃ−シス
ティン、Ｅ−グルタミン酸、Ｑ＝グルタミインＧ−グリ
シン、Ｈ−ヒスチジン、■−イソロイシン、Ｌ−ロイシ
ン、Ｋ＝リジン、Ｆ−フェニルアラニン、Ｐ−プロリン
、Ｓ−セリン、Ｔ−スレオニン、Ｙ−チロシン、■＝バ
リン。
に省略して表すこととする。その様な一般に認められて
いる表示方法を次に示す：Ａ−アラニン、Ｒ−アルギニ
ン、Ｎ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｃ−シス
ティン、Ｅ−グルタミン酸、Ｑ＝グルタミインＧ−グリ
シン、Ｈ−ヒスチジン、■−イソロイシン、Ｌ−ロイシ
ン、Ｋ＝リジン、Ｆ−フェニルアラニン、Ｐ−プロリン
、Ｓ−セリン、Ｔ−スレオニン、Ｙ−チロシン、■＝バ
リン。
本発明化合物はペプチド合成の常套手段により、製造す
ることができる。
ることができる。
別法として、本発明化合物はヒト−プロインシュリンか
ら調製することができ、この方法が好ましい。ヒト−プ
ロインシュリンの入手方法は様々であり、有機合成する
方法、ヒト−膵臓から常法通り単離する方法、あるいは
、より最近では組換えＤＮＡ法による方法が含まれる。
ら調製することができ、この方法が好ましい。ヒト−プ
ロインシュリンの入手方法は様々であり、有機合成する
方法、ヒト−膵臓から常法通り単離する方法、あるいは
、より最近では組換えＤＮＡ法による方法が含まれる。
組換えＤＮＡ法によりプロインシュリンを製造する方法
の概要を述べると、単離または組立て、あるいはその併
用、のいずれかの方法によってヒト−プロインシュリン
のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を得る。次
いでヒト−プロインシュリンをコードしているＤＮＡを
適当なりローニングおよび発現ビヒクルの解読相内に挿
入する。
の概要を述べると、単離または組立て、あるいはその併
用、のいずれかの方法によってヒト−プロインシュリン
のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を得る。次
いでヒト−プロインシュリンをコードしているＤＮＡを
適当なりローニングおよび発現ビヒクルの解読相内に挿
入する。
このビヒクルを用いて適当な微生物を形質転換した後、
形質転換された微生物を発酵条件下に置き、（ａ）ヒト
−プロインシュリン遺伝子−含有ベクターのコピーを生
産せしめ、（ｂ）ヒト−プロインシュリン産物またはヒ
ト−プロインツユリン前駆体産物を発現させる。
形質転換された微生物を発酵条件下に置き、（ａ）ヒト
−プロインシュリン遺伝子−含有ベクターのコピーを生
産せしめ、（ｂ）ヒト−プロインシュリン産物またはヒ
ト−プロインツユリン前駆体産物を発現させる。
発現産物がヒト−プロインシュリン前駆体である場合、
それは、通常、ヒトープロインツユリンのアミノ酸配列
のアミノ末端に、外来のタンパク質、または、ヒト−プ
ロインシュリン遺伝子が挿入された遺伝子配列の正常な
発現に由来する他のタンパク質、が結合しているアミノ
酸配列である。
それは、通常、ヒトープロインツユリンのアミノ酸配列
のアミノ末端に、外来のタンパク質、または、ヒト−プ
ロインシュリン遺伝子が挿入された遺伝子配列の正常な
発現に由来する他のタンパク質、が結合しているアミノ
酸配列である。
ヒトープロインツユリンのアミノ酸配列は、このタンパ
ク質フラグメントに対し、特異的な開裂部位、例えばメ
チオニンを介して結合している。この産物は普通、融合
遺伝子産物と称される。
ク質フラグメントに対し、特異的な開裂部位、例えばメ
チオニンを介して結合している。この産物は普通、融合
遺伝子産物と称される。
臭化シアンを用いてこの融合遺伝子産物からヒト−プロ
インシュリンのアミノ酸配列を切断した後、ヒト−プロ
インシュリンのアミノ酸配列中のノステインのメルカプ
ト基を対応するＳ−スルボネートに変換することにより
安定化させる。
インシュリンのアミノ酸配列を切断した後、ヒト−プロ
インシュリンのアミノ酸配列中のノステインのメルカプ
ト基を対応するＳ−スルボネートに変換することにより
安定化させる。
得られたヒト−プロインシュリンのＳ−スルホオート化
合物を精製し、次いでこの精製ヒト−プロインシュリン
Ｓ−スルホネートを、例えばアメリカ特許第４，４３０
，２６６号の方法に従い、その適切な位置に３つのジス
ルフィド結合を形成させることにより、ヒト−プロイン
シュリンに変換する。次いでこのヒト−プロインシュリ
ン産物を周知の方法で精製する。
合物を精製し、次いでこの精製ヒト−プロインシュリン
Ｓ−スルホネートを、例えばアメリカ特許第４，４３０
，２６６号の方法に従い、その適切な位置に３つのジス
ルフィド結合を形成させることにより、ヒト−プロイン
シュリンに変換する。次いでこのヒト−プロインシュリ
ン産物を周知の方法で精製する。
本発明化合物はヒト−プロインシュリンの酵素消化によ
り、製造することができる。即ち、ヒト−プロインシュ
リンをトリプシンで処理すると、他の生成物と共に（３
２−３３スプリツト）ｒ−ｉｐｔが生成する。この生成
物を含む混合物をゲル濾過し、次いで逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、精製（３２−３３
スプリツト）ＨＰＩを回収する。
り、製造することができる。即ち、ヒト−プロインシュ
リンをトリプシンで処理すると、他の生成物と共に（３
２−３３スプリツト）ｒ−ｉｐｔが生成する。この生成
物を含む混合物をゲル濾過し、次いで逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、精製（３２−３３
スプリツト）ＨＰＩを回収する。
この（３２−’３３スプリット）ＨＰＩを用いて他の本
発明化合物を調製する。即ち、この（３２−３３スプリ
ツト）ＨＰＩをカルボキシペプチダーゼＢで処理し、デ
ス（３１，３２）ＨＰ Ｉを得る。
発明化合物を調製する。即ち、この（３２−３３スプリ
ツト）ＨＰＩをカルボキシペプチダーゼＢで処理し、デ
ス（３１，３２）ＨＰ Ｉを得る。
前述の如く、本発明化合物はヒト−プロインシュリンよ
りも実質上活性の高い、インシュリン様の抗糖尿病作用
を有する。
りも実質上活性の高い、インシュリン様の抗糖尿病作用
を有する。
本発明化合物群は、そのインシュリン様活性に基づき、
糖尿病の治療に宵用である。従って、本発明化合物は、
種々の医薬組成物および製剤類に使用し得ると共に、筋
肉内、静脈内、皮下および腹腔内等、通常の様々な投与
経路で投与することができる。
糖尿病の治療に宵用である。従って、本発明化合物は、
種々の医薬組成物および製剤類に使用し得ると共に、筋
肉内、静脈内、皮下および腹腔内等、通常の様々な投与
経路で投与することができる。
本発明化合物を投与する場合の注射に適した医薬製剤と
しては、滅菌水溶液または分散液、並びに滅菌注射液ま
たは分散液を調製し得る滅菌粉剤等が挙げられる。
しては、滅菌水溶液または分散液、並びに滅菌注射液ま
たは分散液を調製し得る滅菌粉剤等が挙げられる。
滅菌注射液は、本発明化合物と、所望により、種々の他
の成分とを、計算量の適当な溶媒に入れて調製する二と
ができる。
の成分とを、計算量の適当な溶媒に入れて調製する二と
ができる。
以下に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。
これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない
。
。
宋旦１ （３２−３３スプリツト）ＨＰＩの製造
ヒト−プロインシュリン（湿重量３１２Ｍ？）を０゜１
Ｍ トリス緩衝液５７ｚ（ｌに溶かしく最終ｐＨ７，
０）、この溶液を水浴中で２５℃に加温した。トリプシ
ン（２５，１μｇ）の０．０５Ｍトリス−０，０２ＭＣ
ａＣｌ２２（Ｉ）Ｈ７、０） ５７μρ中溶液を加えた
。６８分後、酢酸を加えて溶液のｐＨを２５まで下げる
ことにより、反応を終了させた。
Ｍ トリス緩衝液５７ｚ（ｌに溶かしく最終ｐＨ７，
０）、この溶液を水浴中で２５℃に加温した。トリプシ
ン（２５，１μｇ）の０．０５Ｍトリス−０，０２ＭＣ
ａＣｌ２２（Ｉ）Ｈ７、０） ５７μρ中溶液を加えた
。６８分後、酢酸を加えて溶液のｐＨを２５まで下げる
ことにより、反応を終了させた。
この酸性溶液（５７ｍｇ）を、５Ｘ２００ｃ＊Ｇ５０ス
ーパーフアイン・セファデックス・カラムにかけ、カラ
ム溶媒としてＩＭモル濃度の酢酸を使用し、６℃でクロ
マトクラツーイーした。まず最初に、未反応ＨＰＩ、（
３２−３３スプリツト）ＨＰＩおよび（６５−Ａ Ｉス
プリット）ＨＰｒを含有する幅広いピークが溶出し、次
いで、かなり明確に分離されてノーＡｒｇ３１・３２ヒ
ト−インシュリンを含有する第２のピークが溶出した。
ーパーフアイン・セファデックス・カラムにかけ、カラ
ム溶媒としてＩＭモル濃度の酢酸を使用し、６℃でクロ
マトクラツーイーした。まず最初に、未反応ＨＰＩ、（
３２−３３スプリツト）ＨＰＩおよび（６５−Ａ Ｉス
プリット）ＨＰｒを含有する幅広いピークが溶出し、次
いで、かなり明確に分離されてノーＡｒｇ３１・３２ヒ
ト−インシュリンを含有する第２のピークが溶出した。
以下の要領てカラム分画をプールした：プールの開始
ＵＶ測定に基づくプール１−を−Ｆ６よび終了点 中の
タンパク質含量※Ａ １７６８〜 ＨＰｒと
モノスプリット２１４６ｉρ ＨＰＩとの混合物８３
．３叩Ｂ ２１４６〜 ＨＰＩとモノスプリ
ット２４６４ｙｔｔＱ ＨＰ Ｉとの混合物９８．
１ｆｆｇＣ２４６４−ノーＡｒｇ３′・３２ヒト−イ２
８４３ｍ（２ンンユリン ３４次９ ※ 容量は、０Ｄ２７０および計算された吸光係数に基
づいて計算された。
ＵＶ測定に基づくプール１−を−Ｆ６よび終了点 中の
タンパク質含量※Ａ １７６８〜 ＨＰｒと
モノスプリット２１４６ｉρ ＨＰＩとの混合物８３
．３叩Ｂ ２１４６〜 ＨＰＩとモノスプリ
ット２４６４ｙｔｔＱ ＨＰ Ｉとの混合物９８．
１ｆｆｇＣ２４６４−ノーＡｒｇ３′・３２ヒト−イ２
８４３ｍ（２ンンユリン ３４次９ ※ 容量は、０Ｄ２７０および計算された吸光係数に基
づいて計算された。
以上のプールを凍結乾燥した。
次いでこれら３つの凍結乾燥したプールを３部に分け、
カラム溶媒として０５％トリフルオロ酢酸中３４％ＣＨ
，ｌＣＮ溶液を用い、２，５Ｘ６’ＯＧｍのＣ−１８Ｈ
ＰＬＣカラムにかけてクロマトグラフすることにより、
それらの成分を分離した。
カラム溶媒として０５％トリフルオロ酢酸中３４％ＣＨ
，ｌＣＮ溶液を用い、２，５Ｘ６’ＯＧｍのＣ−１８Ｈ
ＰＬＣカラムにかけてクロマトグラフすることにより、
それらの成分を分離した。
プールＡの１部（７９ｍｇ）を希塩酸（最終ｐＨ＝２）
に溶かしてカラムにかけ、所望の２つのプール（Ｄおよ
びＥ）を得た。
に溶かしてカラムにかけ、所望の２つのプール（Ｄおよ
びＥ）を得た。
プールの開始 ＵＶ測定に基づくプールスニ夾 および
終了点 中のタンパク質含量Ｄ ５１９〜 精製
（３２−３３スプリツ６２７靜 ト）ＨＰ Ｉ Ｃ
７９ｘｙの４３％〕 Ｅ ７’００〜 純度７０％の（６５−Ａ１８
０８屑ρ スプリット）Ｉ−ＩＰ Ｉ ｌ ４．７７Ｑ
（７９ｍｙの１８．５％〕 プールＤを凍結乾燥して純粋な（３２−３３スプリツト
）Ｉ−ＩＰＩを得た。
終了点 中のタンパク質含量Ｄ ５１９〜 精製
（３２−３３スプリツ６２７靜 ト）ＨＰ Ｉ Ｃ
７９ｘｙの４３％〕 Ｅ ７’００〜 純度７０％の（６５−Ａ１８
０８屑ρ スプリット）Ｉ−ＩＰ Ｉ ｌ ４．７７Ｑ
（７９ｍｙの１８．５％〕 プールＤを凍結乾燥して純粋な（３２−３３スプリツト
）Ｉ−ＩＰＩを得た。
試料の純度は、分析用ＨＰＬＣ，ポリアクリルアミドを
ベースとするディスクゲル電気泳動法、および分析用高
速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によ
り決定した。化合物の同定にはアミノ酸分析およびアミ
ノ酸配列決定法を採用した。
ベースとするディスクゲル電気泳動法、および分析用高
速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によ
り決定した。化合物の同定にはアミノ酸分析およびアミ
ノ酸配列決定法を採用した。
実施例２ デス（３１，３，２）ＨＰ Ｉの製造（３２
，３３スプリツト）ＨＰＩ（湿重量２７．９３ａｇ）を
０．１Ｍ トリス（ｐＨ７，０）５’、０１１（２中に
溶かし、３９．４μ９のカルボキシペプチダーゼＢによ
り、２５℃で３２分間処理した。混合物をｐＨ２’、７
になるまでＩＭＨＣＱで酸性化し、反応を終了させた。
，３３スプリツト）ＨＰＩ（湿重量２７．９３ａｇ）を
０．１Ｍ トリス（ｐＨ７，０）５’、０１１（２中に
溶かし、３９．４μ９のカルボキシペプチダーゼＢによ
り、２５℃で３２分間処理した。混合物をｐＨ２’、７
になるまでＩＭＨＣＱで酸性化し、反応を終了させた。
得られた溶液を、２％酢酸で平衡処理した０゜９Ｘ４０
ｃｉＧ２５Ｍセファデックスカラムにかけてり、！マド
グラフし、タンパク質１６．６ｉ９（Ｕ。
ｃｉＧ２５Ｍセファデックスカラムにかけてり、！マド
グラフし、タンパク質１６．６ｉ９（Ｕ。
■１重量）を得た。
タンパク質（Ｉ４，５９１！Ｇ湿重量）を、１Ｍ酢酸を
充填した２、５ＸＩ２５ｃ１ＮＧ５０８Ｆセフアデツク
スカラムを使って６℃でクロマトグラフィーし、タンパ
ク質１１ 、１ ｍ９（Ｕ、Ｖ 重量）を得た。
充填した２、５ＸＩ２５ｃ１ＮＧ５０８Ｆセフアデツク
スカラムを使って６℃でクロマトグラフィーし、タンパ
ク質１１ 、１ ｍ９（Ｕ、Ｖ 重量）を得た。
５ｘ５０ｍｍのファーマシア・モノ・ニス・カヂオン交
換カラムを使って最終的にタンパク質を精製した。
換カラムを使って最終的にタンパク質を精製した。
開始時・・・・・・７Ｍ尿素−０，ＩＭ酢酸終了時・・
・・・・７Ｍ尿素−０，１Ｍ酢酸−ＩＭＮａＣＱθ〜０
．３ＭＮａＣｌ２のリニアーグラジェント法により、３
０分間でタンパク質を溶出した。主要ピークの物質を０
．９Ｘ４０ｃｍの２％酢酸で処理した０２５Ｍセファデ
ックス・カラムでクロマトグラフィーし、高純度のデス
（３１，３２）Ｉ−ＩＰ １６ 、２２１１１９（Ｕ、
Ｖ、重量）を得た。
・・・・７Ｍ尿素−０，１Ｍ酢酸−ＩＭＮａＣＱθ〜０
．３ＭＮａＣｌ２のリニアーグラジェント法により、３
０分間でタンパク質を溶出した。主要ピークの物質を０
．９Ｘ４０ｃｍの２％酢酸で処理した０２５Ｍセファデ
ックス・カラムでクロマトグラフィーし、高純度のデス
（３１，３２）Ｉ−ＩＰ １６ 、２２１１１９（Ｕ、
Ｖ、重量）を得た。
生物学的活性
Ａ、ＩＭ−９ラジオレセプター分析
２ｍＭグルタミン、２５ＭＨＥＰＥＳおよび１０％ウシ
胎児血清を含有しているＲ、 Ｐ Ｍ Ｉ培地でＩＭ−
９細胞を増殖させた。遠心して細胞を収集し、洗浄しｔ
こ後、Ｉ−［Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ分析用緩衝液（ｐＨ７，６
）に懸濁した〔デマイッ、Ｐ１インシュリン・アンド・
グロース・ホルモン・レセプターズ・イン・ヒユーマン
・カルチヤード・リンホザイッ・アンド・ペリフェラル
・モノサイッ（Ｉ ｎ５ｕｌｉｎ ａｎｄＧｒｏｗｔ
ｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ’ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉ
ｎ ＨｕｍａｎＣｕｌｔｕｒｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅｓ ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａ’ＩＭｏｎ
ｏｃｙＬｅｓ）ブレツチ＋−，Ｍ、編、ニューヨーク、
マースル・デツカ−・インコーホレイテッド、３０１〜
３３０（Ｉ９７６））。トリパン・ブルーの排除に基づ
いてｉ＋）定した細胞の生存率は、各実験において９０
％以上であった。３本−組の試験管を用意し、それぞれ
に１００μｇの分析用緩衝液、ヒト−インシフリン、ヒ
ト−プロインシュリンまたは本発明化合物、並びに２０
０μρの１２５Ｉ−インツユリン（終濃度１〜２ Ｘ
Ｉ Ｏ−”Ｍ）、並びに２００μρの細胞（約５００，
０００細胞）を入れた。
胎児血清を含有しているＲ、 Ｐ Ｍ Ｉ培地でＩＭ−
９細胞を増殖させた。遠心して細胞を収集し、洗浄しｔ
こ後、Ｉ−［Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ分析用緩衝液（ｐＨ７，６
）に懸濁した〔デマイッ、Ｐ１インシュリン・アンド・
グロース・ホルモン・レセプターズ・イン・ヒユーマン
・カルチヤード・リンホザイッ・アンド・ペリフェラル
・モノサイッ（Ｉ ｎ５ｕｌｉｎ ａｎｄＧｒｏｗｔ
ｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ’ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉ
ｎ ＨｕｍａｎＣｕｌｔｕｒｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅｓ ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａ’ＩＭｏｎ
ｏｃｙＬｅｓ）ブレツチ＋−，Ｍ、編、ニューヨーク、
マースル・デツカ−・インコーホレイテッド、３０１〜
３３０（Ｉ９７６））。トリパン・ブルーの排除に基づ
いてｉ＋）定した細胞の生存率は、各実験において９０
％以上であった。３本−組の試験管を用意し、それぞれ
に１００μｇの分析用緩衝液、ヒト−インシフリン、ヒ
ト−プロインシュリンまたは本発明化合物、並びに２０
０μρの１２５Ｉ−インツユリン（終濃度１〜２ Ｘ
Ｉ Ｏ−”Ｍ）、並びに２００μρの細胞（約５００，
０００細胞）を入れた。
１ 、５ ｍＱのミクロフユージ・チューブ内で１５°
Ｃにおいて２時間インキュベートした。この結合実験に
用いた、インツユリン、プロインシュリンまたは本発明
化合物を含有するストック溶液の濃度は、アミ２ノ酸分
析と２７６ｎｍにおける吸収に基づいて求めた。実験中
、３０分毎にチューブを数個転倒させることにより、細
胞を懸蜀させる様にした。インキコベーション終了後、
ベックマン・ミクロフコージ（Ｍ ｊｃｒｏｆｕｇｅ）
によって１分間遠心した後、上澄液を吸引し、細胞ペレ
ットを含むチューブの先端を切除し、放射活性を測定し
た。
Ｃにおいて２時間インキュベートした。この結合実験に
用いた、インツユリン、プロインシュリンまたは本発明
化合物を含有するストック溶液の濃度は、アミ２ノ酸分
析と２７６ｎｍにおける吸収に基づいて求めた。実験中
、３０分毎にチューブを数個転倒させることにより、細
胞を懸蜀させる様にした。インキコベーション終了後、
ベックマン・ミクロフコージ（Ｍ ｊｃｒｏｆｕｇｅ）
によって１分間遠心した後、上澄液を吸引し、細胞ペレ
ットを含むチューブの先端を切除し、放射活性を測定し
た。
以上の実験結果を次の表Ｉに示す。
表 １ １Ｍ−９ラジオレセプター分析ヒト−インシュ
リン ４．２７±０．３Ｘ１０−” ７０ヒト−プロ
インシュリン２．９７±０．２Ｘ１０−ａｌ（３２１３
スプリツト）＋Ｉｌ’＋ ５．９２±０．７ＸｉＯ−
” ５デス（３］ 、３２）ＨＰ Ｉ ５．６０±
０．３Ｘ１０−” ５Ｂ 単離した脂肪細胞によるラ
ジオレセプター分析 ロッドベル（Ｒｏｄｂｅｌｌ）、Ｍ の方法（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイー（Ｊ。
リン ４．２７±０．３Ｘ１０−” ７０ヒト−プロ
インシュリン２．９７±０．２Ｘ１０−ａｌ（３２１３
スプリツト）＋Ｉｌ’＋ ５．９２±０．７ＸｉＯ−
” ５デス（３］ 、３２）ＨＰ Ｉ ５．６０±
０．３Ｘ１０−” ５Ｂ 単離した脂肪細胞によるラ
ジオレセプター分析 ロッドベル（Ｒｏｄｂｅｌｌ）、Ｍ の方法（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイー（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）２３９−１３７５−３８０
（Ｉ９６４））の改良法〔ツーバー（Ｈｕｂｅｒ）、Ｃ
，Ｔ、 、ソロモン（Ｓ ｏｌｏｍｏｎ）、 Ｓ 、
Ｓ 、、およびダックワース（Ｄｃ＋ｃｋｗｏｒＬｈ）
、Ｗ、Ｃ，、ジャーナル・クリニカル・インベスティゲ
ーション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、）。
（Ｉ９６４））の改良法〔ツーバー（Ｈｕｂｅｒ）、Ｃ
，Ｔ、 、ソロモン（Ｓ ｏｌｏｍｏｎ）、 Ｓ 、
Ｓ 、、およびダックワース（Ｄｃ＋ｃｋｗｏｒＬｈ）
、Ｗ、Ｃ，、ジャーナル・クリニカル・インベスティゲ
ーション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、）。
１１．４６１〜４６８．（Ｉ９８０））により、単離脂
肪細胞を調製した。インキュベーションは、全て、４％
ろシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有〜オるクレブスー
リンゲルーヘベス（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ −Ｈｅ
ｐｅｓ、 Ｋ ｎ Ｉ−１）’１衝液（ｐＨ７，４）中
、全量を２ｍＱにして行った。脂肪細胞を、１２５Ｉ−
標識インシュリン（Ｉ−２ｘ ｌ Ｏ−”Ｍ）、および
選択された濃度の緩衝液、またはヒト−インシュリンま
たはヒト−プロインツユリンまたは本発明化合物、と−
緒に１５℃で２時間インキュベートした。選択した時間
の経過後、３００μｅづつ、３試料をとり、１００μＱ
のツノニル・フタレートを入れたマイクロフユーノ・チ
ョーブに加えた〔グリ−マン（Ｇｌｉｅｍａｎｎ）、
Ｊ 、オスターリント（Ｏｓｔｅｒｌｉｎｄ）、に、、
ヴインテン（Ｖ １ｎｔｅｎ）、 Ｊ 、およびガメル
トフト（ＧａｍｍｅｌｔｏｆＬ）、’Ｓ 、 、ビオシ
ミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ）２８見、ｌ−９（Ｉ
９７２）参照〕。ミクロフユージ内で１分間遠心した後
、このチューブを油層から切断し、ガンマ・カウンター
で細胞ペレットを計数し、結合を調べた。１′■−標識
インシュリンの分解は、ミクロフユージ・チューブから
得た緩衝液の層を水冷下のＫＲＨ緩衝液に加え、即座に
十分量のトリクロロ酢酸を終濃度５％になる様に加える
ことにより、調べた。
肪細胞を調製した。インキュベーションは、全て、４％
ろシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有〜オるクレブスー
リンゲルーヘベス（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ −Ｈｅ
ｐｅｓ、 Ｋ ｎ Ｉ−１）’１衝液（ｐＨ７，４）中
、全量を２ｍＱにして行った。脂肪細胞を、１２５Ｉ−
標識インシュリン（Ｉ−２ｘ ｌ Ｏ−”Ｍ）、および
選択された濃度の緩衝液、またはヒト−インシュリンま
たはヒト−プロインツユリンまたは本発明化合物、と−
緒に１５℃で２時間インキュベートした。選択した時間
の経過後、３００μｅづつ、３試料をとり、１００μＱ
のツノニル・フタレートを入れたマイクロフユーノ・チ
ョーブに加えた〔グリ−マン（Ｇｌｉｅｍａｎｎ）、
Ｊ 、オスターリント（Ｏｓｔｅｒｌｉｎｄ）、に、、
ヴインテン（Ｖ １ｎｔｅｎ）、 Ｊ 、およびガメル
トフト（ＧａｍｍｅｌｔｏｆＬ）、’Ｓ 、 、ビオシ
ミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、 ）２８見、ｌ−９（Ｉ
９７２）参照〕。ミクロフユージ内で１分間遠心した後
、このチューブを油層から切断し、ガンマ・カウンター
で細胞ペレットを計数し、結合を調べた。１′■−標識
インシュリンの分解は、ミクロフユージ・チューブから
得た緩衝液の層を水冷下のＫＲＨ緩衝液に加え、即座に
十分量のトリクロロ酢酸を終濃度５％になる様に加える
ことにより、調べた。
上記の実験の結果を次の表Ｈに示す。
表−ｌ 単離脂肪細胞のラジオレセプター分析化合物
ＥＤ−ｏ（猷）相、対効力ヒト−インシ
ュリン １．４３±０．２Ｘ１０＝ １７８ヒト−プ
ロインシュリン２．５５±０．６ＸＩＯ−７１（３２−
３３スプリツト）Ｉ（Ｐｌ ５．２９±１．８Ｘ１０
−６ ５デス（３１，３２）ＨＰ １ ２．８５±０．
ｌＸ１０−”９Ｃ１単離−ラット・アジボザイト（ぞお
ける生物学的活性 アジボサイト（脂肪細胞）は、ロッドベルのコラ−ゲナ
ーゼ消化法（前掲）の改良法（ツーバー、前掲）により
、副畢丸脂肪褥（パッド）から調製した。
ＥＤ−ｏ（猷）相、対効力ヒト−インシ
ュリン １．４３±０．２Ｘ１０＝ １７８ヒト−プ
ロインシュリン２．５５±０．６ＸＩＯ−７１（３２−
３３スプリツト）Ｉ（Ｐｌ ５．２９±１．８Ｘ１０
−６ ５デス（３１，３２）ＨＰ １ ２．８５±０．
ｌＸ１０−”９Ｃ１単離−ラット・アジボザイト（ぞお
ける生物学的活性 アジボサイト（脂肪細胞）は、ロッドベルのコラ−ゲナ
ーゼ消化法（前掲）の改良法（ツーバー、前掲）により
、副畢丸脂肪褥（パッド）から調製した。
単離およびインキュベージコンの全工程には、４％ウシ
血清アルブミンと０．５５ｍＭグルコースを含有するク
レブスーリンゲルーヘペス（Ｋ ＲＨ）Ｆ緩衝液（ｐＨ
７，４）を用いた。
血清アルブミンと０．５５ｍＭグルコースを含有するク
レブスーリンゲルーヘペス（Ｋ ＲＨ）Ｆ緩衝液（ｐＨ
７，４）を用いた。
約２ｘ＋ｏ５のアジボサイトを、１″■〜（Ａ１４）ブ
タ−インツユリン、および種々の濃度の標識されていな
いヒト−インシュリン、ヒト−プロインシュリンまたは
本発明化合物と一緒に、緩衝液１酎中でインキュベート
した。インキュベーションは１５℃で４．５時間行った
。インキュベーション期間の最後に、フランク（Ｆｒａ
ｎｋ）、Ｂ、 Ｈ，、ビービイ（Ｐ ｅａｖｙ）、 Ｉ
）、 Ｅ 、、フッカ−（Ｈｏｏｋｅｒ）。
タ−インツユリン、および種々の濃度の標識されていな
いヒト−インシュリン、ヒト−プロインシュリンまたは
本発明化合物と一緒に、緩衝液１酎中でインキュベート
した。インキュベーションは１５℃で４．５時間行った
。インキュベーション期間の最後に、フランク（Ｆｒａ
ｎｋ）、Ｂ、 Ｈ，、ビービイ（Ｐ ｅａｖｙ）、 Ｉ
）、 Ｅ 、、フッカ−（Ｈｏｏｋｅｒ）。
Ｃ，Ｓ、、およびダックワース（Ｄ ｕｃｋｖｏｒｔｈ
）、Ｗ、 Ｃ。
）、Ｗ、 Ｃ。
らの記載（ダイアペッツ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）３２．
７０５−７１１（Ｉ９８３））に従って結合（細胞関与
の放射活性）を測定するために３つの試料を採取した。
７０５−７１１（Ｉ９８３））に従って結合（細胞関与
の放射活性）を測定するために３つの試料を採取した。
インギｊベーンヨン温度１５℃においては、トレーサー
・インシュリンの分解は検出されなかった。
・インシュリンの分解は検出されなかった。
試料の計数はトレーサー・アナリティック・モデル１２
８５ガンマ・ノンデレージョン・分光器を使用し、計数
効率８シ％で行った。
８５ガンマ・ノンデレージョン・分光器を使用し、計数
効率８シ％で行った。
生物学的活性は、ムーディ（Ｍｏｏｄｙ）、Ａ、 Ｊ
、、スタン（Ｓｔａｎ）、Ｍ、Ａ、、スタン（Ｓｔａｎ
）Ｊ４．およびグリ−マン（Ｇ ｌｌｅｍａｎ） 、
Ｊ 、の方法（ホルモン・アンド・メタポリツクリサー
チ（Ｈｏｒｍ、 Ｍｅｔａｂ。
、、スタン（Ｓｔａｎ）、Ｍ、Ａ、、スタン（Ｓｔａｎ
）Ｊ４．およびグリ−マン（Ｇ ｌｌｅｍａｎ） 、
Ｊ 、の方法（ホルモン・アンド・メタポリツクリサー
チ（Ｈｏｒｍ、 Ｍｅｔａｂ。
Ｒｅｓ、）６，１２−．１６（Ｉ９７４））に従い、２
−３Ｈ−グルコースの全脂肪細胞内への取り込みを観察
することにより、行った。細胞を種々の濃度のコールド
・ヒト−インシュリン、ヒト−プロインシュリンまたは
本発明化合物と共に３７℃で１時間インキュベートした
後、リキフラワー（ＬｉｑｕｊｆｌｕｏｒＸニューイン
グランド・ヌクレアー）１０ｘ（２を加えて反応を終結
させた。放射活性は、ソアール・アイソキャップ（Ｓ’
ｅａｒｌｅ Ｉ ５ｏｃａｐ） ３００液体ンンチレ
ーション・カウンター中、効率的３０％で測定した。ブ
ランクは、細胞が添加される前にシンデレージョン液を
とり、バイエルに入れて調製した。これらの各バイエル
から得たカウント数の平均値を、他の全試料について観
察された値から差し引いた。
−３Ｈ−グルコースの全脂肪細胞内への取り込みを観察
することにより、行った。細胞を種々の濃度のコールド
・ヒト−インシュリン、ヒト−プロインシュリンまたは
本発明化合物と共に３７℃で１時間インキュベートした
後、リキフラワー（ＬｉｑｕｊｆｌｕｏｒＸニューイン
グランド・ヌクレアー）１０ｘ（２を加えて反応を終結
させた。放射活性は、ソアール・アイソキャップ（Ｓ’
ｅａｒｌｅ Ｉ ５ｏｃａｐ） ３００液体ンンチレ
ーション・カウンター中、効率的３０％で測定した。ブ
ランクは、細胞が添加される前にシンデレージョン液を
とり、バイエルに入れて調製した。これらの各バイエル
から得たカウント数の平均値を、他の全試料について観
察された値から差し引いた。
競合的な結合曲線および生物学的活性の用量一応答曲線
を、プレフィツト（ＰＲＥＦＩＴ）およびアルフィツト
（ＡＬＬＦＩＴ）プログラム〔ドウレーン（ＤｅＬｅａ
ｎ）、Ａ、 、ムンソンＣＭ ｕｎｓｏｎ） 、 Ｐ
。
を、プレフィツト（ＰＲＥＦＩＴ）およびアルフィツト
（ＡＬＬＦＩＴ）プログラム〔ドウレーン（ＤｅＬｅａ
ｎ）、Ａ、 、ムンソンＣＭ ｕｎｓｏｎ） 、 Ｐ
。
、Ｉ およびロッドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ）、Ｄ 、
アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジイ（Ａｍ
。
アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジイ（Ａｍ
。
Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、）２３５ＳＥ９７−Ｅｌ ０２（
Ｉ９７８）〕を使用し、４−パラメータ・ロジスティッ
ク・モデルに基づいて解析した。これらの解析の結果か
ら、最大応答の１／２の応答を得るのに必要なインシュ
リンまたはプロインシュリンの濃度、並びに最大および
最小値がわかった。値は全て平均±ＳＥＭで示した。
Ｉ９７８）〕を使用し、４−パラメータ・ロジスティッ
ク・モデルに基づいて解析した。これらの解析の結果か
ら、最大応答の１／２の応答を得るのに必要なインシュ
リンまたはプロインシュリンの濃度、並びに最大および
最小値がわかった。値は全て平均±ＳＥＭで示した。
以上の結果を次の表■に示す。
表 ■ 単離−ラット・アジポサイトにおける生物学的
活性
活性
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｅはグル
タミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
ジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、
Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔ
はスレオニン、Ｙはチロシン、Ｖはバリンであり、ｎは
０または１である） で示される化合物またはその塩。 ２、ｎが０である第１項に記載の化合物。 ３、ｎが１である第１項に記載の化合物。 ４、第１項〜第３項のいずれかに記載の化合物を有効成
分とする抗糖尿病薬。 ５、第１項に記載の式（ I ）で示される化合物または
その塩の製造方法であって、 （Ａ）ヒト−プロインシュリンをトリプシンで酵素処理
してｎが１である式（ I ）の化合物を得るか、あるい
は （Ｂ）ｎが１である式（ I ）の化合物をカルボキシペ
プチダーゼＢで処理してｎが０である式（ I ）の化合
物を得ることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US620782 | 1984-06-14 | ||
| US06/620,782 US4569791A (en) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Anti-diabetic compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6117599A true JPS6117599A (ja) | 1986-01-25 |
Family
ID=24487365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60129742A Pending JPS6117599A (ja) | 1984-06-14 | 1985-06-13 | 抗糖尿病化合物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4569791A (ja) |
| EP (1) | EP0171147B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6117599A (ja) |
| AT (1) | ATE87661T1 (ja) |
| CA (1) | CA1243972A (ja) |
| DE (1) | DE3587226T2 (ja) |
| DK (1) | DK262685A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63157498U (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-14 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4888414A (en) * | 1987-04-09 | 1989-12-19 | Board Of Regents, University Of Texas System | Insulin-binding peptides and uses thereof |
| US4992417A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogues |
| US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
| US5208217A (en) * | 1989-04-20 | 1993-05-04 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Hepatospecific insulin analogues |
| TW224471B (ja) * | 1991-11-26 | 1994-06-01 | Lilly Co Eli | |
| US6001604A (en) * | 1993-12-29 | 1999-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents |
| US5631347A (en) * | 1995-06-07 | 1997-05-20 | Eli Lilly And Company | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein |
| CA2402191C (en) | 2000-03-24 | 2012-03-13 | Genentech, Inc. | Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
-
1984
- 1984-06-14 US US06/620,782 patent/US4569791A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-06-10 CA CA000483551A patent/CA1243972A/en not_active Expired
- 1985-06-12 AT AT85304164T patent/ATE87661T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-12 EP EP85304164A patent/EP0171147B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-12 DK DK262685A patent/DK262685A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-06-12 DE DE8585304164T patent/DE3587226T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-13 JP JP60129742A patent/JPS6117599A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J.BIOL.CHEM=1971 * |
| J.CLIN.INVEST=1978 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63157498U (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-14 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0171147B1 (en) | 1993-03-31 |
| DK262685A (da) | 1985-12-15 |
| ATE87661T1 (de) | 1993-04-15 |
| DE3587226D1 (de) | 1993-05-06 |
| US4569791A (en) | 1986-02-11 |
| DK262685D0 (da) | 1985-06-12 |
| DE3587226T2 (de) | 1993-08-05 |
| EP0171147A3 (en) | 1989-01-18 |
| EP0171147A2 (en) | 1986-02-12 |
| CA1243972A (en) | 1988-11-01 |
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