JPS58149677A - Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 - Google Patents
Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法Info
- Publication number
- JPS58149677A JPS58149677A JP57033497A JP3349782A JPS58149677A JP S58149677 A JPS58149677 A JP S58149677A JP 57033497 A JP57033497 A JP 57033497A JP 3349782 A JP3349782 A JP 3349782A JP S58149677 A JPS58149677 A JP S58149677A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glutamic acid
- mol
- acid
- enzyme
- generating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ
１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および１モル
の水から、１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアン
モニアおよび１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒
する酵素作用を有するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
Ｈ２Ｏ２・ジェネレイヂイング） ： Ｌ −Ｇｌｕｔ
ａｍｉｃ ａｃｌ ｏｘｉｄａｓｅ （）（２０２”
ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ） 、およびＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）の製造法
、ならびにＬ−グルタミン酸オキシター−ゼ（Ｈ２Ｏ２
・ジエネレイティング）を用いる分析方法に関する。
１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および１モル
の水から、１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアン
モニアおよび１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒
する酵素作用を有するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
Ｈ２Ｏ２・ジェネレイヂイング） ： Ｌ −Ｇｌｕｔ
ａｍｉｃ ａｃｌ ｏｘｉｄａｓｅ （）（２０２”
ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ） 、およびＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）の製造法
、ならびにＬ−グルタミン酸オキシター−ゼ（Ｈ２Ｏ２
・ジエネレイティング）を用いる分析方法に関する。
従来より、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有する酸化
酵素としては、２モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸
素および１モルの水から、２モルのα−ケトグルタル酸
、２モルのアンモニアおよ −び１モルの水を生成する
反応を触媒する酵素作用を有するＬ−（＋）−グルタミ
ン酸オキシドレダクタ−Ｆが知られているにすぎない［
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ。
酵素としては、２モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸
素および１モルの水から、２モルのα−ケトグルタル酸
、２モルのアンモニアおよ −び１モルの水を生成する
反応を触媒する酵素作用を有するＬ−（＋）−グルタミ
ン酸オキシドレダクタ−Ｆが知られているにすぎない［
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ。
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ、 Ａｃｔａ１３６８．
（１９７４） １５８−１７２］。
（１９７４） １５８−１７２］。
また従来より、Ｌ−アミノ酸に基質特異性を有し、かつ
１モルのアミノ酸、１モルの酸素および１モルの水から
、１モルのα−ケト酸、１モルのアンモニアおよび１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素作用を有
するＬ−アミノ酸オキシダーゼが知られている［ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍ−ｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ
ｕｍｅ １１．２０４−２１１ （１９５５）等〕。
１モルのアミノ酸、１モルの酸素および１モルの水から
、１モルのα−ケト酸、１モルのアンモニアおよび１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素作用を有
するＬ−アミノ酸オキシダーゼが知られている［ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍ−ｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ
ｕｍｅ １１．２０４−２１１ （１９５５）等〕。
しかしながら、Ｌ−（＋）−グルタミン酸オキシドレタ
ークターゼは、前述の通り、２モルのし一グルタミン酸
に作用して、２モルのα−ケトグＪＶタミン酸、２モル
のアンモニアおよび１モルの水を生成する反応を触媒す
る酵素であり、過酸化水素も発生しない。またＬ−アミ
ノ酸オキシダーゼは、１モルのアミノ酸に作用して１モ
ルのα−ケト酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過
酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であるが、その
基質たるアミノ酸としてＬ−グルタミン酸に作用する酵
素については報告されておらず、従来のＬ−アミノ酸オ
キシダーゼはＬ−グルタミン酸に対して作用しないと報
告されている［ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ｎ、 ２０４−２１１（１９５
５） ：）。
ークターゼは、前述の通り、２モルのし一グルタミン酸
に作用して、２モルのα−ケトグＪＶタミン酸、２モル
のアンモニアおよび１モルの水を生成する反応を触媒す
る酵素であり、過酸化水素も発生しない。またＬ−アミ
ノ酸オキシダーゼは、１モルのアミノ酸に作用して１モ
ルのα−ケト酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過
酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であるが、その
基質たるアミノ酸としてＬ−グルタミン酸に作用する酵
素については報告されておらず、従来のＬ−アミノ酸オ
キシダーゼはＬ−グルタミン酸に対して作用しないと報
告されている［ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ｎ、 ２０４−２１１（１９５
５） ：）。
本発明者らは、長野県佐久市の畑土壌から分離した放線
菌Ａ７７００株および群馬県吾妻郡長野原町のサツマイ
モ畑の土壌から分離した放線菌Ａ３０６３株が、Ｌ−グ
ルタミン酸に基質特異性を有し、かつ１モルのＬ−グル
タミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、１モル
のα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素作用を有
する新規な酵素蛋白を産生ずることを見い出し、かつこ
れを単一な成分として精製、採取することを完成し、こ
の新規な酵素蛋白をＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ
２Ｏ２・ジエネレイテイング）と命名した。さらにごれ
らの放線菌Ａ７７００株およびＡ３０６３株を培養して
得られたこのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
シネレイティング）を用いることにより、種々のＬ−グ
ルタミン酸を含有する液体の新規な分析方法を確立した
。
菌Ａ７７００株および群馬県吾妻郡長野原町のサツマイ
モ畑の土壌から分離した放線菌Ａ３０６３株が、Ｌ−グ
ルタミン酸に基質特異性を有し、かつ１モルのＬ−グル
タミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、１モル
のα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素作用を有
する新規な酵素蛋白を産生ずることを見い出し、かつこ
れを単一な成分として精製、採取することを完成し、こ
の新規な酵素蛋白をＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ
２Ｏ２・ジエネレイテイング）と命名した。さらにごれ
らの放線菌Ａ７７００株およびＡ３０６３株を培養して
得られたこのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
シネレイティング）を用いることにより、種々のＬ−グ
ルタミン酸を含有する液体の新規な分析方法を確立した
。
まず本発明における上記放線菌Ａ７７００株およびＡ３
０６３株の肉眼的および顕微鏡的観察などに基く各種培
地上における培養の特徴は、次に記載する通りである。
０６３株の肉眼的および顕微鏡的観察などに基く各種培
地上における培養の特徴は、次に記載する通りである。
（Ａ）放線菌Ａ７７００株について。
■顕微鏡的観察
スターチ・無機塩寒天培地上で、３０℃、１０〜１５日
間培養し、観察した形態的所見は、次の通りである。な
お、オートミール寒天培地およびイーストエキス、麦芽
エキス寒天培地上でもほぼ同様な形態が観察された。
間培養し、観察した形態的所見は、次の通りである。な
お、オートミール寒天培地およびイーストエキス、麦芽
エキス寒天培地上でもほぼ同様な形態が観察された。
基生菌糸は曲線状で、分岐を伴って伸長し、直径０．５
〜０．６μで、菌糸の分裂や胞子の着生はない。
〜０．６μで、菌糸の分裂や胞子の着生はない。
基生菌糸より生じた気菌糸は、曲線状で単純分岐をなし
て伸長し、直径０．６〜０．８μであり、多数の連鎖し
た胞子を形成する。
て伸長し、直径０．６〜０．８μであり、多数の連鎖し
た胞子を形成する。
胞７の連鎖は螺旋を呈し、２〜３回巻いたものが多いが
、ループ状あるいはフック状のものもある。
、ループ状あるいはフック状のものもある。
胞子の形は楕円ないし短稈形で、大きさは０．６〜ｏ、
ｓ ｘ ｏ、 ｓ〜１．０μであり、その表面はイ滑
である。
ｓ ｘ ｏ、 ｓ〜１．０μであり、その表面はイ滑
である。
鞭毛胞子や胞子のうは形成しない。
■、ジアミノピメリン酸組成
全細胞を用いての分析で、Ｌ−型のシアジノピメリン酸
が検出され、ｍθ８〇−型は検出されなかった。
が検出され、ｍθ８〇−型は検出されなかった。
■、肉眼的観察
各種培地上で、３０℃、１４日間培養し、観察した所見
は、第１表に示す通りである。
は、第１表に示す通りである。
また色の表示は、Ｃｏ１ｏｒ ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎ
ｕａｌ 第４版１９５８年（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒ−■、生理的性
状 ■生育温度範囲：２０〜４０℃、 （竿）酸素の要求性：好気性、 ■ゼラチンの液化：陽性（極めて弱い）、（４’）スタ
ーチの加水分解：陽性、 ■脱脂牛乳：ペプトン化：陽性（弱い）、凝固；陰性、 ■メラニン様色素の生成： チロシン寒天培地上；陰性、 ペプトン イーストエキス・鉄寒天培地上；陽性、 （、ｆ）炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−グルコース、イノシトール、Ｄ−アンニ
トール、ラフィノース、Ｌ−ラムノース、シュクロース
およびＤ−キシロースの全てを利用する。
ｕａｌ 第４版１９５８年（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒ−■、生理的性
状 ■生育温度範囲：２０〜４０℃、 （竿）酸素の要求性：好気性、 ■ゼラチンの液化：陽性（極めて弱い）、（４’）スタ
ーチの加水分解：陽性、 ■脱脂牛乳：ペプトン化：陽性（弱い）、凝固；陰性、 ■メラニン様色素の生成： チロシン寒天培地上；陰性、 ペプトン イーストエキス・鉄寒天培地上；陽性、 （、ｆ）炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−グルコース、イノシトール、Ｄ−アンニ
トール、ラフィノース、Ｌ−ラムノース、シュクロース
およびＤ−キシロースの全てを利用する。
以上の通り、本菌Ａ７７００株は、真性の基土菌糸より
、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノ
ピメリン酸がＬ型であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成せ
ず、好気条件で生育することなどの特徴を有することか
ら、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属
に属するものと認められ、よって本菌Ａ７７００株をス
トレプトマイセス・ニス・ビー・Ａ ７７００ （Ｓｔ
ｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｅｐ′Ａ ７７００）と称するこ
ととし、また工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号、微工研菌寄第６２４１号（ＦＥｌ’ＬＭ Ｐ−６
２４１）として寄託した。
、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノ
ピメリン酸がＬ型であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成せ
ず、好気条件で生育することなどの特徴を有することか
ら、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属
に属するものと認められ、よって本菌Ａ７７００株をス
トレプトマイセス・ニス・ビー・Ａ ７７００ （Ｓｔ
ｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｅｐ′Ａ ７７００）と称するこ
ととし、また工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号、微工研菌寄第６２４１号（ＦＥｌ’ＬＭ Ｐ−６
２４１）として寄託した。
（Ｂ）放線菌Ａ３０６３株について、
ｌ、顕微鏡的観察
スターチ・無機塩寒天培地上で、３０℃、１０〜１５日
間培養し、観察した形卵的所見は、次の通りである。な
お、グリセリン・アヌパラギン寒天培地、チロシン寒天
培地およびイーストエキス・麦芽エキス寒天培地上にお
いても、はぼ同様な形態が観察された。
間培養し、観察した形卵的所見は、次の通りである。な
お、グリセリン・アヌパラギン寒天培地、チロシン寒天
培地およびイーストエキス・麦芽エキス寒天培地上にお
いても、はぼ同様な形態が観察された。
基土菌糸は曲線状で分岐を伴って伸長し、直径０．５〜
０．６μであり、菌糸の分裂や胞子の着生はない。
０．６μであり、菌糸の分裂や胞子の着生はない。
基土菌糸より生じた気菌糸は曲線状で単純分岐をなして
伸長し、直径０．６〜０．８μであり、多数の連鎖した
胞子を形成する。
伸長し、直径０．６〜０．８μであり、多数の連鎖した
胞子を形成する。
胞イの連鎖は、ループ状、フック状あるいは２回巻いた
螺旋を呈するものが多く、３回以上巻いた螺旋も少数存
在する。
螺旋を呈するものが多く、３回以上巻いた螺旋も少数存
在する。
胞子の形は球形で、大きさは直径０．６〜０８μであり
、その表面はとげ状を呈している。
、その表面はとげ状を呈している。
鞭毛胞子や胞子のうけ形成しない。
■、ジアミノピメリン酸組成
全細胞を用いての分析で、Ｌ型のジアミノピメリン酸が
検出され、ｍｅｓｏ−型は検出されなかった。
検出され、ｍｅｓｏ−型は検出されなかった。
Ｌ肉眼的観察
各種培地上で、３０℃、１４日間培養し、観察した所見
は、第２表に示す通りである。
は、第２表に示す通りである。
■、生理的性状
■生育温度範囲＝１５〜４３℃・
■酸素の要求性：好気性、
■ゼラチンの液化：陽性（弱い）、
（ｊ）スターチの加水分解：陽性
■脱脂牛乳：ペプトン化：陽性、
凝固 陰性、
■メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地およびペプ
トン・イーストエキス・鉄寒天培地上で陽性、 ■炭素源の利用性： 利用するもの：Ｄ−フラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ
−マンニトール％Ｌ−５ムノースオヨヒシュクロース、 利用性の弱いもの；Ｌ−アラビノース、イノシトール、
ラフィノースおよびＤ−キシロース、以上の通り、重曹
Ａ３０６３株は、真性の基性菌糸より、多数の胞子の連
鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノピメリン酸がＬ型
であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成せず、好気条件で生
育することなどの特徴を有することから、ストレプトマ
イセス属に属するものと認められ、よって重曹Ａ３０６
３株をストレプトマイセス ニス・ピー・Ａ８０６３
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｅｌｌ）、 Ａ ８０６
３ ）と称することとし、また工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号、微工研菌寄第６２４２号（ＦＥＢ
ＭＰ−６２４２）として寄託した。
トン・イーストエキス・鉄寒天培地上で陽性、 ■炭素源の利用性： 利用するもの：Ｄ−フラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ
−マンニトール％Ｌ−５ムノースオヨヒシュクロース、 利用性の弱いもの；Ｌ−アラビノース、イノシトール、
ラフィノースおよびＤ−キシロース、以上の通り、重曹
Ａ３０６３株は、真性の基性菌糸より、多数の胞子の連
鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノピメリン酸がＬ型
であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成せず、好気条件で生
育することなどの特徴を有することから、ストレプトマ
イセス属に属するものと認められ、よって重曹Ａ３０６
３株をストレプトマイセス ニス・ピー・Ａ８０６３
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｅｌｌ）、 Ａ ８０６
３ ）と称することとし、また工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号、微工研菌寄第６２４２号（ＦＥＢ
ＭＰ−６２４２）として寄託した。
またこの新規な酵素Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ
２Ｏ２・ジエネレイテイング）Ｌ−グルタミン酸に基質
特異性を有し、１モルめＬ−グルタミン酸、１モルの酸
素および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸
、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成
する反応を触媒する酵素であり、種々の定量手段を用い
ることにより、Ｌ−グルタミン酸を含有する液体にこの
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイ
テイング）を作用せしめ、次いで反応系におけるＬ−グ
ルタミン酸の量に基いて消費された酸素の量の定量、ま
たは、生成された過酸化水素の定量、アンモニアの定量
またはα−ケトグルタル酸の定量を行なうことによりＬ
−グルタミン酸と含有する液体のＬ−グルタミン酸の定
量分析方法を見い出した。
２Ｏ２・ジエネレイテイング）Ｌ−グルタミン酸に基質
特異性を有し、１モルめＬ−グルタミン酸、１モルの酸
素および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸
、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成
する反応を触媒する酵素であり、種々の定量手段を用い
ることにより、Ｌ−グルタミン酸を含有する液体にこの
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイ
テイング）を作用せしめ、次いで反応系におけるＬ−グ
ルタミン酸の量に基いて消費された酸素の量の定量、ま
たは、生成された過酸化水素の定量、アンモニアの定量
またはα−ケトグルタル酸の定量を行なうことによりＬ
−グルタミン酸と含有する液体のＬ−グルタミン酸の定
量分析方法を見い出した。
本発明は以上の知見に基いて完成されたもので、少なく
とも下記の基質特異性、酵素作用の理化学的性質を有す
る新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング）、・基質特異性：Ｌ−グルタミン酸
に基質特異性を有す ・酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素
および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、
１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成す
る反応（反応式〔■〕）を触媒する Ｌ−グルタミン酸 α−ケトグルタル酸お
よびストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）生産菌を
培養し、その培養物からＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）を採取することを特
徴とするし一グルタミン酸オキシダービ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング）の製造法、ならびにＬ−グルタミン
酸を含有する液体に、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を
有し、１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および
１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、１モル
のアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成する反応
を触媒するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・
ジエネレイテイング）を作用せしめ、次いで消費される
酸素の量、または生成されるα−ケトグルタル酸、アン
モニアまたは過酸化水素の量を定量することを特徴とす
るＬ−グルタミン酸の分析方法である。
とも下記の基質特異性、酵素作用の理化学的性質を有す
る新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング）、・基質特異性：Ｌ−グルタミン酸
に基質特異性を有す ・酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素
および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、
１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成す
る反応（反応式〔■〕）を触媒する Ｌ−グルタミン酸 α−ケトグルタル酸お
よびストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）生産菌を
培養し、その培養物からＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）を採取することを特
徴とするし一グルタミン酸オキシダービ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング）の製造法、ならびにＬ−グルタミン
酸を含有する液体に、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を
有し、１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および
１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、１モル
のアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成する反応
を触媒するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・
ジエネレイテイング）を作用せしめ、次いで消費される
酸素の量、または生成されるα−ケトグルタル酸、アン
モニアまたは過酸化水素の量を定量することを特徴とす
るＬ−グルタミン酸の分析方法である。
本発明における新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング〔以下単にＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）と称す〕としては、前記
の基質特異性および酵素作用を特徴として有するもので
あればよく、等重点、Ｋｍ値、でも、上記の特徴を有す
るものは本発明に包含されるものであり、また、この新
規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を得る
ための使用菌としては前記の菌はその例である。
Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング〔以下単にＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）と称す〕としては、前記
の基質特異性および酵素作用を特徴として有するもので
あればよく、等重点、Ｋｍ値、でも、上記の特徴を有す
るものは本発明に包含されるものであり、また、この新
規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を得る
ための使用菌としては前記の菌はその例である。
また本発明の製造法における使用菌としては、前記の菌
はその例であって、ストレプトマイセス属に属するし一
グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産能力を有す
るものであればすべて本発明において使用できる。もち
ろん、微生物は、自然的、人工的に変異を起しやすく、
これらの変異株であってもＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼの生産能力を失わない限り本発明に使用し得ることは
いう°までもないことであり、さらにこのＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の生産遺伝子を細胞工学
へ遺伝子組み換え操作にて他の細胞へと形質転換せしめ
てＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を製造す
ることも本発明に包含されるものである。
はその例であって、ストレプトマイセス属に属するし一
グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産能力を有す
るものであればすべて本発明において使用できる。もち
ろん、微生物は、自然的、人工的に変異を起しやすく、
これらの変異株であってもＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼの生産能力を失わない限り本発明に使用し得ることは
いう°までもないことであり、さらにこのＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の生産遺伝子を細胞工学
へ遺伝子組み換え操作にて他の細胞へと形質転換せしめ
てＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を製造す
ることも本発明に包含されるものである。
本発明を実施するに当って、ストレプトマイセス属に属
するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産菌
による製造法について例示すれば、次の如くである。例
れば、ストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｈ２０ｇ）生産菌を、抗生物質、酵素な
どを生産する通常の方法で培養する。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよく、工業的にはＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産菌の細胞をその生産用
培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利であ
る。
するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産菌
による製造法について例示すれば、次の如くである。例
れば、ストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｈ２０ｇ）生産菌を、抗生物質、酵素な
どを生産する通常の方法で培養する。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよく、工業的にはＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産菌の細胞をその生産用
培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利であ
る。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、例えばコーン・スチープ・リカー
、大豆粉、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫
安、塩化アンモニウムやＬ−グルタミン酸などの各種ア
ミノ酸などが使用される。炭素源としては、同化可能な
炭素化合物であればよく、例えばシフロース、グルコー
ス、フラクトース、糖蜜、マルトエキス、スターチ加水
分解物などが使用される。その他、食塩、塩化カリウム
、硫酸マグネシウム、リン酸第−カリウム、リン酸第二
カリウムなどの種々の無機塩 ゛・や消泡剤が必要に応
じて使用される。
ものが広く使用される。窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、例えばコーン・スチープ・リカー
、大豆粉、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫
安、塩化アンモニウムやＬ−グルタミン酸などの各種ア
ミノ酸などが使用される。炭素源としては、同化可能な
炭素化合物であればよく、例えばシフロース、グルコー
ス、フラクトース、糖蜜、マルトエキス、スターチ加水
分解物などが使用される。その他、食塩、塩化カリウム
、硫酸マグネシウム、リン酸第−カリウム、リン酸第二
カリウムなどの種々の無機塩 ゛・や消泡剤が必要に応
じて使用される。
培養温度は菌が発育し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２）を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通
常２０〜３５℃、好ましくは２６℃近辺である。培養時
間は、条件によって多少異なるが、通常５０〜１２０時
間程度であって、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２
Ｏ２）が最高力価に達する時期をみはからって適当な時
期に培養を終了すればよい。
（Ｈ２Ｏ２）を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通
常２０〜３５℃、好ましくは２６℃近辺である。培養時
間は、条件によって多少異なるが、通常５０〜１２０時
間程度であって、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２
Ｏ２）が最高力価に達する時期をみはからって適当な時
期に培養を終了すればよい。
このようにして得られた培養物において、Ｌ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）はその菌体内に含有され
ている。
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）はその菌体内に含有され
ている。
さらにこのようにして得られた培養物からＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を抽出し、粗製のＬ−グ
ルタミン酸オキシダーＭ（Ｈ２Ｏ２）を得るに当って例
示すれば、まず培養物を固液分離し得られる湿菌体を、
必要に応じてリン酸緩衝液、トリス−ＨＣＪ緩衝液、ジ
メチルグルタル酸−Ｎａ。
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を抽出し、粗製のＬ−グ
ルタミン酸オキシダーＭ（Ｈ２Ｏ２）を得るに当って例
示すれば、まず培養物を固液分離し得られる湿菌体を、
必要に応じてリン酸緩衝液、トリス−ＨＣＪ緩衝液、ジ
メチルグルタル酸−Ｎａ。
Ｈ緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次いでフレンチプ
レス処理、超音波処理、ミル処理やりゾチーム処理など
の種々の菌体破砕処理手段を適宜選択、組合せて処理し
て、粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）
含有液を得る。次いでこの溶液を、さらに公知の蛋白質
、酵素などの単離、精製されたＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を得ることができる。例えば、粗製
のＬ−グルタミン酸オキシター−ゼ（Ｈ２Ｏ２）含有液
に、アセト／、メタノール、エタノールやイソプロパツ
ールなどの有機溶剤による分別沈澱法、硫安などによる
塩析法などの手段を用いて沈澱せしめ、回収して粗製の
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）含有物を得
てもよい。さらにこれ祭、例えば電気泳動法などにて単
一の帯を示すまで精製してもよく、その精製手段として
は、例えば上記の粗製のＬ−グルタミン酸オキシター−
ゼ（Ｈ２Ｏ２）含有物を前記の如くの緩衝液に溶解せし
め、透析手段やジエチルアミノエチルセルｉロース、ジ
エチルアミノエチルセファロースなどのイオン交換体、
デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなどのゲ
ルｐ過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。また
これらの手段を適宜組合せて精製すればよく、次いでこ
れを凍結乾燥手段により乾燥してＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の精製粉末を得る。
レス処理、超音波処理、ミル処理やりゾチーム処理など
の種々の菌体破砕処理手段を適宜選択、組合せて処理し
て、粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）
含有液を得る。次いでこの溶液を、さらに公知の蛋白質
、酵素などの単離、精製されたＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を得ることができる。例えば、粗製
のＬ−グルタミン酸オキシター−ゼ（Ｈ２Ｏ２）含有液
に、アセト／、メタノール、エタノールやイソプロパツ
ールなどの有機溶剤による分別沈澱法、硫安などによる
塩析法などの手段を用いて沈澱せしめ、回収して粗製の
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）含有物を得
てもよい。さらにこれ祭、例えば電気泳動法などにて単
一の帯を示すまで精製してもよく、その精製手段として
は、例えば上記の粗製のＬ−グルタミン酸オキシター−
ゼ（Ｈ２Ｏ２）含有物を前記の如くの緩衝液に溶解せし
め、透析手段やジエチルアミノエチルセルｉロース、ジ
エチルアミノエチルセファロースなどのイオン交換体、
デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなどのゲ
ルｐ過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。また
これらの手段を適宜組合せて精製すればよく、次いでこ
れを凍結乾燥手段により乾燥してＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の精製粉末を得る。
本発明によって得られるＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２）の活性測定法および理化学的性質は、次の
通りである。
（Ｈ２Ｏ２）の活性測定法および理化学的性質は、次の
通りである。
（１）活性測定法
０．３％４−アミノアンチピリン ０，３−ペルオ
キシダーゼ（５０ルー） ０．１ｍｅＯ０２Ｍ
リン酸緩衝液（ＰＨ７，０） ０．６ｄ０．２％Ｎ、
Ｎ−ジメチルーｍ −）ルイジン
０．３−〇、２ＭＬ−グルタミン酸（ＰＨ ７，０に調製） １５−蒸留水
０．２ゴーーーーユ 計８．〇− 上記の組成を有する反応液８．０−を調製し、３７℃に
加温して石英セルに加え、酵素液５０μ！を加えてすば
やく混合し、３７℃に調整された恒温セルホルダーを有
する分光光度計に装着し、混合後２分目から正確に５分
間反応を行ない、この間の５４５ｎｍにおける吸光度変
化（ΔＡ３４５ ）を測定する。
キシダーゼ（５０ルー） ０．１ｍｅＯ０２Ｍ
リン酸緩衝液（ＰＨ７，０） ０．６ｄ０．２％Ｎ、
Ｎ−ジメチルーｍ −）ルイジン
０．３−〇、２ＭＬ−グルタミン酸（ＰＨ ７，０に調製） １５−蒸留水
０．２ゴーーーーユ 計８．〇− 上記の組成を有する反応液８．０−を調製し、３７℃に
加温して石英セルに加え、酵素液５０μ！を加えてすば
やく混合し、３７℃に調整された恒温セルホルダーを有
する分光光度計に装着し、混合後２分目から正確に５分
間反応を行ない、この間の５４５ｎｍにおける吸光度変
化（ΔＡ３４５ ）を測定する。
また活性測定の算出法は、次式に従う。
％式％
０
株の産生じたＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
）〔以下、Ａ７７００酵素と略す〕およびストレプトマ
イセス・ニス・ピー・Ａ３０６３株の産生じたＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）［：以下、Ａ３０６
３酵素と略す〕の各酵素を用いて、前記の活性測定法を
利用して、そのＬ−グルタミン酸の代りに、第３表に記
載の種々の基質を用いて、Ｌ−グルタミン酸に対する相
対活性（％）を求めた。
）〔以下、Ａ７７００酵素と略す〕およびストレプトマ
イセス・ニス・ピー・Ａ３０６３株の産生じたＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）［：以下、Ａ３０６
３酵素と略す〕の各酵素を用いて、前記の活性測定法を
利用して、そのＬ−グルタミン酸の代りに、第３表に記
載の種々の基質を用いて、Ｌ−グルタミン酸に対する相
対活性（％）を求めた。
その結果、第３表に示す通りで、両酵素ともＬ−グルタ
ミン酸に基質特異性を有し、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオ
ニン、Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−アルギニン、Ｌ−リ
ジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アラニン、Ｌ−インロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−−、Ｘレオニン、Ｌ−セリンに基
質特異性を有さないものと認められた。
ミン酸に基質特異性を有し、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオ
ニン、Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−アルギニン、Ｌ−リ
ジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アラニン、Ｌ−インロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−−、Ｘレオニン、Ｌ−セリンに基
質特異性を有さないものと認められた。
第 ３ 表
（３）酵素作用
基質として０．５μｍｏ ｌｅθＬ−グルタミン酸を用
いて、両酵素の作用に基く、消費された酸素の量、生成
されたα−ケトグルタル酸の量、アンモニアの量および
過酸化水素の量を定量した。
いて、両酵素の作用に基く、消費された酸素の量、生成
されたα−ケトグルタル酸の量、アンモニアの量および
過酸化水素の量を定量した。
その結果は、第４表の通りであった。
第 ４ 表
なお、消費された酸素の量は酸素電極で定量し、生成し
たα−ケトグルタル酸の量は２．４−ジニトロフェニル
ヒドラジン法〔化学の領域、増刊３３第９９〜１０４頁
、「生化学領域における光電比色法」〕で定量し、生成
したアンモニアの量はインドフェノール法［Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃ”ｈｅｍ、、 １０２．４９９（１９３３）
〕で定量し、生成した過酸化水素の量はペルオキシダー
ゼ−４−アミノアンチピリン−フェノール系の発色法で
定量したものである。
たα−ケトグルタル酸の量は２．４−ジニトロフェニル
ヒドラジン法〔化学の領域、増刊３３第９９〜１０４頁
、「生化学領域における光電比色法」〕で定量し、生成
したアンモニアの量はインドフェノール法［Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃ”ｈｅｍ、、 １０２．４９９（１９３３）
〕で定量し、生成した過酸化水素の量はペルオキシダー
ゼ−４−アミノアンチピリン−フェノール系の発色法で
定量したものである。
以上の結果、両酵素とも、１モルのＬ−グルタミン酸、
１モルの酸素および１モルの水から、１モルのα−ケト
グルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化
水素を生成する反応（反応式〔Ｉ〕）を触媒することが
確認された。
１モルの酸素および１モルの水から、１モルのα−ケト
グルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化
水素を生成する反応（反応式〔Ｉ〕）を触媒することが
確認された。
Ｃ０ＯＨＣ！ＯＯＨ
１
Ｌ−グルタミン酸 α−ケトグルタル酸（
４）等電点 Ａ７７００酵素およびＡ３０６３酵素の等電点を、キャ
リアー・アンフオライトＰ Ｈ３，５〜ＰＨ６，０（Ｌ
ＫＢ社製）を用いて等重点電気泳動法にて、両酵素の等
重点を求めた結果、Ａ７７００酵素はＰ Ｈ４，３付近
、Ａ３０６３酵素はＰ Ｈ４，１付近であった。
４）等電点 Ａ７７００酵素およびＡ３０６３酵素の等電点を、キャ
リアー・アンフオライトＰ Ｈ３，５〜ＰＨ６，０（Ｌ
ＫＢ社製）を用いて等重点電気泳動法にて、両酵素の等
重点を求めた結果、Ａ７７００酵素はＰ Ｈ４，３付近
、Ａ３０６３酵素はＰ Ｈ４，１付近であった。
（５） Ｋｍ値
両酵素のＬ−グルタミン酸に対するＫｍ値は、Ａ７７０
０酵素が約５．６ Ｘ １０−’Ｍ、 Ａ ８０６３酵
素が約ＬＩＸＩＯＭと測定された。
０酵素が約５．６ Ｘ １０−’Ｍ、 Ａ ８０６３酵
素が約ＬＩＸＩＯＭと測定された。
（６）至適ＰＨ
活性測定法における緩衝液の代りに、グリシン−ＨＣＪ
緩衝液（Ｐ Ｈ２，５〜４．５）、ジメチルグルタル酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ４〜７）、リン酸緩衝液（ＰＨ
６〜８）、トリス−）１（Ｊ緩衝液（ＰＨ７〜９）、グ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ９〜９．５）の各緩衝液
を用いて、両酵素の活性測定を行なってその至適ＰＨを
測定した。
緩衝液（Ｐ Ｈ２，５〜４．５）、ジメチルグルタル酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ４〜７）、リン酸緩衝液（ＰＨ
６〜８）、トリス−）１（Ｊ緩衝液（ＰＨ７〜９）、グ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ９〜９．５）の各緩衝液
を用いて、両酵素の活性測定を行なってその至適ＰＨを
測定した。
その結果、第１図はＡ７７００酵素の至適ＰＨ曲線を示
し、図中、・はグリシン−ＨＣＪ緩衝液、×はジメチル
グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液、ムはリン酸緩衝液、園は
トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液、◆はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
の場合を示し、第２図はＡ３０６３酵素の至適ＰＨ曲線
を示し、図中Ｏはグリシン−ＩＬＣ）緩衝液、×はジメ
チルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液、△はリン酸緩衝液、
口はトリス−ＨＣ！緩衝液、◇はグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液の場合を示すもので、両酵素ともＰＨ５〜７５に至
適ＰＨを有するものと測定された。
し、図中、・はグリシン−ＨＣＪ緩衝液、×はジメチル
グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液、ムはリン酸緩衝液、園は
トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液、◆はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液
の場合を示し、第２図はＡ３０６３酵素の至適ＰＨ曲線
を示し、図中Ｏはグリシン−ＩＬＣ）緩衝液、×はジメ
チルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液、△はリン酸緩衝液、
口はトリス−ＨＣ！緩衝液、◇はグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液の場合を示すもので、両酵素ともＰＨ５〜７５に至
適ＰＨを有するものと測定された。
（７）熱安定性
２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０）に、各酵素Ａ７
７００酵素、Ａ８０６３酵累を溶解し、種々の温度で１
０分間加熱し、処理後直ちに水浴に入れて冷した後、各
酵素の残存活性を活性測定法に基いて測定した。
７００酵素、Ａ８０６３酵累を溶解し、種々の温度で１
０分間加熱し、処理後直ちに水浴に入れて冷した後、各
酵素の残存活性を活性測定法に基いて測定した。
その結果、第３図に示す通りで、図中、・はＡ７７００
酵素の場合を示し、○はＡ３０６３酵素の場合を示し、
両酵素とも５５℃までは安定であり、７０℃では完全に
失ｙｔした。
酵素の場合を示し、○はＡ３０６３酵素の場合を示し、
両酵素とも５５℃までは安定であり、７０℃では完全に
失ｙｔした。
（８） Ｐ Ｈ安定性
種々の緩衝液を用いて、Ａ７７００酵素のＰＨ安定性曲
線（第４図に示す）およびＡ３０６３酵素のＰＨ安定性
曲線（第５図に示す）を求めた。
線（第４図に示す）およびＡ３０６３酵素のＰＨ安定性
曲線（第５図に示す）を求めた。
用いた緩衝液としては濃度４０ｍＭで、グリシン−〇
（Ｊ緩衝液（Ｐ Ｈ２，５〜４．５）（第４図および第
５図中○にて示す）、ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩
衝液（ＰＨ４〜７．５）（第４図および第５図中・にて
示す）、リン酸緩衝液（ＰＨ６〜８）（第４図および第
５図中ムにて示す）、トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（、ＰＨ７
〜９）（第４図および第５図中Δにて示す）、グリシン
−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ９〜９．５）（第４図および第
５図中口にて示す）を用い、各種緩衝液にそれぞれの酵
素を溶解し、３７℃で６０分間加温した後、直ちに氷冷
し、それぞれのＰＨにおける残存活性を活性測定法に基
いて測定した。
（Ｊ緩衝液（Ｐ Ｈ２，５〜４．５）（第４図および第
５図中○にて示す）、ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩
衝液（ＰＨ４〜７．５）（第４図および第５図中・にて
示す）、リン酸緩衝液（ＰＨ６〜８）（第４図および第
５図中ムにて示す）、トリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（、ＰＨ７
〜９）（第４図および第５図中Δにて示す）、グリシン
−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＨ９〜９．５）（第４図および第
５図中口にて示す）を用い、各種緩衝液にそれぞれの酵
素を溶解し、３７℃で６０分間加温した後、直ちに氷冷
し、それぞれのＰＨにおける残存活性を活性測定法に基
いて測定した。
その結果、Ａ７７００酵素の場合は第４図に示す通りで
Ｐ Ｈ４，５〜７５で安定と認められ、またＡ３０６３
酵素の場合は第５図に示す通りでＰＨ４〜７．５で安定
と認められた。
Ｐ Ｈ４，５〜７５で安定と認められ、またＡ３０６３
酵素の場合は第５図に示す通りでＰＨ４〜７．５で安定
と認められた。
（９）金属塩の影響
Ａ７７００酵素およびＡ３０６３酵素の活性に対する金
属イオンの影響を測定した結果、第５表に示す。Ｃｕ２
＋イオン以外はとんど影響はなかった。
属イオンの影響を測定した結果、第５表に示す。Ｃｕ２
＋イオン以外はとんど影響はなかった。
第 ５ 表
αＱ界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性化、種
々の界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性化の結
果について、第６表に示す。
々の界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性化の結
果について、第６表に示す。
その結果、ＥＤＴＡによる影響が認められないことから
、両酵素とも金属酵素でないと推定される。また両酵素
とも、ＮａＮ３やＫＣＮによっても阻害されず、ＦＡＤ
、ＦＭＮによっても大きく影響されなかった。
、両酵素とも金属酵素でないと推定される。また両酵素
とも、ＮａＮ３やＫＣＮによっても阻害されず、ＦＡＤ
、ＦＭＮによっても大きく影響されなかった。
第 ６ 表
以上の通り、Ａ７７００酵素およびＡ３０６３酵素は、
Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ１モルのＬ
−グルタミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、
１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよ
び１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）で、新規な酵素と
認められる。
Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ１モルのＬ
−グルタミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、
１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよ
び１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）で、新規な酵素と
認められる。
また新規なこのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（１１２
０２）は、その酵素作用に基いて消費された成分である
酸素の量、生成された成分であるα−ケトグルタル酸の
量、アンモニアの量、過酸化水素の量の定量を行なうこ
とによりＬ−グルタミン酸を含有する液体の新規な分析
方法に使用されるっ本発明の対象となるＬ−グルタミン
酸を含有する液体としては、Ｌ−グルタミン酸を含有す
るものであればすべて包まれる。例えばＬ−グルタミン
酸試薬、Ｌ−グルタミン酸醗酵液、Ｌ−グルタミン酸を
含有する飲食品などの被検液や、Ｌ−グルタミン酸を生
成、遊離する酵素反応系やＬ−グルタミン酸を基質とし
て消費する酵素反応系の酵素活性測定用またはその酵素
基質定量用被検液が挙られる。またその酵素活性測定用
またはその酵素基質定量用被検液の酵素反応系としては
、以下の種々の反応系が挙られる。
０２）は、その酵素作用に基いて消費された成分である
酸素の量、生成された成分であるα−ケトグルタル酸の
量、アンモニアの量、過酸化水素の量の定量を行なうこ
とによりＬ−グルタミン酸を含有する液体の新規な分析
方法に使用されるっ本発明の対象となるＬ−グルタミン
酸を含有する液体としては、Ｌ−グルタミン酸を含有す
るものであればすべて包まれる。例えばＬ−グルタミン
酸試薬、Ｌ−グルタミン酸醗酵液、Ｌ−グルタミン酸を
含有する飲食品などの被検液や、Ｌ−グルタミン酸を生
成、遊離する酵素反応系やＬ−グルタミン酸を基質とし
て消費する酵素反応系の酵素活性測定用またはその酵素
基質定量用被検液が挙られる。またその酵素活性測定用
またはその酵素基質定量用被検液の酵素反応系としては
、以下の種々の反応系が挙られる。
・グルタメイト・ビルベイト トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）活性反応系 ＧＰＴ Ｌ−アラニン＋α−クトグルタル酸□ ピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸 ・グルタメイト・オギザロアセテート・トランスアミナ
ーゼ（ＧＯＴ）活性反応系 ０Ｔ Ｌ−アスパラギン酸＋α−クトグルタル酸□オギザロ酢
酸＋Ｌ−グルタミン酸 ・システィン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴａｅ
ｅ）活性反応系 ＫＡＴａｅｅ Ｌ−システィン＋α−ケトグルタル酸 β−メルカプトピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸・チロシ
ン・アミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴａｅｅ ）活性
反応系 ＴＡＴ ａｓｅ Ｌ−チロシ／＋α−ケトグルタル酸 Ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸＋Ｌ−４ルタミン酸
・ロイシン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴａｅｅ
）活性反応系 ＫＡＴａｅｅ Ｌ−ロイシ／＋α−ケトグルタル酸 ２−オキソインカプロン酸＋Ｌ−グルタミン酸・キヌレ
ン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴａｅｅ ）活性
反応液 ＫＡＴａｅｅ Ｌ−キヌレン＋α−ケトグルタル酸 ０−アミノベンゾイルピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸・
アミノブチレート・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴ
ａｅｅ）活性反応系 ＫＡＴａｅｅ ４−アミノブタン酸＋α−ケトグルタル酸サクシニック
セミアルデヒド＋Ｌ−グルタミン酸・γ−グルタミル・
トランスペプチダーゼ（ｒ−ＧＴＰ）活性反応系 γ一部 Ｌ−グルタミール−Ｘ＋Ｌ−グルタミン酸−一一りリシ
ルーグリシルーＸ＋Ｌ−ｆルタミン酸（ただしＸはグル
タミル−アミノ酸などの転位基）・グルタメイト・ラセ
マーゼ（ＧＲａｓｅ）活性反応系 Ｇ Ｒａ ｓ ｅ Ｄ−グルタミン酸−−−−一→Ｌ−グルタミン酸これら
の酵素反応系は例示であうで、何んら本発明の被検液を
限定するものではなく、またこれらの反応系において、
生成、遊離されるＬ−グルタミン酸の量を定量分析する
ことにより、その酵素活性測定を行なうか、またその酵
素基質定量となるものである。
ＰＴ）活性反応系 ＧＰＴ Ｌ−アラニン＋α−クトグルタル酸□ ピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸 ・グルタメイト・オギザロアセテート・トランスアミナ
ーゼ（ＧＯＴ）活性反応系 ０Ｔ Ｌ−アスパラギン酸＋α−クトグルタル酸□オギザロ酢
酸＋Ｌ−グルタミン酸 ・システィン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴａｅ
ｅ）活性反応系 ＫＡＴａｅｅ Ｌ−システィン＋α−ケトグルタル酸 β−メルカプトピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸・チロシ
ン・アミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴａｅｅ ）活性
反応系 ＴＡＴ ａｓｅ Ｌ−チロシ／＋α−ケトグルタル酸 Ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸＋Ｌ−４ルタミン酸
・ロイシン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴａｅｅ
）活性反応系 ＫＡＴａｅｅ Ｌ−ロイシ／＋α−ケトグルタル酸 ２−オキソインカプロン酸＋Ｌ−グルタミン酸・キヌレ
ン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴａｅｅ ）活性
反応液 ＫＡＴａｅｅ Ｌ−キヌレン＋α−ケトグルタル酸 ０−アミノベンゾイルピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸・
アミノブチレート・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡＴ
ａｅｅ）活性反応系 ＫＡＴａｅｅ ４−アミノブタン酸＋α−ケトグルタル酸サクシニック
セミアルデヒド＋Ｌ−グルタミン酸・γ−グルタミル・
トランスペプチダーゼ（ｒ−ＧＴＰ）活性反応系 γ一部 Ｌ−グルタミール−Ｘ＋Ｌ−グルタミン酸−一一りリシ
ルーグリシルーＸ＋Ｌ−ｆルタミン酸（ただしＸはグル
タミル−アミノ酸などの転位基）・グルタメイト・ラセ
マーゼ（ＧＲａｓｅ）活性反応系 Ｇ Ｒａ ｓ ｅ Ｄ−グルタミン酸−−−−一→Ｌ−グルタミン酸これら
の酵素反応系は例示であうで、何んら本発明の被検液を
限定するものではなく、またこれらの反応系において、
生成、遊離されるＬ−グルタミン酸の量を定量分析する
ことにより、その酵素活性測定を行なうか、またその酵
素基質定量となるものである。
・アミノ−アシッド・アセチルトランスフェラーゼ（Ａ
ＡＡＴａｓｅ）活性反応系 ＡＡａｓｅ アセチル−ＣＯＡ十Ｌ−グルタミン酸 Ｃ０ＡＳＨ十Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸・グリシ
／・アミノトランスフェラーゼ（ＧＬＡＴ ａｓｅ ）
活性反応系 グリシン÷α−ケトグルタル酸 ・グルタルメイト・デカルボキシラーゼ（ＧＤａｓｅ）
活性反応系 γ−アミノブタン酸＋００２ ・γ−グルタミルーシスティｙ・シンセターゼ（γ−Ｇ
ＬＯ８ａｓｅ）活性反応系 γ（）ＬＣ８ａｓｅ ＡＴＰ＋Ｌ−グルタミン酸＋Ｌ−システィンγ−Ｌ−グ
ルタミル−Ｌ−システィン＋ＡＤＰ十無機リン酸上記の
酵素反応系は例示であって、何んら本発明の被検液を限
定するものではなく、またこれらの反応系において酵素
基質として消費されたＬ −グルタミン酸の量を定量す
ることにより、その酵素活性測定を行なうものである。
ＡＡＴａｓｅ）活性反応系 ＡＡａｓｅ アセチル−ＣＯＡ十Ｌ−グルタミン酸 Ｃ０ＡＳＨ十Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸・グリシ
／・アミノトランスフェラーゼ（ＧＬＡＴ ａｓｅ ）
活性反応系 グリシン÷α−ケトグルタル酸 ・グルタルメイト・デカルボキシラーゼ（ＧＤａｓｅ）
活性反応系 γ−アミノブタン酸＋００２ ・γ−グルタミルーシスティｙ・シンセターゼ（γ−Ｇ
ＬＯ８ａｓｅ）活性反応系 γ（）ＬＣ８ａｓｅ ＡＴＰ＋Ｌ−グルタミン酸＋Ｌ−システィンγ−Ｌ−グ
ルタミル−Ｌ−システィン＋ＡＤＰ十無機リン酸上記の
酵素反応系は例示であって、何んら本発明の被検液を限
定するものではなく、またこれらの反応系において酵素
基質として消費されたＬ −グルタミン酸の量を定量す
ることにより、その酵素活性測定を行なうものである。
次いでこのようにして用意されたＬ−グルタミン酸を・
骨？有する液体に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ
２Ｏ２）を作用せしめるのである力（、このＬ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２） Ｇま酵素の安定ＰＨ
域の緩衝液に溶解した溶液であってもよく、さらにその
酵素活性を劣化せしめない状態にて、マイクロカプセル
化手段、樹脂または多糖類や無機ガラスなどとの共有結
合手段、吸光手段などの酵素の固定化手段を化したもの
であってもよい。またＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
Ｈ２Ｏ２）の使用量としては、用いる液体の量や反応時
間などによって異なるが、１テスト当り通常０．３単位
以上であればよく、好ましくは２〜１０単位程度である
。また用いるＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
）の比活性は高いものほど反応にとって良好であること
は言うまでもないことであるが、必ずしも最高純度のも
のを要求するものではない。
骨？有する液体に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ
２Ｏ２）を作用せしめるのである力（、このＬ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２） Ｇま酵素の安定ＰＨ
域の緩衝液に溶解した溶液であってもよく、さらにその
酵素活性を劣化せしめない状態にて、マイクロカプセル
化手段、樹脂または多糖類や無機ガラスなどとの共有結
合手段、吸光手段などの酵素の固定化手段を化したもの
であってもよい。またＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
Ｈ２Ｏ２）の使用量としては、用いる液体の量や反応時
間などによって異なるが、１テスト当り通常０．３単位
以上であればよく、好ましくは２〜１０単位程度である
。また用いるＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
）の比活性は高いものほど反応にとって良好であること
は言うまでもないことであるが、必ずしも最高純度のも
のを要求するものではない。
また用いられるＬ−グルタミン酸を含有する液体の量と
しては、特に限定されるものではなく、適宜希釈するか
、またはその株の状態にて用いる。
しては、特に限定されるものではなく、適宜希釈するか
、またはその株の状態にて用いる。
このようにして、該液体に、Ｌ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（Ｈ２Ｏ２）を作用せしめて、一定時間、一定温度
、例えば５〜２０分間、約３７℃にてインキュベイトす
ることにより、該液体中のＬ−グルタミン酸１モル比当
り、１モルの酸素を消費し、１モルのα−ケトクルタル
酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素が生
成される。次いでこれらの酸素、α−ケトグルタル酸、
アンモニアまたは過酸化水素の定量を行なうものである
が、酸素の定量に当っては酸素電極を用い、電気的変化
として定量する方法が最も簡便であり、α−ケトグルタ
ル酸の定量に当っては例えば２．４−ジニトロフェニル
ヒドラジンを用いるヒドラゾン法により比色定量（吸収
波長４１５ｎｍ又は５３０ｎｍ）にて行なうことが簡便
である。またアンモニアの定量としては、アンモニア電
極やアンモニウムイオンとなした後にイオン電極で電気
的変化として定量するか、インドフェノール法にて定量
すればよい。さらに過酸化水素の定量としては、過酸化
水素電極を用い電気的変化として定量するか、過酸化水
素と反応して検出できる生成物に変化する指示薬組成物
を用いて定量してもよい。またこの指示薬組成物として
は、通常色調の変化を可視にて生ずる呈色薬組成物、紫
外線照射により螢光を発する螢光薬組成物や発色する発
光薬組成物である分光光学的手段によりその変化を定量
し得る組成物が用いられる。例えば呈色薬組成物として
はペルオキシダーゼ作用を有する物質と染料前駆体との
含有物が用いられる。このペルオキシダーゼ作用を有す
る物質としては、西洋わさび由来のベルオキシター−ゼ
が通常よく用いられ、また染料前駆体としては電子受容
体とフェノール誘導体またはアニリン誘導体の組合せが
通常よく用いられる。
ーゼ（Ｈ２Ｏ２）を作用せしめて、一定時間、一定温度
、例えば５〜２０分間、約３７℃にてインキュベイトす
ることにより、該液体中のＬ−グルタミン酸１モル比当
り、１モルの酸素を消費し、１モルのα−ケトクルタル
酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素が生
成される。次いでこれらの酸素、α−ケトグルタル酸、
アンモニアまたは過酸化水素の定量を行なうものである
が、酸素の定量に当っては酸素電極を用い、電気的変化
として定量する方法が最も簡便であり、α−ケトグルタ
ル酸の定量に当っては例えば２．４−ジニトロフェニル
ヒドラジンを用いるヒドラゾン法により比色定量（吸収
波長４１５ｎｍ又は５３０ｎｍ）にて行なうことが簡便
である。またアンモニアの定量としては、アンモニア電
極やアンモニウムイオンとなした後にイオン電極で電気
的変化として定量するか、インドフェノール法にて定量
すればよい。さらに過酸化水素の定量としては、過酸化
水素電極を用い電気的変化として定量するか、過酸化水
素と反応して検出できる生成物に変化する指示薬組成物
を用いて定量してもよい。またこの指示薬組成物として
は、通常色調の変化を可視にて生ずる呈色薬組成物、紫
外線照射により螢光を発する螢光薬組成物や発色する発
光薬組成物である分光光学的手段によりその変化を定量
し得る組成物が用いられる。例えば呈色薬組成物として
はペルオキシダーゼ作用を有する物質と染料前駆体との
含有物が用いられる。このペルオキシダーゼ作用を有す
る物質としては、西洋わさび由来のベルオキシター−ゼ
が通常よく用いられ、また染料前駆体としては電子受容
体とフェノール誘導体またはアニリン誘導体の組合せが
通常よく用いられる。
さらに電子受容体としては、例えば４−アミノアンチピ
リン、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−
１，２，４−トリアゾール、２−ヒドラジノベンゾチア
ゾール、３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン
、２−アミノベンゾチアゾールなどが用いられ、またフ
ェノール誘導体またはアニリン誘導体としては、例えば
フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ｐ−
クロロフＪ、ノール、２．４−ジクロロフェノール、４
．６−ジクロロ−〇−クレゾール、２．４−シフロモフ
ェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ −）ルイジン、Ｎ
、Ｎ−ジエチル−ｍ −トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−ｍ−メトキシトルイジン、Ｎ、Ｎ−ジェタノール−ｍ
−）ルイジン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロ
キシエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルツ
ユニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル
−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ −）ルイジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−）ルイジンナトリウム、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシン−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、ｍ−アセトアミノ
−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンなどが挙られる。また４−
アミノアンチピリンとフェノール誘導体とによる呈色化
合物は特異的吸収波長として５００〜５２０ ｎｍ近辺
を有し、また４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体
とによる呈色化合物は特異的吸収波長として５３５〜５
８０ ｎｍ近辺を有するものである。また螢光薬組成物
や発光薬組成物における発螢光基質としては、公知の種
々のものが挙られ、例えばビス（２，４，６−１リクロ
ロフエノール）オギザレイト、フェニルチオヒダントイ
／、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、バ
ニリルアミン、３−メトキシチラミン、フロレチン酸、
ホルデニン、ルミノールモノアニオン、質とともに用い
て過酸化水素を定量してもよい。
リン、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−
１，２，４−トリアゾール、２−ヒドラジノベンゾチア
ゾール、３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン
、２−アミノベンゾチアゾールなどが用いられ、またフ
ェノール誘導体またはアニリン誘導体としては、例えば
フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ｐ−
クロロフＪ、ノール、２．４−ジクロロフェノール、４
．６−ジクロロ−〇−クレゾール、２．４−シフロモフ
ェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ −）ルイジン、Ｎ
、Ｎ−ジエチル−ｍ −トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−ｍ−メトキシトルイジン、Ｎ、Ｎ−ジェタノール−ｍ
−）ルイジン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロ
キシエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルツ
ユニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル
−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ −）ルイジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−）ルイジンナトリウム、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシン−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、ｍ−アセトアミノ
−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリンなどが挙られる。また４−
アミノアンチピリンとフェノール誘導体とによる呈色化
合物は特異的吸収波長として５００〜５２０ ｎｍ近辺
を有し、また４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体
とによる呈色化合物は特異的吸収波長として５３５〜５
８０ ｎｍ近辺を有するものである。また螢光薬組成物
や発光薬組成物における発螢光基質としては、公知の種
々のものが挙られ、例えばビス（２，４，６−１リクロ
ロフエノール）オギザレイト、フェニルチオヒダントイ
／、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、バ
ニリルアミン、３−メトキシチラミン、フロレチン酸、
ホルデニン、ルミノールモノアニオン、質とともに用い
て過酸化水素を定量してもよい。
これらの過酸化水素と反応して検出できる生成物に変化
する指示薬組成物において、例えばペルオキシダーゼの
使用量としては、１テスト当り通常０．１単位以上、好
ましくは１〜１０単位程度使用すればよく、また４−ア
ミノアンチピリンなどの電子受容体やフェノール誘導体
またはアニリン誘導体は、２モル比の過酸化水素当り各
１モルが反応し、消費されるもので、生成される過酸化
水素の量に対して上記モル比以上用いればよいが、通常
過酸化水素の量に対して５倍モル比以上の適宜量が使用
される。さらにこれらの各試薬は溶液としてあらかじめ
混合、調整すればよく、またＬ −グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の溶液と混合、調整してもよく、さ
らに合成樹脂フィルムやＰ脈アンモニアや過酸化水素の
定量において、電気的変化にて定量する際には、用いる
電極の検知部にＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）の固定化酵素を付着せしめた酵素電極型として行な
うことが簡便である。
する指示薬組成物において、例えばペルオキシダーゼの
使用量としては、１テスト当り通常０．１単位以上、好
ましくは１〜１０単位程度使用すればよく、また４−ア
ミノアンチピリンなどの電子受容体やフェノール誘導体
またはアニリン誘導体は、２モル比の過酸化水素当り各
１モルが反応し、消費されるもので、生成される過酸化
水素の量に対して上記モル比以上用いればよいが、通常
過酸化水素の量に対して５倍モル比以上の適宜量が使用
される。さらにこれらの各試薬は溶液としてあらかじめ
混合、調整すればよく、またＬ −グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の溶液と混合、調整してもよく、さ
らに合成樹脂フィルムやＰ脈アンモニアや過酸化水素の
定量において、電気的変化にて定量する際には、用いる
電極の検知部にＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）の固定化酵素を付着せしめた酵素電極型として行な
うことが簡便である。
このようにして定量された酸素の量、α−ケトグルタル
酸の量、アンモニアの量、過酸化水素の量は、それらの
検量線により、使用した被検液中のＬ−グルタミン酸の
含有量を求めればよく、Ｌグルタミン酸そのものを測定
するＬ−グルタミン酸試薬、Ｌ−グルタミン酸醗酵液や
飲食物中のＬ−グルタミン酸を分析目的とする場合には
そのままの値から求められるもので、またＬ−グルタミ
ン酸を遊離、生成する酵素反応系やＬ−グルタミン酸を
基質として消費する酵素反応系では、Ｌ−グルタミン酸
の定量算出値から各反応系の酵素活性値や基質となる物
質の濃度を算出することにより良好に定量分析されるも
のである。
酸の量、アンモニアの量、過酸化水素の量は、それらの
検量線により、使用した被検液中のＬ−グルタミン酸の
含有量を求めればよく、Ｌグルタミン酸そのものを測定
するＬ−グルタミン酸試薬、Ｌ−グルタミン酸醗酵液や
飲食物中のＬ−グルタミン酸を分析目的とする場合には
そのままの値から求められるもので、またＬ−グルタミ
ン酸を遊離、生成する酵素反応系やＬ−グルタミン酸を
基質として消費する酵素反応系では、Ｌ−グルタミン酸
の定量算出値から各反応系の酵素活性値や基質となる物
質の濃度を算出することにより良好に定量分析されるも
のである。
次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何んら限定されるものではない。
明はこれらによって何んら限定されるものではない。
実施例１
ペプトン０．５％、肉エキス０．３％および酵母エキス
０．１％、マルトエキス０．５％を含有する培地１００
ｄ（ＰＨ７，０）を５０〇−容三角フラスコに入れ、１
２０℃、２０分間滅菌した後、４日間培養したストレプ
トマイセス・ニス ピー Ａ７７００株（ＦＥＲＭ
Ｐ−６２４１）を白金耳で接種し、２６℃で４日間攪拌
培養した。次いで培養物を遠心分離して菌体を回収し、
この菌体を石英砂存在下にて乳鉢ですりつぶした。次い
でこれに２０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ＰＨ７，０）を加え
て抽出し、その抽出液を回収した。
０．１％、マルトエキス０．５％を含有する培地１００
ｄ（ＰＨ７，０）を５０〇−容三角フラスコに入れ、１
２０℃、２０分間滅菌した後、４日間培養したストレプ
トマイセス・ニス ピー Ａ７７００株（ＦＥＲＭ
Ｐ−６２４１）を白金耳で接種し、２６℃で４日間攪拌
培養した。次いで培養物を遠心分離して菌体を回収し、
この菌体を石英砂存在下にて乳鉢ですりつぶした。次い
でこれに２０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ＰＨ７，０）を加え
て抽出し、その抽出液を回収した。
その結果、そのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）の活性は培養液換算１が当り０．１３単位であった
。
２）の活性は培養液換算１が当り０．１３単位であった
。
実施例２
実施例と同一組成の培地を用いて、４日間培養シタスト
レプトマイセス・ニス・ピー、へ８０６３株（ＦＥＢＭ
Ｐ−６２４２）を白金耳で接種し、２６℃で４日間
培養した後、以下実施例１と同様に行なって抽出液を回
収した。
レプトマイセス・ニス・ピー、へ８０６３株（ＦＥＢＭ
Ｐ−６２４２）を白金耳で接種し、２６℃で４日間
培養した後、以下実施例１と同様に行なって抽出液を回
収した。
その結果、そのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）の活性は、０．５８単位／−であった。
２）の活性は、０．５８単位／−であった。
実施例３
ペプトン０．５％、肉エキス０，３％および酵母エキス
０．１％、アルドエキス０．５％を有する培地１００
ｍｌ （Ｐ Ｈ７，０）を５００−容三角フラスコに分
注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した稜、ストレプト
マイセス、ニス・ピー・Ａ３０６３株（ＦＩＲＭ Ｐ
−６２４２）の−白金耳を移植して２６℃で３日間培養
して種培養物を得た。
０．１％、アルドエキス０．５％を有する培地１００
ｍｌ （Ｐ Ｈ７，０）を５００−容三角フラスコに分
注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した稜、ストレプト
マイセス、ニス・ピー・Ａ３０６３株（ＦＩＲＭ Ｐ
−６２４２）の−白金耳を移植して２６℃で３日間培養
して種培養物を得た。
次いでペプトン０．５％、肉エキス０．３％、酵母１
エキス％％、 ％％およびマルトエキス０．５％を合算
する培地２０Ｊ（ＰＨ７，０）を３０！容ジヤー・ファ
メンターに仕込み、１２０℃、２０分間加熱滅菌後、上
記の種培養物約２００ｍ（２本分）を移植した。次いで
これを、２６℃で無菌空気２０！／分、３００ ｒｐｍ
の通気攪拌条件にて９６時間培養した。培養後培養物を
５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離してその菌体を得た。
する培地２０Ｊ（ＰＨ７，０）を３０！容ジヤー・ファ
メンターに仕込み、１２０℃、２０分間加熱滅菌後、上
記の種培養物約２００ｍ（２本分）を移植した。次いで
これを、２６℃で無菌空気２０！／分、３００ ｒｐｍ
の通気攪拌条件にて９６時間培養した。培養後培養物を
５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離してその菌体を得た。
次いでこの菌体を、１５分間遠心分離して上清液２．８
２Ａ（１１２００単位）を得た。さらにこの上清液に硫
安を加え、０、４−０．５３飽和硫安にて沈澱した両分
を回収した。次いでこの沈澱物を２０ ｍ Ｍ ’）ン
酸緩衝液（ＰＨ７，０）に溶解し、これをセロファンチ
ューブにて２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０） １
２ Ｊに対して２０時間透析せしめ、これをＤＥＡ Ｅ
−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（径５０Ｘ４００ｍ
／ ｍ ）にチャージして、０−０．７ ＭＫ（Ｊの
２０ｍ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０＞を用いる
直線濃度勾配法で溶出せしめ、その０．５Ｋ（Ｊ付近の
溶出液１３０Ｉ１１７！（６６９０単位）を得た。さら
にこの溶出液を透析（セロファンチューブを用い、２０
ｍＭ１Ｊン酸緩衝液６）対して１８時間透析）した後濃
縮しく１５＋＋＋／）、さらにこれをセファロースＣＬ
−６Ｂにチャージし、１０ｍＭ、リン酸緩衝液（Ｐ Ｈ
７，０）で溶出せしめてその流出液８０ｍ（５９００単
位）を得た。この溶液を限外口過膜で８献に濃縮したの
ちさらにセファロースＣ！Ｌ−６Ｂにチャージしてその
流出液６０ｍ（４８９０単位）を得、これを凍結実検し
てＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２） ７８．
９■（５８，２単位／■、４５９５単位）を得た。
２Ａ（１１２００単位）を得た。さらにこの上清液に硫
安を加え、０、４−０．５３飽和硫安にて沈澱した両分
を回収した。次いでこの沈澱物を２０ ｍ Ｍ ’）ン
酸緩衝液（ＰＨ７，０）に溶解し、これをセロファンチ
ューブにて２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０） １
２ Ｊに対して２０時間透析せしめ、これをＤＥＡ Ｅ
−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム（径５０Ｘ４００ｍ
／ ｍ ）にチャージして、０−０．７ ＭＫ（Ｊの
２０ｍ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０＞を用いる
直線濃度勾配法で溶出せしめ、その０．５Ｋ（Ｊ付近の
溶出液１３０Ｉ１１７！（６６９０単位）を得た。さら
にこの溶出液を透析（セロファンチューブを用い、２０
ｍＭ１Ｊン酸緩衝液６）対して１８時間透析）した後濃
縮しく１５＋＋＋／）、さらにこれをセファロースＣＬ
−６Ｂにチャージし、１０ｍＭ、リン酸緩衝液（Ｐ Ｈ
７，０）で溶出せしめてその流出液８０ｍ（５９００単
位）を得た。この溶液を限外口過膜で８献に濃縮したの
ちさらにセファロースＣ！Ｌ−６Ｂにチャージしてその
流出液６０ｍ（４８９０単位）を得、これを凍結実検し
てＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２） ７８．
９■（５８，２単位／■、４５９５単位）を得た。
実施例４
ペプトン０，５％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．
１％およびマルトエキス０．５％を含有する培地２０
Ｊ （Ｐ Ｈ７，０）を３０！容ジヤー・ファーメンタ
−に仕込み、１２０℃、２０分間滅菌後、同一培地で３
日間培養したストレプトマイセス・ニス・ピー・Ａ７７
００株（ＦＥＢＭ Ｐ−６２４１）の種培養物２００
ｍ（２本分）を移植し、次いで２６℃、９６時間、２０
ノ／分の無菌空気、３００ ｒｐｍの通気攪拌条件にて
培養した。培養後これを５００Ｏｒｐｍ、５分間遠心分
離して菌体を回収し、これを３！の２０ｍＭリン酸緩衝
液（Ｐて上清液（２，８４Ｊ、２９５０単位）を得た。
１％およびマルトエキス０．５％を含有する培地２０
Ｊ （Ｐ Ｈ７，０）を３０！容ジヤー・ファーメンタ
−に仕込み、１２０℃、２０分間滅菌後、同一培地で３
日間培養したストレプトマイセス・ニス・ピー・Ａ７７
００株（ＦＥＢＭ Ｐ−６２４１）の種培養物２００
ｍ（２本分）を移植し、次いで２６℃、９６時間、２０
ノ／分の無菌空気、３００ ｒｐｍの通気攪拌条件にて
培養した。培養後これを５００Ｏｒｐｍ、５分間遠心分
離して菌体を回収し、これを３！の２０ｍＭリン酸緩衝
液（Ｐて上清液（２，８４Ｊ、２９５０単位）を得た。
次いでこれに硫安を加えて０．４７−０．６１飽和硫安
での沈澱物を回収し、さらにこの沈澱物を２０ｍＭリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０）に溶解し、これをセロファンチ
ューブプにて透析（２ｏｍＭリン酸緩衝液、Ｐ Ｈ７，
０対して２０時間）せしめた。透析後、ＤＢＡＩ−ヒフ
ァロース０Ｌ−６Ｂのカラムにグヤージし、０−０．７
ＭＫ（Ｊの２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０）を用
いる直線濃度勾配法で溶出せしめ、０．５ ＭＫＣＩ付
近での溶出液を回収し、さらにこれを透析せしめ（セロ
ファンチューブを用い、１６ｍ Ｍ 、リン酸緩衝液Ｐ
Ｈ７，調蝙して１８時間濃縮した。さらにこれを、セ
ファロース０Ｌ−６Ｂのカラムにチャージして精製し、
その流出液を回収し、濃縮したのち、再度セファロース
ＣＬ−６Ｂのカラムにチャージしてその流出液を得、こ
れを凍結乾燥してＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２
Ｏ２）粉末２２． ＯＳ９ （４９，５単位／ｗＩ９．
１０９０単位）を得た。
での沈澱物を回収し、さらにこの沈澱物を２０ｍＭリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０）に溶解し、これをセロファンチ
ューブプにて透析（２ｏｍＭリン酸緩衝液、Ｐ Ｈ７，
０対して２０時間）せしめた。透析後、ＤＢＡＩ−ヒフ
ァロース０Ｌ−６Ｂのカラムにグヤージし、０−０．７
ＭＫ（Ｊの２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０）を用
いる直線濃度勾配法で溶出せしめ、０．５ ＭＫＣＩ付
近での溶出液を回収し、さらにこれを透析せしめ（セロ
ファンチューブを用い、１６ｍ Ｍ 、リン酸緩衝液Ｐ
Ｈ７，調蝙して１８時間濃縮した。さらにこれを、セ
ファロース０Ｌ−６Ｂのカラムにチャージして精製し、
その流出液を回収し、濃縮したのち、再度セファロース
ＣＬ−６Ｂのカラムにチャージしてその流出液を得、こ
れを凍結乾燥してＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２
Ｏ２）粉末２２． ＯＳ９ （４９，５単位／ｗＩ９．
１０９０単位）を得た。
実施例５［Ｌ−グルタミン酸の定量３
４０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）
０．０３％４−アミノアンチピリン
０．０４％Ｎ、Ｎ−ジメチルーＩｕ ）シイジン２単
位／−ペルオキシダーゼ。
位／−ペルオキシダーゼ。
２単位／ｄＬ−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（Ｈ２Ｏ２
）１．１．−！−に希釈した溶液をそれぞれ５０ ｐＪ
づ５１０ つ透加し、３７℃で１０分間反応せしめた。反応終了後
、その呈色を波長５４５ｎｍで比色定量したＯ その結果、第６図に示す通りで、また図中○Ｇま実施例
３で得られたＬ−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（Ｈ２Ｏ
２）を用いた場合を示し、△Ｃま実施例４で得られたＬ
−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（Ｈ２Ｏ２）を用いた場
合を示し、両酵素ともよく一致し、力）つＬ−グルタミ
ン酸量と吸光度の間（こ良（、ｚ直線性が得られた。
）１．１．−！−に希釈した溶液をそれぞれ５０ ｐＪ
づ５１０ つ透加し、３７℃で１０分間反応せしめた。反応終了後
、その呈色を波長５４５ｎｍで比色定量したＯ その結果、第６図に示す通りで、また図中○Ｇま実施例
３で得られたＬ−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（Ｈ２Ｏ
２）を用いた場合を示し、△Ｃま実施例４で得られたＬ
−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（Ｈ２Ｏ２）を用いた場
合を示し、両酵素ともよく一致し、力）つＬ−グルタミ
ン酸量と吸光度の間（こ良（、ｚ直線性が得られた。
さらにこの両酵素ともよく一致したとの結果から、以下
実施例３で得られたＬ−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（
Ｈ２Ｏ２）を用いて、各実施例を述べる。
実施例３で得られたＬ−グルタミン酸オキシタ゛−ゼ（
Ｈ２Ｏ２）を用いて、各実施例を述べる。
実施例６〔血清中ＧＰＴ活性測定〕
Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジン ３ｍＭ４−ア
ミノアンチピリン １．５ ｍ Ｍペルオキ
シダーゼ ５単位／−Ｌ−アラニン
２００ｍＭα−クトグルタル酸
１０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ＰＨ７，５
） ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシダービ（
Ｈ２Ｏ２） ６単位／−上記組成を有する反応液
１．０−を小試験管に分取し、３７℃に加温した。これ
に血清（１／１゜３／４ 、１／２ 、１／４ 、１／
１０の各希釈液とした）を５０μ！添加し、３７℃で正
確に２０分間反応せしめた後、０．ＩＭマツク・イルベ
イン（Ｍｃ ｌ１ｖａｉｎ）緩衝液（Ｐ Ｈ５，５）
２．０ ｍｇを添加し、次いでその呈色を波長５４５ｎ
ｍにて比色定量した。（なお、盲検としては上記反応液
中のＬ−アラニンを除去したものを用いた。） その結果、第７図に示す通りで、血清中のＧＰＴ活性を
良好に定量し得たものであった。
ミノアンチピリン １．５ ｍ Ｍペルオキ
シダーゼ ５単位／−Ｌ−アラニン
２００ｍＭα−クトグルタル酸
１０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ＰＨ７，５
） ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシダービ（
Ｈ２Ｏ２） ６単位／−上記組成を有する反応液
１．０−を小試験管に分取し、３７℃に加温した。これ
に血清（１／１゜３／４ 、１／２ 、１／４ 、１／
１０の各希釈液とした）を５０μ！添加し、３７℃で正
確に２０分間反応せしめた後、０．ＩＭマツク・イルベ
イン（Ｍｃ ｌ１ｖａｉｎ）緩衝液（Ｐ Ｈ５，５）
２．０ ｍｇを添加し、次いでその呈色を波長５４５ｎ
ｍにて比色定量した。（なお、盲検としては上記反応液
中のＬ−アラニンを除去したものを用いた。） その結果、第７図に示す通りで、血清中のＧＰＴ活性を
良好に定量し得たものであった。
実施例７〔血清中ＧＰＴ活性測定〕
Ｎ、Ｎ−ジエチル−川−トルイジン ３ｍＭ４−ア
ミノアンチピリン １．５ ｍ Ｍペルオキ
シダーゼ ５単位／ＩＩＩＩ！Ｌ−アス
パラギン酸 ２００ｍＭα−ケトグルタル
酸 １０ｍＭトリス−Ｈ０Ｊ緩衝液（Ｐ
Ｈ７，５） ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２） ６単位／−上記組成を有する
反応液１．０−を小試験管に分取し、３７℃に加温した
。これに血清（１／１，３７４゜１／２ 、１／４ 、
１／１０の各稀釈液とした）５０ｐＪを添加し、３７℃
で正確に２００分間反応しめた後、０、１ ＭＭｃ ｌ
１ｖａｉｎ緩衝液（Ｐ Ｈ５，５） ２．０−を添加し
、次いでその呈色を波長５４５ｎｍにて比色定量した。
ミノアンチピリン １．５ ｍ Ｍペルオキ
シダーゼ ５単位／ＩＩＩＩ！Ｌ−アス
パラギン酸 ２００ｍＭα−ケトグルタル
酸 １０ｍＭトリス−Ｈ０Ｊ緩衝液（Ｐ
Ｈ７，５） ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２） ６単位／−上記組成を有する
反応液１．０−を小試験管に分取し、３７℃に加温した
。これに血清（１／１，３７４゜１／２ 、１／４ 、
１／１０の各稀釈液とした）５０ｐＪを添加し、３７℃
で正確に２００分間反応しめた後、０、１ ＭＭｃ ｌ
１ｖａｉｎ緩衝液（Ｐ Ｈ５，５） ２．０−を添加し
、次いでその呈色を波長５４５ｎｍにて比色定量した。
なお、盲検としては上記反応液中のＬ−アスパラギン酸
を除去したものを用いた。
を除去したものを用いた。
その結果、第８図に示す通りで、血清中のＧ０Ｔ活性を
良好に定量し得たものであった。
良好に定量し得たものであった。
実施例８〔血清中ＧＰＴ活性測定〕
〔試薬Ｉ〕
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−」−トルイジン ３
ｍＭ６．オキシダーゼ ５単位／−Ｌ−
アラニン ２００ｍＭα−ケトグル
タル酸 １０ｍＭトリス−ＨＣＪ緩衝
液 ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（Ｈ２Ｏ２） ５単位／＃Ｉ／アスコルビン酸
オキシダーゼ ５単位／ゴ〔試薬■〕 ４−アミノアンチピリン １５ｍＭ上記の組
成を有する試薬Ｉの１．０ｆｆｉ７！を石英セルに分取
し、これに血清５０μノを添加し、３７℃で５分間反応
せしめた後、３７℃に加温した試薬■０．１ｍｌをさら
に添加し、３７℃で種々の時間反応せしめ、次いで波長
５５０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。
ｍＭ６．オキシダーゼ ５単位／−Ｌ−
アラニン ２００ｍＭα−ケトグル
タル酸 １０ｍＭトリス−ＨＣＪ緩衝
液 ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（Ｈ２Ｏ２） ５単位／＃Ｉ／アスコルビン酸
オキシダーゼ ５単位／ゴ〔試薬■〕 ４−アミノアンチピリン １５ｍＭ上記の組
成を有する試薬Ｉの１．０ｆｆｉ７！を石英セルに分取
し、これに血清５０μノを添加し、３７℃で５分間反応
せしめた後、３７℃に加温した試薬■０．１ｍｌをさら
に添加し、３７℃で種々の時間反応せしめ、次いで波長
５５０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。
その結果、第９図に示す通りで、血清中ＧＰＴ活性測定
においてラグタイムが認められず、原点を通る良好な直
線性が得られた。また本発明方法で測定することにより
第一段反応で非特異的反応およびラグタイムを改善、除
去しているために盲検を必要としない良好な測定法であ
る。
においてラグタイムが認められず、原点を通る良好な直
線性が得られた。また本発明方法で測定することにより
第一段反応で非特異的反応およびラグタイムを改善、除
去しているために盲検を必要としない良好な測定法であ
る。
実施例９〔血清中ＧＯＴ活性測定〕
〔試薬Ｉ〕
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン ３
ｍＭペルオキシダーゼ ５単位／ ｍ１
Ｌ−アスパラギン酸 ２００ｍＭα−ケト
グルタル酸 １０ｍＭトリス−Ｈｃｉ
緩衝液 ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（Ｈ２Ｏ２） ５ 単位／ ｄアスコルビン
酸オキシダーゼ ５単位／−〔試薬■〕 ４−アミノアンチピリン １５ｍＭ上記の組
成を有する試薬Ｉの１，０−を石英セルに分取し、これ
に血清５０μ！を添加し、３７℃で５分間反応せしめた
後、３７℃に加温した試薬■０、１ ｍｌをさらに添加
し、３７℃で種々の時間反応せしめ、次いで波長５５０
ｎｍにおける吸光度変化を測定した。
ｍＭペルオキシダーゼ ５単位／ ｍ１
Ｌ−アスパラギン酸 ２００ｍＭα−ケト
グルタル酸 １０ｍＭトリス−Ｈｃｉ
緩衝液 ５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（Ｈ２Ｏ２） ５ 単位／ ｄアスコルビン
酸オキシダーゼ ５単位／−〔試薬■〕 ４−アミノアンチピリン １５ｍＭ上記の組
成を有する試薬Ｉの１，０−を石英セルに分取し、これ
に血清５０μ！を添加し、３７℃で５分間反応せしめた
後、３７℃に加温した試薬■０、１ ｍｌをさらに添加
し、３７℃で種々の時間反応せしめ、次いで波長５５０
ｎｍにおける吸光度変化を測定した。
その結果、第１０図に示す通りで、測定においてラグタ
イムが認められず、かつ盲検も必要としない、原点を通
る良好な直線性を与えるＧＯＴ活性の測定をなし得たも
のであった。
イムが認められず、かつ盲検も必要としない、原点を通
る良好な直線性を与えるＧＯＴ活性の測定をなし得たも
のであった。
実施例１０
実施例８と同一の試薬■および試薬■を用いて、血清４
０サンプルを被検液（各５０μりとして、実施例８と同
様に行なって各血清中ＧＰＴ活性を測定した。
０サンプルを被検液（各５０μりとして、実施例８と同
様に行なって各血清中ＧＰＴ活性を測定した。
また同一サンプルを用いて、従来のＧＰＴ活性測定法［
ＵＶ法、和光紬薬（株）キラ）、Ｇ４ＵＶワコー〕にて
測定した。
ＵＶ法、和光紬薬（株）キラ）、Ｇ４ＵＶワコー〕にて
測定した。
両方法の結果に基いて相−を求めた結果、γ二〇、 ９
９８ ｙ ＝ １．０３ ｘ＋１．６ で、非常に良好な相−を示した。またその相−図は第１
１図に示す通りであ〜つだ。
９８ ｙ ＝ １．０３ ｘ＋１．６ で、非常に良好な相−を示した。またその相−図は第１
１図に示す通りであ〜つだ。
実施例１１
実施例９と同一の試薬１および試薬■を用いて、血清４
０サンプルを被検液（各５０μｔ）として、実施例９と
同様に行なって各血清中のＧＯＴ活性を測定した。
０サンプルを被検液（各５０μｔ）として、実施例９と
同様に行なって各血清中のＧＯＴ活性を測定した。
また同一サンプルを用いて、従来のＧＯＴ活性測定法［
ＵＶ法・和光紬薬（株）キラ） 、 Ｇ ミＵ Ｖワコ
ー〕にて測定した。
ＵＶ法・和光紬薬（株）キラ） 、 Ｇ ミＵ Ｖワコ
ー〕にて測定した。
両方法の結果に基いて相−を求めた結果、７＝０．９９
７ ｙ ＝ １．０１ ｘ＋１１ で非常に良好な相鍾を示した。またその相所図は第１２
図に示す通りであった。
７ ｙ ＝ １．０１ ｘ＋１１ で非常に良好な相鍾を示した。またその相所図は第１２
図に示す通りであった。
第１図はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）で
あるＡ７７００酵素の至適ＰＨ凸曲線示し、第２図はＬ
〜グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２） であるＡ
３０６３酵素の至適ＰＨ凸曲線示し、第３図はそのＡ７
７００酵素およびＡ３０６３酵素の熱安定性曲線を示し
、第４図はそのＡ７７００酵素のＰＨ安定性曲線を示し
、第５図はそのＡ３０６３酵素のＰＨ安定性曲線を示し
、第６図はそのＡ７７００酵素およびＡ３０６３酵素を
用いるＬ−グルタミン酸の定量曲線を示し、第７図は血
清中ＧＰＴ活性測定曲線を示し、第８図は血清中ＧＯＴ
活性測定曲線を示し、第９図は血清中ＧＰＴ’活性測定
曲線を示し、第１０図は血清中ＧＯＴ活性測定曲線を示
し、第１１図はＧＰＴ活性測定における相函図を示し、
第１２図はＧＯＴ活性測定における相函図を示す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第 １ 図 ４ ６ ８ １
０第２図 ２ ４ ０８ １０第
３図 温度（“Ｃ） 第４ 図 ０ ９４ ６ ｇ ］ｆ＋ Ｉ）１１ 第５図 □− （） ４ （、Ｇ １０第６図 希釈率 第７図 ｏ １／ ｌ／ ｌ／ ３／ １１ ”’ｉｋ８’ｌ！！ ”希 、イ （） ”１０ ’／４３／４ ’／１ 希釈率第９図
あるＡ７７００酵素の至適ＰＨ凸曲線示し、第２図はＬ
〜グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２） であるＡ
３０６３酵素の至適ＰＨ凸曲線示し、第３図はそのＡ７
７００酵素およびＡ３０６３酵素の熱安定性曲線を示し
、第４図はそのＡ７７００酵素のＰＨ安定性曲線を示し
、第５図はそのＡ３０６３酵素のＰＨ安定性曲線を示し
、第６図はそのＡ７７００酵素およびＡ３０６３酵素を
用いるＬ−グルタミン酸の定量曲線を示し、第７図は血
清中ＧＰＴ活性測定曲線を示し、第８図は血清中ＧＯＴ
活性測定曲線を示し、第９図は血清中ＧＰＴ’活性測定
曲線を示し、第１０図は血清中ＧＯＴ活性測定曲線を示
し、第１１図はＧＰＴ活性測定における相函図を示し、
第１２図はＧＯＴ活性測定における相函図を示す。 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第 １ 図 ４ ６ ８ １
０第２図 ２ ４ ０８ １０第
３図 温度（“Ｃ） 第４ 図 ０ ９４ ６ ｇ ］ｆ＋ Ｉ）１１ 第５図 □− （） ４ （、Ｇ １０第６図 希釈率 第７図 ｏ １／ ｌ／ ｌ／ ３／ １１ ”’ｉｋ８’ｌ！！ ”希 、イ （） ”１０ ’／４３／４ ’／１ 希釈率第９図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも下記の基質特異性、酵素作用の理化学
的性質を有する新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）、・基質特異性：Ｌ−
グルタミン酸に基質特異性を有す ・酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素
および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、
１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成す
る反応（反応式〔Ｉ〕）を触媒する Ｌ−グルタミン酸 α−ケトグルタル酸（２）・等電
点がＰ Ｈ４，３付近（キャリアーアンポライ） Ｐ
Ｈ８，５〜６．０による測定値）であり、・Ｌ−グルタ
ミン酸に対するＫｍ値が約５．６ Ｘ １０”’Ｍであ
り、 ・至適Ｐ）ｌが５〜７５付近であり、 ・熱安定性が５５℃付近までであり、 ・ＰＨ安定性がＰＨ４，５〜７５である特許請求の範囲
第１項記載のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
・ジエネレイティング）。 （３）・等電点がＰ Ｈ４，１付近（キャリアーアンポ
ライドＰ Ｈ８，５〜６．０による測定値）であり、・
Ｌ−グルタミン酸に対するＫｍ値が約１．ＩＸ１σ３Ｍ
であり、 ・至適ＰＨが５〜７．５付近であり、 熱安定性が５５℃付近までであり、 ・ＰＨ安定性が４〜７．５である特許請求の範囲第１項
記載のＬ−グルタミンオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネ
レイティング）。 （４）ストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジェネレイティング）生産菌
を培地に培養し、その培養物がらＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジェネレイティング）を採取する
ことを特徴とする新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２・ジェネレイティング）の製造法。 （５）ストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジェネレイティング）生産菌
力、ストレプトマイセス・ニス・ビー・Ａ７７００、Ｆ
ＥＲＭＰ−６２４１である特許請求の範囲第４項記載の
製造法。 （６）ストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸
オキシター−ゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイティング）生産
菌力、ストレプトマイセス・ニス・ビー・Ａ３０６３、
ＦＥＲＭＰ−６２４２である特許請求の範囲第４項記載
の製造法。 （７）Ｌ−グルタミン酸を含有する液体に、Ｌ−グルタ
ミン酸に基質特異性を有し、１モルのＬ−＃にタミン酸
、１モルの酸素、１モルの水から、１モルのα−ケトグ
ルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒するＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイ／グを作用せしめ、次
いで消費される酸素の量、または生成されるα−ケトグ
ルタル酸、アンモニアまたは過酸化水素の量を定量する
ことを特徴とするＬ−グルタミン酸の分析方法。 （８）過酸化水素の量の定量が、過酸化水素と反応して
検出できる生成物に変化する指示薬組成物である特許請
求の範囲第７項記載の分析方法。 （９）指示薬組成物が、呈色試薬組成物、螢光試薬組成
物または螢光試薬組成物である特許請求の範囲第８項記
載の分析方法。 αｄＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネ
レイテイ／グ）が、ストレプトマイセス属に属するＬ−
グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイ
ング）生産菌から得られた酵素である特許請求の範囲第
７項記載の分析方法 ０υＬ−グルタミン酸を含有する液体が、Ｌ−グルタミ
ン酸を遊離、生成する酵素反応系の被検液である特許請
求の範囲第７項記載の分析方法。 ０２酵素反応系の被検液が、グルタメイト・ピルベイト
・トランスアミナーゼ活性測定系被検液である特許請求
の範囲第１１項記載の分析方法。 Ｇ３酵素反応系の被検液が、グルタメイト・オギザワア
セテートートう／スアミナーゼ活性測定系被検液である
特許請求の範囲第１１項記載の分析方法。 Ｇ４酵素反応系の被検液が、ペプチダーゼ活性測定系被
検液である特許請求の範囲第１１項記載の分析方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57033497A JPS58149677A (ja) | 1982-03-02 | 1982-03-02 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 |
| DE3348379A DE3348379C2 (ja) | 1982-03-02 | 1983-03-01 | |
| DE19833307607 DE3307607A1 (de) | 1982-03-02 | 1983-03-01 | L-glutaminsaeure-oxidase, verfahren zu deren herstellung und verwendung fuer analysenmethode |
| IT19856/83A IT1161590B (it) | 1982-03-02 | 1983-03-02 | Acido-l-glutammico ossidasi (generatore di h202),sua produzione e saggio analitico che lo utilizza |
| KR1019830000832A KR870000509B1 (ko) | 1982-03-02 | 1983-03-02 | L-글루탐산 산화효소(h₂o₂생성), 그 제법 및 분석방법 |
| US06/472,174 US4605615A (en) | 1982-03-02 | 1983-03-02 | L-glutamic acid oxidase (H2 O2 -generating), its production and analytical method therefor |
| FR8303412A FR2522680B1 (fr) | 1982-03-02 | 1983-03-02 | Oxydase d'acide l-glutamique (productrice de h2o2), sa production et methode d'analyse l'utilisant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57033497A JPS58149677A (ja) | 1982-03-02 | 1982-03-02 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1091676A Division JPH02163080A (ja) | 1989-04-11 | 1989-04-11 | Ｌ―グルタミン酸オキシダーゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58149677A true JPS58149677A (ja) | 1983-09-06 |
| JPH0329399B2 JPH0329399B2 (ja) | 1991-04-24 |
Family
ID=12388181
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57033497A Granted JPS58149677A (ja) | 1982-03-02 | 1982-03-02 | Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法、ならびに分析方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4605615A (ja) |
| JP (1) | JPS58149677A (ja) |
| KR (1) | KR870000509B1 (ja) |
| DE (2) | DE3307607A1 (ja) |
| FR (1) | FR2522680B1 (ja) |
| IT (1) | IT1161590B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5942896A (ja) * | 1982-08-21 | 1984-03-09 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Ｌ−グルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キット |
| CN114657088A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-06-24 | 大自然生物集团有限公司 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU565635B2 (en) * | 1982-06-29 | 1987-09-24 | Yamasa Shoyu K.K. | L-glutamic acid oxidase |
| JPS6041500A (ja) * | 1983-08-12 | 1985-03-05 | Yamasa Shoyu Co Ltd | アンモニアの定量法 |
| DE3333453A1 (de) * | 1983-09-16 | 1985-04-11 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | L-aminosaeure-oxidase aus hefen der gattung cryptococcus, ihre herstellung und verwendung |
| US5464775A (en) * | 1991-09-16 | 1995-11-07 | Chimera Research And Chemical, Inc. | Method of detecting adulterant in urine |
| RU2170252C2 (ru) * | 1999-03-11 | 2001-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Импакт" | Штамм streptomyces sp. z-11-6-продуцент внеклеточной l-глутаматоксидазы |
| WO2001079503A1 (en) * | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Yamasa Corporation | L-glutamate oxidase |
| US7297800B2 (en) * | 2001-12-27 | 2007-11-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Process of producing glutamate derivatives |
| CA2484871C (en) | 2002-08-26 | 2010-11-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel aldolase and production process of substituted .alpha.-keto acids |
| AU2003289264A1 (en) | 2002-12-09 | 2004-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant d-aminotransferase and process for producing optically active glutamic acid derivative using the same |
| US7180370B2 (en) * | 2004-09-01 | 2007-02-20 | Micron Technology, Inc. | CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors |
| CN101663403B (zh) * | 2007-03-05 | 2013-04-24 | 先进流体逻辑公司 | 基于微滴的过氧化氢测定 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5743685A (en) * | 1980-08-28 | 1982-03-11 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | L-glutamic oxidase |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU565635B2 (en) * | 1982-06-29 | 1987-09-24 | Yamasa Shoyu K.K. | L-glutamic acid oxidase |
-
1982
- 1982-03-02 JP JP57033497A patent/JPS58149677A/ja active Granted
-
1983
- 1983-03-01 DE DE19833307607 patent/DE3307607A1/de active Granted
- 1983-03-01 DE DE3348379A patent/DE3348379C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-02 IT IT19856/83A patent/IT1161590B/it active
- 1983-03-02 FR FR8303412A patent/FR2522680B1/fr not_active Expired
- 1983-03-02 US US06/472,174 patent/US4605615A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-02 KR KR1019830000832A patent/KR870000509B1/ko not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5743685A (en) * | 1980-08-28 | 1982-03-11 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | L-glutamic oxidase |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5942896A (ja) * | 1982-08-21 | 1984-03-09 | Yamasa Shoyu Co Ltd | Ｌ−グルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キット |
| CN114657088A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-06-24 | 大自然生物集团有限公司 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
| CN114657088B (zh) * | 2022-02-17 | 2023-10-13 | 大自然生物集团有限公司 | 用于催化生产α-酮戊二酸的专用高温菌及催化生产方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0329399B2 (ja) | 1991-04-24 |
| IT8319856A1 (it) | 1984-09-02 |
| DE3307607A1 (de) | 1983-09-29 |
| KR870000509B1 (ko) | 1987-03-13 |
| FR2522680B1 (fr) | 1986-06-27 |
| IT8319856A0 (it) | 1983-03-02 |
| IT1161590B (it) | 1987-03-18 |
| DE3307607C2 (ja) | 1990-12-20 |
| US4605615A (en) | 1986-08-12 |
| FR2522680A1 (fr) | 1983-09-09 |
| KR840004161A (ko) | 1984-10-10 |
| DE3348379C2 (ja) | 1992-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0533997B2 (ja) | ||
| US4614714A (en) | Use of novel L-glutamic acid oxidase | |
| KR870000509B1 (ko) | L-글루탐산 산화효소(h₂o₂생성), 그 제법 및 분석방법 | |
| JPS59198972A (ja) | 微生物学的に製造したＬ−フエニルアラニン−デヒドロゲナ−ゼ、その取得法及びＬ−α−アミノカルボン酸の製法 | |
| JPH0665300B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
| JPS6126357B2 (ja) | ||
| US4234691A (en) | L-Lysine α-oxidase | |
| US5821061A (en) | Method and reagent for detecting a ligand in a sample | |
| US4921786A (en) | Novel NAD synthetase, assay method using said novel NAD synthetase and a process for production thereof | |
| US4224407A (en) | Assay of L-lysine | |
| EP0101653B1 (en) | Leucine dehydrogenase and a process for production thereof | |
| KR950012760B1 (ko) | 신규 nad 합성효소 및 그 제조법 및 이를 이용한 측정방법 | |
| JPH02163080A (ja) | Ｌ―グルタミン酸オキシダーゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法 | |
| KR890002412B1 (ko) | L-글루타민산 옥시다아제의 제조법 | |
| JPS6210159B2 (ja) | ||
| JPS6368099A (ja) | ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 | |
| CN100451107C (zh) | 微生物 | |
| JP3114838B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼおよびその用途 | |
| WO1998042863A1 (en) | Highly sensitive method for assaying chiro-inositol and compositions for the assay | |
| JPH0272873A (ja) | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 | |
| US5134073A (en) | Microbiologically produced n-acetyl-2,3-didehydroleucine acylase | |
| US5212069A (en) | Method of using N-acetyl-2,3-Didehydroleucine acylase for the preparation of D- or L-tryptophyl glycine, D- or L-tryptophyl-D-methionine or L-tryptophyl-D-cysteine | |
| FR2517698A1 (fr) | Procede de dosage de l'ethanolamine | |
| JP4150576B2 (ja) | 耐熱性ｌ−アミノ酸酸化酵素 | |
| KR0183447B1 (ko) | 신균주 바실러스 엘케이-1 |