JPS6118876A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野１ 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理法
に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、写真
感光材料を用いるオートラジオグラフィーにおいて、Ｄ
ＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列の決定のためのデ
ジタル信号処理における放射性標識物質の分離展開位置
の比較同定方法に関するものである。

［発明の構成１ 支持媒体上′において少なくとも一次元的方向に分布し
て分布列を形成している放射性標識物質の位置情報を得
るための方法としてオートラジオグラフィーが既に知ら
れている。

たとえば、蛋白質、核酸などのような生物体由来の高分
子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識を
付した高分子物質、その誘導体。

島るいはその分解物など（以下、放射性標識物質ともい
う）をゲル状支持媒体上で電気泳動などの分離操作にか
けて分離展開を行なうことにより、該支持媒体上に放射
性標識物質の分離展開列（ただし目には見えない）を形
成させ、この分離展開列のオートラジオグラフを放射線
フィルムに可視画像として取得し、その可視画像から放
射性標識物質の位置情報を得ている。また、得られた放
射性標識物質の位置情報を基にして、その高分子物質の
分離、同定、あるいは高分子物質の分子量、特性の評価
などを行なう方法は既″に開発され、実際に利用されて
いる。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、Ｄ　
Ｎ　Ａ　、（もしくはＩ）ＮＡ断片物、以下同様）の塩
基配列の決定に有効に利用されている。

このオートラジオグラフィーを利用してＤ−Ｎ　Ａの塩
基配列を決定するための代表的な方法の一つとして、サ
ンガー・クールソン（Ｓａｎｇｅ、ｒ−ＣａｕＩｓａｎ
）法が知られている。この方法は、ＤＮＡが二本の鎖状
分子からなる二重ラセン構造を有し、かつそ・の二本の
鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ
）、グアこン（Ｇ）、シ゛トシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）
なる塩基を有する構成単位から構成されていること、そ
して、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間
の水素結合によって架橋されており、しかも各構成単位
間の水素結合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合わ
せのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な構
造に着目し、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合成、
ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィ〜の手段を巧
みに利用してＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。

サンガー拳り−ルソン法において、塩基配列を決定しよ
うとしているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物（以後、これ
らを検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を合成す
るためには幾つかの方法があるが、基本的には一本鎖の
検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし、上記四種類の
塩基を含むモノヌクレオシドトリフオスフェートの存在
下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を作用させ
ることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長さのＤＮ
Ａ断片を合成する。このとき、一部のモノヌクレオシド
トリフオスフェートに放射性標識が付与されたものを用
いること、および合成条件に工夫を凝らして四種の塩基
のいずれか−一つに対して特異的になるようにすること
により、放射性標識が付与された塩基特異的合成りＮＡ
断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数のＤＮＡ合成物から
なる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離展
開する（ただし、視覚的には見ることができない）、そ
して、この支持媒体上の分離展開列をＸ線フィルムなど
の放射線フィルム上に可看、化してオートラジオグラフ
を得、得られたオートラジオグラフに基ういて鎖状分子
の末端か−ら顯にその塩基配列を決定し、このようにし
て検体ＤＮＡのすべての塩基の配列を決定している。

なお、上記に要約したサンガー・クールノン法の特徴お
よび操作については、たとえば次の文献に記載されてい
る。

「遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩基配
列解析法Ｊ三浦謹一部、現代化学、１９７７年９月号４
６〜５４頁（■東京化学同人列）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、
、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｇｏｕｌｓｏｎ、　
Ａ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ’、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ、　７４．　ｐｐ、　５４ｆ１３−上述のように放
射線写真法を利用するオートラジオグラフィーでは、放
射性標識物質の位置情報を得るためにはこの位置情報を
有するオートラジオグラフを放射線写真フィルム上に可
視化することが必須となっている。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを自分自身の目で判断することにより、試料中の放射
性標識物質の分布を測定し、放射性標識が付与された特
定物質についての位置情報の知見を得ている。すなわち
、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与された塩基特
異的ＤＮＡ合成物もしくはその混合物のそれぞれについ
て、分離展開位置を視覚的に判断し、それら塩基特異的
ＤＮＡ合成物の分離展開列を相互に比【することにより
決定されている。よって、得られたオートラジオグラフ
の解析は、通常、人間の視覚を通して行なわれており、
そのために多大な時間と労力が費されている。

また、人間の目に依存しているため、そのオートラジオ
グラフを解析して得られる位置情報が研究者によって異
なるなど得られる情報の精度には限界がある。特に、放
射線フィルム上に可視化されたオートラジオグラフが良
好な画質（鮮鋭度、コントラスト）を有していない場合
には、満足できる情報が得られがたく、またその精度は
低下しがちであるという問題がある。

従来より、求める位置情報の精度を向上させるために、
たとえば、その可視化されたオートラジオグラフをスキ
ャニングデンシトメーターなどの測定器具を用いて測定
する方法も利用されている。しかしながら、そのような
測定器具を単に用いる方法においては精度の向上に限界
がある。

たとえば、前記の分離展開列が形成された支持媒体と放
射線フィルムとを密着させて行なわれる露光操作時にそ
の重ね合わせにズレが生じる場合があり、この場合には
放射線フィルム上に可視画像として得られる分離展開列
（例えば、泳動列）はフィルムの長さ方向に対して平行
でなく、ずれる結果となるため、放射性標識物質の位置
情報を視覚的に判断□する際に誤差が生じやすくなり、
その精度は低下しがちである。また、支持媒体や分離展
開条件によって、得られる分離展開列が支持媒体の長さ
方向に対して平行でなかったり、歪んだりすることが往
々にして生じる。

さらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、こ
のゲルは自己支持性がないため通常はガラスなどで両面
を挟持した状態で分離展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り；放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また同様な分離展開の不均一
さはゲル中に空気泡が含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。こりよ゛うな理由から、たとえば、支゛持゛媒体の
中央付近における分離展開列の移動距離に比べて両端の
分離展開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆ
るスマイリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気
泳動により分離展開する場合において電圧が支持媒体に
均一に印加されない場合があり、そのような場合にも分
離展開条件が支持媒体上で局部的に異なってくるため、
得られる分離展開列に歪みが生じがちである。

以上のような場合においては、放射性標識物質の位置情
報の解析が特に困難になり、前記のような測定器具を利
用しても分離展開された放射性標識物質の位置情報、す
なわちＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を充分な
精度で得ることは困難である。

［発明の要旨］ 本発明者は、放射線写真法を利用する従来のオートラジ
オグラフィーにおいて、写真感光材料上に画像化された
放射性標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフ
を光電的に読み取ってデジタル信号に変換し、好適な信
号処理を行なうことによりＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物
の塩基配列を簡・易かつ高精度に決定することを実現し
、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩
基配列を決定するためのオートラジオグラ１、フィーに
おける信号処理法であって、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断
片物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標識が付与
されている。

１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
特異的ＤＮＡ合成物の全てを全体として含むように任意
に組合せられた少なくとも二種の塩基特異的ＤＮＡ合成
物もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物からなる一組
の基準列形成用試料を少なくとも二組、および、 ２）塩基特異的ＤＮＡ合成物もしくは塩基特異的切断物
混合物を少なくとも一種、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の二組の基準列形成用試料のそれぞれ二基上の
分離展開列が、少なくとも一列の上記２）の塩基特異的
ＤＮＡ合成物もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物の
分離展開列を挟むように互いに平行関係を以って一次元
的に分離展開されて形成された少なくとも１列の分離展
開列を構成する放射性標識物質群の位置情報を有するオ
ートラジオグラフを写真感光材料上に記録したのち、該
写真感光材料上に可視化されたオートラジオグラフを光
電的に読み取ることにより得られるそれぞれの分離展開
列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号につい
て、 ｉ）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
出する工程、 ｉ１）各々の基準列形成用試料の各々二基上の分離展開
列から各々の基準列を合成し、各々の基準列について基
準サンプリング点を検出する工程、 １ｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
線を設定する工程、モしてｉｖ）該連続線により、各分
離展開列のサンプリング点を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理法から
なるものである。

なお、本発明において、基準列とは、Ｉ）ＮＡの四種類
の塩基、すなわち、グアニン、アデニン、チミンおよび
シトシンの各塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含む分離
展開列に相当する列を意味し、検体ＤＮＡの塩基配列の
決定において、その放射性標識が付与された塩基特異的
ＤＮＡ合成物が支持媒体上で分離展開されてなる分離展
開列の内部標準となるものである。

基準列を得るのに用いる標識化されたＤＮＡは、検体Ｄ
ＮＡを用いて作られたものであってもよいし、また、別
のＤＮＡを用いて作られたものであってもよいが、前者
の方がより好ましい。

また、本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしくは任
意の組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、前述のよう・な支持媒体上における放
射性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−
次元的方向に分離展開して分離展開列を形成している放
射性標識・物質のオートラジオグラフを放射線フィルム
に形成させる操作における位置ズレなどにより、放射線
フィルム上に記録されたオートラジオグラフ全体にわた
って歪み、ズレが生じている場合にも、高精度にＤＮＡ
もしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定することができ
る。

とりわけ、分離展開方向の歪みに対しては、複数の分離
展開列から内部標準となる複数の基準列を合成して得ら
れることにより、デジタル画像データ上において゛この
基準列に基づいてその歪みを測定し、得られた歪みの補
正を各列について行なったのちに、各列の分離展開部位
を同定することが可能となる。従って高精度かつ合理的
に目的の塩基配列を決定することができるものである。

［発明の構成］ 本発明において用いられる試料の例としては、ＤＮＡみ
しくはＤＮＡ断片物をテンプレートとして、放射性標識
が付与されたデオキシヌクレオシドトリフオスフェート
（ｄＮＴＰ）とＤＮＡ合成酵素とを用いて合成された各
塩基特異的ＤＮＡ合成物およびそれらの混合物が、−次
元的方向に分離展開されて分離展開列を形成している支
持媒体を挙げることができる。

本発明において、放射性標識に用いられる放射性元素は
、放射線（α線、・β線、γ線、中性子線、Ｘ線など）
を放射するものであれば、どのような核種であってもよ
く、その具体例として、３２Ｐ、１４Ｃ，３５Ｓ、３Ｈ
１応■などが挙げられる。

また、上記放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開
するための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（
形状は層状、柱状など任意）、ア゛セテートなどのポリ
マー成形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用い
る電気泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる
薄層クロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げ
られるｆこのうちで、ゲル状支持媒体を用いる電気泳動
法が代表的な分離展開方法であり、好ましい。

本発明に用いられる写真感光材料は、基本構造として、
支持体および写真乳剤層からなるものである。写真乳剤
層は、ハロゲン化銀を分散状態で含有支持するゼラチン
などの結合剤からなるもの−である。感光材料は、たと
えば、支持体としてポリエチレンテレフタレートなどの
透明なシートを用い、このシート上に上記写真乳剤層を
設けたものであり、その例としては高感度Ｘ線フィルム
などの放射線フィルム慶挙げることができる。

本発明に８いて、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放ｉされる放射線による写真感光材料の感光操作（露
光操作）は、支持媒体と写真感光材料とを一定時間重ね
合わせることにより、その支持媒体上の放射性標識物質
から放出される放射線の少なくとも一部によって写真感
光材料中の感光物質に吸収させて実施する。この露光操
作は、支持媒体と写真感光材料とを密着した状態で配置
し、たとえば、氷点下のよ・うな低温で数日間この状態
に置くことにより行なうことができる。なお、露光操作
においては増感紙の使用、あるいはフラッシュ露光等の
前露光の適用によって増感を行なってもよい。

なお、オートラジオグラフィーにおける試料の写真感光
材料への露光操作および感光材料の現像処理については
、既に良く知られており、それらの操作および処理につ
いては、たとえば、次に示す文献に記載されている。

生化学実験講座６　トレーサー実験法（上）２７１〜２
８９頁、７８．　　オートラジオグラフィーｊ末吉徹、
重末昭世（１９７７年、−東京化学同人刊） 次に、本発明において、写真感光材料に記録された支持
媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情報を有する
オートラジオグラフを読み取ってデジタル信号に変換す
るための方法について、添付図面の第１図に示した読取
装置の例を参照しながら略述する。

第１図は、写真感光材料工に可視画像として記録されて
いる放射性標識物質の一次元的な位置情報を有するオー
トラジオグラフを読み取るための画像読取装置の例の概
略図を示している。

中空の回転・ドラム２には、その外側に可視画像を有す
る感光材料１が装着されている。この回転ドラム２は、
一定速度で回転すると同時に軸方向に一部ピッチで移動
するようにされている。また、この回転ドラムｚ内には
ミラー３が挿入されており、光源４からの光ビーム５は
レンズ６を通って入射する。この光源４からの光ビーム
５は、ミラー３で上方に反射され、透明ドラム２に装着
した感光材料ｌを透過して光電子増倍管７に入射する。

このようにして、感光材料１の画面が光ビーム５による
光点でＸＹ方向に走査さ゛れる。

光電子増倍管７は、感光材料ｌの各点の透過光を電気信
号に変換する。この電気信号は、増幅器８により増幅さ
れたのち、Ａ／Ｄ変換器９に入力される。Ａ／Ｄ変換器
９で、電気信号はデジタル信号に変換される。なお５画
像の読み取り操作の詳細については、たとえば、特開昭
５４−１２１０４３号公報に記載されている。

また、本発明における写真感光材料に記録された放射性
標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフを読み
取るための方法について、上記においては光ビームを用
いた光透過法による読み取り操作を説明したが、光反射
法による読み取り操作も適用できる。本発明において利
用することができる読み取り操作は、上記の例に限られ
るものではなく、たとえば、テレビカメラによる読み取
り操作など各種の方法が可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示さ
れる信号処理回路１０に入力される。信号処理回路１０
では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号および
／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩基配
列の決定が行なわれる。

以下、本発明の信号処理法を用いたＤＮＡの塩基配列決
定のためのオートラジオグラフィーにおける信号処理の
実施態様を、前記のサンガー・クールラン法を利用、し
た場合を例にとり、次の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物
およびＤＮＡ合成物混合物の組合わせを用いて、異なる
三種類の検体ＤＮＡについて同−支持媒体上で電気泳動
させた場合について説明する。

１）グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物 ２）チミン特異的ＤＮＡ合成物 ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 ３）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、・ ４）シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 まず、三種類の検体ＤＮＡをテンプレートとして放射性
標識（３２Ｆ）が付与されたモノヌクレオシドトリフオ
スフェートとＤＮＡポリメテーゼとを用いて常法により
、塩基特異的に合成することにより、それぞれ上記１）
〜４）の四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物およびＤＮＡ合
成物混合物からなる三組を得る。

次に上記四群の塩基特異的ＤＮＡ合成物およびＤＮＡ合
成物混合物三組のそれぞれを、゛ゲル支持媒体上で電気
泳動により分離展開させてそれぞれの分離展開列を得る
。ただし、少なくとも上記１）および２）の工科の塩基
特異的ＤＮＡ合成物混合物の分離展開列を、支持媒体上
の少なくとも二箇所において互いに隣接して配置し、か
つ、その隣接した分離展開列゛の組が、上記３）および
４）の工科の塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列を挟
むように配置して分離展開操作を行なう。

次にこの試料（分離展開列が形成されたゲル状支持媒体
）と放射線フィルムとを−７０〜−９０℃の低温で数日
間重ね合わせることにより露光操作を行ない、分離展開
列のオートラジオグラフを放射線フィルムに記録する。

第２図は、放射性や識の付与された、ＤＮＡの各塩基特
異的ＤＮＡ合成物およびＤＮＡ合成物混合物が分子ａ展
開されてなる上記四群の泳動列のオートラジオグラフの
例を示す。すなわち、第２図の第１夕ηから第１２列は
順に、 （１）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （２）−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 、＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （３）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （４）、−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （，５）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （６）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物 （７）、−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物 ＋（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （８，）７（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物 （９）−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物 （１（）、）＝−（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物（ｉ　ｔ）
−（Ｇ）特異的ＤＮＡ合成物＋（Ａ）特異的ＤＮＡ合成
物 （１２）、−（Ｔ）特異的ＤＮＡ合成物＋（Ｃ）特異的
ＤＮＡ合成物 の各列（泳動列）を示す。第１列〜第４列、第５列〜第
８列、および第９列〜第１２列はｄ′いに異なる検体Ｄ
ＮＡの分離展開列群である。また、第１列と第２列、第
６列と第７列、および第１１列と第１２列は、それぞれ
基準列形成用試料の組である。

放射線フィルムに記録されたオートラジオグラフを第１
図に示した読取装置に装填して読み取ることにより、信
号処理回路ｌＯに入力されたデジタル信号は、放射線入
イルムに固定された座標系で表わされ′ｆ一番＃！（Ｘ
、Ｆ）とその＃地における信号のレベル（２）とを有し
ており、その信号のレベルは透過光の光量に対応してい
る。すなわち、デジタル信号は第２図のオートラジオグ
ラフに対応している。従って、信号処理回路１ｏには、
上記放射性標識物質の位置情報を有するデジタル画像デ
ータが入力されることになる。本発明において、デジタ
ル画像データとは、放射性標識物質のオートラジオグラ
フに対応するデジタル信号の集合体を意味する。

まず、デジタル画像データ上で、上記１２列のそれぞれ
について放射性標識物質の分離展開位置を検出し、そ、
れらをサンプリング点とする。サンプリング点は、たと
えば、次のようにして得ることができる。

上記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分布方向（分離展開列方向）を横断するようにデジタル
画像データ上の異なる位置を平行に二回走査することに
よって、各走査領域上で各列の放射性標識物質の分布点
を検出しくこの分布点を検出するための走査を予備走査
という）、各列についてそれぞれ二分布点を結んで１２
木の直線を得、得られた直線をそれぞれ各列におけるサ
ンプリング点検出のための走査方向とする。

なお、本発明の信号処理法において、放射線フィルムを
読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回路ｌＯ
において一旦メモリーに記憶される（すなわちバッファ
ーメモリーあるいは磁気ディスク等の不揮発性メモリー
に記憶される）。信号処理において、デジタル画像デー
タ上を走査するとは、この走査箇所のデジタル信号のみ
をメモ・リーから選択的に取り出すとを意味する。

次いで、デジタル画像データ上を走査方向に沿って走査
することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす関
数ｆ　（ｗ）、［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得
ることができる。そしてこの関数ｆ（ｗ）に、たとえば
適当なフィルター関数を用いてコンボリューションを行
なうことによりスムージング処理を施し、関数ｇ　（ｗ
）を得る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行な
う。すなわち、閾値（α０）に対し、 ｇ（ｗ）≧α０のとき、ｇ（ｗ）＝１ ｇ　（ｗ）　＜α０のとき４ｇ（ｗ）＝０とする処理を
施すことにより、関数ｇ（ｗ）を１またはＯの連続関数
に変換する。サンプリング点は、ｇ　（ｗ）＝　１の領
域の各中点とすることにより検出される。なお、上記の
閾値処理における閾値（α０）は、たとえば、走査領域
上のデジタル信号について、信号のレベルと、その頻度
との関係、すなわちヒストグラムから決定することがで
きる。

このようにして各列についてサンプリング点の集合（Ｓ
ｋｎ　（Ｘｋｎ　＊　Ｖｂｃ　ｎ　＊　Ｚｋｎ））を検
出することができる。ここで、ｋは正の整数であって各
列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリン
グ点の番号を表わす。なお、サンプリング点を検出する
ための方法は、上記の方法に限られる５ものではない。

次に、第１列のサンプリング点と第２列のサンプリング
点とを論理加算することにより、新たに（Ｇ）特異的Ｄ
ＮＡ合成物、（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物、（Ｔ）ｍ異的
ＤＮＡ合成物、および、（Ｃ）特異的ＤＮＡ合成物の四
種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物の全てを含むサンプリン
グ点の列、すなわち基準（内部標準）列（Ｓｏ。）を得
る。

たとえば、この合成を演算ヒして表わすと次のように°
なる。

（ＳＩ３ｎ）　　＝’（Ｓ　　１　ｎｌ　　Ｕ　　（Ｓ
ｚｎ’）ここで、（）はサンプリング、板の集合を表わ
し、Ｕは論理和演算子を表わす。この基準列は、第１列
と第２列との中間に仮想的に存在するように、基準サン
プリング点５Ｔ３ｎの座標を新たに設定する。

同様の処理を第６列のサンプリング点と第７列のサンプ
リング点について行なうことにより基準サンプリング点
（Ｓｕｎ）を有する基準列を合成し、また、第１１列の
サンプリング点と第１２列のサンプリング点についても
同様の処理を行なうことにより基準サンプリング点（Ｓ
　＊５ｎ　’ｊを有する基準列を合成して得る。このよ
うにして、分離展開して得られた十二重の泳動列の両端
および中央部にデジタル画像データ上において仮想的に
五列の基準列を設けることができる。

各基準列において対応する基準サンプリング点、すなわ
ち、サンブリジグ点の番号ｎがギしい基準サンプリング
点を結んで複数の直線（もしくは折れ線）を得る。たと
えば、分離展開位置の最も遠い（ｎ＝１の〕基準サンプ
リング点５Ｔ３Ｗ、Ｓ＆４Ｍおよび５ＩＳＩを結んで折
れ線を得、ざらにｎ＝２　、３　、・・・・・・につい
ても同様にして順次直線（もしく　１１折れ線）を得る
ことにより、各基準列。

における基準サンプリング点の数だけの直線（もしくは
折れ線）を得る。さらに、得られた折れ線を適当な曲線
で近似することもできる。これらの直線、折れ線または
曲線からなる連続線群は、分離展開位置についての等高
線群（Ｌｎ）　とみなすことができる。ただし、ｎは基
準サンプリング点の゛番号ｎに一致する。

第３図は、上記のようにして得られる曲線で近似された
等高線の一部分を示す図である。

この等高線を基ｉ、第３列のサンプリング点について、
比較同定を行なう。たとえば、第３列のサンプリング点
Ｓ３１については、サンプリング点３３１の位置ＣＸ３
１１　ｙ３１）が等高線群（ＬＱ）の中のどの等高線に
最も近いかを判定する。今、それがＬｌであったとする
と、サンプリング点５３１は基準サンプリング点５ｔｌ
ｌに帰属することができる。このようにして、順に第３
°列の全てのサンプリング点を基準サンプリング点のい
ずれかに帰属させる。すなわち、第３列のサンプリング
点は、基準サンプリング点の部分集合（Ｓｒ３ｎ）　３
で表わされる。

上記の操作により、ｙ座標（Ｖｋｎ）で表わされるサン
プリング点５ｋｉｎを等高線Ｌｎをもって表わすことが
でき、また、この等高線は泳動座標ともいえるから、こ
の操作は換言すれば、ｘｙ座標から泳動座標への座標変
換とみなすことができる。

さらに、第３列のサンプリング点の集合は、この基準列
を構成する第１列のサンプリング点の集合（Ｓ　＊　ｎ
）に含まれるので、 （ＳＩ３ｎ）　３ｎ　（Ｓｔｎ）　＝’（Ｓｚｓｎ）な
る論理積演算で表わされる新たなサンプリング点の集合
（Ｓ１８　ｎ　）を有する仮想的な第′１６列を得、得
られた第１６列は、第１゛列〜第４列の組におけるアデ
ニン特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列に相当する。

同様の操作を第４列と第２列との間においても行ない、
チミン特異的ＤＮＡ合成物の分離展開列に相当する第１
７列を得る。次に、第３列、第４列、第１６列および第
１′７列について、ｎの小さい順に基準サンプリング点
３１３ｎとサンプリング点Ｓｋｎとを比較していき、そ
れが合致したとき、その基準サンプリング点ＳＩ３’ｎ
を合致したサンプリング点Ｓｋｎで置き換える。そして
、基準列をｎの小さい順にたどれば、たとえば、次のよ
うな図式を得ることができる。

Ｓ３　Ｚ　ｒ　Ｓ　４　＊　＋　Ｓ　１７　ｊ　＋　Ｓ
、３２・’Ｓ　１６　ｆ　＋上記図式において、５３ｎ
＝Ｇ、５４ｎ−ｃ、Ｓ　□ｓ　ｎ　＝　Ａ　、　　Ｓ　
１７　ｏ　＝　Ｔと置き換えルコトニより、次のような
図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−・・・・・・ このようにして、第１列〜第４列の組において、検体Ｄ
ＮＡと相補的な塩基配列を有する、塩基特異的ＤＮＡ合
成物の鎖状分子についての塩基配列を決定することがで
きる。

さらに、同様の処理を第５列〜第８列の組および第９列
〜第１２列の組に対しても行なうことにより、それぞれ
のＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基配列を決定す
ることができる。

なお、得られたＤＮＡの塩基配列についての情報は、上
記の表示形態に限られるものではなく、任意の表示形態
が可能である。たとえば、所望により、ざらに各列の走
査方向上における信号のレベルを任意に演算処理するこ
とにより、分離展開された各ＤＮＡ合成物の相対量をも
表示することが可能である。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち上記の記
号で表わされた図式において各塩基に対応する組合わせ
として、Ａ７Ｔ、Ｇ−Ｃ１Ｃ＋Ｇ、Ｔ−＋Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ　−・・・・・・ Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−・・・・・・ なお、本発明の信号、処理法により、上記の（Ｇ＋Ａ、
Ｔ＋Ｃ，Ｇ、Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡの塩基配
列決定法は、ＤＮＡの塩基配列決定法の一例であって、
本発明の信号処理法は、上記の組合わせに限定されるも
のではなく種々の組合わせが可能であり、またその組合
わせを利用して、上記の方法に準じる方法により同様に
して塩基配列を決定することができる。

ただし、いずれの組合わせにおいても、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ
の全ての塩基特異的ＤＮＡ合成物からなる基準（内部標
準）列を合成して得ることができるような組合わせを有
することが必要である。

さらに、基準列形成用試料の分離展開列は、近接して配
置されでいなければならず、かつ、この基準列を得るた
めの分離展開列の組は、−基配列決定対象の塩基特異的
ＤＮＡ合成物の分離展開列を挟むよう−に配置されて分
離展開を行なうことが必要である。

この基準列形成用試料の分離展開列の分離展開位置は、
高精度にＤＮＡの塩基配列を決定するためには、各組が
できる限り離れているのが好ましい。すなわち、この組
が二組から生る場合には、複数の分離展開列の両端部に
配置するのが好ましく、三組からなる場合には、複数の
分離展開列の両端および中央部に配置するのが好ましい
。この組が三組よりも多い場合には、検知対象の分離展
開列の間に適当な間隔をもって配置されるのが好ましい
。゛三組以上の設置は、放射性標識物質が分離展開され
た支持媒体に前述のスマイリング効果が生じている場合
には特に有効であり、ＤＮＡの塩基配列を高精度に決定
すること氷できる。設置する基準列形成用試料の分離展
開列の組数が増加するほど得られる等高級は正確なもの
となり、従ってＤＮＡの塩基配列を高精度に決定するこ
とが可能となる。

この基準列形成用試料は基準列を単に形成するのみなら
ず、同時に一分離展開列としてそのＤＮＡの塩基配列決
定に関与するものである。しだがって、分離展開列の数
が多ければ多いほど、基準列を多く合′成できることに
なり、よって正確な等高線を得ることが可能となる。す
なわち、一層高精度に塩基配列を決定することができる
ものである。

上記の例においては、支持媒体上で一次元的方向に分＃
展開している１２列の放射性標識物質群を用いて説明し
たが、分離展開列は１２列に限定されるものではない。

あるいは、同時に数種１以上の−Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配列
を決定することも可能である。

」二足のような信号処理法により決定されたＤＮＡの塩
基・配列についての情報は、信号処理回路１０から出力
されたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁
気テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）
へ伝送さ′れる。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等−に記録するもの、熱線を用いて感
熱記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた
記録装置を用いることができる。

なお、−り記のようにして得られた情報は、このほかに
も、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡの塩
基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行なう
ことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明において感光材料上に記録された試料
中の放射性標識物質の位置情報を有するオートラジオグ
ラフを読み取°るための読取装置の例を示すものである
。 ｌ：写真感光材料、２：透明ドラム、３：ミラー、４：
光源、５：光ビーム、６：レンズ、７：光電子増倍管、
８：増幅器、９：Ａ／Ｄ変換器、ｌＯ：信号処理回路 第２図は、検体ＤＮＡの塩基特異的ＤＮＡ合成物の分離
展開列のオートラジオグラフの例を示す図である。 第３図は、曲線で近似された基準サンプリング点を結ぶ
等高線の一部分を示す図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 箇 赴 第２図 第３図　　　　　　　Ｘ ＋３　　３４　５　　１４　　８　９１０　　１５手続
補正書 昭和５９年９月ｌＯ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する
   ためのオートラジオグラフィーにおける信号処理法であ
   って、該ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基配
   列を有し、かつ放射性標識が付与されている、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物、アデニン特異的ＤＮ
   Ａ合成物、チミン特異的ＤＮＡ合成物、およびシトシン
   特異的ＤＮＡ合成物の全てを全体として含むように任意
   に組合せられた少なくとも二種の塩基特異的ＤＮＡ合成
   物もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物からなる一組
   の基準列形成用試料を少なくとも二組、および、 ２）塩基特異的ＤＮＡ合成物もしくは塩基特異的切断物
   混合物を少なくとも一種、 のそれぞれが、支持媒体上において、 上記１）の二組の基準列形成用試料のそれぞれ二以上の
   分離展開列が、少なくとも一列の上記２）の塩基特異的
   ＤＮＡ合成物もしくは塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物の
   分離展開列を挟むように互いに平行関係を以って一次元
   的に分離展開されて形成された少なくとも五列の分離展
   開列を構成する放射性標識物質群の位置情報を有するオ
   ートラジオグラフを写真感光材料上に記録したのち、該
   写真感光材料上に可視化されたオートラジオグラフを光
   電的に読み取ることにより得られるそれぞれの分離展開
   列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号につい
   て、 ｉ）分離展開列のそれぞれについてサンプリング点を検
   出する工程、 ｉｉ）各々の基準列形成用試料の各々二以上の分離展開
   列から各々の基準列を合成し、各々の基準列について基
   準サンプリング点を検出する工程、 ｉｉｉ）該複数の基準列間で対応する基準サンプリング
   点を結んだ直線、折れ線または曲線からなる複数の連続
   線を設定する工程、そして ｉｖ）該連続線により、各分離展開列のサンプリング点
   を比較同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ２、上記１）の基準列形成用試料の各々二以上の分離展
   開列が少なくとも三組配置され、かつ、互いに隣接する
   二組の基準列形成用試料の分離展開列が、少なくとも一
   列の上記２）のＤＮＡ合成物もしくはＤＮＡ合成物混合
   物の分離展開列を挟むように配置されていることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載のオートラジオグラフ
   ィーにおける信号処理法。 ３、サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ４、一組の基準列形成用試料が、 １）グアニン特異的ＤＮＡ合成物 ＋アデニン特異的ＤＮＡ合成物、および、 ２）チミン特異的ＤＮＡ合成物 ＋シトシン特異的ＤＮＡ合成物、 の二種の塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物から構成されて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項
   のいずれかの項記載のオートラジオグラフィーにおける
   信号処理法。