RS58367B1 - Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom - Google Patents

Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom

Info

Publication number
RS58367B1
RS58367B1 RS20190189A RSP20190189A RS58367B1 RS 58367 B1 RS58367 B1 RS 58367B1 RS 20190189 A RS20190189 A RS 20190189A RS P20190189 A RSP20190189 A RS P20190189A RS 58367 B1 RS58367 B1 RS 58367B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
maytansinoid
cell
mixture
cytotoxic agent
Prior art date
Application number
RS20190189A
Other languages
English (en)
Inventor
Xinfang Li
Jared M Worful
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Priority claimed from PCT/US2012/031243 external-priority patent/WO2012135517A2/en
Publication of RS58367B1 publication Critical patent/RS58367B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA POVEZANOST SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova patentna prijava zahteva prioritet od SAD privremene patentne prijave br.61/468,997, podnete 29. marta 2011, i SAD privremene patentne prijave br. 61/468,981, podnete 29. marta 2011.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Konjugati antitelo-lek (ADC) koji su korisni za lečenje kancera i drugih bolesti obično su sačinjeni od tri posebna elementa: sredstva koje se vezuje za ćeliju; linkera; i citotoksičnog sredstva. Uobičajeni postupak konjugovanja sredstva koje se vezuje za ćeliju, kao što je antitelo, za citotoksično sredstvo, uključuje dva odvojena koraka reakcije sa antitelom. U prvom koraku reakcije (korak modifikacije), antitelo reaguje sa heterobifunkcionalnim linkerom da bi se proizvelo antitelo modifikovano linkerom. Proizvod modifikovanog antitela se zatim opciono prečišćava od viška linkera ili hidrolizovanog linkera. U drugom koraku reakcije (korak konjugacije), antitelo modifikovano linkerom reaguje sa citotoksičnim sredstvom koje sadrži reaktivnu grupu, kao što je tiol, da bi se stvorio konjugat antitelo-citotoksično sredstvo, koji se ponovo prečišćava u dodatnom koraku prečišćavanja.
[0003] Prethodno opisani postupci za proizvodnju konjugata antitelo-citotoksično sredstvo su složeni zato što su opterećeni koracima koji su teški za izvođenje ili proizvode imunokonjugate koji su manje čisti ili manje stabilni nego što je to optimalno poželjno. Prema tome, bilo bi poželjno izmeniti ili ukloniti jedan ili više proizvodnih koraka uz istovremeno poboljšanje kvaliteta proizvoda, kao što je čistoća i/ili stabilnost.
[0004] S obzirom na gore navedeno, postoji potreba u stanju tehnike za razvijanjem poboljšanih postupaka za pripremu konjugata sredstvo koje se vezuje za ćeliju-citotoksično sredstvo koji su suštinski visoke čistoće i mogu da se pripreme izbegavajući korake teške za izvođenje i redukovanjem potrebnog vremena i troškova za korisnika. Pronalazak obezbeđuje takav postupak. Ove i druge prednosti pronalaska, kao i dodatne inventivne karakteristike, biće očigledne iz opisa pronalaska koji je dat u ovom tekstu.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] Pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva tj., konjugata antitela i majtanzinoida koji obuhvata korak dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo, a zatim dovođenja u kontakt prve smeše koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom koji sadrži linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila smeša koja sadrži (i) konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, gde je sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno preko linkera sa citotoksičnim sredstvom, (ii) slobodno citotoksično sredstvo, i (iii) sporedne proizvode reakcije. Postupak može dalje da obuhvata korak prečišćavanja smeše da bi se dobio prečišćeni konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva.
[0006] Postupci prema predmetnom pronalasku obezbeđuju konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva visoke čistoće i/ili stabilnosti. Da bi se postigla visoka čistoća i/ili stabilnost konjugata, od suštinskog je značaja da se citotoksično sredstvo prvo dovede u kontakt sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju da bi se obrazovala smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo pre nego što se smeša dovede u kontakt sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom.
[0007] Predmetni pronalazak takođe uključuje konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva pripremljen prema postupcima koji su ovde opisani.
[0008] Na osnovu opisa koji je sadržan u ovom dokumentu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu konjugata antitela i majtanzinoida koji obuhvata korak: (a) dovođenja u kontakt antitela sa majtanzinoidom da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži antitelo i majtanzinoid, zatim dovođenja u kontakt prve smeše sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom koji sadrži linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila druga smeša koja sadrži (i) konjugat antitela i majtanzinoida, pri čemu je antitelo hemijski spojeno preko linkera sa majtanzinoidom, (ii) slobodni majtanzinoid i (iii) sporedne proizvode reakcije.
[0009] Predmetni pronalazak i njegovi primeri izvođenja prikazani su u priloženim patentnim zahtevima.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0010] Pronalazak obezbeđuje jednostepeni postupak za pripremu konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva tj., konjugata antitela i majtanzinoida. Postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju (tj., antitela) sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo, i zatim dovođenja u kontakt prve smeše koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom koji sadrži linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila druga smeša koja sadrži konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, slobodno citotoksično sredstvo i sporedne proizvode reakcije, pri čemu je sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno preko linkera sa citotoksičnim sredstvom. Druga smeša se zatim podvrgava prečišćavanju da bi se dobio prečišćeni konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva.
[0011] U jednom primeru izvođenja, dovođenje u kontakt se obavlja obezbeđivanjem sredstva koje se vezuje za ćeliju, zatim dovođenjem u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim sredstvom da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo, i zatim dovođenja u kontakt prve smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom. Na primer, u jednom primeru izvođenja, sredstvo koje se vezuje za ćeliju se stavlja u reakcionu posudu, citotoksično sredstvo se dodaje u reakcionu posudu (čime se dovodi u kontakt sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju), a zatim se bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens dodaje u smešu koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo (čime se dovodi u kontakt sa smešom koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo). U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje se vezuje za ćeliju se stavlja u reakcionu posudu, i citotoksično sredstvo se dodaje u reakcionu posudu odmah nakon stavljanja sredstva koje se vezuje za ćeliju u posudu. U drugom primeru izvođenja, sredstvo koje se vezuje za ćeliju se stavlja u reakcionu posudu, i citotoksično sredstvo se dodaje u reakcionu posudu nakon vremenskog intervala koji sledi posle stavljanja sredstva koje se vezuje za ćeliju u posudu (npr., oko 5 minuta, oko 10 minuta, oko 20 minuta, oko 30 minuta, oko 40 minuta, oko 50 minuta, oko 1 čas, oko 1 dan ili duže nakon sipanja sredstva koje se vezuje za ćeliju u posudu). Citotoksično sredstvo može da se doda brzo (tj., tokom kratkog vremenskog intervala, kao što je oko 5 minuta, oko 10 minuta) ili polako (na primer upotrebom pumpe).
[0012] Smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo može zatim da se dovede u kontakt sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom ili odmah nakon dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim sredstvom ili u nekoj kasnijoj tački (npr., oko 5 minuta do oko 8 časova ili duže) posle dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim sredstvom. Na primer, u jednom primeru izvođenja, bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens se dodaje u smešu koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo odmah posle dodavanja citotoksičnog sredstva u reakcionu posudu koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju. Alternativno, smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo može da se dovede u kontakt sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom na oko 5 minuta, oko 10 minuta, oko 20 minuta, oko 30 minuta, oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, oko 4 časa, oko 5 časova, oko 6 časova, oko 7 časova, oko 8 časova, ili duže posle dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim sredstvom.
[0013] U drugom primeru izvođenja, citotoksično sredstvo i bifunkcionalno sredstvo se dodaju kroz više ciklusa (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili više ciklusa). Na primer, pronalazak obezbeđuje postupak koji obuhvata korake: a) dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo; i zatim dovođenja u kontakt prve smeša sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom koji sadrži linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila druga smeša koja sadrži konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, slobodno citotoksično sredstvo, i sporedne proizvode reakcije, pri čemu je sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno preko linkera sa citotoksičnim sredstvom; b) dovođenja u kontakt druge smeše sa citotoksičnim sredstvom da bi se obrazovala treća smeša; i zatim dovođenja u kontakt treće smeše sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom na pH od 4 do 9 da bi se dobila četvrta smeša; i c) prečišćavanja četvrte smeše da bi se dobio prečišćeni konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva. U jednom primeru izvođenja, korak b) se izvodi posle vremenskog intervala (npr., oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa ili duže) nakon koraka a). U drugom primeru izvođenja, korak b) može da se ponavlja nekoliko puta (npr., 1, 2, 3, 4 ili više puta) pre izvođenja koraka c). Dodatni korak b) može da se izvede posle vremenskog intervala (npr., oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa ili duže) nakon polaznog koraka b).
[0014] U drugom primeru izvođenja, bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens se dodaje pre završenog dodavanja citotoksičnog sredstva. Na primer, u jednom primeru izvođenja, citotoksično sredstvo se dodaje sredstvu koje se vezuje za ćeliju neprekidno tokom vremenskog perioda (npr., tokom oko 5 minuta, oko 10 minuta, oko 30 minuta, oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, ili duže) da bi se obrazovala smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo. Pre završetka dodavanja citotoksičnog sredstva, bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens se dodaje smeši koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo, pod uslovom da je u bilo koje vreme citotoksično sredstvo u molarnom višku u odnosu na bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens. U jednom primeru izvođenja, bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens se dodaje neprekidno tokom vremenskog perioda (npr., tokom oko 5 minuta, oko 10 minuta, oko 30 minuta, oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, ili duže).
[0015] Nakon što se smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo dovede u kontakt sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom, reakcija se ostavlja da se odvija oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, oko 4 časa, oko 5 časova, oko 6 časova, oko 7 časova, oko 8 časova, oko 9 časova, oko 10 časova, oko 11 časova, oko 12 časova, oko 13 časova, oko 14 časova, oko 15 časova, oko 16 časova, oko 17 časova, oko 18 časova, oko 19 časova, oko 20 časova, oko 21 čas, oko 22 časa, oko 23 časa, oko 24 časa, ili duže (npr., oko 30 časova, oko 35 časova, oko 40 časova, oko 45 časova, ili oko 48 časova).
[0016] Dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim sredstvom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom (tj., reakcioni korak) odvija se u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 (npr., 4, oko 4,5, oko 5, oko 5,5, oko 6, oko 6,5, oko 7, oko 7,5, oko 8, oko 8,5, ili 9). U jednom primeru izvođenja, reakcioni korak se odvija u rastvoru koji ima pH od oko 6 ili manje (npr., 4 do oko 6, 4 do oko 5,5, ili oko 4,5 do oko 5,5).
[0017] U drugom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom, a zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom u rastvoru koji ima pH od oko 6 ili više (npr., oko 6 do 9, oko 6 do oko 7, oko 7 do 9, oko 7 do oko 8,5, oko 7,5 do oko 8,5, oko 7,5 do oko 8,0, oko 8,0 do 9,0, ili oko 8,5 do 9,0). Na primer, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom u rastvoru koji ima pH od oko 6,0, oko 6,1, oko 6,2, oko 6,3, oko 6,4, oko 6,5, oko 6,6, oko 6,7, oko 6,8, oko 6,9, oko 7,0, oko 7,1, oko 7,2, oko 7,3, oko 7,4, oko 7,5, oko 7,6, oko 7,7, oko 7,8, oko 7,9, oko 8,0, oko 8,1, oko 8,2, oko 8,3, oko 8,4, oko 8,5, oko 8,6, oko 8,7, oko 8,8, oko 8,9, ili 9,0. U specifičnom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom u rastvoru koji ima pH od oko 7,8 (npr., pH od 7,6 do 8,0 ili pH od 7,7 do 7,9).
[0018] Inventivni postupak obuhvata izvođenje jednostepene reakcije (tj., dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom) na bilo kojoj pogodnoj temperaturi poznatoj u stanju tehnike. Na primer, jednostepena reakcija može da se odvija na oko 20 °C ili manje (npr., oko -10° C (pod uslovom da je sprečeno zamrzavanje rastvora, npr., pomoću prisustva organskog rastvarača korišćenog za rastvaranje citotoksičnog sredstva i bifunkcionalnog unakrsno-vezujućeg reagensa) do oko 20 °C, oko 0 °C do oko 18 °C, oko 4 °C do oko 16 °C), na sobnoj temperaturi (npr., oko 20 °C do oko 30 °C ili oko 20 °C do oko 25 °C), ili na povišenoj temperaturi (npr., oko 30 °C do oko 37 °C). U jednom primeru izvođenja, dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom se odvija na temperaturi od oko 16 °C do oko 24 °C (npr., oko 16 °C, oko 17 °C, oko 18 °C, oko 19 °C, oko 20 °C, oko 21 °C, oko 22 °C, oko 23 °C, oko 24 °C, ili oko 25 °C).
[0019] U drugom primeru izvođenja, dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom se odvija na temperaturi od oko 15 °C ili manje (npr., oko -10 °C do oko 15 °C, ili oko 0 °C do oko 15 °C). U ovom pogledu, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom na temperaturi od oko 15 °C, oko 14 °C, oko 13 °C, oko 12 °C, oko 11 °C, oko 10 °C, oko 9 °C, oko 8 °C, oko 7 °C, oko 6 °C, oko 5 °C, oko 4 °C, oko 3 °C, oko 2 °C, oko 1 °C, oko 0 °C, oko -1 °C, oko -2 °C, oko -3 °C, oko -4 °C, oko -5 °C, oko -6 °C, oko -7 °C, oko -8 °C, oko -9 °C, ili oko -10 °C, pod uslovom da je sprečeno zamrzavanje rastvora, npr., pomoću prisustva organskog/organskih rastvarača korišćenih za rastvaranje bifunkcionalnog unakrsno-vezujućeg reagensa. U jednom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom na temperaturi od oko -10 °C do oko 15 °C, oko 0 °C do oko 15 °C, oko 0 °C do oko 10 °C, oko 0 °C do oko 5 °C, oko 5 °C do oko 15 °C, oko 10 °C do oko 15 °C, ili oko 5 °C do oko 10 °C. U drugom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom na temperaturi od oko 10 °C (npr., na temperaturi od 8 °C do 12 °C ili na temperaturi od 9 °C do 11 °C).
[0020] U jednom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom u rastvoru koji ima visok pH (npr., oko 7 ili veći) na niskoj temperaturi (npr., oko 15 °C ili nižoj). Na primer, u jednom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom u rastvoru koji ima pH od oko 7,5 na temperaturi od oko 15 °C, u rastvoru koji ima pH od oko 7,8 na temperaturi od oko 10 °C, u rastvoru koji ima pH oko 8,2 na temperaturi od oko 0° C, ili u rastvoru koji ima pH oko 8,5 na temperaturi od oko 0° C. U drugom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom u rastvoru koji ima pH od 7,0 do 8,5 (npr., pH od 7,5 do 8,0) na temperaturi od 5 °C do 15 °C.
[0021] U jednom primeru izvođenja, inventivni postupak dalje obuhvata korak gašenja da bi se ugasilo svo neizreagovano citotoksično sredstvo i/ili neizreagovani bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens. Korak gašenja se izvodi pre prečišćavanja konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva. Na primer, inventivni postupak obuhvata (a) dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom, da bi se obrazovala smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo i zatim dovođenja u kontakt smeše koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom koji sadrži linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila smeša koja sadrži (i) konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, pri čemu je sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno preko linkera sa citotoksičnim sredstvom, (ii) slobodno citotoksično sredstvo, i (iii) sporedne proizvode reakcije, (b) gašenje smeše pripremljene u koraku (a) da bi se ugasilo svo neizreagovano citotoksično sredstvo i/ili neizreagovani bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens, i (c) prečišćavanje smeše da bi se dobio prečišćeni konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva.
[0022] U jednom primeru izvođenja, smeša se gasi dovođenjem u kontakt smeše sa reagensom za gašenje. Kako se ovde koristi, „reagens za gašenje“ se odnosi na reagens koji reaguje sa slobodnim citotoksičnim sredstvom i/ili bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom.
[0023] U jednom primeru izvođenja, reagensi za gašenje na bazi maleimida ili haloacetamida, kao što je 4-maleimidobuterna kiselina, 3-maleimidopropionska kiselina, N-etilmaleimid, jodoacetamid, ili jodoacetamidopropionska kiselina, mogu da se koriste da bi se osiguralo da se bilo koja neizreagovana grupa (kao što je tiol) u citotoksičnom sredstvu ugasi. Korak gašenja može da pomogne u sprečavanju dimerizacije citotoksičnog sredstva, posebno citotoksičnog sredstva koje ima neizreagovanu grupu tiola (kao što je DM1). Uklanjanje dimerizovanog citotoksičnog sredstva može da bude teško. Korak gašenja može takođe da svede na minimum bilo kakve neželjene reakcije uzajamnog dejstva tiol-disulfid sa disulfidnim grupama nativnog antitela. Pri gašenju sa polarnim, naelektrisanim reagensima za gašenje na bazi tiola (kao što je 4-maleimidobuterna kiselina ili 3-maleimidopropionska kiselina), višak, neizreagovano citotoksično sredstvo se prevodi u polarni, naelektrisani adukt rastvorljiv u vodi, koji može lako da se razdvoji od kovalentno-vezanog konjugata tokom koraka prečišćavanja. Gašenje nepolarnim i neutralnim reagensima za gašenje tiola može takođe da se primeni.
[0024] U jednom primeru izvođenja, smeša se gasi dovođenjem u kontakt smeše sa reagensom za gašenje koji reaguje sa neizreagovanim bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom. Na primer, nukleofili mogu da se dodaju u smešu da bi se ugasio sav neizreagovani bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens. Nukleofil je poželjno amino grupa koja sadrži nukleofil, kao što je lizin, taurin i hidroksilamin.
[0025] U poželjnom primeru izvođenja, reakcija (tj., dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom) se ostavlja da se odvija do završetka pre dovođenja u kontakt smeše sa reagensom za gašenje. U tom pogledu, reagens za gašenje se dodaje u smešu oko 1 čas do oko 48 časova (npr., oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, oko 4 časa, oko 5 časova, oko 6 časova, oko 7 časova, oko 8 časova, oko 9 časova, oko 10 časova, oko 11 časova, oko 12 časova, oko 13 časova, oko 14 časova, oko 15 časova, oko 16 časova, oko 17 časova, oko 18 časova, oko 19 časova, oko 20 časova, oko 21 čas, oko 22 časa, oko 23 časa, oko 24 časa, ili oko 25 časova do oko 48 časova) posle dovođenja u kontakt smeše koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom.
[0026] Inventivni postupak može opciono da uključuje dodavanje saharoze u reakcionom koraku (tj., koraku dovođenja u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom) da bi se povećala rastvorljivost i oporavak konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva. Poželjno, saharoza se dodaje u koncentraciji od oko 0,1% (tež./zapr.) do oko 20% (tež./zapr.) (npr., oko 0,1% (tež./zapr.), 1% (tež./zapr.), 5% (tež./zapr.), 10% (tež./zapr.), 15% (tež./zapr.), ili 20% (tež./zapr.)). Poželjno, saharoza se dodaje u koncentraciji od oko 1% (tež./zapr.) do oko 10% (tež./zapr.) (npr., oko 0,5% (tež./zapr.), oko 1% (tež./zapr.), oko 1,5% (tež./zapr.), oko 2% (tež./zapr.), oko 3% (tež./zapr.), oko 4% (tež./zapr.), oko 5% (tež./zapr.), oko 6% (tež./zapr.), oko 7% (tež./zapr.), oko 8% (tež./zapr.), oko 9% (tež./zapr.), oko 10% (tež./zapr.), ili oko 11% (tež./zapr.)). Pored toga, reakcioni korak može da obuhvata i dodavanje puferskog sredstva. Može da se koristi bilo koje pogodno pufersko sredstvo poznato u stanju tehnike. Pogodna puferska sredstva uključuju, na primer, citratni pufer, acetatni pufer, sukcinatni pufer i fosfatni pufer. U jednom primeru izvođenja, pufersko sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od HEPPSO (N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-(2-hidroksipropansulfonska kiselina)), POPSO (piperazin-1,4-bis-(2-hidroksi-propan-sulfonska kiselina) dehidrat), HEPES (4-(2-hidroksietil) piperazin-1-etansulfonska kiselina), HEPPS (EPPS) (4-(2-hidroksietil) piperazin-1-propansulfonska kiselina), TES (N-[tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoetansulfonska kiselina) i njihove kombinacije.
[0027] Nakon reakcionog koraka, konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva podvrgava se koraku prečišćavanja. U tom pogledu, konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva može da se prečisti od drugih komponenti smeše (npr., slobodnog citotoksičnog sredstva i sporednih proizvoda reakcije) upotrebom filtracije tangencijalnim protokom (TFF), koja predstavlja postupak filtracije tangencijalnim protokom na bazi membrane, neadsorpcione hromatografije, adsorpcione hromatografije, adsorpcione filtracije, selektivne precipitacije, ili bilo kog drugog pogodnog postupka prečišćavanja, kao i njihovih kombinacija. U jednom primeru izvođenja pronalaska, konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva prečišćava se upotrebom jednog koraka prečišćavanja (npr., TFF). Poželjno, konjugat se prečišćava i prevodi u odgovarajuću formulaciju upotrebom jednog koraka prečišćavanja (npr., TFF). U drugom primeru izvođenja pronalaska, konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva prečišćava se upotrebom dva uzastopna koraka prečišćavanja. Na primer, konjugat može prvo da se prečisti pomoću selektivne precipitacije, adsorpcione filtracije, apsorpcione hromatografije ili neapsorpcione hromatografije, praćene prečišćavanjem pomoću TFF. Stručnjak sa prosečnim znanjem u ovoj oblasti će znati da prečišćavanje konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva omogućava izdvajanje stabilnog konjugata koji sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno sa citotoksičnim sredstvom.
[0028] Bilo koji pogodni sistemi za TFF mogu da se koriste za prečišćavanje, uključujući sistem tipa Pellicon (Millipore, Billerica, MA), kasetni sistem Sartocon (Sartorius AG, Edgewood, NY), i sistem tipa Centrasette (Pall Corp., East Hills, NY).
[0029] Bilo koja pogodna smola za adsorpcionu hromatografiju može da se koristi za prečišćavanje. Poželjne smole za adsorpcionu hromatografiju uključuju hidroksiapatitnu hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju sa indukcijom naelektrisanja (HCIC), hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom (HIC), jonoizmenjivačku hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju sa kombinovanim režimom, afinitetnu hromatografiju sa imobilizovanim metalom (IMAC), ligandnu hromatografiju sa bojom, afinitetnu hromatografiju, hromatografiju reverzne faze, i njihove kombinacije. Primeri pogodnih hidroksiapatitnih smola uključuju keramički hidroksiapatit (CHT tipa I i tipa II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), hidroksiapatit HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY) i keramički fluoroapatit (CFT tipa I i tipa II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primer pogodne smole za HCIC je smola MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, NY). Primeri pogodnih smola za HIC uključuju butil-sefarozne, heksil-sefarozne, fenil-sefarozne i oktil-sefarozne smole (sve od GE Healthcare, Piscataway, NJ), kao i Macro-prep metil i Macro-Prep t-butil smole (Biorad Laboratories, Hercules, CA). Primeri pogodnih jonoizmenjivačkih smola uključuju smole SP-Sefaroza, CM-Sefaroza i Q-Sefaroza (sve od GE Healthcare, Piscataway, NJ), i smolu Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primeri pogodnih jonoizmenjivača sa kombinovanim režimom uključuju smolu Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg NJ). Primeri pogodnih smola za IMAC uključuju helatnu sefaroznu smolu (GE Healthcare, Piscataway, NJ) i smolu Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primeri pogodnih ligandnih smola sa bojom uključuju plavu sefaroznu smolu (GE Healthcare, Piscataway, NJ) i Affi-gel plavu smolu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primeri pogodnih afinitetnih smola uključuju Protein A sefaroznu smolu (npr., MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), pri čemu je sredstvo koje se vezuje za ćeliju antitelo, i lektin-afinitetne smole, npr. lektin-sefarozna smola Lentil (GE Healthcare, Piscataway, NJ), pri čemu sredstvo koje se vezuje za ćeliju nosi odgovarajuća lektin-vezujuća mesta. Alternativno može da se koristi antitelo specifično za sredstvo koje se vezuje za ćeliju. Takvo antitelo može da bude imobilizovano na, na primer, smoli Sefaroza 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Primeri pogodnih smola reverzne faze uključuju smole C4, C8 i C18 (Grace Vydac, Hesperia, CA).
[0030] Bilo koja pogodna neadsorpciona hromatografska smola može da se koristi za prečišćavanje. Primeri pogodnih neadsorpcionih hromatografskih smola uključuju, ali nisu ograničeni na, SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL™ smole (npr., S-200 i S-300), SUPERDEX™ smole (npr., SUPERDEX™ 75 i SUPERDEX™ 200), BIO-GEL® smole (npr., P-6, P-10, P-30, P-60 i P-100), i druge poznate stručnjacima sa prosečnim znanjem u ovoj oblasti.
[0031] U jednom primeru izvođenja, inventivni postupak dalje obuhvata korak zadržavanja reakcije za oslobađanje nestabilno vezanih linkera sa sredstva koje se vezuje za ćeliju. Korak zadržavanja reakcije obuhvata zadržavanje smeše pre prečišćavanja konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva (npr., posle koraka reakcije, između koraka reakcije i koraka gašenja, ili posle koraka gašenja). Na primer, inventivni postupak obuhvata (a) dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom da bi se obrazovala smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo; i zatim dovođenja u kontakt smeše koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom, koje obezbeđuje linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila smeša koja sadrži (i) konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, pri čemu je sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno preko linkera sa citotoksičnim sredstvom, (ii) slobodno citotoksično sredstvo, i (iii) sporedne proizvode reakcije, (b) zadržavanje smeše pripremljene u koraku (a) da bi se oslobodili nestabilno vezani linkeri sa sredstva koje se vezuje za ćeliju, i (c) prečišćavanje smeše da bi se dobio prečišćeni konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva.
[0032] U drugom primeru izvođenja, inventivni postupak obuhvata (a) dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom da bi se obrazovala smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo; i zatim dovođenja u kontakt smeše koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom, koji obezbeđuje linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila smeša koja sadrži (i) konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, pri čemu je sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeno preko linkera sa citotoksičnim sredstvom, (ii) slobodno citotoksično sredstvo, i (iii) sporedne proizvode reakcije, (b) gašenje smeše pripremljene u koraku (a) da bi se ugasilo svo neizreagovano citotoksično sredstvo i/ili neizreagovani bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens, (c) zadržavanja smeše pripremljene u koraku (b) da bi se oslobodili nestabilno vezani linkeri sa sredstva koje se vezuje za ćeliju, i (d) prečišćavanja smeše da bi se dobio prečišćeni konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva.
[0033] Alternativno, korak zadržavanja može da se sprovede posle prečišćavanja konjugata sredstvo koje se vezuje za ćeliju-citotoksično sredstvo, praćen dodatnim korakom prečišćavanja.
[0034] U poželjnom primeru izvođenja, reakcija (tj., dovođenje u kontakt sredstva koje se vezuje za ćeliju tj., antitela sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom i zatim sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom) se ostavlja da se odvija do završetka pre koraka zadržavanja reakcije. U tom pogledu, korak zadržavanja reakcije može da se sprovede oko 1 čas do oko 48 časova (npr., oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, oko 4 časa, oko 5 časova, oko 6 časova, oko 7 časova, oko 8 časova, oko 9 časova, oko 10 časova, oko 11 časova, oko 12 časova, oko 13 časova, oko 14 časova, oko 15 časova, oko 16 časova, oko 17 časova, oko 18 časova, oko 19 časova, oko 20 časova, oko 21 čas, oko 22 časa, oko 23 časa, oko 24 časa, ili oko 24 časa do oko 48 časova) nakon što se smeša koja sadrži sredstvo koje se vezuje za ćeliju i citotoksično sredstvo dovede u kontakt sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom.
[0035] Korak zadržavanja reakcije obuhvata održavanje rastvora na pogodnoj temperaturi (npr., oko 0 °C do oko 37 °C) tokom pogodnog perioda vremena (npr., oko 1 čas do oko 1 nedelje, oko 1 čas do oko 24 časa, oko 1 čas do oko 8 časova, ili oko 1 čas do oko 4 časa) da bi se oslobodili nestabilno vezani linkeri sa sredstva koje se vezuje za ćeliju, a da se u isto vreme suštinski ne oslobode stabilno vezani linkeri sa sredstva koje se vezuje za ćeliju. U jednom primeru izvođenja, korak zadržavanja obuhvata održavanje rastvora na oko 20 °C ili manje (npr., oko 0 °C do oko 18 °C, oko 4 °C do oko 16 °C), na sobnoj temperaturi (npr., oko 20 °C do oko 30 °C ili oko 20 °C do oko 25 °C), ili na povišenoj temperaturi (npr., oko 30 °C do oko 37 °C). U jednom primeru izvođenja, korak zadržavanja obuhvata održavanje rastvora na temperaturi od oko 16 °C do oko 24 °C (npr., oko 15 °C, oko 16 °C, oko 17 °C, oko 18 °C, oko 19 °C, oko 20 °C, oko 21 °C, oko 22 °C, oko 23 °C, oko 24 °C, ili oko 25 °C). U drugom primeru izvođenja, korak zadržavanja obuhvata održavanje rastvora na temperaturi od oko 2 °C do oko 8 °C (npr., oko 0 °C, oko 1 °C, oko 2 °C, oko 3 °C, oko 4 °C, oko 5 °C, oko 6 °C, oko 7 °C, oko 8 °C, oko 9 °C, ili oko 10 °C). U drugom primeru izvođenja, korak zadržavanja obuhvata održavanje rastvora na temperaturi od oko 37 °C (npr., oko 34 °C, oko 35 °C, oko 36 °C, oko 37 °C, oko 38 °C, oko 39 °C, ili oko 40 °C).
[0036] Trajanje koraka zadržavanja zavisi od temperature i pH na kome se korak zadržavanja sprovodi. Na primer, trajanje koraka zadržavanja može suštinski da se skrati izvođenjem koraka zadržavanja na povišenoj temperaturi, sa maksimalnom temperaturom ograničenom stabilnošću konjugata sredstvo koje se vezuje za ćeliju-citotoksično sredstvo. Korak zadržavanja može da obuhvata održavanje rastvora tokom oko 1 časa do oko 1 dana (npr., oko 1 čas, oko 2 časa, oko 3 časa, oko 4 časa, oko 5 časova, oko 6 časova, oko 7 časova, oko 8 časova, oko 9 časova, oko 10 časova, oko 12 časova, oko 14 časova, oko 16 časova, oko 18 časova, oko 20 časova, oko 22 časa, ili oko 24 časa), oko 10 časova do oko 24 časa, oko 12 časova do oko 24 časa, oko 14 časova do oko 24 časa, oko 16 časova do oko 24 časa, oko 18 časova do oko 24 časa, oko 20 časova do oko 24 časa, oko 5 časova do oko 1 nedelje, oko 20 časova do oko 1 nedelje, oko 12 časova do oko 1 nedelje (npr., oko 12 časova, oko 16 časova, oko 20 časova, oko 24 časa, oko 2 dana, oko 3 dana, oko 4 dana, oko 5 dana, oko 6 dana, ili oko 7 dana), ili oko 1 dan do oko 1 nedelje.
[0037] U jednom primeru izvođenja, korak zadržavanja obuhvata održavanje rastvora na temperaturi od oko 2 °C do oko 8 °C tokom perioda od najmanje oko 12 časova do nedelju dana. U drugom primeru izvođenja, korak zadržavanja obuhvata održavanje rastvora na temperaturi od oko 2 °C do oko 8 °C preko noći (npr., oko 12 do oko 24 časa, poželjno oko 20 časova).
[0038] Vrednost pH za korak zadržavanja reakcije poželjno je oko 4 do oko 10. U jednom primeru izvođenja, pH vrednost za korak zadržavanja reakcije je oko 4 ili više, ali manje od oko 6 (npr., 4 do 5,9) ili oko 5 ili više, ali manje od oko 6 (npr., 5 do 5,9). U drugom primeru izvođenja, pH vrednosti za korak zadržavanja reakcije nalaze se u opsegu od oko 6 do oko 10 (npr., oko 6,5 do oko 9, oko 6 do oko 8). Na primer, pH vrednosti za korak zadržavanja reakcije mogu da budu oko 6, oko 6,5, oko 7, oko 7,5, oko 8, oko 8,5, oko 9, oko 9,5, ili oko 10.
[0039] U specifičnim primerima izvođenja, korak zadržavanja reakcije može da obuhvata inkubiranje smeše na 25 °C na pH od oko 6-7,5 tokom oko 12 časova do oko 1 nedelje, inkubiranje smeše na 4 °C na pH od oko 4,5-5,9 tokom oko 5 časova do oko 5 dana, ili inkubiranje smeše na 25 °C na pH od oko 4,5-5,9 tokom oko 5 časova do oko 1 dan.
[0040] Pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu kompozicija stabilnih konjugata koje sadrže sredstvo koje se vezuje za ćeliju tj., antitelo hemijski spojeno sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom pri čemu su kompozicije suštinski bez nestabilnih konjugata. U ovom pogledu, pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva suštinski visoke čistoće i stabilnosti. Takve kompozicije mogu da se koriste za lečenje bolesti zbog visoke čistoće i stabilnosti konjugata. Kompozicije koje sadrže sredstvo koje se vezuje za ćeliju, kao što je antitelo, hemijski spojeno sa citotoksičnim sredstvom, kao što je majtanzinoid, opisane su u, na primer, SAD patentu 7,374,762. U jednom aspektu pronalaska, konjugat sredstvo koje se vezuje za ćeliju-citotoksično sredstvo suštinski visoke čistoće ima jedno ili više od sledećih svojstava: (a) više od oko 90% (npr., više od, ili jednako sa oko 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%), poželjno više od oko 95%, vrsta konjugata su monomerne, (b) nivo nekonjugovanog linkera u preparatu konjugata je manji od oko 10% (npr., manji od, ili jednak sa oko 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili 0%) (u odnosu na ukupni linker), (c) manje od 10% vrsta konjugata je unakrsno vezano (npr., manje od, ili jednako sa oko 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili 0%), (d) nivo slobodnog citotoksičnog sredstva u preparatu konjugata je manji od oko 2% (npr., manji od, ili jednak sa oko 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0.1%, ili 0%) (mol/mol u odnosu na ukupno citotoksično sredstvo) i/ili (e) nema suštinskog povećanja nivoa slobodnog citotoksičnog sredstva nakon skladištenja (npr., posle oko 1 nedelje, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 1 meseca, oko 2 meseca, oko 3 meseca, oko 4 meseca, oko 5 meseci, oko 6 meseci, oko 1 godine, oko 2 godine, oko 3 godine, oko 4 godine, ili oko 5 godina). „Suštinsko povećanje“ nivoa slobodnog citotoksičnog sredstva znači da posle određenog vremena skladištenja (npr., oko 1 nedelje, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 1 mesec, oko 2 meseca, oko 3 meseca, oko 4 meseca, oko 5 meseci, oko 6 meseci, oko 1 godine, oko 2 godine, oko 3 godine, oko 4 godine, ili oko 5 godina), povećanje nivoa slobodnog citotoksičnog sredstva je manje od oko 0,1%, oko 0,2%, oko 0,3%, oko 0,4%, oko 0,5%, oko 0,6%, oko 0,7%, oko 0,8%, oko 0,9%, oko 1,0%, oko 1,1%, oko 1,2%, oko 1,3%, oko 1,4%, oko 1,5%, oko 1,6%, oko 1,7%, oko 1,8%, oko 1,9%, oko 2,0%, oko 2,2%, oko 2,5%, oko 2,7%, oko 3,0%, oko 3,2%, oko 3,5%, oko 3,7%, ili oko 4,0%.
[0041] Kako se ovde koristi, izraz „nekonjugovani linker“ se odnosi na sredstvo koje se vezuje za ćeliju koje je kovalentno vezano sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom, pri čemu sredstvo koje se vezuje za ćeliju nije kovalentno vezano za citotoksično sredstvo preko linkera bifunkcionalnog unakrsno-vezujućeg reagensa (tj., „nekonjugovani linker“ može da bude predstavljen kao CBA-L, gde CBA predstavlja sredstvo koje se vezuje za ćeliju i L predstavlja bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens. Nasuprot tome, konjugat sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva može da bude predstavljen kao CBA-L-D, gde D predstavlja citotoksično sredstvo).
[0042] U jednom primeru izvođenja, prosečni molarni odnos citotoksičnog sredstva prema sredstvu koje se vezuje za ćeliju u konjugatu sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva je oko 1 do oko 10, oko 2 do oko 7, oko 3 do oko 5, oko 2,5 do oko 4,5 (npr., oko 2,5, oko 2,6, oko 2,7, oko 2,8, oko 2,9, oko 3,0, oko 3,1, oko 3,3, oko 3,4, oko 3,5, oko 3,6, oko 3,7, oko 3,8, oko 3,9, oko 4,0, oko 4,1, oko 4,2, oko 4,3, oko 4,4, oko 4,5), oko 3,0 do oko 4,0, oko 3,2 do oko 4,2, ili oko 4,5 do 5,5 (npr., oko 4,5, oko 4,6, oko 4,7, oko 4,8, oko 4,9, oko 5,0, oko 5,1, oko 5,2, oko 5,3, oko 5,4, ili oko 5,5).
[0043] Predmetni pronalazak obezbeđuje efikasniji postupak za pripremu kompozicije stabilnih konjugata koji obuhvataju sredstvo koje se vezuje za ćeliju tj., antitelo hemijski spojeno sa citotoksičnim sredstvom tj., majtanzinoidom. U jednom primeru izvođenja, u poređenju sa tradicionalnim postupcima za pripremu konjugata sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva, potrebna je manja količina citotoksičnog sredstva za postizanje istog prosečnog molarnog odnosa citotoksičnog sredstva i sredstva koje se vezuje za ćeliju za konjugate.
[0044] Pogodna sredstva koja se vezuju za ćelije uključuju antitela (npr., monoklonska antitela i njihove fragmente).
[0045] Kada je sredstvo koje se vezuje za ćeliju antitelo, ono se vezuje za antigen koji je polipeptid ili glikotop i može da bude transmembranski molekul (npr., receptor) ili ligand kao što je faktor rasta. Primeri antigena uključuju molekule kao što je renin; hormon rasta, uključujući humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; faktor oslobađanja hormona rasta; paratiroidni hormon; tireostimulišući hormon; lipoproteini; alfa-1-antitripsin; insulinski A-lanac; insulinski B-lanac; proinsulin; folikulostimulišući hormon; kalcitonin; luteinizirajući hormon; glukagon; faktori zgrušavanja kao što je faktor vmc, faktor IX, tkivni faktor (TF) i „fon Vilebrandov“ faktor; faktori protiv zgrušavanja kao što je protein C; atrijalni natriuretski faktor; plućni surfaktant; aktivator plazminogena, kao što je urokinaza ili humani urinarni aktivator plazminogena ili tkivni tip aktivatora plazminogena (t-PA); bombezin; trombin; hematopoezni faktor rasta; faktor nekroze tumora-alfa i -beta; enkefalinaza; RANTES (hemokini koji su regulisani nakon aktivacije, i eksprimirani i sekretovani od strane normalnih T-ćelija); humani makrofagni inflamatorni protein (MIP-1-alfa); serumski albumin, kao što je humani serumski albumin; Milerova inhibitorna supstanca; A-lanac relaksina; B-lanac relaksina; prorelaksin; mišji gonadotropin-udruženi peptid; mikrobni protein, kao što je beta-laktamaza; DNKaza; IgE; antigen povezan sa citotoksičnim T-limfocitima (CTLA), kao što je CTLA-4; inhibin; aktivin; vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF); receptori za hormone ili faktore rasta; protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofni faktor kao što je neurotrofni faktor izveden iz kosti (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, ili -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ili NT-6), ili faktor rasta nerava kao što je NGF-β; trombocitni faktor rasta (PDGF); fibroblastni faktor rasta kao što je aFGF i bFGF; epidermalni faktor rasta (EGF); transformišući faktor rasta (TGF) kao što je TGF-alfa i TGF-beta, uključujući TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ili TGF-β5; insulinu-sličan faktor rasta-I i -II (IGF-I i IGF-II); dez(1-3)-IGF-I (moždani IGF-I); proteini koji vezuju insulinu-sličan faktor rasta; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; EphA receptori; EphB receptori; folatni receptor; FOLR1; mezotelin; kripto; alfavbeta6; integrini; VEGF, VEGFR; EGFR; receptor transferina; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; CD proteini kao što su CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 ili antitelo koje se vezuje za jedan ili više antigena povezanih sa tumorom ili receptora ćelijske površine opisanih u objavi SAD patentne prijave br.2008/0171040 ili objavi SAD patentne prijave br. 2008/0305044; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; koštani morfogenetski protein (BMP); interferon, kao što je interferon-alfa, -beta i -gama; faktori stimulacije kolonija (CSF), npr., M-CSF, GM-CSF, i G-CSF; interleukini (IL), npr., IL-1 do IL-10; superoksid dismutaza; T-ćelijski receptori; površinski membranski proteini; faktor ubrzanja raspada; virusni antigen kao što je, na primer, deo omotača HIV virusa; transportni proteini; receptori za usmeravanje ćelija ka odredištu; adresini; regulatorni proteini; integrini, kao što su CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 i VCAM; antigeni povezani sa tumorom kao što su HER2, HER3, ili HER4 receptor; endoglin; c-Met; IGF1R; antigeni prostate kao što su PCA3, PSA, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, TMEFF2 i STEAP1; LGR5; B7H4; i fragmenti bilo kog od gore navedenih polipeptida.
[0046] Dodatno, GM-CSF, koji se vezuje za mijeloidne ćelije može da se koristi kao sredstvo koje se vezuje za ćeliju, za ćelije pogođene akutnom mijeloidnom leukemijom. IL-2 koji se vezuje za aktivirane T-ćelije može da se koristi za sprečavanje odbacivanja transplantiranog kalema, za lečenje i prevenciju bolesti kalem-protiv-domaćina, i za lečenje akutne T-ćelijske leukemije. MSH, koji se vezuje za melanocite, može da se koristi za lečenje melanoma, kao i antitela usmerena prema melanomima. Folna kiselina može da se koristi za ciljno delovanje na folatni receptor eksprimiran na tumorima jajnika i drugim tumorima. Epidermalni faktor rasta može da se koristi za ciljno delovanje na skvamozne kancere kao što je kancer pluća i glave i vrata. Somatostatin može da se koristi za ciljno delovanje na neuroblastome i druge tipove tumora.
[0047] Pojam „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji imunoglobulin, bilo koji fragment imunoglobulina, kao što je Fab, Fab', F(ab')2, dsFv, sFv, mini-antitela, di-antitela, tri-antitela, tetra-antitela (Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol., 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960), Kim et al., Mol. Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006)), ili imunoglobulinske himerne molekule, koji mogu da se vežu za antigen na površini ćelije (npr., koji sadrže region koji određuje komplementarnost (CDR)). Bilo koje pogodno antitelo može da se koristi kao sredstvo koje se vezuje za ćeliju. Stručnjak sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti će shvatiti da će izbor odgovarajućeg antitela zavisiti od ciljne ćelijske populacije. U tom pogledu, vrsta i broj molekula ćelijske površine (tj., antigena) koji se selektivno eksprimiraju u određenoj ćelijskoj populaciji (tipično i poželjno u populaciji obolelih ćelija) upravljaće odabirom odgovarajućeg antitela za upotrebu u inventivnoj kompoziciji. Profili ekspresije na ćelijskoj površini su poznati za širok opseg ćelijskih tipova, uključujući tumorske ćelijske tipove, ili, ako su nepoznati, mogu da se odrede upotrebom rutinskih tehnika molekularne biologije i histohemije.
[0048] Antitelo može da bude poliklonsko ili monoklonsko, ali je najpoželjnije monoklonsko antitelo. Kako se ovde koristi, pojam „poliklonska“ antitela se odnosi na heterogene populacije molekula antitela, tipično sadržane u serumu imunizovanih životinja. Pojam „monoklonska“ antitela se odnosi na homogene populacije molekula antitela specifičnih za određeni antigen. Monoklonska antitela tipično proizvodi pojedinačni klon B limfocita („B ćelije“). Monoklonska antitela mogu da se dobiju upotrebom različitih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući standardnu tehnologiju hibridoma (videti, npr., Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), i C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Ukratko, metod hibridoma za proizvodnju monoklonskih antitela tipično uključuje injektovanje bilo koje pogodne životinje, tipično i poželjno miša, antigenom (tj., „imunogenom“). Životinja se zatim žrtvuje, i B ćelije koje su izolovane iz njene slezine se fuzionišu sa humanim ćelijama mijeloma. Tako se proizvodi hibridna ćelija (tj., „hibridom“), koja proliferiše beskonačno i kontinuirano izlučuje visoke titrove antitela sa željenom specifičnošću in vitro. Bilo koji odgovarajući metod poznat u stanju tehnike može da se koristi za identifikovanje ćelija hibridoma koje proizvode antitelo sa željenom specifičnošću. Takve metode uključuju, na primer, enzimski imunosorbentni esej (ELISA), Western blot analizu, i radioimunoesej. Populacija hibridoma se pregleda da bi se izdvojili pojedinačni klonovi, od kojih svaki izlučuje jednu vrstu antitela na antigen. Budući da je svaki hibridom klon izveden iz fuzije sa pojedinačnom B ćelijom, svi molekuli antitela koje on proizvodi su identične strukture, uključujući njihovo antigen-vezujuće mesto i izotip. Monoklonska antitela takođe mogu da se proizvedu upotrebom drugih pogodnih tehnika uključujući tehnologiju EBV-hibridoma (videti, npr., Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2): 361-67 (1984), i Roder et al., Methods Enzymol., 121: 140-67 (1986)), ekspresionim sistemima bakteriofagnih vektora (videti, npr., Huse et al., Science, 246: 1275-81 (1989)), ili biblioteke prikaza na fagu koje obuhvataju fragmente antitela, kao što su Fab i scFv (jednolančani varijabilni region) (videti, npr., SAD patente 5,885,793 i 5,969,108, i objave međunarodnih patentnih prijava WO 92/01047 i WO 99/06587).
[0049] Monoklonsko antitelo može da bude izolovano iz, ili proizvedeno u bilo kojoj pogodnoj životinji, ali je poželjno proizvedeno u sisaru, poželjnije mišu ili čoveku, i najpoželjnije čoveku. Postupci za proizvodnju antitela u miševima su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i opisani su u ovom dokumentu. Što se tiče humanih antitela, stručnjak u odgovarajućoj oblasti će znati da poliklonska antitela mogu da se izoluju iz seruma humanih subjekata vakcinisanih ili imunizovanih odgovarajućim antigenom. Alternativno, humana antitela mogu da se dobiju prilagođavanjem poznatih tehnika za proizvodnju humanih antitela u nehumanim životinjama kao što su miševi (videti, npr., SAD patente 5,545,806, 5,569,825 i 5,714,352, i objavu SAD patentne prijave br.2002/0197266 A1).
[0050] Iako predstavljaju idealan izbor za terapijske primene kod ljudi, humana antitela, naročito humana monoklonska antitela, tipično je teže proizvesti nego mišja monoklonska antitela. Mišja monoklonska antitela, međutim, indukuju brzi odgovor antitela domaćina kada se primene kod ljudi, što može da smanji terapijski ili dijagnostički potencijal konjugata antitelo-citotoksično sredstvo. Da bi se izbegle ove komplikacije, poželjno je da humani imunski sistem ne prepoznaje monoklonsko antitelo kao „strano“.
[0051] U tom cilju, za stvaranje antitela može da se koristi prikaz na fagu. U tom pogledu, biblioteke faga koji kodiraju antigen-vezujuće varijabilne (V) domene antitela mogu da se dobiju upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije i rekombinantne DNK (videti, npr., Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Fagi koji kodiraju varijabilni region sa željenom specifičnošću se selektuju za specifično vezivanje za željeni antigen, i rekonstituiše se kompletno humano antitelo koje sadrži selektovani varijabilni domen. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju rekonstituisano antitelo se uvode u pogodnu ćelijsku liniju, kao što je ćelija mijeloma korišćena za proizvodnju hibridoma, tako da ćelija izlučuje humana antitela koja imaju svojstva monoklonskih antitela (videti, npr., Janeway et al., gore, Huse et al., gore, i SAD patent 6,265,150). Alternativno, monoklonska antitela mogu da budu dobijena iz miševa koji su transgeni za specifične gene teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina. Takvi postupci su poznati u stanju tehnike i opisani su u, na primer, SAD patentima 5,545,806 i 5,569,825, i Janeway et al., gore.
[0052] Najpoželjnije, antitelo je humanizovano antitelo. Kako se ovde koristi, „humanizovano“ antitelo je ono u kome su regioni koji određuju komplementarnost (CDR) mišjeg monoklonskog antitela, koji obrazuju petlje za vezivanje antigena u antitelu, nakalemljeni na okvirne regione molekula humanog antitela. Zbog sličnosti okvirnih regiona mišjih i humanih antitela, u stanju tehnike je uopšteno prihvaćeno da ovaj pristup proizvodi monoklonsko antitelo koje je antigenski identično humanom antitelu, ali vezuje isti antigen kao mišje monoklonsko antitelo od koga potiču CDR sekvence. Postupci za dobijanje humanizovanih antitela su dobro poznati u stanju tehnike i detaljno su opisani u, na primer, Janeway et al., gore, SAD patentima 5,225,539, 5,585,089 i 5,693,761, evropskom patentu br.0239400 B1 i patentu Velike Britanije br.
2188638. Humanizovana antitela mogu da se dobiju i upotrebom tehnologije izmene površine antitela opisane u SAD patentu 5,639,641 i kod Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235: 959-973 (1994). Iako je najpoželjnije da antitelo uključeno u konjugat inventivne kompozicije bude humanizovano monoklonsko antitelo, obimom pronalaska je obuhvaćeno i humano monoklonsko antitelo i mišje monoklonsko antitelo, kao što je gore opisano.
[0053] Fragmenti antitela koji imaju najmanje jedno antigen-vezujuće mesto, i stoga prepoznaju i vezuju se za najmanje jedan antigen ili receptor prisutan na površini ciljne ćelije takođe su obuhvaćeni obimom pronalaska. U tom pogledu, proteolitičko isecanje intaktnog molekula antitela može da proizvede različite fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena. Na primer, ograničena digestija molekula antitela proteazom papainom tipično proizvodi tri fragmenta, od kojih su dva identična i označena kao fragmenti Fab, budući da zadržavaju antigen-vezujuću aktivnost parentalnog molekula antitela. Isecanje molekula antitela enzimom pepsinom normalno proizvodi dva fragmenta antitela, od kojih jedan zadržava obe antigen-vezujuće ručice molekula antitela, i označen je stoga kao fragment F(ab')2. Redukcija fragmenta F(ab')2 ditiotreitolom ili merkaptoetilaminom proizvodi fragment označen kao fragment Fab'. Jednolančani fragment varijabilnog regiona (sFv) antitela, koji se sastoji od skraćenog fragmenta Fab koji sadrži varijabilni (V) domen teškog lanca antitela vezan za V domen lakog lanca antitela preko sintetskog peptida, može da se proizvede upotrebom rutinskih tehnika tehnologije rekombinantne DNK (videti, npr., Janeway et al., gore). Slično, fragmenti varijabilnog regiona stabilizovani disulfidnim vezama (dsFv) mogu da se pripreme tehnologijom rekombinantne DNK (videti, npr., Reiter et al., Protein Engineering, 7: 697-704 (1994)). Fragmenti antitela u kontekstu pronalaska, međutim, nisu ograničeni na ove primere tipova fragmenata antitela. Bilo koji pogodan fragment antitela koji prepoznaje i vezuje željeni receptor na površini ćelije ili antigen može da se koristi. Fragmenti antitela su dodatno opisani u, na primer, Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983), Spring et al., J. Immunol., 113: 470-478 (1974), i Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960). Vezivanje antitelo-antigen može da se ispita upotrebom bilo kog pogodnog postupka poznatog u stanju tehnike, kao što je, na primer, radioimunoesej (RIA), ELISA, Western blot, imunoprecipitacija, i testovi kompetitivne inhibicije (videti, npr., Janeway et al., gore, i objavu SAD patentne prijave br.2002/0197266 A1).
[0054] Pored toga, antitelo može da bude himerno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Pod „himernim“ se podrazumeva da antitelo obuhvata najmanje dva imunoglobulina, ili njihova fragmenta, dobijena ili izvedena iz najmanje dve različite vrste (npr., dva različita imunoglobulina, kao što je konstantni region humanog imunoglobulina kombinovan sa varijabilnim regionom mišjeg imunoglobulina). Antitelo takođe može da bude domensko antitelo (dAb) ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što je, na primer, antitelo kamelida (videti, npr., Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3: 752, (1996)), ili antitelo ajkule, kao što je, na primer, novi antigeni receptor (IgNAR) (videti, npr., Greenberg et al., Nature, 374: 168 (1995), i Stanfield et al., Science, 305: 1770-1773 (2004)).
[0055] Bilo koje pogodno antitelo može da se koristi u kontekstu pronalaska. Na primer, monoklonsko antitelo J5 je mišje IgG2a antitelo koje je specifično za opšti antigen akutne limfoblastne leukemije (CALLA) (Ritz et al., Nature, 283: 583-585 (1980)), i može da se koristi za ciljno delovanje na ćelije koje eksprimiraju CALLA (npr., ćelije akutne limfoblastne leukemije). Monoklonsko antitelo MY9 je mišje IgG1 antitelo koje se vezuje specifično za CD33 antigen (Griffin et al., Leukemia Res., 8: 521 (1984)), i može da se koristi za ciljno delovanje na ćelije koje eksprimiraju CD33 (npr., ćelije akutne mijeloidne leukemije (AML)).
[0056] Slično, monoklonsko antitelo anti-B4 (označeno i kao B4) je mišje IgG1 antitelo koje se vezuje za CD19 antigen na B ćelijama (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983)), i može da se koristi za ciljno delovanje na B ćelije ili obolele ćelije koje eksprimiraju CD19 (npr., ćelije ne-Hočkinovog limfoma i ćelije hronične limfoblastne leukemije). N901 je mišje monoklonsko antitelo koje se vezuje za CD56 (neuralni ćelijski adhezioni molekul) antigen nađen na ćelijama neuroendokrinog porekla, uključujući sitnoćelijski tumor pluća, koje može da se koristi u konjugatu za ciljnu isporuku lekova u ćelije neuroendokrinog porekla. Na antitelima J5, MY9 i B4 poželjno se obavlja izmena površine ili humanizacija pre njihove upotrebe kao dela konjugata.
Izmena površine ili humanizacija antitela opisana je, na primer, kod Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-73 (1994).
[0057] Pored toga, monoklonsko antitelo C242 se vezuje za CanAg antigen (videti, npr., SAD patent 5,552,293), i može da se koristi za usmeravanje konjugata na tumore koji eksprimiraju CanAg, kao što su kolorektalni, kanceri pankreasa, nesitnoćelijski kanceri pluća i kanceri želuca. HuC242 je humanizovani oblik monoklonskog antitela C242 (videti, npr., SAD patent 5,552,293). Hibridom iz koga se proizvodi HuC242 je deponovan pod ECACC identifikacionim brojem 90012601. HuC242 može da se pripremi upotrebom metodologije kalemljenja CDR (videti, npr., SAD patente 5,585,089, 5,693,761 i 5,693,762) ili tehnologijom izmene površine (videti, npr., SAD patent 5,639,641). HuC242 može da se koristi za usmeravanje konjugata na tumorske ćelije koje eksprimiraju CanAg antigen, kao što su, na primer, ćelije kolorektalnog, kancera pankreasa, nesitnoćelijskog kancera pluća i kancera želuca.
[0058] Za ciljno delovanje na ćelije kancera jajnika i kancera prostate, u konjugatu može da se koristi anti-MUC1 antitelo kao sredstvo koje se vezuje za ćeliju. Anti-MUC1 antitela uključuju, na primer, anti-HMFG-2 (videti, npr., Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981)), hCTM01 (videti, npr., van Hof et al., Cancer Res., 56: 5179-5185 (1996)) i DS6. Na ćelije kancera prostate takođe može ciljno da se deluje konjugatom upotrebom antitela na prostata-specifični membranski antigen (PSMA) kao sredstva koje se vezuje za ćeliju, kao što je J591 (videti, npr., Liu et al., Cancer Res., 57: 3629-3634 (1997)). Osim toga, na kancerske ćelije koje eksprimiraju Her2 antigen, kao što su kanceri dojke, prostate i jajnika, može ciljno da se deluje konjugatom upotrebom anti-Her2 antitela, npr., trastuzumaba, kao sredstva koje se vezuje za ćeliju. Na ćelije koje eksprimiraju receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR) i njegove varijante, kao što je delecioni mutant tipa III, EGFRvIII, može ciljno da se deluje konjugatom upotrebom anti-EGFR antitela. Anti-EGFR antitela su opisana u međunarodnim patentnim prijavama br. PCT/US11/058385 i PCT/US11/058378. Anti-EGFRvIII antitela su opisana u SAD patentima 7,736,644 i 7,628,986 i objavama SAD patentnih prijava 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 i 2009/0155282. Anti-IGF-IR antitela koja se vezuju za receptor insulinu-sličnog faktora rasta, kao što su ona opisana u SAD patentu 7,982,024, takođe mogu da se koriste u konjugatu. Antitela koja se vezuju za CD27L, Cripto, CD138, CD38, EphA2, integrine, CD37, folat, CD20, PSGR, NGEP, PSCA, TMEFF2, STEAP1, endoglin i Her3 takođe mogu da se koriste u konjugatu.
[0059] U jednom primeru izvođenja, antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od huN901, huMy9-6, huB4, huC242, anti-HER2 antitela (npr., trastuzumaba), bivatuzumaba, sibrotuzumaba, rituksimaba, huDS6, anti-mezotelin antitela opisanih u objavi međunarodne patentne prijave WO 2010/124797 (kao što je MF-T), antitela na kripto protein opisanih u objavi SAD patentne prijave 2010/0093980 (kao što je huB3F6), anti-CD138 antitela opisanih u objavi SAD patentne prijave 2007/0183971 (kao što je huB-B4), anti-EGFR antitela opisanih u međunarodnim patentnim prijavama br. PCT/US11/058385 i PCT/US11/058378 (kao što je EGFR-7), anti-EGFRvIII antitela opisanih u SAD patentima 7,736,644 i 7,628,986 i u objavama SAD patentnih prijava 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 i 2009/0155282, humanizovanih EphA2 antitela opisanih u objavama međunarodnih patentnih prijava WO 2011/039721 i WO 2011/039724 (kao što je 2H11R35R74); anti-CD38 antitela opisanih u objavi međunarodne patentne prijave WO 2008/047242 (kao što je hu38SB19), anti-folatnih antitela opisanih u objavi međunarodne patentne prijave WO 2011/106528, i u objavi SAD patentne prijave 2012/0009181 (npr., huMov19); anti-IGF1R antitela opisanih u SAD patentima 5,958,872, 6,596,743 i 7,982,024; anti-CD37 antitela opisanih u objavi SAD patentne prijave 2011/0256153 (npr., huCD37-3); anti-integrin αvβ6 antitela opisanih u objavi SAD patentne prijave 2006/0127407 (npr., CNTO95); i anti-Her3 antitela opisanih u objavi međunarodne patentne prijave WO 2012/019024.
[0060] Posebno poželjna antitela su humanizovana monoklonska antitela opisana u ovom dokumentu. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, huN901, huMy9-6, huB4, huC242, humanizovano monoklonsko anti-Her2 antitelo (npr., trastuzumab), bivatuzumab, sibrotuzumab, CNTO95, huDS6 i rituksimab (videti, npr., SAD patente 5,639,641 i 5,665,357, SAD privremenu patentnu prijavu br. 60/424,332 (koja je povezana sa SAD patentom 7,557,189), objavu međunarodne (PCT) patentne prijave WO 02/16401, Pedersen et al., gore, Roguska et al., gore, Liu et al., gore, Nadler et al., gore, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994) i Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)). Druga humanizovana monoklonska antitela su poznata u stanju tehnike i mogu da se koriste u vezi sa pronalaskom.
[0061] U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje se vezuje za ćeliju je humanizovano antitelo na folat ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1, pri čemu antitelo sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GYFMN; CDR2 teškog lanca koji sadrži RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3; i CDR3 teškog lanca koji sadrži YDGSRAMDY; i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQSVSFAGTSLMH; CDR2 lakog lanca koji sadrži RASNLEA; i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSREYPYT; gde je Xaa1 odabran od K, Q, H i R; Xaa2 je odabran od Q, H, N i R; i Xaa3 je odabran od G, E, T, S, A i V. Poželjno, CDR2 sekvenca teškog lanca sadrži RIHPYDGDTFYNQKFQG.
[0062] U drugom primeru izvođenja, antitelo na folat je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1 koji sadrži teški lanac koji ima sledeću aminokiselinsku sekvencu
[0063] U drugom primeru izvođenja, antitelo na folat je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran plazmidnom DNK deponovanom u ATCC 7. aprila 2010. pod ATCC brojevima PTA-10772 i PTA-10773 ili 10774.
[0064] U drugom primeru izvođenja, antitelo na folat je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni domen teškog lanca koji je najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičan sa
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS, i varijabilni domen lakog lanca koji je najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičan sa
[0065] Citotoksično sredstvo je majtanzinoid, uključujući majtanzinol i analoge majtanzinola. Majtanzinoidi su jedinjenja koja inhibiraju obrazovanje mikrotubula i visoko su toksična za sisarske ćelije. Primeri pogodnih analoga majtanzinola uključuju one koji imaju modifikovani aromatični prsten i one koji imaju modifikacije na drugim položajima. Takvi majtanzinoidi su opisani u, na primer, SAD patentima 4,256,746, 4,294,757, 4,307,016, 4,313,946, 4,315,929, 4,322,348, 4,331,598, 4,361,650, 4,362,663, 4,364,866, 4,424,219, 4,371,533, 4,450,254, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545 i 6,333,410.
[0066] Primeri analoga majtanzinola koji imaju modifikovani aromatični prsten uključuju: (1) C-19-dehloro (SAD patent 4,256,746) (pripremljen LAH redukcijom ansamitocina P2), (2) C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /-C-19-dehloro (SAD patenti 4,361,650 i 4,307,016) (pripremljen demetilacijom upotrebom Streptomyces ili Actinomyces ili dehlorinacijom upotrebom LAH), i (3) C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (-OCOR), /-dehloro (SAD patent 4,294,757) (pripremljen acilacijom upotrebom acilhlorida).
[0067] Primeri analoga majtanzinola koji imaju modifikacije na pozicijama drugačijim od aromatičnog prstena uključuju: (1) C-9-SH (SAD patent 4,424,219) (pripremljen reakcijom majtanzinola sa H2S ili P2S5), (2) C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (SAD patent 4,331,598), (3) C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (SAD patent 4,450,254) (pripremljen iz Nocardia), (4) C-15-hidroksi/aciloksi (SAD patent 4,364,866) (pripremljen konverzijom majtanzinola pomoću Streptomyces), (5) C-15-metoksi (SAD patenti 4,313,946 i 4,315,929) (izolovan iz Trewia nudiflora), (6) C-18-N-demetil (SAD patenti 4,362,663 i 4,322,348) (pripremljen demetilacijom majtanzinola pomoću Streptomyces), i (7) 4,5-deoksi (SAD patent 4,371,533) (pripremljen redukcijom majtanzinola pomoću titanijum trihlorida/LAH).
[0068] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, konjugat koristi majtanzinoid DM1 koji sadrži tiol, poznat i kao N<2'>-deacetil-N<2'>-(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin, kao citotoksično sredstvo. Struktura DM1 je predstavljena formulom (I):
[0069] U još jednom poželjnom primeru izvođenja pronalaska, konjugat koristi majtanzinoid DM4 koji sadrži tiol, poznat i kao N<2'>-deacetil-N<2'>-(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin, kao citotoksično sredstvo. Struktura DM4 je predstavljena formulom (II):
[0070] Drugi majtanzinoidi mogu da se koriste u kontekstu pronalaska, uključujući, na primer, majtanzinoide koji sadrže tiol ili disulfid koji nose mono ili di-alkil supstituciju na atomu ugljenika koji nosi atom sumpora. Posebno poželjan je majtanzinoid koji na poziciji C-3 ima (a) C-14 hidroksimetil, C-15 hidroksi, ili C-20 desmetil funkcionalnu grupu, i (b) acilovani aminokiselinski bočni lanac sa acil grupom koja nosi blokiranu sulfhidrilnu grupu, pri čemu atom ugljenika acil grupe koji nosi tiolnu funkcionalnu grupu ima jedan ili dva supstituenta, gde su navedeni supstituenti CH3, C2H5, linearni ili granati alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil, ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde dodatno jedan od supstituenata može da bude H, i gde acil grupa ima linearni lanac dužine od najmanje tri atoma ugljenika između karbonilne funkcionalne grupe i atoma sumpora.
[0071] Dodatni majtanzinoidi za upotrebu u kontekstu pronalaska uključuju jedinjenja predstavljena formulom (III):
gde Y' predstavlja
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ, gde su R1 i R2 svaki nezavisno CH3, C2H5, linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde R2 može da bude i H,
gde su A, B, D cikloalkil ili cikloalkenil koji imaju 3-10 atoma ugljenika, prosti ili supstituisani aril, ili heterociklični aromatični, ili heterocikloalkil radikal,
gde su R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 i R12 svaki nezavisno H, CH3, C2H5, linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični, ili heterocikloalkil radikal,
gde su l, m, n, o, p, q, r, s i t svaki nezavisno nula ili ceo broj od 1 do 5, pod uslovom da najmanje dva od l, m, n, o, p, q, r, s i t nisu nula u bilo kom trenutku, i gde Z predstavlja H, SR ili COR, gde je R linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, ili prosti ili supstituisani aril ili heterociklični aromatični, ili heterocikloalkil radikal.
[0072] Poželjni primeri izvođenja formule (III) uključuju jedinjenja formule (III) gde (a) R1 predstavlja H, R2 je metil i Z je H, (b) R1 i R2 su metil i Z je H, (c) R1 je H, R2 je metil, i Z je -SCH3, i (d) R1 i R2 su metil, i Z je -SCH3.
[0073] Takvi dodatni majtanzinoidi takođe uključuju jedinjenja predstavljena formulom (IV-L), (IV-D), ili (IV-D,L):
gde Y predstavlja (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ,
gde su R1 i R2 svaki nezavisno CH3, C2H5, linearni alkil, ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil, ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde R2 može da bude i H,
gde su R3, R4, R5, R6, R7, i R8 svaki nezavisno H, CH3, C2H5, linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil, ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal,
gde su l, m, i n svaki nezavisno ceo broj od 1 do 5, i dodatno, n može da bude nula,
gde Z predstavlja H, SR, ili COR, gde je R linearni ili granati alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, ili prosti ili supstituisani aril ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde May predstavlja majtanzinoid koji nosi bočni lanac na C-3, C-14 hidroksimetil, C-15 hidroksi, ili C-20 desmetil.
[0074] Poželjni primeri izvođenja formula (IV-L), (IV-D) i (IV-D,L) uključuju jedinjenja formula (IV-L), (IV-D) i (IV-D,L) gde (a) R1 predstavlja H, R2 je metil, R5, R6, R7 i R8 su svaki H, l i m su svaki 1, n je 0, i Z je H, (b) R1 i R2 su metil, R5, R6, R7, R8 su svaki H, l i m su 1, n je 0, i Z je H, (c) R1 je H, R2 je metil, R5, R6, R7 i R8 su svaki H, l i m su svaki 1, n je 0, i Z je -SCH3, ili (d) R1 i R2 su metil, R5, R6, R7, R8 su svaki H, l i m su 1, n je 0, i Z je -SCH3.
[0075] Poželjno citotoksično sredstvo je predstavljeno formulom (IV-L).
[0076] Dodatni poželjni majtanzinoidi takođe uključuju jedinjenja predstavljena formulom (V):
gde Y predstavlja (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ,
gde su R1 i R2 svaki nezavisno CH3, C2H5, linearni alkil, ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde R2 može da bude i H,
gde su R3, R4, R5, R6, R7, i R8 svaki nezavisno H, CH3, C2H5, linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil, ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal,
gde su l, m, i n svaki nezavisno ceo broj od 1 do 5, i dodatno n može da bude nula, i
gde Z predstavlja H, SR ili COR, gde je R linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, ili prosti ili supstituisani aril ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal.
[0077] Poželjni primeri izvođenja formule (V) uključuju jedinjenja formule (V) gde (a) R1 predstavlja H, R2 je metil, R5, R6, R7 i R8 su svaki H; l i m su svaki 1; n je 0; i Z je H, (b) R1 i R2 su metil; R5, R6, R7, R8 su svaki H, l i m su 1; n je 0; i Z je H, (c) R1 je H, R2 je metil, R5, R6, R7 i R8 su svaki H, l i m su svaki 1, n je 0, i Z je -SCH3, ili (d) R1 i R2 su metil, R5, R6, R7, R8 su svaki H, l i m su 1, n je 0, i Z je -SCH3.
[0078] Dodatni poželjni majtanzinoidi uključuju jedinjenja predstavljena formulama (VI-L), (VI-D), ili (VI-D,L):
gde Y2 predstavlja (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2,
gde su R1 i R2 svaki nezavisno CH3, C2H5, linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde R2 može da bude i H,
gde su R3, R4, R5, R6, R7, i R8 svaki nezavisno H, CH3, C2H5, linearni ciklični alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, gde su l, m, i n svaki nezavisno ceo broj od 1 do 5, i dodatno n može da bude nula,
gde Z2 predstavlja SR ili COR, gde je R linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, ili prosti ili supstituisani aril ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i gde je May makrociklična prstenasta struktura majtanzinoida.
[0079] Dodatni poželjni majtanzinoidi uključuju jedinjenja predstavljena formulom (VII) :
gde Y2' predstavlja
(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, gde su R1 i R2 svaki nezavisno CH3, C2H5, linearni granati ili alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, i dodatno R2 može da bude H,
gde su A, B, i D svaki nezavisno cikloalkil ili cikloalkenil koji ima 3 do 10 atoma ugljenika, prosti ili supstituisani aril, ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal, gde su R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 i R12 svaki nezavisno H, CH3, C2H5, linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, fenil, supstituisani fenil ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal,
gde su l, m, n, o, p, q, r, s, i t svaki nezavisno nula ili ceo broj od 1 do 5, pod uslovom da najmanje dva od l, m, n, o, p, q, r, s i t nisu nula u bilo kom trenutku, i gde Z2 predstavlja SR ili -COR, gde je R linearni alkil ili alkenil koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, granati ili ciklični alkil ili alkenil koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika, ili prosti ili supstituisani aril ili heterociklični aromatični ili heterocikloalkil radikal.
[0080] Poželjni primeri izvođenja formule (VII) uključuju jedinjenja formule (VII), gde R1 predstavlja H i R2 je metil.
[0081] Konjugati sredstva koje se vezuje za ćeliju i citotoksičnog sredstva mogu da se pripreme in vitro postupcima. U cilju vezivanja citotoksičnog sredstva za antitelo, koristi se vezujuća grupa. Pogodne vezujuće grupe su dobro poznate u stanju tehnike i uključuju disulfidne grupe, grupe koje su nestabilne pod dejstvom kiselina, grupe koje su nestabilne pod dejstvom svetlosti, grupe koje su nestabilne pod dejstvom peptidaza i grupe koje su nestabilne pod dejstvom esteraza, kao i vezujuće grupe koje ne mogu da se iseku. Na primer, sredstvo koje vezuje ćeliju može da bude hemijski spojeno sa citotoksičnim sredstvom putem hemijskih veza odabranih iz grupe koja se sastoji od disulfidnih veza, veza koje su nestabilne pod dejstvom kiselina, veza koje su nestabilne pod dejstvom svetlosti, veza koje su nestabilne pod dejstvom peptidaza, tioetarskih veza, i veza koje su nestabilne pod dejstvom esteraza.
[0082] U skladu sa pronalaskom, sredstvo koje se vezuje za ćeliju je vezano sa citotoksičnim sredstvom preko bifunkcionalnog unakrsno-vezujućeg reagensa. Kako se ovde koristi, izraz „bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens“ se odnosi na reagens koji ima dve reaktivne grupe; od kojih je jedna sposobna da reaguje sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju, dok je druga sposobna da reaguje sa citotoksičnim sredstvom da bi se sredstvo koje se vezuje za ćeliju vezalo sa citotoksičnim sredstvom, čime se obrazuje konjugat.
[0083] Bilo koji pogodan bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens može da se koristi u vezi sa pronalaskom, sve dok reagens koji služi kao linker obezbeđuje očuvanje terapijskih svojstava, npr., citotoksičnosti, i svojstava ciljnog delovanja citotoksičnog sredstva, odnosno sredstva koje se vezuje za ćeliju, bez nepotrebne toksičnosti. Poželjno, molekul linkera povezuje citotoksično sredstvo sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju putem hemijskih veza (kao što je gore opisano), tako da su citotoksično sredstvo i sredstvo koje se vezuje za ćeliju hemijski spojeni (npr., kovalentno vezani) jedno za drugo.
[0084] U jednom primeru izvođenja, bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens obuhvata linkere koji ne mogu da se iseku. Linker koji ne može da se iseče je bilo koji hemijski fragment koji može da veže citotoksično sredstvo, kao što je majtanzinoid, taksan, ili CC-1065 analog, za sredstvo koje se vezuje za ćeliju na stabilan, kovalentni način. Prema tome, linkeri koji ne mogu da se iseku su suštinski otporni na isecanje indukovano kiselinom, isecanje indukovano svetlošću, isecanje indukovano peptidazama, isecanje indukovano esterazama, i isecanje disulfidnih veza, u uslovima pod kojima citotoksično sredstvo ili sredstvo koje se vezuje za ćeliju ostaje aktivno.
[0085] Pogodni unakrsno-vezujući reagensi koji obrazuju linkere koji ne mogu da se iseku između citotoksičnog sredstva i sredstva koje se vezuje za ćeliju su dobro poznati u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja, citotoksično sredstvo je vezano za sredstvo koje se vezuje za ćeliju preko tioetarske veze. Primeri linkera koji ne mogu da se iseku uključuju linkere koji imaju fragment na bazi maleimida ili haloacetila za reakciju sa citotoksičnim sredstvom. Takva bifunkcionalna unakrsno-vezujuća sredstva su dobro poznata u stanju tehnike (videti objave SAD patentnih prijava br.2010/0129314, 2009/0274713, 2008/0050310, 20050169933, 2009/0274713, 2010/0129314, i one dostupne kod Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, SAD) i uključuju, ali nisu ograničena na, N-sukcinimidil 4-(maleimidometil) cikloheksankarboksilat (SMCC), N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat), koji je analog „dugog lanca“ SMCC (LC-SMCC), N-sukcinimidil estar κ-maleimidoundekanske kiseline (KMUA), N-sukcinimidil estar γ-maleimidobuterne kiseline (GMBS), N-hidroksisukcinimid estar ε-maleimidokapronske kiseline (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), N-(α-maleimidoacetoksi)-sukcinimid estar (AMAS), sukcinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)heksanoat (SMPH), N-sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirat (SMPB) i N-(p-maleimidofenil)izocijanat (PMPI). Unakrsno vezujući reagensi koji obuhvataju fragment na bazi haloacetila uključuju N-sukcinimidil-4-(jodoacetil)-aminobenzoat (SIAB), N-sukcinimidil jodoacetat (SIA), N-sukcinimidil bromoacetat (SBA), i N-sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat (SBAP), bis-maleimidopolietilenglikol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, N-(β-maleimidopropiloksi)sukcinimid estar (BMPS), 5-maleimidovalerinsku kiselinu NHS, HBVS, 4-(4-N-maleimidofenil)-buternu kiselinu hidrazid·HCl (MPBH), sukcinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoat (SVSB), ditiobis-maleimidoetan (DTME), 1,4-bis-maleimidobutan (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroksibutan (BMDB), bis-maleimidoheksan (BMH), bis-maleimidoetan (BMOE), sulfosukcinimidil 4-(N-maleimido-metil)cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC), sulfosukcinimidil(4-jodoacetil)aminobenzoat (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisulfosukcinimid estar (sulfo-MBS), N-(γ-maleimidobutriloksi)sulfosukcinimd estar (sulfo-GMBS), N-(ε-maleimidokaproiloksi)sulfosukcimido estar (sulfo-EMCS), N-(κ-maleimidoundekanoiloksi) sulfosukcinimid estar (sulfo-KMUS), sulfosukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat (sulfo-SMPB), CX1-1, sulfo-Mal i PEGn-Mal. Poželjno, bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens je SMCC.
[0086] U jednom primeru izvođenja, povezujući reagens je linker koji može da se iseče. Primeri pogodnih linkera koji mogu da se iseku uključuju disulfidne linkere, linkere koji su nestabilni pod dejstvom kiselina, linkere koji su nestabilni pod dejstvom svetlosti, linkere koji su nestabilni pod dejstvom peptidaza i linkere koji su nestabilni pod dejstvom esteraza. Linkeri koji sadrže disulfid su linkeri koji mogu da se iseku putem disulfidne razmene, koja može da se odvija pod fiziološkim uslovima. Linkeri koji su nestabilni pod dejstvom kiselina su linkeri koji mogu da se iseku na kiselom pH. Na primer, određene intracelularne odeljke, kao što su endozomi i lizozomi, imaju kiseli pH (pH 4-5), i obezbeđuju uslove pogodne za isecanje linkera koji su nestabilni pod dejstvom kiselina. Linkeri koji su nestabilni pod dejstvom svetlosti su korisni na površini tela i u mnogim telesnim šupljinama koje su dostupne svetlosti. Osim toga, infracrvena svetlost može da prodre u tkivo. Linkeri koji su nestabilni pod dejstvom peptidaza mogu da se koriste za isecanje određenih peptida unutar ili izvan ćelija (videti npr., Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 626-629 (1982), i Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989)). U jednom primeru izvođenja, linker koji može da se iseče se seče pod blagim uslovima, tj., uslovima u ćeliji pod kojima aktivnost citotoksičnog sredstva nije narušena.
[0087] U drugom primeru izvođenja, citotoksično sredstvo je vezano za sredstvo koje se vezuje za ćeliju tj., antitelo putem disulfidne veze. Molekul linkera sadrži reaktivnu hemijsku grupu koja može da reaguje sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju. Poželjne reaktivne hemijske grupe za reakciju sa sredstvom koje se vezuje za ćeliju su N-sukcinimidil estri i N-sulfosukcinimidil estri. Dodatno molekul linkera sadrži reaktivnu hemijsku grupu, poželjno ditiopiridil grupu, koja može da reaguje sa citotoksičnim sredstvom da bi se obrazovala disulfidna veza. Bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagensi koji omogućavaju vezivanje sredstva koje se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim sredstvom preko disulfidnih veza su poznati u stanju tehnike i uključuju, na primer, N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) (videti, npr., Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)butanoat (SPDB) (videti, npr., SAD patent 4,563,304), N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoat (SPP) (videti, npr., CAS registracioni broj 341498-08-6) i N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoat (sulfo-SPDB) (videti, npr., objavu SAD prijave 2009/0274713). Drugi bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagensi koji mogu da se koriste za uvođenje disulfidnih grupa su poznati u stanju tehnike i opisani u SAD patentima 6,913,748, 6,716,821 i objavama SAD patentnih prijava 2009/0274713 i 2010/0129314.
[0088] Drugi unakrsno-vezujući reagensi kojima nedostaje atom sumpora, koji obrazuju linkere koji ne mogu da se iseku mogu takođe da se koriste u inventivnom postupku. Takvi linkeri mogu da budu izvedeni iz fragmenata na bazi dikarboksilne kiseline. Pogodni fragmenti na bazi dikarboksilne kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, α,ω-dikarboksilne kiseline opšte formule (IX):
HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH
(IX),
gde je X linearna ili granata alkil, alkenil, ili alkinil grupa koja ima 2 do 20 atoma ugljenika, Y je cikloalkil ili cikloalkenil grupa koja nosi 3 do 10 atoma ugljenika, Z je supstituisana ili nesupstituisana aromatična grupa koja nosi 6 do 10 atoma ugljenika, ili supstituisana ili nesupstituisana heterociklična grupa gde je hetero atom odabran od N, O ili S, i gde su l, m i n svaki 0 ili 1, pod uslovom da l, m, i n nisu svi nula u isto vreme.
[0089] Mnogi od ovde opisanih linkera koji ne mogu da se iseku detaljno su opisani u objavi SAD patentne prijave br.2005/0169933 A1.
[0090] Primeri koji slede dodatno ilustruju pronalazak, ali ih, naravno, ne treba shvatiti kao ograničavajuće za njegov obim u bilo kom smislu.
Primer 1
[0091] Humanizovano CD37-3 antitelo je reagovalo sa heterobifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom SMCC i majtanzinoidom DM1 upotrebom prethodno opisanog postupka (npr. SAD patent 5,208,020), kao i upotrebom jednostepenog postupka koji je predmet ove prijave.
[0092] Za prethodno opisani postupak, huCD37-3 (15 mg/mL) je prvo reagovalo sa SMCC (u molarnom višku od 6,5 puta u odnosu na količinu antitela) da bi se obrazovalo modifikovano antitelo. Reakcija modifikacije je izvedena na 16 °C u 50 mM natrijum fosfatnom puferu (pH 6,9) koji sadrži 2 mM EDTA i 10% DMA tokom 90 minuta. Reakcija je ugašena sa 1 M acetata da bi se pH vrednost podesila na 4,5 i modifikovano antitelo je prečišćeno upotrebom kolone od smole sefadeks G-25F uravnotežene i eluirane sa 20 mM natrijum acetatom (pH 4,5) koji sadrži 2 mM EDTA. Posle prečišćavanja, modifikovano antitelo (5 mg/mL) je reagovalo sa majtanzinoidom DM1 (u molarnom višku od 6,8 puta u odnosu na količinu antitela; u višku od 1,3 puta u odnosu na izmerenu količinu linkera na antitelu) da bi se obrazovalo konjugovano antitelo. Reakcija konjugacije je izvedena na 20 °C u 20 mM natrijum acetatnom puferu (pH 5,0) koji sadrži 2 mM EDTA i 5% DMA tokom približno 20 časova. Reakciona smeša je zatim prečišćena upotrebom kolone od smole sefadeks G-25F uravnotežene i eluirane sa 10 mM natrijum sukcinatom (pH 5,0).
[0093] Za inventivni postupak, huCD37-3 (2,5 mg/mL) je pomešano sa DM1 (molarni višak od 6,2 puta u odnosu na količinu antitela) i zatim sa SMCC (višak od 5,2 puta u odnosu na količinu antitela). Reakcija je izvedena na 20 °C u 50 mM puferu EPPS [4-(2-hidroksietil)-1-piperazinpropansulfonska kiselina] (pH 8,1) koji sadrži 2 mM EDTA i 10% DMA tokom približno 4 časa. Reakcija je ugašena dodatkom 1 M acetata za podešavanje vrednosti pH do 5,0. Reakciona smeša je zatim održavana na 2 - 8 °C približno 20 časova. Nakon zadržavanja, reakciona smeša je filtrirana kroz PVDF filter promera 0,2 µm i prečišćena i podvrgnuta dijafiltraciji u 10 mM natrijum sukcinatu (pH 5,0) upotrebom filtracije tangencijalnim protokom (TFF).
[0094] Konjugat dobijen pomoću dva postupka ispitivan je: UV spektroskopijom za koncentraciju i opterećenje citotoksičnim sredstvom (odnos majtanzinoida prema antitelu, MAR); masenom spektrometrijom za određivanje nivoa nekonjugovanog linkera; redukujućom SDS PAGE elektroforezom za određivanje nivoa vrsta koje se ne redukuju; SEC-HPLC za određivanje monomera konjugata; i na stabilnost pri skladištenju u odnosu na monomer konjugata i oslobađanje slobodnog majtanzinoida.
[0095] Koncentracija i odnos majtanzinoida prema antitelu (MAR) su određeni merenjem apsorbance konjugata na 252 i 280 nm u UV-VIS spektrofotometru i upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata DM1 i antitela na dve talasna dužine da bi se izračunale molarne koncentracije antitela i DM1.
[0096] Nivo nekonjugovanog linkera konjugata ispitivan je masenom spektrometrijom: izmerene su površine pikova pojedinačnih vrsta konjugata (uključujući konjugate sa ili bez nekonjugovanih linkera); nivo nekonjugovanog linkera je izračunat pomoću odnosa zbira površina koje sadrže nekonjugovane linkere (ponderisanog po broju linkera) i zbira površina svih vrsta konjugata (takođe ponderisanog po broju linkera).
[0097] Nivo vrsta konjugata koje ne mogu da se redukuju ispitivan je redukujućom SDS gel elektroforezom: merene su površine pikova pojedinačnih redukovanih vrsta konjugata (uključujući redukovani laki lanac, redukovani teški lanac, unakrsno vezane lake-lake lance, unakrsno vezane lake-teške lance, itd.); nivo vrsta koje ne mogu da se redukuju izračunat je pomoću odnosa zbira površina vrsta koje ne mogu da se redukuju i zbira površina svih vrsta.
[0098] Nivo monomera konjugata ispitivan je pomoću ekskluzione HPLC: merene su površine pikova monomera, dimera, agregata i vrsta male molekulske težine upotrebom detektora apsorbance podešenog na talasnu dužinu od 252 nm ili 280 nm; nivo monomera je izračunat pomoću odnosa površine monomera i ukupne površine.
[0099] Količina slobodnog majtanzinoida prisutnog u konjugatu ispitivana je pomoću HPLC sa dualnom kolonom (kolone HiSep i C18): merene su površine pikova ukupnih slobodnih vrsta majtanzinoida (eluirane u gradijentu i identifikovane poređenjem vremena elucije sa poznatim standardima) upotrebom detektora apsorbance podešenog na talasnu dužinu od 252 nm; količina slobodnog majtanzinoida izračunata je upotrebom standardne krive dobijene na osnovu površina pikova poznatih količina standarda.
[0100] Kao što je prikazano u tabeli 1 ispod, konjugat proizveden upotrebom inventivnog postupka po svojstvima nadmašuje konjugat koji je proizveden upotrebom prethodno opisanog postupka u odnosu na nekonjugovani linker, vrste koje ne mogu da se redukuju i monomer konjugata. Pored toga, stabilnost konjugata napravljenog inventivnim postupkom bila je značajno bolja u odnosu na oslobađanje slobodnog majtanzinoida posle skladištenja tokom pet meseci na 4 °C. Nivoi monomera konjugata napravljenih pomoću oba postupka bili su stabilni.
Tabela 1. Poređenje ključnih svojstava konjugata CD37-3 proizvedenog inventivnim postupkom nasuprot prethodnom postupku
[0101] Rezultati eksperimenata koji se ogledaju u ovom primeru pokazuju poboljšane postupke za pripremu konjugata sredstvo koje se vezuje za ćeliju-citotoksično sredstvo, koji su suštinski visoke čistoće. Pored poboljšanja u čistoći i stabilnosti konjugata dobijenih upotrebom inventivnog postupka, postoje i poboljšanja u pogledu vremena i praktičnosti obrade, zbog eliminacije dva koraka obrade (reakcija modifikacije i prečišćavanje modifikovanog antitela).
Primer 2
[0102] Humanizovano antitelo na folatni receptor huMov19 (videti objavu SAD prijave 2012/0009181) je reagovalo sa heterobifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom sulfo-SPDB i majtanzinoidom DM4 upotrebom dva prethodno opisana postupka, kao i poboljšanim postupkom koji je predmet ove prijave.
[0103] Za prethodno opisani postupak A (dvostepeni postupak, npr. Chari et al., US 5,208,020), huMov19 antitelo (20 mg/mL) je prvo reagovalo sa sulfo-SPDB (molarni višak od 5,7 puta u odnosu na količinu antitela, rastvorenim u DMA, dimetilacetamidu) da bi se obrazovalo modifikovano antitelo. Reakcija modifikacije je izvedena na 20 °C u 50 mM pufera EPPS (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-propansulfonska kiselina) (pH 8,1) koji sadrži 5% DMA tokom 180 minuta. Modifikovano antitelo je prečišćeno upotrebom kolone sa smolom sefadeks G-25F uravnoteženom i eluiranom sa 50 mM EPPS (pH 8,1) sa 2 mM EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina). Posle prečišćavanja, modifikovano antitelo (5,0 mg/mL) je reagovalo sa majtanzinoidom DM4 (rastvorenim u DMA; molarni višak od 9,7 puta u odnosu na količinu antitela; molarni višak od 1,7 puta u odnosu na izmerenu količinu linkera na antitelu) da bi se obrazovalo konjugovano antitelo. Reakcija konjugacije je sprovedena na sobnoj temperaturi u 50 mM EPPS (pH 8,1) koji sadrži 2 mM EDTA i 5% DMA tokom približno 18 časova. Reakciona smeša je zatim prečišćena upotrebom kolone sa smolom sefadeks G-25F uravnoteženom i eluiranom sa 10 mM natrijum sukcinatom (pH 5,0).
[0104] Za prethodno opisani postupak B (postupak sinteze u jednoj posudi, Dai et al., SAD patent 7,811,572), huMov19 antitelo (10 mg/mL) je prvo reagovalo sa sulfo-SPDB (molarni višak od 4,9 puta u odnosu na količinu antitela, rastvoren u DMA) da bi se obrazovalo modifikovano antitelo. Reakcija modifikacije je sprovedena na 20 °C u 50 mM EPPS pufera (pH 7,5) koji sadrži 2mM EDTA i 10% DMA tokom 60 minuta. Modifikovano antitelo nije prečišćavano pre reakcije konjugacije. Umesto toga, neprečišćeno modifikovano antitelo je reagovalo pri koncentraciji od 10 mg/mL sa majtanzinoidom DM4 (molarni višak od 8,3 puta u odnosu na količinu antitela, rastvoreno u DMA) da bi se obrazovalo konjugovano antitelo. Reakcija konjugacije je izvedena na sobnoj temperaturi u 50 mM EPPS pufera (pH 7,5) koji sadrži 2 mM EDTA i 10% DMA tokom približno 18 časova. Reakciona smeša je zatim prečišćena upotrebom kolone sa smolom sefadeks G-25F uravnoteženom i eluiranom sa 10 mM natrijum sukcinatom (pH 5,0).
[0105] Za inventivni postupak u kome je korišćen sefadeks G-25 (postupak C, jednostepeni postupak) za prečišćavanje konjugata, huMov19 antitelo (6,0 mg/mL) je pomešano sa DM4 (molarni višak od 9,7 puta u odnosu na količinu antitela, rastvoren u DMA), a zatim je dodat sulfo-SPDB (višak od 5,7 puta u odnosu na količinu antitela, rastvoren u DMA). Reakcija je izvedena na 20 °C u 50 mM EPPS puferu (pH 8,1) koji sadrži 2 mM EDTA i 10% DMA tokom približno 20 časova. Reakciona smeša je zatim prečišćena upotrebom kolone sa smolom sefadeks G-25F uravnoteženom i eluiranom sa 10 mM natrijum sukcinatom (pH 5,0).
[0106] Za inventivni postupak u kome je za prečišćavanje konjugata korišćena filtracija tangencijalnim protokom (TFF) (postupak D, jednostepeni postupak), huMov19 antitelo (5,0 mg/mL) je pomešano sa DM4 (molarni višak od 10,2 puta u odnosu na količinu antitela, rastvoren u DMA) i zatim sa sulfo-SPDB (višak od 6,0 puta u odnosu na količinu antitela, rastvoren u DMA). Reakcija je izvedena na 20 °C u 50 mM EPPS puferu (pH 8,5) koji sadrži 2 mM EDTA i 10% DMA tokom približno 20 časova. Reakciona smeša je zatim prečišćena i podvrgnuta dijafiltraciji upotrebom TFF u 10 mM natrijum sukcinatu (pH 5,0).
[0107] Konjugat dobijen različitim postupcima ispitivan je pomoću: UV spektroskopije (za koncentraciju i odnos majtanzinoida prema antitelu, MAR); HPLC reverzne faze za određivanje slobodnog majtanzinoida; masene spektrometrije za određivanje nivoa nekonjugovanog linkera i profila raspodele mase; redukujuće SDS PAGE elektroforeze za određivanje nivoa vrsta koje ne mogu da se redukuju; neredukujuće SDS PAGE elektroforeze za određivanje nivoa fragmentacije; SEC-HPLC za određivanje monomera konjugata. Stabilnost pri skladištenju je procenjena u odnosu na monomer konjugata i oslobađanje slobodnog majtanzinoida. Dodatni detalji o analitičkim metodologijama dati su u primeru 1.
[0108] Kao što je prikazano u tabeli 2 ispod, konjugat proizveden upotrebom inventivnog postupka prevazišao je po svojstvima konjugat proizveden upotrebom prethodno opisanih postupaka uzimajući u obzir monomer. Konjugat proizveden upotrebom postupka sinteze u jednoj posudi i jednostepenog postupka u kome je završno prečišćavanje konjugata izvedeno upotrebom smole sefadeks G-25, postupka B odnosno C, imao je viši nivo slobodnog majtanzinoida nego konjugat proizveden upotrebom dvostepenog postupka, postupka A. Međutim, kada je korišćen drugačiji postupak za finalno prečišćavanje, TFF, (postupak D), nivo slobodnog majtanzinoida bio je veoma nizak i uporediv sa onim koji se javlja kod dvostepenog postupka, i posle početnog prečišćavanja, i posle skladištenja na 4 °C tokom šest nedelja. U odnosu na druga značajna svojstva konjugata (npr. fragmentacija, vrste koje ne mogu da se redukuju, profil raspodele mase i nekonjugovani linker), konjugat proizveden upotrebom inventivnog postupka bio je ekvivalentan onom proizvedenom prethodno opisanim postupcima.
Tabela 2. Poređenje ključnih svojstava konjugata huMov19 proizvedenog inventivnim postupkom nasuprot prethodnim postupcima
* Prečišćeno smolom sefadeks G-25 ;* Prečišćeno upotrebom TFF
[0109] Rezultati eksperimenata koji se ogledaju u ovom primeru pokazuju poboljšane postupke za pripremu konjugata sredstvo koje se vezuje za ćeliju-citotoksično sredstvo koji su suštinski visoke čistoće. Pored poboljšanja u pogledu čistoće i stabilnosti konjugata dobijenih upotrebom inventivnog postupka, postoje i poboljšanja u pogledu vremena i praktičnosti obrade, zahvaljujući eliminaciji dva koraka obrade (reakcija modifikacije i prečišćavanje modifikovanog antitela).
Primer 3
[0110] Ovaj primer pokazuje da jednostepeni postupak opisan u ovom dokumentu može da se koristi za pravljenje konjugata polazeći od različitih linkera i citotoksičnih sredstava majtanzinoida.
[0111] Humanizovano huN901 antitelo je pomešano sa majtanzinoidom (DM1 ili DM4) i zatim sa linkerom (Sulfo-SMCC, SMCC, SPDB, ili SPP). Reakcija je izvedena na 20 °C u 50 mM fosfatnom puferu (pH 7,5) koji sadrži 2 mM EDTA i 10% DMA tokom približno 20-24 časa. Reakciona smeša je zatim prečišćena upotrebom kolone sa smolom sefadeks G25F uravnoteženom i eluiranom sa 10 mM natrijum sukcinatom (pH 5,0).
[0112] Kao što je prikazano u tabeli 3 ispod, jednostepena reakcija može da se izvede sa različitim kombinacijama linkera i majtanzinoida, i da se njome dobije konjugat sa dobrim odnosom MAR i nivoima monomera.
Tabela 3. Pravljenje konjugata upotrebom različitih kombinacija linkera i majtanzinoida
[0113] Upotrebu pokazatelja jednine u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu patentnih zahteva koji slede u tekstu) treba razumeti tako da uključuje i jedninu i množinu, osim ako nije drugačije naznačeno u ovom dokumentu ili očigledno suprotno kontekstu. Izraze „koji obuhvata“, „koji ima“, „uključujući“ i „koji sadrži“ treba tumačiti kao otvorene termine (tj., koji znače „uključujući, ali bez ograničenja“) osim ako nije drugačije naznačeno. Navođenje opsega vrednosti ovde je namenjeno samo da služi kao skraćeni način pojedinačnog navođenja svake posebne vrednosti koja pripada opsegu, osim ako u ovom dokumentu nije drugačije naznačeno, i svaka posebna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi postupci koji su opisani u ovom dokumentu mogu da se sprovedu bilo kojim pogodnim redosledom, osim ako ovde nije drugačije navedeno ili očigledno suprotno kontekstu. Upotreba bilo kog ili svih primera, ili tipičnih izraza (npr., „kao što je“) koji su ovde dati, namenjena je da bolje opiše pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska, osim ako se ne tvrdi drugačije. Nijedan termin u specifikaciji ne treba tumačiti tako da ukazuje na bilo koji element za koji se ne traži zaštita kao bitan za praktikovanje pronalaska.
[0114] Poželjni primeri izvođenja ovog pronalaska opisani su u ovom dokumentu, uključujući najbolji način koji je pronalazačima poznat za izvođenje pronalaska. Varijacije ovih poželjnih primera izvođenja mogu da budu očigledne stručnjacima sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti nakon čitanja gore navedenog opisa. Pronalazači očekuju da će stručnjaci u ovoj oblasti koristiti takve varijacije kao pogodne, i pronalazači su namenili pronalazak da se praktikuje i na drugačiji način nego što je ovde specifično opisano. Prema tome, ovaj pronalazak uključuje sve modifikacije i ekvivalente predmeta koji je naveden u priloženim zahtevima, kao što je dozvoljeno važećim zakonom. Osim toga, bilo koja kombinacija gore navedenih elemenata u svim mogućim njihovim varijacijama obuhvaćena je pronalaskom, osim ako ovde nije drugačije navedeno ili očigledno suprotno kontekstu.

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Postupak za pripremu konjugata antitela i majtanzinoida koji obuhvata korak: (a) dovođenja u kontakt antitela sa majtanzinoidom da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži antitelo i majtanzinoid, zatim dovođenja u kontakt prve smeša sa bifunkcionalnim unakrsno-vezujućim reagensom koji sadrži linker, u rastvoru koji ima pH od 4 do 9 da bi se dobila druga smeša koja sadrži (i) konjugat antitela i majtanzinoida, u kome je antitelo hemijski spojeno preko linkera sa majtanzinoidom, (ii) slobodni majtanzinoid, i (iii) sporedne proizvode reakcije.
  2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što postupak dodatno obuhvata korak: (b) prečišćavanja druge smeše koja sadrži konjugat antitela i majtanzinoida da bi se dobio prečišćeni konjugat antitela i majtanzinoida.
  3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što se druga smeša prečišćava podvrgavanjem smeše filtraciji tangencijalnim protokom, selektivnoj precipitaciji, adsorpcionoj filtraciji, adsorpcionoj hromatografiji, neapsorpcionoj hromatografiji, ili njihovoj kombinaciji, da bi se konjugat antitela i majtanzinoida prečistio od slobodnog majtanzinoida i sporednih proizvoda reakcije, pri čemu je poželjno da se druga smeša prečišćava podvrgavanjem smeše filtraciji tangencijalnim protokom.
  4. 4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što se dovođenje u kontakt u koraku (a) postiže stavljanjem antitela u reakcionu posudu, dodavanjem majtanzinoida u reakcionu posudu da bi se obrazovala prva smeša koja sadrži antitelo i majtanzinoid, a zatim dodavanjem bifunkcionalnog unakrsno-vezujućeg reagensa u prvu smešu.
  5. 5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2-4, koji dalje obuhvata zadržavanje druge smeše između koraka (a) i (b) da bi se nestabilno vezani linkeri oslobodili sa antitela i/ili gašenje druge smeše između koraka (a) i (b) da bi se ugasio sav neizreagovani majtanzinoid i/ili neizreagovani bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens.
  6. 6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što se druga smeša održava tokom oko 20 časova na temperaturi od 2 °C do 8 °C.
  7. 7. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što se smeša gasi dovođenjem u kontakt druge smeše sa reagensom za gašenje koji reaguje sa slobodnim majtanzinoidom.
  8. 8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što je reagens za gašenje odabran iz grupe koja se sastoji od 4-maleimidobuterne kiseline, 3-maleimidopropionske kiseline, N-etilmaleimida, jodoacetamida i jodoacetamidopropionske kiseline.
  9. 9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time što se dovođenje u kontakt u koraku (a) odvija u rastvoru koji ima pH od 7 do 9.
  10. 10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačen time što se dovođenje u kontakt u koraku (a) odvija na temperaturi od 16 °C do 24 °C ili 0 °C do 15 °C.
  11. 11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačen time što je antitelo monoklonsko antitelo, poželjno humanizovano monoklonsko antitelo.
  12. 12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što je antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od huN901, huMy9-6, huB4, huC242, trastuzumaba, bivatuzumaba, sibrotuzumaba, CNTO95, huDS6, rituksimaba, anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD27L, anti-EGFRvIII, Cripto, anti-CD138, anti-CD38, anti-EphA2, antitela usmerenog na integrin, anti-CD37, antitela na folat, anti-Her3 i anti-IGFIR.
  13. 13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačen time što je majtanzinoid N<2'>-deacetil-N<2'>-(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin (DM1) ili N<2'>-deacetil-N<2'>-(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin (DM4).
  14. 14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, naznačen time što je antitelo hemijski spojeno sa majtanzinoidom hemijskim vezama odabranim iz grupe koja se sastoji od disulfidnih veza, veza koje su nestabilne pod dejstvom kiselina, veza koje su nestabilne pod dejstvom svetlosti, veza koje su nestabilne pod dejstvom peptidaza, tioetarskih veza i veza koje su nestabilne pod dejstvom esteraza.
  15. 15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, naznačen time što bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens sadrži fragment N-sukcinimidil estra, fragment N-sulfosukcinimidil estra, fragment na bazi maleimida, ili fragment na bazi haloacetila, pri čemu je poželjno bifunkcionalni unakrsno-vezujući reagens odabran iz grupe koja se sastoji od SPDP, SPP, SPDB, sulfo-SPDB, SMCC, PEG-Mal, sulfo-Mal i CX1-1; gde PEG-Mal predstavlja:
    sulfo-Mal je:
    i CX1-1 je:
  16. 16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-15, naznačen time što rastvor u koraku (a) sadrži saharozu i/ili pufersko sredstvo odabrano iz grupe koja se sastoji od citratnog pufera, acetatnog pufera, sukcinatnog pufera, fosfatnog pufera, HEPPSO (N-(2-hidroksietil) piperazin-N'-(2-hidroksipropansulfonske kiseline)), POPSO (piperazin-1,4-bis-(2-hidroksipropan-sulfonske kiseline) dehidrata), HEPES (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansulfonske kiseline), HEPPS (EPPS) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-propansulfonske kiseline), TES (N-[tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoetansulfonske kiseline), i njihove kombinacije. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20190189A 2011-03-29 2012-03-29 Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom RS58367B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161468997P 2011-03-29 2011-03-29
PCT/US2012/031243 WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-03-29 Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
EP12714160.4A EP2691155B1 (en) 2011-03-29 2012-03-29 Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58367B1 true RS58367B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=46928080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190189A RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2012-03-29 Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom

Country Status (26)

Country Link
US (7) US8795673B2 (sr)
EP (2) EP2691155B1 (sr)
JP (5) JP6000329B2 (sr)
KR (6) KR20220009505A (sr)
CN (2) CN103717262B (sr)
AU (5) AU2012236398B2 (sr)
CA (1) CA2831467C (sr)
CY (1) CY1121321T1 (sr)
DK (1) DK2691155T3 (sr)
EA (2) EA201991268A3 (sr)
ES (1) ES2709577T3 (sr)
HR (1) HRP20190243T1 (sr)
HU (1) HUE041384T2 (sr)
IL (3) IL228559A (sr)
LT (1) LT2691155T (sr)
ME (1) ME03353B (sr)
MX (2) MX339927B (sr)
NZ (1) NZ726386A (sr)
PL (1) PL2691155T3 (sr)
PT (1) PT2691155T (sr)
RS (1) RS58367B1 (sr)
SI (1) SI2691155T1 (sr)
SM (1) SMT201900114T1 (sr)
TR (1) TR201902180T4 (sr)
UA (1) UA116524C2 (sr)
ZA (1) ZA201605918B (sr)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8288557B2 (en) 2004-07-23 2012-10-16 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
AU2006283726C1 (en) 2005-08-24 2015-05-07 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
CN101678124A (zh) 2007-03-14 2010-03-24 恩多塞特公司 结合配体连接的微管溶素递药缀合物
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
CN101784565B (zh) 2007-06-25 2014-12-10 恩多塞特公司 含有亲水性间隔区接头的共轭物
MX2011012794A (es) 2009-06-03 2012-05-08 Immunogen Inc Metodos de conjugacion.
TWI672318B (zh) 2010-02-24 2019-09-21 美商免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
SMT201900549T1 (it) 2010-03-12 2019-11-13 Debiopharm Int Sa Molecole leganti il cd37 e loro immunoconiugati
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
CN114441757A (zh) 2011-04-01 2022-05-06 伊缪诺金公司 用于增加folr1癌症治疗的功效的方法
WO2013126797A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Purdue Research Foundation Cholecystokinin b receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
PL2890717T3 (pl) 2012-08-31 2020-08-10 Immunogen, Inc. Testy i zestawy diagnostyczne do wykrywania receptora folianu
WO2014055877A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
US20150306242A1 (en) * 2012-10-04 2015-10-29 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
HK1213148A1 (zh) * 2012-10-04 2016-06-30 Immunogen, Inc. 離子交換膜的從細胞結合劑細胞毒性劑綴合物中去除雜質的用途
AU2013331440A1 (en) 2012-10-16 2015-04-30 Endocyte, Inc. Drug delivery conjugates containing unnatural amino acids and methods for using
US8769557B1 (en) 2012-12-27 2014-07-01 The Nielsen Company (Us), Llc Methods and apparatus to determine engagement levels of audience members
WO2014134483A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9901647B2 (en) 2013-02-28 2018-02-27 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CN105007950B (zh) 2013-03-15 2019-01-15 诺华股份有限公司 抗体药物缀合物
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
CN105814079B (zh) 2013-08-30 2021-02-09 伊缪诺金公司 用于检测叶酸受体1的抗体和测定
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
RS59077B1 (sr) * 2014-03-11 2019-09-30 Regeneron Pharma Anti-egfrviii antitela i njihova primena
WO2016001485A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
EA201790334A1 (ru) 2014-08-12 2017-06-30 Новартис Аг Конъюгаты анти-cdh6 антитела с лекарственным средством
CA2965362A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Formation Biologics Inc. Egfr antibody-based combination therapy
CN106267225B (zh) * 2015-05-29 2020-03-06 上海新理念生物医药科技有限公司 三马来酰亚胺型连接子及其应用
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
CN108472361B (zh) 2015-06-08 2022-12-27 德彪发姆国际有限公司 抗cd37免疫缀合物及抗cd20抗体组合物
US20190194315A1 (en) 2015-06-17 2019-06-27 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CN108699144B (zh) * 2015-08-28 2022-07-19 德彪发姆国际有限公司 用于检测cd37的抗体和测定
KR102700777B1 (ko) 2015-09-17 2024-08-29 이뮤노젠 아이엔씨 항-folr1 면역접합체를 포함하는 치료제 조합
EP3380525B1 (en) 2015-11-25 2023-11-08 Immunogen, Inc. Pharmaceutical formulations and methods of use thereof
AU2017213858A1 (en) * 2016-02-05 2018-08-16 Immunogen, Inc. Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
CN108421048B (zh) * 2016-09-28 2021-04-20 首都医科大学附属北京世纪坛医院 纳米活性碳靶向药物递送系统、制备方法及其用途
US11278629B2 (en) 2016-11-02 2022-03-22 Debiopharm International, S.A. Methods for improving anti-CD37 immunoconjugate therapy
US10864279B2 (en) 2016-12-16 2020-12-15 Industrial Technology Research Institute Linker-drug and antibody-drug conjugate (ADC) employing the same
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
RU2022101392A (ru) * 2017-02-28 2022-03-02 Иммуноджен, Инк. Производные майтанзиноида с саморасщепляющимися пептидными линкерами и их конъюгаты
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
CN111867621A (zh) * 2018-01-18 2020-10-30 美真达治疗公司 用于耗尽cd134+细胞的组合物和方法
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
KR20210014684A (ko) 2018-05-30 2021-02-09 데비오팜 인터네셔날 에스 에이 항-cd37 면역접합체 투약 용법
CN111620927B (zh) * 2019-05-20 2022-11-11 烟台迈百瑞国际生物医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物中间体的一锅法制备工艺
AU2020307561A1 (en) * 2019-06-25 2022-01-20 Tva (Abc), Llc SSTR-targeted conjugates and formulations thereof
CA3146560A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 Cybrexa 2, Inc. Peptide conjugates of cytotoxins as therapeutics
MY209459A (en) 2019-07-10 2025-07-09 Cybrexa 3 Inc Peptide conjugates of microtubule-targeting agents as therapeutics
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
CA3251592A1 (en) 2022-02-17 2025-07-09 Novelty Nobility Inc. ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
AU2024292473A1 (en) 2023-07-19 2026-01-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc

Family Cites Families (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1043543A (en) 1912-02-15 1912-11-05 Robert H Shaw Poultry-house door.
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4137230A (en) * 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4664911A (en) 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
DE3584012D1 (de) 1985-01-22 1991-10-10 Saint Gobain Vitrage Verfahren zur herstellung eines pulvers auf basis von indium-formiat zur herstellung einer duennen beschichtung auf einem substrat, insbesondere auf glas.
GB8600582D0 (en) 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4859449A (en) 1987-09-14 1989-08-22 Center For Molecular Medicine And Immunology Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance
US5241078A (en) 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714149A (en) 1989-02-10 1998-02-03 Celltech Therapeutics Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
CA2048078A1 (en) * 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
SE470006B (sv) * 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
DK0563475T3 (da) 1992-03-25 2000-09-18 Immunogen Inc Konjugater af cellebindende midler og derivater af CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5556623A (en) * 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
WO1996039183A1 (en) * 1995-05-31 1996-12-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for targeted delivery of effector molecules
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5958872A (en) 1996-04-01 1999-09-28 Apoptosis Technology, Inc. Active survival domains of IGF-IR and methods of use
WO1998026747A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6462070B1 (en) * 1997-03-06 2002-10-08 The General Hospital Corporation Photosensitizer conjugates for pathogen targeting
US6371975B2 (en) * 1998-11-06 2002-04-16 Neomend, Inc. Compositions, systems, and methods for creating in situ, chemically cross-linked, mechanical barriers
ATE282092T1 (de) * 1997-06-11 2004-11-15 Borean Pharma As Trimerisierendes modul
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5958677A (en) 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
JP2002501721A (ja) 1997-08-01 2002-01-22 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト 多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
IL135148A0 (en) * 1997-10-03 2001-05-20 Galenica Pharmaceuticals Inc A polysaccharide conjugate and pharmaceutical compositions containing the same
US6121236A (en) * 1998-03-24 2000-09-19 The Children's Medical Center Corporation Multivalent ligands which modulate angiogenesis
EP1073667A2 (en) * 1998-04-28 2001-02-07 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
US5981564A (en) * 1998-07-01 1999-11-09 Universite Laval Water-soluble derivatives of paclitaxel, method for producing same and uses thereof
EP1098665B9 (en) 1998-07-13 2003-08-13 The Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
TW593241B (en) 1999-04-20 2004-06-21 Hoffmann La Roche Carbamic acid derivatives
AUPQ014799A0 (en) * 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
HK1049787B (en) 1999-10-01 2014-07-25 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
NZ517772A (en) 1999-11-24 2004-03-26 Immunogen Inc Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use
EP1242438B1 (en) 1999-12-29 2006-11-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US20020197266A1 (en) 2000-02-08 2002-12-26 Waldemar Debinski Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6632979B2 (en) 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US7097840B2 (en) * 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US20060062786A1 (en) 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
EP2796468A2 (en) 2001-01-05 2014-10-29 Pfizer Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
EP1373321A2 (en) 2001-01-29 2004-01-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
ATE337011T1 (de) * 2001-02-07 2006-09-15 Beth Israel Hospital Modifizierte psma-liganden und deren verwendung
EP1389090A2 (en) 2001-04-26 2004-02-18 Board of Regents, The University of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
JP2004533449A (ja) 2001-05-11 2004-11-04 ボード　オブ　リージェンツ，　ザ　ユニバーシティ　オブ　テキサス　システム Ｃｄ２６を発現している細胞に関連する疾患の治療としての抗ｃｄ２６モノクローナル抗体
EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
ATE535258T1 (de) 2001-06-01 2011-12-15 Cornell Res Foundation Inc Modifizierte antikörper gegen prostata- spezifisches membranantigen und ihre verwendungen
US6576802B2 (en) 2001-06-04 2003-06-10 Shell Oil Company One-step production of 1, 3-propanediol from ethylene oxide and syngas with a catalyst with a phospholanoalkane ligand
EP1455817B1 (en) 2001-12-11 2008-12-31 Merck & Co., Inc. Staphylococcus aureus exopolysaccharide and process
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
JP2005532258A (ja) 2002-01-03 2005-10-27 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫コンジュゲートの調製方法
US7591994B2 (en) * 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
AU2003265235A1 (en) 2002-04-26 2003-12-19 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
DK1507556T3 (en) 2002-05-02 2016-09-12 Wyeth Holdings Llc Calicheamicin derivative-carrier conjugates
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
CA2490423A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Biogen Idec Inc. Buffered formulations for concentrating antibodies and methods of use thereof
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
ES2314238T3 (es) * 2002-10-08 2009-03-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de oligosacaridos farmaceuticamente activos.
PT1558744E (pt) * 2002-10-30 2011-09-22 Nuevolution As Codificação enzimática
DK1578446T3 (en) 2002-11-07 2015-06-29 Immunogen Inc ANTI-CD33 ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR TREATING ACUTE MYELOID LEUKEMIA BY USING IT
JP4703566B2 (ja) 2003-05-14 2011-06-15 イムノゲン インコーポレーティッド 薬剤複合体組成物
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
CR20170291A (es) 2003-05-20 2017-07-27 Immunogen Inc Agentes citotoxicos mejorados que comprenden nuevos maitansinóides
CA2530172A1 (en) 2003-06-27 2005-02-10 Abgenix, Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US20050074425A1 (en) * 2003-07-02 2005-04-07 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
CA2542886A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-19 Neelima M. Bhat Enhanced b cell cytotoxicity of cdim binding antibody
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
EP1610818A4 (en) 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
US8470315B2 (en) 2004-04-13 2013-06-25 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
US20060073528A1 (en) * 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
WO2005112919A2 (en) 2004-05-19 2005-12-01 Medarex, Inc. Self-immolative linkers and drug conjugates
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
AU2004224925C1 (en) 2004-08-30 2011-07-21 Biotest Ag Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
AR052774A1 (es) 2004-10-08 2007-04-04 Wyeth Corp Inmunoterapia para trastornos autoinmunes
WO2006065533A2 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
CA2591148A1 (en) 2004-12-09 2006-06-15 Centocor, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
US7408030B2 (en) 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
ES2503719T3 (es) * 2005-02-11 2014-10-07 Immunogen, Inc. Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpos y de maitansinoides
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
EP1869084A2 (en) 2005-03-04 2007-12-26 Biogen Idec MA Inc. Methods of humanizing immunoglobulin variable regions through rational modification of complementarity determining residues
US20060233814A1 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Immunogen Inc. Elimination of heterogeneous or mixed cell population in tumors
GB2427360A (en) * 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
PL2233156T3 (pl) 2005-07-15 2013-09-30 Angiochem Inc Zastosowanie polipeptydów aprotyninowych jako nośników w koniugatach farmaceutycznych
JP2009503105A (ja) * 2005-08-03 2009-01-29 イミュノジェン・インコーポレーテッド 免疫複合体製剤
EP1940442A4 (en) * 2005-08-04 2009-08-19 Einstein Coll Med Phosphorylation of tau by abl
AU2006283726C1 (en) 2005-08-24 2015-05-07 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
EP1926498A2 (en) * 2005-09-22 2008-06-04 Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. Dextran and arabinogalactan conjugates of therapeutically active compounds
EP1940470B1 (en) 2005-09-26 2013-04-17 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and their use
EP2298308B1 (en) 2005-11-14 2013-01-16 University Of Southern California Integrin-binding small molecules
US7964415B2 (en) * 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
CL2007001536A1 (es) 2006-05-30 2008-01-25 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd22; polinucleotidos que los codifica; vector y celula huesped que los comprende; metodo de fabricacion; metodo de deteccion del anticuerpo en una muestra biologica; inmunoconjugado que comprende al anticuerpo; composicion que lo comprende y su uso para tratar trastornos proliferativos de celulas b.
NZ574215A (en) 2006-07-18 2012-07-27 Sanofi Aventis Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
US20080213349A1 (en) * 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
SI2019104T1 (sl) 2007-07-19 2013-12-31 Sanofi Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomaimicinske derivate, in njihova terapevtska uporaba
CN102083461B (zh) 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
HUE034763T2 (en) * 2008-04-30 2018-02-28 Immunogen Inc Crosslinkers and their use
GB0811743D0 (en) * 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
EP2355799A4 (en) * 2008-11-17 2012-09-05 Enzon Pharmaceuticals Inc CLEANABLE FUSOGENIC LIPIDS FOR NUCLEIC ACID RELIEF SYSTEMS
SG173152A1 (en) 2009-02-05 2011-08-29 Immunogen Inc Novel benzodiazepine derivatives
UY32560A (es) 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
MX2011012794A (es) 2009-06-03 2012-05-08 Immunogen Inc Metodos de conjugacion.
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
TW201117814A (en) 2009-10-02 2011-06-01 Sanofi Aventis New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
TWI672318B (zh) 2010-02-24 2019-09-21 美商免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
KR20110103182A (ko) 2010-03-12 2011-09-20 삼성전자주식회사 입체 영상 표시 장치
SMT201900549T1 (it) 2010-03-12 2019-11-13 Debiopharm Int Sa Molecole leganti il cd37 e loro immunoconiugati
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
US20120149732A1 (en) * 2010-12-14 2012-06-14 Alexander Chucholowski Multifunctional linkers and methods for the use thereof
KR20190089048A (ko) * 2011-02-15 2019-07-29 이뮤노젠 아이엔씨 컨쥬게이트의 제조방법
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
BR112013025228A2 (pt) 2011-03-29 2018-09-25 Immunogen Inc processo para fabricar conjugados de homogeneidade aperfeçoada
CN114441757A (zh) 2011-04-01 2022-05-06 伊缪诺金公司 用于增加folr1癌症治疗的功效的方法
US20130071482A1 (en) * 2011-09-20 2013-03-21 The University Of Kentucky Research Foundation Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
WO2013090590A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Immunogen, Inc. Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
HK1213148A1 (zh) 2012-10-04 2016-06-30 Immunogen, Inc. 離子交換膜的從細胞結合劑細胞毒性劑綴合物中去除雜質的用途
WO2014055877A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
US20150306242A1 (en) 2012-10-04 2015-10-29 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
US10253099B2 (en) * 2012-12-05 2019-04-09 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Conjugates of proteins and multivalent cell-penetrating peptides and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016202832B2 (en) 2018-05-10
US8795673B2 (en) 2014-08-05
PL2691155T3 (pl) 2019-06-28
KR102272828B1 (ko) 2021-07-05
JP6000329B2 (ja) 2016-09-28
US20140309406A1 (en) 2014-10-16
EA201991268A2 (ru) 2019-10-31
KR20140019414A (ko) 2014-02-14
US20170037080A1 (en) 2017-02-09
CY1121321T1 (el) 2020-05-29
IL250723A0 (en) 2017-06-29
IL258929B (en) 2019-03-31
KR20210082267A (ko) 2021-07-02
KR20220123130A (ko) 2022-09-05
EA201391398A1 (ru) 2014-02-28
US9428543B2 (en) 2016-08-30
US9914748B2 (en) 2018-03-13
JP2014514294A (ja) 2014-06-19
NZ712414A (en) 2016-12-23
JP6456885B2 (ja) 2019-01-23
US20180273581A1 (en) 2018-09-27
CN103717262B (zh) 2017-09-15
AU2020217301A1 (en) 2020-08-27
ES2709577T3 (es) 2019-04-16
MX339927B (es) 2016-06-16
US20120253021A1 (en) 2012-10-04
ME03353B (me) 2019-10-20
AU2018211331A1 (en) 2018-08-23
IL258929A (en) 2018-07-31
AU2018211331B2 (en) 2020-05-14
SI2691155T1 (sl) 2019-03-29
KR20230128583A (ko) 2023-09-05
TR201902180T4 (tr) 2019-03-21
US20240156976A1 (en) 2024-05-16
KR102351886B1 (ko) 2022-01-17
AU2024200123A1 (en) 2024-01-25
ZA201605918B (en) 2021-07-28
NZ726386A (en) 2022-09-30
IL250723B (en) 2018-05-31
US20200330604A1 (en) 2020-10-22
NZ616509A (en) 2015-10-30
KR20220009505A (ko) 2022-01-24
AU2012236398B2 (en) 2016-02-11
PT2691155T (pt) 2019-02-19
CA2831467C (en) 2020-03-24
US20220133899A1 (en) 2022-05-05
JP2023083504A (ja) 2023-06-15
EA201991268A3 (ru) 2020-01-31
EP2691155B1 (en) 2018-11-14
JP2019056003A (ja) 2019-04-11
DK2691155T3 (en) 2019-03-04
UA116524C2 (uk) 2018-04-10
KR20200042965A (ko) 2020-04-24
AU2020217301B2 (en) 2023-10-19
JP6797885B2 (ja) 2020-12-09
LT2691155T (lt) 2019-02-25
AU2012236398A1 (en) 2013-05-16
JP7269210B2 (ja) 2023-05-08
HUE041384T2 (hu) 2019-05-28
AU2016202832A1 (en) 2016-05-19
KR102103302B1 (ko) 2020-04-23
MX2013011215A (es) 2013-10-30
US11090390B2 (en) 2021-08-17
CN103717262A (zh) 2014-04-09
SMT201900114T1 (it) 2019-02-28
EP3545977A1 (en) 2019-10-02
JP2016204385A (ja) 2016-12-08
HRP20190243T1 (hr) 2019-03-22
IL228559A0 (en) 2013-12-31
CN107537040A (zh) 2018-01-05
IL228559A (en) 2017-03-30
EP2691155A2 (en) 2014-02-05
MX369659B (es) 2019-11-15
CA2831467A1 (en) 2012-10-04
BR112013025225A2 (pt) 2018-09-25
JP2021035990A (ja) 2021-03-04
EA033468B1 (ru) 2019-10-31
US10435432B2 (en) 2019-10-08
US11744900B2 (en) 2023-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11744900B2 (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
WO2012135517A2 (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
EP2691117A2 (en) Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
HK40014867A (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
HK1194700A (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
HK1194700B (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
NZ616509B2 (en) Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
NZ712414B2 (en) Preparation of antibody maytansinoid conjugates