JPS61219399A - 核酸塩基配列決定法 - Google Patents
核酸塩基配列決定法Info
- Publication number
- JPS61219399A JPS61219399A JP6066585A JP6066585A JPS61219399A JP S61219399 A JPS61219399 A JP S61219399A JP 6066585 A JP6066585 A JP 6066585A JP 6066585 A JP6066585 A JP 6066585A JP S61219399 A JPS61219399 A JP S61219399A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- nucleic acid
- double
- base sequencing
- acid base
- Prior art date
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- Pending
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は、核酸の分析方法に係り、特に非放射性標識に
好適な、核酸断片の調製を可能とする核酸塩基配列決定
法に関する。
好適な、核酸断片の調製を可能とする核酸塩基配列決定
法に関する。
従来の核酸塩基配列決定法の１つに、チェーンターミネ
ータ法がある（細胞工学、ＶＯ／、、１．Ａ１１ｐｐ、
９３〜１０１ （１９８２））。第１図に、従来方式に
よる塩基配列決定法の模式図を示す。拳法では、それぞ
れ異なる４種の相補鎖伸長停止試薬（ｄｄＡ 、 ｄｄ
ｅ 、 ｄｄＧ 、 ｄｄＴ ）を含む４種の相補鎖合
成反応（ｂ）の生成物（Ｃ）に対し、ホルムアミドを添
加したり、加熱等の変性処理（ｄ）を施し、デオキシリ
ボ核酸（以下、ＤＮＡという）をすべて１本鎖としてか
ら各反応生成物毎に異なる泳動路で電気泳動分離する（
ｅ）。鋳型ＤＮＡは、分子量が大きい（約２５万ドルト
ン）のでほとんど泳動されずに試料注入部にとどまるが
、相補鎖ＤＮＡ断片は分子量が小さい（３５０〜３５，
０００ドルトン程度）ので、その分子量に応じた距離だ
け泳動する。その結果、１塩基ずつ鎖長の異なるＤＮＡ
断片として、分子量分離がなされるので、これを分子量
の小さい順に解釈して行けばＤＮＡの塩基配列を読み取
れる。
ータ法がある（細胞工学、ＶＯ／、、１．Ａ１１ｐｐ、
９３〜１０１ （１９８２））。第１図に、従来方式に
よる塩基配列決定法の模式図を示す。拳法では、それぞ
れ異なる４種の相補鎖伸長停止試薬（ｄｄＡ 、 ｄｄ
ｅ 、 ｄｄＧ 、 ｄｄＴ ）を含む４種の相補鎖合
成反応（ｂ）の生成物（Ｃ）に対し、ホルムアミドを添
加したり、加熱等の変性処理（ｄ）を施し、デオキシリ
ボ核酸（以下、ＤＮＡという）をすべて１本鎖としてか
ら各反応生成物毎に異なる泳動路で電気泳動分離する（
ｅ）。鋳型ＤＮＡは、分子量が大きい（約２５万ドルト
ン）のでほとんど泳動されずに試料注入部にとどまるが
、相補鎖ＤＮＡ断片は分子量が小さい（３５０〜３５，
０００ドルトン程度）ので、その分子量に応じた距離だ
け泳動する。その結果、１塩基ずつ鎖長の異なるＤＮＡ
断片として、分子量分離がなされるので、これを分子量
の小さい順に解釈して行けばＤＮＡの塩基配列を読み取
れる。
従来は、合成反応試薬中に３２ｐ、３ｊＳなどで放射性
標識した基質を加える（第１図ではＡ）ことで、相補鎖
ＤＮＡｔ−放射化し、オートラジオグラフィーにより高
感度で泳動分離帯を検出、同定（〜数Ｐｇ／泳動分離帯
）していた。本操作は、非密封放射性同位体匣用の化学
トレーサー実験となるので、実施区域廃棄等に強い制限
が加わり、ＤＮＡ塩基配列決定の簡便化、迅速化の障害
となっていた。また、第１図（ｅ）に括弧付き泳動分離
帯として示したように、低分子量のいくつかのＤＮＡ断
片は、標識化合物を取り込まないために放射活性を持た
ないので、オートラジオグラフィーでは検出できない。
標識した基質を加える（第１図ではＡ）ことで、相補鎖
ＤＮＡｔ−放射化し、オートラジオグラフィーにより高
感度で泳動分離帯を検出、同定（〜数Ｐｇ／泳動分離帯
）していた。本操作は、非密封放射性同位体匣用の化学
トレーサー実験となるので、実施区域廃棄等に強い制限
が加わり、ＤＮＡ塩基配列決定の簡便化、迅速化の障害
となっていた。また、第１図（ｅ）に括弧付き泳動分離
帯として示したように、低分子量のいくつかのＤＮＡ断
片は、標識化合物を取り込まないために放射活性を持た
ないので、オートラジオグラフィーでは検出できない。
以上、２つの難点を排除するためには、試料を放射化せ
ずに、ＤＮＡ泳動分離帯を直接高感度で検出できればよ
い。非放射化ＤＮＡ検出法としては、銀染色法、エチジ
ウムプロミド等の蛍光色素による蛍光染色法があるが、
いずれも２本鎖ＤＮＡに対しては、高い感度（１〜５ｎ
ｇ）を有すが１本鎖ＤＮＡに対しては、１桁程度感度が
悪いので、従来のチェーンターミネータ法の場合の様に
１本鎖としてＤＮＡ断片が分離されている場合には、適
用できなかった。
ずに、ＤＮＡ泳動分離帯を直接高感度で検出できればよ
い。非放射化ＤＮＡ検出法としては、銀染色法、エチジ
ウムプロミド等の蛍光色素による蛍光染色法があるが、
いずれも２本鎖ＤＮＡに対しては、高い感度（１〜５ｎ
ｇ）を有すが１本鎖ＤＮＡに対しては、１桁程度感度が
悪いので、従来のチェーンターミネータ法の場合の様に
１本鎖としてＤＮＡ断片が分離されている場合には、適
用できなかった。
本発明の目的は、チェーンターミネータ法による核酸塩
基配列決定に銀染色法、蛍光染色法等の核酸検出法を適
用するに際し、検出法の能力を最大限に発揮させるため
、従来法では、１本鎖ＤＮＡとして泳動分離していたＤ
ＮＡ断片を、２本鎖ＤＮＡとして泳動分離することを可
能とする方法を提供することにある。
基配列決定に銀染色法、蛍光染色法等の核酸検出法を適
用するに際し、検出法の能力を最大限に発揮させるため
、従来法では、１本鎖ＤＮＡとして泳動分離していたＤ
ＮＡ断片を、２本鎖ＤＮＡとして泳動分離することを可
能とする方法を提供することにある。
チェーンターミネータ法による核酸塩基配列決定法は、
原理的には電気泳動法により分子量分離したＤＮＡ断片
の相対的位置関係を何らかの方法で明らかにしさえすれ
ば、塩基配列を決定できるので、従来の放射線検出法の
代りとして取扱いが簡単な銀染色法、蛍光染色法などの
非放射線による直接検出法にも適用可能である。
原理的には電気泳動法により分子量分離したＤＮＡ断片
の相対的位置関係を何らかの方法で明らかにしさえすれ
ば、塩基配列を決定できるので、従来の放射線検出法の
代りとして取扱いが簡単な銀染色法、蛍光染色法などの
非放射線による直接検出法にも適用可能である。
ところで、従来のチェーンターミネータ法では、電気泳
動分離帯中に含まれるＤＮＡ断片はすべて１本鎖である
。一方、銀染色法、蛍光染色法は、２本鎖ＤＮＡに対し
ては１１−１Ｏｎ／泳動帯の感度を有すが、１本鎖ＤＮ
Ａに対しては、１桁悪い感度しか有さないと見積られて
いる（蛋白質・核酸・酵素、Ｖｏｔ２７．４１０ 、ｐ
ｐｌ −３。
動分離帯中に含まれるＤＮＡ断片はすべて１本鎖である
。一方、銀染色法、蛍光染色法は、２本鎖ＤＮＡに対し
ては１１−１Ｏｎ／泳動帯の感度を有すが、１本鎖ＤＮ
Ａに対しては、１桁悪い感度しか有さないと見積られて
いる（蛋白質・核酸・酵素、Ｖｏｔ２７．４１０ 、ｐ
ｐｌ −３。
（１９８２）’ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３ｉｏｐｈｙｓ、
３ｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、。
３ｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、。
ＶｏＺ、１０２＋ｐｐ５３−５８ （１９８１））。
それ故、検出法を非放射性方式に変えて、充分な染色濃
度、蛍光強度を得るため１本鎖ＤＮＡを２本鎖ＤＮＡ化
することが有効である。本発明では、相補鎖合成反応時
に生ずる２本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡの１本鎖部分とを
切断した後泳動分離したことで、非放射性検出方式によ
るＤＮＡ断片の高感度検出を可能とした。
度、蛍光強度を得るため１本鎖ＤＮＡを２本鎖ＤＮＡ化
することが有効である。本発明では、相補鎖合成反応時
に生ずる２本鎖ＤＮＡを、鋳型ＤＮＡの１本鎖部分とを
切断した後泳動分離したことで、非放射性検出方式によ
るＤＮＡ断片の高感度検出を可能とした。
以下、本発明の一実施例を第２図により説明する。まず
、クローニングベクターである複製聾Ｍ１３７アージＤ
ＮＡ （ｍｐｌｌ）（ａ’）′ｔ−制限酵素ＢａｍＨＩ
で消化し開裂した後（ｂ’） 、当部位にヒトリンパ球
由来のＤ Ｎ Ａ（ａ）ｔ ＢａｍＨＩで消化したＤＮ
Ａ断片（ｂ）ｔ−、クローニングし、組換体ＤＮＡ（Ｃ
） を作製した。これを塩化カルシウム法にて、大腸菌
（ＪＭ１０３ ）体内に導入し形質転換菌（ｄ）を得た
。
、クローニングベクターである複製聾Ｍ１３７アージＤ
ＮＡ （ｍｐｌｌ）（ａ’）′ｔ−制限酵素ＢａｍＨＩ
で消化し開裂した後（ｂ’） 、当部位にヒトリンパ球
由来のＤ Ｎ Ａ（ａ）ｔ ＢａｍＨＩで消化したＤＮ
Ａ断片（ｂ）ｔ−、クローニングし、組換体ＤＮＡ（Ｃ
） を作製した。これを塩化カルシウム法にて、大腸菌
（ＪＭ１０３ ）体内に導入し形質転換菌（ｄ）を得た
。
形質転換菌ｅＴＹ培地、２−で培養し、菌体外に分泌さ
れる感染型Ｍ１３ｍｐＨの組換体（ｅ）を回収した（約
１０μｇ〜２ｐｍｏｔ）。
れる感染型Ｍ１３ｍｐＨの組換体（ｅ）を回収した（約
１０μｇ〜２ｐｍｏｔ）。
本ＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡで、相補鎖合成反応時の鋳型
となる。
となる。
次の相補鎖合成反応に先立ち、まず、塩基配列決定する
ためクローニングしたＤＮＡ（ｂｌ）の上流域に特異的
に対合するオリゴヌクレオチド（〜１０ ｐｍｏｔ ）
をアニーリングする（第１図（ａ））。
ためクローニングしたＤＮＡ（ｂｌ）の上流域に特異的
に対合するオリゴヌクレオチド（〜１０ ｐｍｏｔ ）
をアニーリングする（第１図（ａ））。
次にＤＮＡを構成する４種のヌクレオチドに対応する４
種の相補鎖合成反応を行い、末端に相補鎖合成停止剤を
結合した種々の長さの相補鎖ＤＮＡを合成する（ （ｆ
） ）。
種の相補鎖合成反応を行い、末端に相補鎖合成停止剤を
結合した種々の長さの相補鎖ＤＮＡを合成する（ （ｆ
） ）。
これら一部、２本鎖、残りは１本鎖の鋳ＩＪＩＩ ＤＮ
Ａ−−一相補鎖ＤＮＡ複合体（ｆ）に対し、１本鎖ＤＮ
Ａのみを特異的に切断するＤＮＡ消化酵素：８１ヌクレ
アーゼ１ユニーツトを作用させると、（ｇ）に示す通シ
、低分子量のモノヌクレオチド、あるいは、ジヌクレオ
チドに分解される。しかし２本鎖部分は、未消化のまま
残る。
Ａ−−一相補鎖ＤＮＡ複合体（ｆ）に対し、１本鎖ＤＮ
Ａのみを特異的に切断するＤＮＡ消化酵素：８１ヌクレ
アーゼ１ユニーツトを作用させると、（ｇ）に示す通シ
、低分子量のモノヌクレオチド、あるいは、ジヌクレオ
チドに分解される。しかし２本鎖部分は、未消化のまま
残る。
このように処理されたＤＮＡ断片混合物（全量１μｇ）
を、厚さ０．５間、泳動路中７ｆｌの１２％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、分子量分離しＤＮＡを銀
染色で染色すると、（ｈ）に示すように、細分化された
鋳型ＤＮＡを先頭にした１塩基対ずつ長さの異なる２本
鎖ＤＮＡ断片の電気泳動分離像が得られるので、これを
解読し、挿入ＤＮＡ （ｂｌ）の塩基配列を決定するこ
とができる。
を、厚さ０．５間、泳動路中７ｆｌの１２％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、分子量分離しＤＮＡを銀
染色で染色すると、（ｈ）に示すように、細分化された
鋳型ＤＮＡを先頭にした１塩基対ずつ長さの異なる２本
鎖ＤＮＡ断片の電気泳動分離像が得られるので、これを
解読し、挿入ＤＮＡ （ｂｌ）の塩基配列を決定するこ
とができる。
本発明によれば、２本鎖ＤＮＡ断片混合物を、その鎖長
に応じて分子量分離できるので、銀染色法、蛍光色素染
色法などの非放射性ＤＮＡ検出法の検出能力を充分に発
揮させることができる。また３２Ｐ、”Ｓなどの非密封
放射性同位体をＤＮＡの標識物として使用することなく
ＤＮＡの塩基配列を決定できるので、これを、通常の実
験施設内で簡便に行うことができると同時に、実験者に
放射線障害を与えるおそれが全く無いという効果がある
。
に応じて分子量分離できるので、銀染色法、蛍光色素染
色法などの非放射性ＤＮＡ検出法の検出能力を充分に発
揮させることができる。また３２Ｐ、”Ｓなどの非密封
放射性同位体をＤＮＡの標識物として使用することなく
ＤＮＡの塩基配列を決定できるので、これを、通常の実
験施設内で簡便に行うことができると同時に、実験者に
放射線障害を与えるおそれが全く無いという効果がある
。
第１図は、放射性標識化合物を使用した従来のチェーン
ターミネータ法による核酸塩基配列決定法の模式図、第
２図は、本発明を採用した改良チェー／ターミネータ法
の手順を示す模式図である。 ヘ ヘ
噂ＩＪ
％ 。 一一
ターミネータ法による核酸塩基配列決定法の模式図、第
２図は、本発明を採用した改良チェー／ターミネータ法
の手順を示す模式図である。 ヘ ヘ
噂ＩＪ
％ 。 一一
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、チェーンターミネータ法による核酸塩基配列決定に
おいて、相補鎖合成反応により生成する鋳型デオキシリ
ボ核酸と相補鎖デオキシリボ核酸との複合体に対し、複
合体の１本鎖部分のみを細分化する酵素を作用させ、２
本鎖部分を未反応のまま残し、これを分子量分離するこ
とを特徴とする核酸塩基配列決定法。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の核酸塩基配列決定法
において、電気泳動法により２本鎖デオキシリボ核酸の
分子量分離を行い、銀染色法あるいは、蛍光染色法によ
り、デオキシリボ核酸断片を含む、電気泳動分離帯の検
出を行うことを特徴とする核酸塩基配列決定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6066585A JPS61219399A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | 核酸塩基配列決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6066585A JPS61219399A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | 核酸塩基配列決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61219399A true JPS61219399A (ja) | 1986-09-29 |
Family
ID=13148852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6066585A Pending JPS61219399A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | 核酸塩基配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61219399A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05308998A (ja) * | 1987-01-14 | 1993-11-22 | Univ Harvard | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| EP0610615A1 (en) * | 1993-02-10 | 1994-08-17 | Promega Corporation | Non-radioactive DNA sequencing |
-
1985
- 1985-03-27 JP JP6066585A patent/JPS61219399A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05308998A (ja) * | 1987-01-14 | 1993-11-22 | Univ Harvard | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| EP0610615A1 (en) * | 1993-02-10 | 1994-08-17 | Promega Corporation | Non-radioactive DNA sequencing |
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