JPS59126253A - オ−トラジオグラフイ−における信号処理法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフィーにおける信号処理法
に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、写真
感光材料を利用したオートラジオグラフィーにおいて、
ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列決定のため
のデジタル信号処理における放射性標識物質の分離展開
位置の比較同定方法に関するものである。

女手１奴体上において少なくとも一次元的方向に分！１
ｊシて分布列を形成している放射性標識物質の位置情報
を得るための方法としてオートラジオグラフィーか既に
知られている。

たとえは、蛋白質、核酸などのような生物体由来の鎗高
分子物質に放射性標識を付与したのち、その放射性標識
を伺した高分子物質、その誘導体、あるいはその分解物
など（以下、放射性標識物質ともいう）をケル状支持奴
体上で電気泳動などの分離操作にかけて分離展開を行な
うことにより、該支持媒体」二に放射性標識物質の分離
展開列を形成させ、この分離展開列のオートラジオグラ
フを放射線フィルムに転写記録したのち、■ｆ視化し可
視画像から放射性標識物質の位置情報を得ている。また
、得られた放射性標識物質の位置情報を基にして、その
高分子物質の分離、同定、あるいは高分子物質の分子量
、特性の評価などを行なう方法は既に開発され、実際に
利用されている。

特に近年においては、オートラジオグラフィーは、ＤＮ
Ａ（もしくはＤＮＡなどの部分分解物、以下同様）の塩
基配列の決定に石効に利用されている。

このオートラジオクラフィーを利用することによりＤＮ
Ａの塩基配列を決定する方法としては、マキサム・キル
ハート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ）法、およびサ
ンガー・クールンン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｏｎ）
法が知られている。これらの方法は、ＤＮＡが二本の鎖
状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその二本の
鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニン（Ａ
）、グアニン（Ｇ　）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）
なる塩基を有する構成単位から構成されていること、そ
して、この二本の鎖状分子の間はこれら四種類の塩基間
の水素結合によって架橋されており、しかも各構成単位
間の水素結合は、Ｇ”−ＣおよびＡ−Ｔの二種類の組合
わせのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な
構造を巧妙に利用して、その塩基配列を決定する方法で
ある。

たとえば、マキサ゛ム・キルハート法は、次に述べるよ
うな方法により実施される。

まず、塩基配列を決定しようとしているＤＮＡあるいは
ＤＮＡの分解物の鎖状分子の一方の側の端部に燐（Ｐ）
の放射性同位元素を含む基を結合させることにより、そ
の対象物を放射性標識物質としたのち、化学的な手段を
利用して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的に
切断する。次に、この操作により得られるＤＮＡあるい
はＤＮＡの分解物の多数の塩基特異的切断分解物の混合
物をゲル電気泳動法により分離展開し、多数の塩基特異
的切断分解物かそれぞれ帯状を形成して分離展開された
分＃展開列（ただし、視覚的には見ることができない）
を得る。そして、この分＃展開列のオートラジオグラフ
をＸ線フィルム上に可視化して、得られた可視画像と各
々の塩基特異的切断手段とから、放射性同位元素が結合
された鎖状分子の端部から一定の位置関係にある塩基を
順次決定し、このようにして対象物のすべての塩基の配
列を決定している。

上述のように従来の放射線写真法を利用するオートラジ
オグラフィーでは、放射性標識物質の位置情報を得るた
めにはこの位置情報を有するオートラジオグラフを放射
線フィルム−上にＯｆ視化することが必須要件となって
いる。

従って、研究者は、その可視化されたオートラジオグラ
フを視覚的に観察することにより、支持媒体上の放射性
標識物質の分布を判断している。

すなわち、ＤＮＡの塩基配列は、放射性標識の付与され
た塩基特異的切断分解物もしくはその混合物のそれぞれ
について、分１１ｉ１１：展開位置を視覚的に判断し、
それら切断分解物の分離展開列を相互に比較することに
より決定されている。

しかしながら、従来のオートラジオグラフィーでは、」
−述のようにその解析作業は人間の目に依存しているた
め、その可視画像とされたオートラジオグラフを解析し
て得られる放射性標識物質の位置情報が研究者によって
相違する場合が発生するなどの問題かあり、得られる情
報の精度には限界がある。特に、放射線フィルム上に可
視化されたオートラジオグラフが良好な画質（幣鋭度、
コントラスト）を有していない場合には、満足できる情
報か得られがたく、またその精度は低下する傾向にある
。従・来より、求める位置情報の精度を向」−させるた
めに、たとえば、その可視化されたオートラジオグラフ
をスキャニングデンシトメーターなどの測定器具を用い
て測定する方法も利用されている。しかしなから、その
ような測定器具を単に用いる方法においては精度の向」
−に限界がある。

また、たとえば、［′ｒｌＩ記の分離展開列か形成され
た支持媒体と放射線フィルムとを電着させて行なわれる
露光操作時にその重ね合わせにズレか生じる場合があり
、この場合には放射線フィルム」−に可視画像として得
られる分離展開列（たとえば、泳動列）はフィルムの長
さ方向に対して平行でなく、すれる結果となるため、放
射性標識物質の位置情報を視覚的に判断する際に誤差が
生しやすくなり、その精度は低下しがちである。また、
支持媒体や分離展開条件によって、得られる分離展開列
が支持媒体の長さ方向に対して平行でなかったり、歪ん
だりすることが往々にして生じる。

ごらに、支持媒体としてゲルを用いる場合において、て
のゲルは自己支持性かないため通常はカラスなどで両面
を挟持した状態で分＃展開を行なうが、その被覆物の変
形などによってゲルに厚さムラが生じたりすることがあ
り、放射性標識物質は支持媒体上で必ずしも一様に分離
展開されるとは限らない。また同様な分離展開の不均一
さはケル中に空気泡か含まれている場合、あるいは、ゲ
ルの組成が不均一であったりした場合においても発生す
る。このような理由から、たとえば、支持媒体の中央付
近における分離展開列の移動距離に比べて両端の分離展
開列の移動距離が相対的に短いといった、いわゆるスマ
イリング効果がしばしば現れる。あるいは、電気泳動に
より分離展開する場合において電圧が支持媒体に均一に
印加されない場合があり、そのような場合にも分離展開
条件か支持媒体上で局部的に異なってくるため、得られ
る分離展開列に歪みが生じがちである。

このような分離展開列の歪みは人為的に補圧する以外に
は適当な方法がなく、従って、以上のような場合におい
ては、放射性標識物質の位置情報の解析が特に困難にな
り、前記のような測定器具を利用しても分離展開された
放射性標識物質の位置情報、すなわちＤＮＡもしくはＤ
ＮＡ部分分解物の塩基配列を充分な精度で得ることは困
難である。

未発り１者は、放射線写真法を利用するオートラジオグ
ラフィーにおいて、写真感光材料上に画像化された放射
性標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフな光
電的に読み取ってデジタル信号に変換し、そして得られ
た放射性標識物質の分Ｚ（ｊ位置を検出するだめのサン
プリング点に対して、さらに好適な信号処理を行なうこ
とによりＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を
簡易かつ高精度に決定することを実現し、本発明に到達
した。

すなわち、本発明は、ＤＮＡもし次はＤＮＡ部分分解物
の塩基配列を決定するためのオートラジオグラフィーに
おける信号処理法であって、放射性標識か付与されたＤ
ＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の特異的切断分解゛によ
り得られた、１）−グアニン特異的切断分解物、アデニ
ン特異的切断分解物、チミン特異的切断分解物、）よひ
シトシン特異的切断分解物の四種類の塩基特異的切断分
解物を含む特異的切断分解物の混合物、および、 ２）少な≦とも一種類の塩基特異的切断分解物を含む塩
基特異的切断分解物、 を含む少なくとも二指の切断分解物試料のそれぞれが、
支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分＃展開され
た放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグ
ラフを写真感光材料上に記録したのち、該写真感光材料
上に可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み取
ることにより得られるそれぞれの分離展開列のオートラ
ジオグラフに対応するデジタル信号について、ｉ）該四
種類の塩基特異的切断分解物を含む切断分解物の分＃展
開列を基準列とし、この基準列について基準サンプリン
グ点を検出する工程、 ｌｌ）基準外以外の分離展開列についてサンプリング点
を検出する工程、そして １１１）該ノ、（型刻の基準サンプリング点を基準とし
て隣接する分＃Ｆ展開列のサンプリング点の比蚊照合を
行なうことにより、その隣接する分＃展開列のサンプリ
ング点を同定する工程、を含むオートラジオグラフィー
における信号処理法を提供するものである。

すなわち、本発明は、試料と放射線フィルムなどの写真
感光材料とを重ね合わせることによって試ネ４から放出
される放射線エネルギーを放射線フィルムに吸収させて
、この放射線フィルムを可視化し、その［ｉＴ視両画像
光電的に読み取って電気信号を得、この電気信号をＡ／
Ｄ変換してテシタル信号として得ることからなる放射線
像変換方法を利用するものである。

なお１本発明において「位置情報」とは、試料中におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心とす
る各種の情報、たとえば、支持媒体中に存在する放射性
物質の集合体の存在位置と形状、その位置における放射
性物質の濃度、分布などからなる情報の一つもしくは任
、ｄの組合わせとして得られる各種の情報を意味する。

本発明によれば、前述のような支持媒体上における放射
性標識物質の分離展開時の位置的な歪み、あるいは−次
元的方向に分布して分布列を形成している放射性標識物
質のオートラジオグラフを蓄積性蛍光体シートへの転写
する操作における位置ズレなどにより、写真感光材料」
二に転写記録されたオートラジオグラフ全体にわたって
歪み、スレか生じている場合にも、精度高＜ＤＮＡもし
くはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定することができ
る。とりわけ、分離展開方向の歪みに対しては、分離展
開方向でその歪みを補正しなから各列の分離展開方向を
同定することが可能であり、従って高精度に、かつ合理
的にその塩基配列を決定することができるものである。

また、効率良く実験を行なうために、一般に、支持媒体
上にはできるだけ多くの分離展開列を設けることが行な
われている。その結果、前述のスマイリング効呆などの
分＃展開列の歪みを生じゃすいものであるが、本発明は
、内部標準としてＤＮＡの四種類の塩基特異的切断分解
物の全てを含む基準列を設けることにより、支持媒体」
二の分離展開列の全てについてその歪みを補正すること
を可能にするものである。

本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識物質か一次元的方向に分離展開された支持媒体を挙げ
ることができる。放射性標識物質の例としては、放射性
標識が付与された生体高分子物質、その誘導体もしくは
それらの分解物を挙げることができる。

たとえは、本発明ｌま、放射性標識が付与された生体高
分子物質が１．蛋白質、核酸、それらの誘導体、それら
の分解物のような高分子物質である場合には、これらの
生体高分子物質の分離、同定などに有用なものである。

さらに、これらの生体高分子物質の全体的あるいは部分
的な分子量、または、それらの分子構造あるいはそれら
の基本単位構成などの解析に本発明は有効に利用するこ
とができる。

ただし、本発明に用いることのできる試料は上記の試料
に限られるものではなく、少なくとも一次元的方向に分
布している放射性標識物質を含有する支持媒体であって
、かつ感光材料上にその放射性標識物質の位置情報を有
するオートラジオグラフを画像化することのできるもの
であればいかなるものであってもよい。

また、放射性標識物質を支持媒体を用いて分離展開する
ための方法としては、たとえば、ゲル状支持媒体（形状
は層状、柱状など任意）、アセテートなどのポリマー成
形体、あるいは濾紙などの各種の支持媒体を用いる電気
泳動、そしてシリカゲルなどの支持媒体を用いる薄層ク
ロマトグラフィーがその代表的な方法として挙げられる
が、分離展開方法はこれらの方法に限定されるものでは
ない。

本発明に用いられる写真感光材料は、基本構造として、
支持体および写真乳剤層からなるものである。写真乳剤
層は、ハロゲン化銀を分散状態で含有支持するゼラチン
などの結合剤からなるものである。感光材料は、たとえ
ば、支持体としてポリエチレンテレフタレートなどの透
明なシートを用い、このシート」二に上記写真乳剤層を
設けたものであり、その例としては高感度Ｘ線フィルム
などの放射線フィルムを挙げることができる。

本発明において、放射性標識物質を含有する支持媒体か
ら放出される放射線による写真感光材料の感光操作（露
光操作）は、支持媒体と写真感光材料とを一更時間重ね
合わせることにより、その支持媒体」−の放射性標識物
質から放出される放射線の少なくとも一部によって写真
感光材料中の感光物質に吸収させて実施する。この露光
操作は、支十ケ媒体と写真感光材料とを電着した状態で
配置し、たとえば、氷点下のような低温で数日間この状
態に置くことにより行なうことができる。なお、露光操
作においては増感紙の使用、あるいはフランシュ露光等
の前露光の適用によって増感を行なってもよい。。

なお、オートラジオグラフィーにおける試料の写真感光
材料への露光操作および感光材料の現像処理については
、既に良く知られており、それらの操作および処理につ
いては、たとえば、次に示す文献に記載、されている。

生化学実験講座６　トレーサー実験法（上）２７１〜２
８９頁、ｌｉ’８．　　オートラジオグラフィーｊ末吉
徹、重末昭世（１９７７年、■東京化学同人刊） 次に、本発明において、写真感光材料に記録された支持
媒体上の放射性標識物質の一次元的な位置情報を有する
オートラジオグラフを読み取ってデジタル信号に変換す
るだめの方法について、添イ・１図面の第１図に示した
読取装置の例を参照しながら略述する。

第１図は、写真感光材料１に可視画像として記録されて
いる放射性標識物質の一次元的な位置情報を有するオー
トラジオグラフを読み取るだめの画像読取装置の例の概
略図を示している。

中空の回転ドラム２には、その外側に可視画像を有する
感光材料ｌが装着されている。この回転トラム２は、−
・定速度で回転すると同時に軸方向に一部ピッチで移動
するようにされている。また１、この回転ドラム２内に
はミラー３が挿入されており、光源４からの光ビーム５
はレンズ６を通って入射する。この光源４からの光ビー
ム５は、ミラー３で上方に反則され、透明ドラム２に装
着した感光材料１を透過して光電子増倍管７に入射する
。このようにして、感光材お［１の画面か光ビーム５に
よる光点でＸＹ方向に走査される。

光電子増倍管７は、感光材料１のゝ各点の透過光を電気
信号に変換する。この電気信号は、増幅器８により増幅
されたのち、Ａ／Ｄ変換器９に入力される。Ａ／Ｄ変換
器９で、電気信号はデジタル信号に変換される。なお、
画像の読み取り操作の詳細については、たとえば、特開
昭５４−１２１０４３号公報に記載されている。

また、本発明における写真感光材料に記録された放射性
標識物質の位置情報を有するオートラジオグラフを読み
取るための方法について、上記においては光ビームを用
いた光透過法による読み取り操作を説明したが、光反射
法による読み取り操作も適用できる。本発明において利
用することができる読み取り操作は、上記の例に限られ
るものではなく、たとえば、テレビカメラによる読み取
り操作など各種の方法が可能である。

このようにして得られた放射性標識物質のオー、トラシ
オクラフに対応するデジタル信号は、次に、第１図に示
される信号処理回路１０に入力される。（ａ号処理回路
１０では、放射性標識物質の一次元的位置情報を記号お
よび／または数値化することにより、目的のＤＮＡの塩
基配列の決定が行なわれる。

以ド、未発ＩＪＪ−１の信号処理力゛法を用いたオート
ラジオグラフィーにおける信号処理の実施態様を、前記
ツマキサム・キル／＜−ト、法を利用したＤＮＡの塩基
配列決定法を例にとり、その塩基配列決定のための典型
的な塩基特異的切断分解物の組合わせとして次の五種類
の切断分解物試料を用いた場合について説明する。

■）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的切断分解物、 ２）グアこン特異的切断分解物、 ３）アデニン特異的切断分解物、 ４）チミン特異的切断分解物、 ５）シトシン特異的切断分解物、 まず、試料は常法により、３′２Ｐによる放射性標識か
イ・１与された上記五木の切断分解物および切断分解物
混合物をゲル支持媒体」−で電気泳動により分＃展開さ
せて得ることかできる。次に、この試料（支持媒体）と
放射線フィルムとを−７０〜−９０°Ｃの低温で数日間
重ね合わぜることにより露光操作を行ない、試料のオー
トラジオグラフを放射線フィルムに転写記録する。

第２図は、放射性標識の付与されたＤＮＡが分＃、展開
されている上記五種類からなる泳動列のオートラジオグ
ラフを示す。すなわち、第２図の第１列から第５列は順
に、 （１）−（Ｇ）特異的切断分解物 （２）−（Ａ）特異的切断分解物 （３）−ＣＧ）＃異的νＪ断分解物 ＋（Ａ）特異的切断分解物 ＋（Ｔ）特異的切断分解物 ＋（Ｃ）特異的切断分解物 （４）−（Ｔ）特異的切断分解物 （５）−（Ｃ）特異的切断分解物 の各泳動列を示す。第３列は、（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の全
ての塩基特異的切断分解物を含んでおり塩基配列決定の
ための内部標準列（基準列）である。

放射線フィルムに転写記録されたオートラジオグラフを
第１図に汀＼した読出装置に装填して読み出すことによ
り１イ８号処理回路１０に人力されたデジタル信号は、
放射線フィルムに固定された座標系で表わされた番地（
ｘ　、　ｙ）とその番地における信号のレベル（Ｚ）と
を有しており、その信号のレベルは輝尽光の光量に対応
している。すなわち、デジタル信号は第２図のオートラ
ジオグラフに夕Ｊ　Ｅ　している。従って、信号処理回
路１０にほに記放射性標識物質の位置情報を有するデジ
タル画像データか人力されることになる。本発明におい
て、デジタル画像データとｌ±、放射性標識物ｉＣｊの
オートラジオグラフ１こ対応するテンタル１１８号の集
合体を意味する。

ます、デジタル画像データ上で、」−記瓦夕１１のそれ
ぞれについて放射性標識物質の分離展開位置を検出し、
それらをサンプリング点とする。サンプリング点は、た
とえば、次のようにして検出する二とかできる。

に記デジタル信号に対して、放射性標識物質の一次元的
分４ｉ方向を横断するようにデジタル画像データ上の異
なる位置を１回走査することによって、各走査領域上で
各列の放射性標識物質の分Ｉｆｉ点を検出しくこの分布
点を検出するだめの走査を予備走査という）、各列につ
いてそれぞれ二分布点を結んで五本の直線を得、得られ
た直線をそれぞれ各列におけるサンプリング点検出のｌ
こめの走査方向とする。

なお本発明の信号処理方法において、放射線フィルムを
読み出して得られたデジタル信号は、信号処理回路１０
において一旦メモリーに記憶される（すなわち、／ヘン
ファーメモリーあるいは磁気ディスク等の不揮発性メモ
リーに記憶される）。

信号処理において、デジタル画像データ上を走査すると
は、この走査箇所のデジタル信号のみをメモリーから′
選択的に取り出すとを意味する。

次いで、デジタル画像データ」二を走査方向に沿って走
査することにより、走査領域上の信号のレベルを表わす
関数ｆ　（ｗ）［ｗは走査方向上の位置を表わす］を得
ることができる。そしてこの関数ｆ　（ｗ）に、たとえ
ば適当なフィルター関数を用いてコンボリューションを
行なうことによりスムージング処理を施し、関数ｇ　（
ｗ）を得る。次に、この関数ｇ　（ｗ）に閾値処理を行
なう。すなわち、閾値（α０）に対し、 ゝ　　ｇ（ｗ）≧＆０のとき、ｇ（ｗ）＝１ｇ　（ｗ）
　＜α０のとき、ｇ（ｗ）−〇とする処理を施すことに
より、関数ｇ（ｗ）を１または０の連続関数に変換する
。サンプリング点は、ｇ（ｗ）＝１の領域の各中点とす
ることにより検出される。なお、上記の閾値処理におけ
る肉（ｉｒｊ　（α０）は、たとえば、走査領域」二の
デジタル信号について、信号のレベルと、その頻度との
関係、すなわちヒストダラムから決定することができる
。

このようにして各列についてサンプリング点Ｓｋｎを検
出することができる。ここで、ｋは止の整数であって各
列の番号を表わし、ｎは正の整数であって、サンプリン
グ点の番号を表わす。なお、サンプリング点を検出する
ための方法゛は、上記の方法に限られるものではない。

次に、各列間の比較同定は、具体的には各列の・間で同
じ分離展開物を探し出す作業が含まれる（たとえば、（
’Ｇ）＋　（Ａ）の列と（Ｇ）の列とを比較する場合に
は（Ｇ）＋　（Ａ）の列から（Ｇ）の要素となっている
分離展開物を探し出す）。しかし、この比較同定は、前
記歪みのある場合には、第３図のように各列の等価な分
＃展開列の位置が必ずしもＸ座標上で等しくはならない
。従来、このような歪みの補正は人間の視覚的な判断に
まかせられていた。しかし、本発明の方法によれば、基
準列および基準サンプリング点を用いることにより、人
に頼ることなく自動的に“歪みを補正し各列間の正確な
比較同定を行なうことができる。

このことを第３図に基づいて説明する。

第３図は、基準列（第３列）および第４列の一部分を示
す図である。ここで、黒画角は放射性標識物質の分離展
開部位に相当する各列のサンプ、リング点を表わし、中
空四角は内挿された基準サンプリング点を表わす。

基準列である第３列のサンプリング点３３ｎをノ、（準
サンプリング点として、隣接する第４列のサンプリング
点ｓ４ｎとの比較同定を行なうことにより、第４列につ
いて基準サンプリング点の内挿を行なう。

たとえは、第４列のサンプリング点Ｓ４１については、
サンプリング点３４１の位Ｋ　（Ｘ　４１　）と第３列
の基準サンプリング点Ｓ３２の位・置（×３□）および
５３３の位置（Ｘ３３）とを比較する。たとえは、 ｌＸ３２　　Ｘ４＋１＝ａ ｌＸ３３　　ｘ４＋ｌ＝ｂ とすると、この場合にはａ＞ｂであるから、サンプリン
グ点Ｓ４１は、基準サンプリング点Ｓ３３と回しＸ座標
をもつものと帰属される。こめようにして順に第４列の
全てのサンプリング点を基準サンプリング点のいずれか
に帰属させる。そして帰属された第４列のサンプリング
点ｓ４ｎを基にて、残りの第３列の基準サンプリング点
のそれれを第４列に内挿することにより、第４列におて
仮初的な基準サンプリング点の集合（Ｓａ。

）を作成する。ただし、ｍは正の整数であり、第３列の
サンプリング点の番号ｎに一致する。このようにして第
４列の位置に第３列で求めた基準列を移動させた仮想的
基準列を得ることができる。

次に、作成した第４列の基準サンプリング点ｓ４ｍを基
に、隣接する第５列のサンプリング点ｓｓｎについて基
準サンプリング点５４ｍを介して基質サンプリング点Ｓ
３ｎへの帰属を行ない、さらに第４列の基準サンプリン
グ点ｓ４ｍを内挿することにより、第５列において仮想
的な基準サンプリング点の組（３５ｍ　）を作成すや。

このようにして基準列の基準サンプリング点Ｓ３ｎに基
づいて、順々に各列において仮想的な基準サンプリング
点の組（Ｓｋｌｆｌ）を作成しなから、全てのサンプリ
ング点Ｓｋｎを基準サンプリング点Ｓ３ｎのいずれかに
帰属させる。

すなわち、以上の方法は、 １）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的切断分
解物、チミン特異的切断分解物、シトシン特異的切断分
解物の四種類の切断分解物混合物、および、 １群の塩基特異的切断分解物、 を含む少なくとも二群の切断分解物試料のそれぞれが、
支持媒体」二に平行関係を以って一次元的に分離展開さ
れた放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオ
グラフを写真感光材料上に記録したのち、該写真感光材
料上に可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み
出すことにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号について、ｉ）該
四種類の塩基特異的切断分解物を含む切断分解物の分離
展開列を基準列とし、この基準列について基準サンプリ
ング点を検出する工程、 １１）基準列以外の各分離展開列についてサンプリング
点を検出する工程、 １１１）基準列の基準サンプリング点を基準として該基
準列に隣接する分離展開列のサンプリン接する分離展開
列のサンプリング点を同定し、ここで同定されたサンプ
リング点に基づき新たに基準サンプリング点を定める工
程、１ｖ）」−記の１１１）の工程において新たに定め
られた基準サンプリング点と、その基準サンプリング点
が定められた分離展開列に隣接する分離展開列のサンプ
リング点との比較照合を行なうことにより、その隣接す
る分離展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含む信号処理方法とまとめることができる。

次に、第１列、第２列、第４列および第５列について、
ｍの小さい順にそれぞれの列における仮想的基準サンプ
リング点（ｓｋｍ）とその列における実在のサンプリン
グ点Ｓｋｎとを比較していき、それが合致したとき、基
準列（第３列）のｍに対応するサンプリング点５３ｍを
合致したサンプリング点Ｓｋｎで置き換える。そして、
基準列を口の小さい順にたどれば、たとえば、次のよう
な図式を得ることができる。

Ｓ＋＋・５５１１Ｓ４１１Ｓ１２．Ｓ２１゜Ｓ　　２　
２　　、Ｓ　　４　２　　＋　　Ｓｌ　　３　　＋　　
Ｓ５　　□　、・・・・・・上記図式において、Ｓ、ｎ
＝Ｇ、５２ｎ＝Ａ。

５４ｎ＝Ｔ、５５ｎ−Ｃと置き換えることにより、次の
ような図式を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−・・・・・・こ
のようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩基
配列を決定することができる。なお、得られたＤＮＡの
塩基配列についての情報は、上記の表示形態に限られる
ものではなく、任意の表示形態が可能である。たとえば
、所望により、ざらに各列の走査方向」−における信号
のレベルを任意に演算処理することにより、分離展開さ
れた各切断分解物の相対量をも表示することが可能であ
る。

あるいはさらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方について
の塩基配列を表示することもできる。すなわち、上記の
記号で表わされた図式において各塩基に対応する狙合わ
せとして、Ａ−Ｔ、Ｇ＋Ｃ１Ｃ−Ｇ、Ｔ＋Ａなる情報を
与えることにより、次のような図式で表わされるＤＮＡ
の塩基配列を得る。

Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−（、−Ｃ−・・・・・・
Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−・・・・・・な
お、本発明の信号処理方法により、」１記の（Ｇ＋Ａ＋
Ｔ＋Ｃ，Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組合わせを利用したＤＮＡ
の塩基配列決定法は、ＤＮＡの塩基配列決定方法の一例
であって、本発明の信号処理方法は、」−記の組合わせ
に限定されるものはなく、種々の組合わせが可能であり
、またその組合わせを利用して、上記の方法に準じる方
法により同様にして塩基配列を決定することかできる。

ただし、いずれの組合わせにおいても内部標準として、
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの全ての塩特異的切断分解物の混合物の
列（基準列）を設けることが必要である。この基準列の
分離展開位置は、上記のように必ずしも支持媒体の中央
部に配置する必要はないが、より高精度にＤＮＡの塩基
配列を決定するためには、支持媒体の中央部に配置する
のが好ましい。また、基準列は、−組のＤＮＡの特異的
切断分解物の組合わせにのみ適用されるものではなく、
同一種類のＤＮＡであれば、支持媒体上に分離展開され
た放射性標識物質群のそれぞれに適用することかできる
。

未発明においては、たとえば、（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の組
合わせを利用しても、ＤＮＡの塩基配列を決定すること
ができる。あるいは、少なくとも一群の塩特異的切断分
解物と適当な参照物質（たとえば、各塩特異的切断分解
物の混合物）との組合わせから、特定の塩基についての
配列を決定することも１１丁能である。

また、上記の例においては、支持媒体上で一次元的方向
に分離展開している五列の放射性標識物質群を用いて説
明したが、分離展開列は五列に限定されるものではなく
、五列より多くある場合には本発明の信号処理方法は特
に有効である。すなわち、本発明は、分１ＩＩＩＩ展開
方向のズレを基準列を中心として順々に補止しながら同
定を行なう方法であるため、分離展開列の数が多ければ
多いはと本発明は有効に利用されうるものである。ある
いはまた、同時番ｉｉ種類し、またそれ以下であっても
よい。あるいは、一つの支持媒体を用いて同時に二種類
以上のＤＮＡの塩基配列を決定することも可能である。

上記のような信号処理方法により決定されたＤＮＡの塩
基配列についての情報は、信号処理回路１０から出力さ
れたのち、次いで直接的に、もしくは必要により、磁気
テープなどの保存手段を介して記録装置（図示なし）へ
伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された記号・数値をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基ついた記
録装置を用いることができる。

なお、上記のようにして得られた情報は、このほかにも
、たとえば、既に記録保存されている他のＤＮＡｌ７）
塩基配列と照合するなどの遺伝言語学的情報処理を行な
うことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において感光材料上に記録された試料
中の放射性標識物質の位置情報を有するオートラジオグ
ラフを読み取るための読取装置の例を示すものである。 １、写真感光材料、２：透明ドラム、３：ミラー、４：
光源、５：光ビーム、６：レンズ、７：光電子増倍省、
８：増幅器、９：Ａ／Ｄ変換器、１０：信号処理回路 第２図は、ＤＮＡの塩基特異的切断分解物かゲル支持媒
体」二で分離展開された試料のオートラジオグラフの例
を示す図である。 第３図は、第２図のオートラジオグラフを部分的に拡大
した図である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　弁
理士　　　柳川泰男 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 第２図 第３図 ず １　、− ４ 手糸売ネ市正書 昭和５８年１月２５日 特許庁長官　　若杉和夫　殿 ２゜発明の名称 オートラジオグラフィーにおける信号処理法３゜補正を
する者 事件との関係　　　　特許出願人 住所　　　　（５２０）富士写真フィルム株式会社氏名
　　　　　代表基　大　西　　實 ４゜代理人 手続補正書 昭和ロ年ノＯ月ノ１日 粘′許庁長官　　若杉和夫殿 表示 昭和５８年　特許随筆１３３９　号 ２、発明の名称　　　オートラジオグラフィーにおける
信号処理法３　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 （Ｊ− 氏　　名（名称）　　　（５２０）　Ｎ士写真フィルム
株式会社人 明細書の「発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補正致
します。 記 一二岨旧り−−鰹融月紀一 （１）９頁１９行目　　従来の　　　　　　→　削除（
２）＋５頁１５行目　　放射線像変換　　　→　削除（
３）１８頁８行目　　蓄積性蛍光体シー　→　亙凰感Ｘ
材對１・ （４）２５頁１行目　　読出装置　　　　　→　読取装
置（５）２５頁２行目　　出すことにより、　−取）６
シヒに劣」よ（６）２５頁６行目　　輝尽光　　　　　
　−透過光（７）３０頁９行目　　３４ｍを内挿　　　
−互土亜（第互刀凡内挿３ｍ （９）３２頁１９行目　　ｍ　　　　　　　　　−”ｎ
（１０）３４頁１４行目　　塩物異的切断分解　→　塩
基特異的以瓶分解物物 （１１）３５頁１４行目　　塩物異的切断分解　→　塩
基特黒釣辺逝分解物物 （＋２）３５頁８行目　　各塩特異的切断分　→　芥塩
基笠黒的以逝分解解物　　　　　　　　　物 （＋３）３ｆ３頁１行目　　同時に二種類し、　→　玉
料以工またそれ以下 （１４）図　　面　　　第３図の補正図面を添付する。 以上 第３ 争 （− −

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■。ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基配列を決定
   するためのオートラジオグラフィーにおける信号処理法
   であって、放射性標識が・付与されたＤＮＡもしくはＤ
   ＮＡ部分分解物の特異的切断分解により得られた、 ■）グアニン特異的切断分解物、アテニン特異的９ノ断
   分解物、チミン特異的切断分解物、およびシトシン特異
   的切断分解物の四種類の塩基特異的切断分解物を含む切
   断分解物混合物、および、 ２）少なくとも一種類の塩基特異的切断分解物を含む塩
   基特異的切断分解物、 を含む少なくとも二指の切断分解物試料のそれぞれか、
   支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分＃展開され
   た放射性標識物質群の位置情報を有するオートラジオグ
   ラフを写真感光材料」二に記録したのち、該写真感光材
   料」−に可視化されたオートラジオグラフを光電的に読
   み取ることにより得られるそれぞれの分＃展開列のオー
   トラジオグラフに対応するデジタル信号について、ｉ）
   該四種類の塩基特異的切断分解物を含む切断分解物の分
   離展開列を基準列とし、この基準列について基準サンプ
   リング点を検出する工程、 １１）基準列以外の分離展開列についてサンプリング点
   を検出する工程、そして １１１）該基準列の基準サンプリング点を基準として隣
   接する分離展開列のサンプリング点の比較照合を行なう
   ことにより、その隣接する分離展開列のサンプリング点
   を同定する工程、を含むオートラジオグラフィーにおけ
   る信号処理法。 ２゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のオート
   ラジオグラフィーにおける信号処理法。 ３゜ＤＮＡもしくはＤ　Ｎ’Ａ部分分解物の塩基配列を
   決定するためのオートラジオグラフィーにおける信号処
   理法であって、放射性標識か伺与されたＤＮＡもしくは
   Ｉ）ＮＡ部分分解物の特異的切断分解により得られた、 １）グアニン特異的切断分解物、アデニン特異的ジノ断
   分解物、チミン特異的切断分解物、シトシン特異的切断
   分解物の四種類の切断分解物混合物、および、 ２）それぞれが互いに異なる少なくとも一種類の塩基特
   異的切断分解物を含む少なくとも二指の塩基特異的切断
   分解物、 を含む少なくとも二指の切断分解物試料のそれぞれが、
   支持媒体上に平行関係を以って一次元的に分離展開され
   た放射性標識物質群の位置情報を看するオートラジオグ
   ラフを写真感光材料」二に記録したのち、該写真感光材
   料上に可視化されたオートラジオグラフを光電的に読み
   取ることにより得られるそれぞれの分離展開列のオート
   ラジオグラフに対応するデジタル信号について。 １）該四種類の切断分解物混合物の分離展開列を基準列
   とし、この基準列について基準サンプリング点を検出す
   る工程、 爾）基準列以外の各分離展開列についてサンプリング点
   を検出する工程、 １１１）基準列の基準サンプリング点を基準として該基
   準夕１１に隣接する分離展開位置のサンプリング点の比
   較照合を行なうことにより、その隣接する分離展開列の
   サンプリング点を同定し、ここで同定されたサンプリン
   グ点に基づき新たに仮想的な基準サンプリング点を定め
   る］１程、 １ｖ）」−記の１１１）の工程において新たに定められ
   た基準サンプリング点と、その基準サンプリング点が定
   められた分離展開列に隣接する分離展開列のサンプリン
   グ点との比較照合を行なうことにより、その隣接する分
   離展開列のサンプリング点を同定する工程、 を含むオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ４゜ノ、（外型の両隣に、基準列以外の分＃展開列を配
   置し、」１記１ｉｉ）の工程を該両隣の分離展開列の双
   方について実施することを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理法
   。 ５゜サンプリング点が、複数の分離展開列のそれぞれの
   走査方向上のデジタル画像データに対して、スムージン
   グおよび／または閾値処理を行なうことにより検出され
   ることを特徴とする特許求の範囲第３項もしくは第４項
   記載のオートラジオグラフィーにおける信号処理法。 ６。ＤＮＡもしくはＤＮＡ部分分解物の塩基特異的切断
   分解物か、 ■）グアニン特異的切断分解物 ＋アデニン特異的切断分解物 ＋チミン特異的切断分解物 ＋シトシン特異的リＪ断分解物、 ２）グアニン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 ３）アデニン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 ４）チミン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分解
   物 ５）シトシン特異的切断分解物を含む塩基特異的切断分
   解物 からなる少なくとも三群の９ノ断分解物試料を含むるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３項乃至第５項のいす
   れかの項記載のオーｉ・ラジオクラフィーにおける信号
   処理法。