JPS61185198A - トランスグルタミナ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の利用分野 本発明は、医学並びに生化学の研究、特に臨床医学にお
いて肝疾患等の診断に利用し得るトランスグルタミナー
ゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ：　ａｍｉ
ｎｅｒ　−ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ＋
　Ｅ　Ｃ２，３，２，１３）の活性測定法に関する。

従来技術 トランスグルタミナーゼは、哺乳動物の肝臓、血清、血
小板、毛のう、表皮等に存在し、ペプチド鎖内にあるグ
ルタミン残基のＴ−カルボキサミド基をアシル供与体と
し、タンパク質やペプチド中のりジン残基のε−アミノ
基を受容体とするアシル転移反応を触媒する酵素であり
、その反応式は次のように示される。

Ｃ＝０　　　　　　０ Ｈ 本酵素の活性測定法としては、従来、カルボベンヅキシ
ーグルタミニルーグリシンとハイトロキシルアミンを基
質にし、生成するヒドロキサム酸を鉄キレートとして比
色定置する方法（Ｊ、Ｅ、Ｆｏｌｋｅｔ　ａｌ、　Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ第２４１巻　５５１８〜５５２５頁（
１９６６年）〕が行われていたが、最近になって、ペプ
チドと放射性同位元素でラヘルしたプトレッシンを基質
とし、反応によってペプチドに取込まれたプトレッシン
量をＣＩ４をカウントすることによって求め、トランス
グルタミナーゼ活性を定量する方法（Ｐ、Ｊ、Ｂｉｒｃ
ｋｂ−ｉｃｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｔｃａ　Ａｃｔａ第７２３
巻　２７〜３４頁（１９８３年）〕が報告された。

発明が解゛　しようとする問題点 従来の比色法によるトランスグルタミナーゼ活性測定法
は、除蛋白操作が必要であり、煩雑であること及び検体
中にキレータ−の作用を有する物質が存在すると正確な
測定値が得られないという欠点がある。又放射性同位元
素を用いる最近のトランスグルタミナーゼ活性測定法は
、放射性同位元素を使用するため特殊な設備を必要とす
る欠点がある。

問題点を解決するための手段 そこで、本発明者らは、上記現状を考慮し、簡便かつ正
確なトランスグルタミナーゼ活性測定法を見い出すべく
鋭意検討し以下の知見を得た。（１）基質としてペプチ
ドとポリアミンを用い、トランスグルタミナーゼを作用
させ、ペプチドにポリアミンを転移反応させる際にあら
かじめ反応液中のポリアミン濃度を一定にしておくと、
反応後に残存する未反応のポリアミン量を求めれば、反
応したポリアミン量がわかること、（２）反応したポリ
アミン量はトランスグルタミナーゼ活性と比例するので
、未反応のポリアミン量を求めることによってトランス
グルタミナーゼ活性を定量できること、（３）未反応の
ポリアミン量はポリアミン酸化酵素によって正確に定量
することが可能であること、本発明者らはこれらの知見
を組合せることによって、トランスグルタミナーゼを簡
単に、正確に測定できる方法を見い出し本発明を完成し
た。即ち本発明はペプチドとポリアミンからなる基質に
トランスグルタミナーゼを作用させた後、残存する未反
応のポリアミンをポリアミン酸化酵素によって定量し、
反応に要したポリアミン量を求め、これよりトランスグ
ルタミナーゼ活性を求めることを特徴とするトランスグ
ルタミナーゼ活性測定法である。

作用 本発明で用いられるグルタミン残基含有ペプチドとして
は、天然及び合成のペプチドが用いられる。天然ペプチ
ドの例としてはカゼインがあり、合成ペプチドの例とし
てはカルボベンゾキシ−グルタミル−グリシンがあげら
れる。

ポリアミンとしては、トランスグルタミナーゼが作用す
るものであれば、どのようなものでもよいが、例えばス
ペルミジン、スペルミン、プトレッシンなどが用いられ
る。

ポリアミン酸化酵素は、動植物あるいは微生物起源のも
のが知られており、本発明においてはいずれの起源のも
のも使用できる。動物起源としては、牛血漿より（Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ第　２３７巻　１５１１〜１５１６頁（
１９６２年）〕の記載によって調製された牛血漿アミン
オキシダーゼがあげられ、植物起源としては、発芽大豆
より特開昭５５−１６０８５２号公報記載の方法によっ
て調製された発芽大豆アミンオキシダーゼがあげられ、
微生物起源のものとしては、特開昭５６−９２７８８号
公報記載のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓＩ
ＦＯ６３４６の産生するポリアミンオキシダーゼＡＴ−
１及びＯ０＾ｄａｃｈ　ｉらのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
第３０巻　１２０２〜１２１０頁（１９６６年）記載の
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕｓｓ　ｒｏｓｅｕｓ　（旧菌株名旧
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｕｂｅｎｓｌ　Ｆ　Ｏ３７６８
）の産生ずるプトレッシン酸化酵素などがあげられる。

ポリアミン酸化酵素を使用するに際してはその基質特異
性に留意する必要がある。ａｌｌえばトランスグルタミ
ナーゼの基質としてスペルミン、スペルミジン又はプト
レッシンを用い名のであれば当然のことながらスペルミ
ン、スペルミジン又はプトレッシンに作用し得るポリア
ミン酸化酵素を選択せねばならない。本発明は、トラン
スグルタミナーゼ活性を求めるに際してトランスグルタ
ミナーゼと基質ペプチド及びポリアミンを反応させた後
に残存する未反応のポリアミンをまず定量し、それに基
づいて反応したポリアミン量を求め、これよりさらにト
ランスグルタミナーゼ活性を求める。未反応ポリアミン
の量は未反応ポリアミンにポリアミン酸化酵素を作用さ
せて生成する過酸化水素を酵素的あるいは物理化学的に
定量することによって行う。過酸化水素の酵素的な定量
法としては、パーオキシダーゼと水素供与体の色素源を
過酸化水素と反応させることによって生成する色素を比
色定量する方法が知られており、本発明の方法において
もこの方法を用いることができる。色素源としては、例
えば４−アミノアンチピリンとフェノール、４−アミノ
アンチピリンとＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウムなどの組み
合せがあげられる。

以下に本発明の簡易にして正確なトランスグルタミナー
ゼ活性測定法についてより詳細に実施例にて説明する。

実施例１　モルモット肝のトランスグルタミナーゼの測
定 １１）酵素液の調製：モルモット肝１ｉ１ｉ　１００ｇ
をホモジナイズし、０．２５Ｍのシュークロース２５０
ｒｕＩ！を加えて抽出、遠心分離を行い、抽出液２６０
−を得た。

この抽出液２６０−をあらかじめ２ｍＭ　　ＥＤＴＡを
含むｌ１０１ｌＩトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（カラム容ｓｔ　
３００１１ｉ）に流し、トランスグルタミナーゼを吸着
させ、カラムを上記緩衝液で洗浄後、食塩の濃度勾配で
溶出し、トランスグルタミナーゼを含む分画１００−を
集めた。この分画をトランスグルタミナーゼ含有液とし
て以下の試験を行った。

ｔ２＋　Ｍ　’１１の調製：カルボベンゾキシ−グルタ
ミニルーグリシン（ＣＢＺ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ
−ｇｌｙｃｉｎｅ、国産化学社製品）　　１００ｑ、Ｃ
ａＣｌ２　・２　Ｈ２Ｏ７■、スペルミジン（シグマ社
製品）５■をＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６）　１０−に
溶解した。

（３）反応したスペルミジンｉ（ΔＡ　５５５ｎｍ）　
　：　）ランスグルタミナーゼ含有液を１０倍、２０倍
、４０倍希釈したちの各１００４に調製した基質をそれ
ぞれ１０Ｍずつ加え、３７℃で６０分間反応させ、次い
で反応液にポリアミンオキシダーゼＡＴＬ（Ａｓ−ｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ　Ｉ　Ｆ　Ｏ６３４６
を特開昭５６−９２７８８号公報記載の方法で培養し、
培養ろ液を精製して調製）　０．７５ｕ、パーオキシダ
ーゼ（西洋ワサビ起源、大野製薬製品）　１７．５ｕ、
４−アミノアンチピリン（試薬−級、和光純薬工業社製
品）０．５■、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム（試薬−級
、和光純薬工業社製品）　２．２５ｍｇを含む０．１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ６）を２１ｎ！加え、室温で１０分放
置後、５５５ｎｍにおける吸光度を測定（未反応スペル
ミジン量に相当）した。対照としてトランスグルタミナ
ーゼ含有希釈液の代わりに水を用いて同様に測定し、対
照の吸光度より各反応液の吸光度を差し引いた値（反応
したスペルミジン量に相当）を表１に示す。

表　　　１ （４）トランスグルタミナーゼ活性二表１に示すように
、トランスグルタミナーゼ含有液中のトランスグルタミ
ナーゼ濃度とΔＡ　５５５ｎｍ　（反応したスペルミジ
ン量）との間には直線関係が得られる。反応生成物（色
素）の分子吸光係数は、１６０００であり、１分間に１
ｕモルの反応生成物を生じせしめる酵素量をｌｕとする
とトランスグルタミナーゼ活性は０．０４１９ｕ　／−
と計算される。

なお従来の比色法（Ｊ、Ｅ、Ｆｏｌｋら、Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
、ｒｙ第２４１巻　５５１８〜５５２５頁（１９６６年
）の方法〕で定量すると本試料のトランスグルタミナー
ゼ活性は０．６７１ｕ　／−であり、本発明法によるト
ランスグルタミナーゼ活性値は約１６分の１の値を示す
ことがわかる。

実施例２　モルモット肝のトランスグルタミナーゼ活性 （１１酵素液の調製：実施例１の（１）で得られたトラ
ンスグルタミナーゼ含有液５０−を８０％飽和の硫安で
塩析し、脱イオン水で透析することによって精製トラン
スグルタミナーゼ含有液３５ｍ１！を得た。

（２）基質の調製：カゼイン（ミルクカゼイン、メルク
社製品）１００■、プトレッシン（シグマ社製品）５　
ｍｇＳＣａＣ１２・２　Ｈ２Ｏ１０ｍｇを２０ｍＭ　）
リス塩酸緩衝／＆　（ｐＨ７）　１０−に溶解した。（
３）反応したプトレッシン量（ΔＡ　５５５ｎｍ）　　
：精製トランスグルタミナーゼ含有液を１０倍、４０倍
、８０倍希釈したちの各１００艷に調製した基質をそれ
ぞれ１００４ずつ加え、３７℃で６０分間反応させ、次
いで反応液にプトレッシン酸化酵素〔旧ｃｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｒｏｓｅｕｓｌ　Ｆ　Ｏ３７６８を０．Ａｄａｃ
ｈｉらＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ第３０巻　１２０２〜１
２１０頁（１９６６年）記載の方法に従って培養し、培
養ろ液を精製して調製〕１５０ｕ、４−アミノアンチピ
リン（試薬−級、和光純薬工業社製品）０．５■、Ｎ−
エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−）ルイジンナトリウム（試薬−級、和光純薬工業社製
品）２．２５■を含む精製水を２−加え、室温でｌＯ分
放置後５５５ｎｍにおける吸光度を測定（未反応プトレ
ッシン量に相当）した。対照として、精製トランスグル
タミナーゼ含有希釈液の代わりに水を用いて同様に測定
し、対照の吸光度より各反応液の吸光度を差し引いた値
（反応したプトレッシン量に相当）を表２に示す。

（以下余白） 表　　　２ （４）トランスグルタミナーゼ活性二表２に示すように
精製トランスグルタミナーゼ含有液中のトランスグルタ
ミナーゼ濃度とΔＡ　５５５ｎｍ　（反応したプトレッ
シン量に相当）との間には直線関係が得られる。反応生
成物（色素）の分子吸光係数は１６０００であり、１分
間に１μモルの反応生成物を生ぜしめる酵素ｍをｌｕと
するとトランスグルタミナーゼ活性は０．１０５＋ｕ／
ｒｎＩ！と計算される。

実施例３　ヒト血清中のトランスグルタミナーゼの測定 ＋１）酵素液の調製：ヒト血清中に含まれるトランスグ
ルタミナーゼを測定するために正常人及び肝疾患患者各
５名の血清そのものを検体試料とした。

（２）基質：実施例１（２）で調製したものを用いた。

但し、０．１Ｍ酢酸緩衝液のｐＨは６．５を用いた。

（３）活性測定：各検体血清１００ｇに基質１００ｐｌ
をそれぞれ混合し、３７°Ｃで２時間反応後、各々に実
施例１と同じポリアミンオキシダーゼＡＴ−１含有液２
ｍｅを加え、室温で１０分放置後吸光度を測定（未反応
スペルミジン量に相当）した。一方対照として、検体血
清の代わりに水を用いて同様に測定し、対照の吸光度よ
り各反応液の吸光度を差し引いた値（反応したスペルミ
ジン量に相当）を求め、次いで反応生成物（色素）の分
子吸光係数が１６０００であり、１分間に１μモルの反
応生成物を生ぜしめる酵素量をｌｕとして、血清中のト
ランスグルタミナーゼ活性を求めた。その結果を表３に
示す。

（以下余白） 表　　　３ 表３より明らかのように肝疾患患者は正常人に比して血
清中トランスグルタミナーゼ活性が相対的に高い値を示
すことがわかる。

発明の詳細 な説明したように、本発明のトランスグルタミナーゼ活
性測定法は、放射性同位元素を用いることもなく、又遠
心分離などの煩雑な操作も行うことなく、単に反応後に
残存する未反応のポリアミン量を測定するのみで、検体
中のトランスグルタミナーゼの活性を求めることができ
る簡易にして正確なトランスグルタミナーゼ活性測定法
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ペプチドとポリアミンからなる基質にトランスグル
   タミナーゼ含有液を作用させ、ポリアミンをペプチドに
   転移させた後、残存する未反応のポリアミンをポリアミ
   ン酸化酵素を用いて定量することによってペプチドに転
   移したポリアミン量を求め、これよりトランスグルタミ
   ナーゼ活性を求めることを特徴とするトランスグルタミ
   ナーゼ活性測定法。 ２　ポリアミンがスペルミン、スペルミジン、プトレッ
   シンのいずれかである特許請求の範囲第１項記載のトラ
   ンスグルタミナーゼ活性測定法。 ３　ポリアミン酸化酵素がスペルミン又はスペルミジン
   を酸化する酵素である特許請求の範囲第１項記載のトラ
   ンスグルタミナーゼ活性測定法。 ４　ポリアミン酸化酵素がプトレッシン酸化酵素である
   特許請求の範囲第１項記載のトランスグルタミナーゼ活
   性測定法。 ５　スペルミン又はスペルミジンを酸化する酵素がアス
   ペルギルス・テレウスの産生するポリアミンオキシダー
   ゼＡＴ−１である特許請求の範囲第３項記載のトランス
   グルタミナーゼ活性測定法。