JPH1146800A - オリゴヌクレオチドの分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安全かつ迅速なＤＮＡ配列を決定するため方
法の提供。 【解決手段】 オリゴヌクレオチド、ＤＮＡの配列決定
の際に生ずるオリゴヌクレオチド断片の新規な分析法。
発色団（発色剤、着色剤）若しくは蛍光物質（蛍光発生
剤）群を使用して、配列決定操作により生じるＤＮＡ断
片を標識し、かつ分離の際に、オリゴヌクレオチド、Ｄ
ＮＡ断片の検出及び特性化を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡ配列決定法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮ
Ａ（リボ核酸）の信頼しうる配列分析法の開発は、組換
ＤＮＡ技術および遺伝子工学の成功に対する１つの鍵と
なっている。近代分子生物学の他の技術と共に使用すれ
ば、核酸配列を決定することによって動物、植物および
ウイルスのゲノムを所定の化学構造を有する個々の遺伝
子に分解しかつ分析することを可能にする。生物学的分
子の機能はその構造により決定されるので、遺伝子の構
造の決定は遺伝情報のこの基本単位を有用な方法で最終
的に処理するのに重要である。遺伝子を単離しかつ特性
化することができれば、これらは原蛋白質が有するもの
とは異なる性質を有する遺伝子生成物（すなわち蛋白
質）の産生を可能にするように改変することができ、そ
の構造における所望の変化をもたらすことができる。天
然もしくは合成の遺伝子が組み込まれる微生物を化学
「工場」として使用し、たとえばインタフェロン、成長
ホルモンおよびインシュリンのような微量なヒト蛋白質
を多量に産生させることができる。植物に遺伝情報を与
えて、これらを過酷な環境条件で生存させ、あるいはそ
れ自身の栄養素を生産することができる。

【０００３】近代の核酸配列決定法の開発によって、各
種の技術が並行的に開発されている。その１つは、ＤＮ
Ａの小型乃至中型ストランドを細菌プラスミド、バクテ
リオファージ、あるいは小動物のウイルスにクローン化
させる簡単かつ確実な方法の出現であった。これは、化
学分析するのに充分な量で純粋なＤＮＡを産生すること
を可能にした。他の開発は、オリゴヌクレオチドをその
寸法に応じて高度に解離、分離するためのゲル電気泳動
法の完成であった。しかしながら、開発の鍵となる概念
は、一連の寸法群のクローン化され、かつ精製されたＤ
ＮＡ断片を生成する方法の導入である。これら断片はそ
の種々な長さの集合として、もとのＤＮＡ分子を構成す
るヌクレオチドの配列を決定するのに必要とされる情報
を含んでいる。これら断片群を生成させるための２つの
異なる方法が広範に使用されており、その１つはサンガ
ーにより開発されたもの〔エフ・サンガー、エス・ニッ
クレンおよびエー・アール・クールソン、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、
第７４巻 第５４６３頁（１９７７）およびエー・ジェ
ー・エッチ・スミス、メソッヅ・イン・エンザイモロジ
ー、第６５巻 第５６−５８０頁（１９８０）〕であ
り、もう１つはマキサムおよびギルバートにより開発さ
れたもの〔エー・エム・マキサムおよびダブリュー・ギ
ルバート、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６５
巻 第４９９−５５９頁（１９８０）〕である。

【０００４】サンガーにより開発された方法をジデオキ
シチェーンターミネーション法と呼ぶ。この方法の最も
一般的に使用される変法においては、ＤＮＡ断片をたと
えばＭ13のような一本鎖ＤＮＡファージにクローン化す
る。これらのファージＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片による相補的ストランドのプライム合成
に対する鋳型として使用することができる。このプライ
マーは合成オリゴヌクレオチドまたは制限断片のいずれ
かであって、クローン化挿入体の3'末端近くでＭ１３ベ
クターの領域に特異的にハイブリド化する原組換ＤＮＡ
から単離される。

【０００５】４種の配列決定反応のそれぞれにおいて、
プライム合成は４種の可能なデオキシヌクレオチドのう
ちの１種のジデオキシ誘導体を充分量存在させて行なわ
れ、その結果、鎖の成長はこれらの「死端部」ヌクレオ
チドを組み込むことによりランダムに終了される。デオ
キシ型に対するジデオキシ型の相対濃度は、ゲル電気泳
動により分離されうる全ての可能な鎖長に対応する長さ
が生ずるように調整される。４種のプライム合成反応の
それぞれから得られる生成物を、ポリアクリルアミドゲ
ルの個々のトラック（レーン）で電気泳動により分離す
る。成長した鎖中に組み込まれた放射能標識を使用し
て、各電気泳動トラックにおけるＤＮＡパターンのオー
トラジオグラフを作成する。クローン化ＤＮＡにおける
デオキシヌクレオチドの配列を、４つのレーンにおける
バンドパターンを解析して決定する。

【０００６】マキサムおよびギルバードにより開発され
た方法は、精製ＤＮＡを化学処理して、サンガー法によ
り得られるものと同様な一連の寸法群のＤＮＡ断片を生
成させる。3'末端もしくは5'末端のいずれかが放射性リ
ン酸で標識された一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡをこの方
法により配列決定することができる。４種の反応群にお
いて、４種のヌクレオチド塩基のうち１種もしくは２種
につき化学処理により開裂を引き起こさせる。開裂は３
段階の過程を含む。すなわち、塩基の修飾、修飾された
塩基の糖成分からの除去、およびこの糖成分におけるス
トランド切断である。反応条件は、末端標識された断片
の大部分がゲル電気泳動により分離しうるサイズ（典型
的には１〜４００個のヌクレオチド）となるように調整
される。電気泳動、オートラジオグラフおよびパターン
解析が、サンガー法とほぼ同様に行なわれる。（化学処
理によって、２つのＤＮＡ断片が必らず生ずるが、末端
標識を有する断片のみがオートラジオグラフで検出され
る）。

【０００７】これらのＤＮＡ配列決定法は、広範に使用
され、かつそれぞれ幾つかの変法を有する。それぞれの
場合、１回の反応群から得られる配列の長さは、主とし
て電気泳動に使用したポリアクリルアミドゲルの分離能
により制限される。典型的には、１回のゲルトラックか
ら２００〜４００個の塩基を解読することができる。こ
れら両方法ではうまくいくが重大な欠点を有する。これ
は主として電気泳動に伴なう問題である。１つの問題
は、ゲルにおけるＤＮＡバンドの位置を決定するため標
識として放射性標識を使用する必要があることである。
燐−３２の短い半減期、すなわち放射性標識剤の不安定
性を考慮せねばならず、また放射能廃棄および取り扱い
の問題を考慮せねばならない。より重要なことは、オー
トラジオグラフィーの性質（放射性ゲルバンドのフイル
ム像はバンド自身よりも幅広いものである）および４種
の異なるゲルトラックの間のバンド位置の比較（これは
バンド移動の点で均一に挙動したり、しなかったりす
る）によって、観察されるバンドの分離、すなわちゲル
から解読しうる配列の長さが制限される。さらに、トラ
ック毎の不規則性はオートラジオグラフの自動読みとり
を困難にし、現在では、これらの不規則性の補正はコン
ピュータによるよりも肉眼の方が良好である。オートラ
ジオグラフは、人為的に「解読」する必要性があるため
時間がかかり、面倒かつ誤差の多いものである。さら
に、実際に電気泳動を行ないながらゲルパターンを解読
することは不可能であり、隣接するバンドを分離するに
は解離が不充分である際にも電気泳動を終了することが
できず、或る基準化した時間で電気泳動を終了させ、か
つ配列解読を開始する前に放射能写真が現像されるのを
待たねばならない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡ配列
決定法における電気泳動工程に伴なうこれらおよびその
他の問題を解決し、かつ当業界に著しい進歩をもたらす
ものと信じられる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】要するに、本発明はオリ
ゴヌクレオチド、ＤＮＡの配列決定の際に生ずるオリゴ
ヌクレオチド断片の新規な分析法であって、４種の発色
団（発色剤、着色剤）若しくは蛍光物質（蛍光発生剤）
群を使用して、配列決定操作により生じるＤＮＡ断片を
標識し、かつゲルによる電気泳動で分離される際に、オ
リゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片の検出及び特性化を可能
にする。この検出には、標識バンドがゲル中を移動する
際に、これらを監視しうる吸光若しくは蛍光光度計を使
用する。

【００１０】さらに本発明はＤＮＡ断片の新規な分析装
置（系）をも含み、この装置（系）は、発色性もしくは
螢光性標識されたＤＮＡ断片（これら断片は種々異なっ
て標識される）の原料と、電気泳動ゲルを含む領域と、
標識ＤＮＡ断片を前記領域へ導入する手段と、標識ＤＮ
Ａ断片がゲル中を移動して、これにより分離される際に
前記標識ＤＮＡ断片をモニターしまたは検出する光度測
定手段とを含むものである。

【００１１】本発明の目的は、ＤＮＡの新規な配列分析
法を提供することである。

【００１２】本発明の他の目的は、ＤＮＡ断片の新規な
分析装置（系）を提供することである。

【００１３】特に、本発明の目的は、ＤＮＡの配列分析
に対する改良方法を提供することである。

【００１４】本発明のこれらおよびその他の目的および
利点は、添付図面を参照して以下の詳細な説明から明ら
かとなるであろう。

【００１５】サンガー法に使用するための標識プライマ
ーの設計 サンガーのジデオキシチェーンターミネーション法に基
づく方法を含め、ＤＮＡ配列決定の従来法においては、
単一の放射性標識、すなわち燐−３２を使用して全ての
バンドをゲル上で同定する。この方法は、４種の合成反
応で生じた断片群を別々のゲルトラックにかけることを
必要とし、異なるトラックにおけるバンド移動度を比較
することに伴なう問題が生ずる。この問題は、本発明に
おいて、それぞれ異なる最大吸収もしくは螢光を有する
４種の発色剤もしくは螢光発色剤の群を使用することに
より解決される。これら標識のそれぞれを、プライマー
へ化学結合させて断片ストランドの合成を開始させるの
に使用する。次いで、それぞれ標識されたプライマーを
ジデオキシヌクレオチドの１種と組み合せ、これを使用
してＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片によるプライム
合成反応に使用する。

【００１６】プライマーは次の特性を持たねばならな
い： (1)ポリメラーゼでチェーンを延長させるため遊離の3'
ヒドロキシル基を持たねばならない。 (2)クローン化挿入体の3'の特有の領域に相補的でなけ
ればならない。 (3)ハイブリドして独特の安定な二本鎖を形成するのに
充分な長さでなければならない。 (4)発色団または螢光発色剤はハイブリド化を妨げた
り、あるいはポリメラーゼによる3'末端延長を妨げては
ならない。

【００１７】上記条件１、２および３は、Ｍ１３ベクタ
ーを用いるサンガー型配列決定に一般的に使用される数
種の合成オリゴヌクレオチドプライマーにより満たされ
る。この種のプライマーの１つは１２mer 5' ＴＣＡ
ＣＧＡ ＣＧＴ ＴＧＴ 3' であり、ここでＡ、
Ｃ、ＧおよびＴはＤＮＡの４種の異なるヌクレオチド成
分を示し、Ａはアデノシン、Ｃはシトシン、Ｇはグアノ
シン、Ｔはチミジンを示す。

【００１８】発色性もしくは螢光性標識の結合について
は本出願人による１９８３年１２月２０日付け出願の米
国特許出願第５６５０１０号に記載されており、その開
示を参考のためここに引用する。使用する方法は、オリ
ゴヌクレオチドプライマーの合成における最後の付加と
して5'末端に脂肪族アミノ基を導入することである。こ
の反応性アミノ基は次いで広範な種類のアミノ反応性発
色剤および（または）螢光発生剤と容易に結合すること
ができる。この方法は、上記条件４による標識プライマ
ーにつき好適である。

【００１９】使用する４種の染料は、高い吸光係数およ
び（または）比較的高い螢光量子収率を持たねばならな
い。さらに、充分に離れた最大吸収および（または）最
大放出を持たねばならない。この種の４種のアミノ反応
性染料の代表的なものは次の通りである：

【００２０】

【表１】

【００２１】これらの染料はＭ１３プライマーに結合し
ており、この結合物を２０％ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動にかける。標識されたプライマーは、ゲルにお
けるその吸収と螢光とにより検出することができる。４
種の標識プライマーは全て同一の電気泳動移動度を有す
る。染料結合されたプライマーは、ＤＮＡに特異的にハ
イブリドする能力を保持するが、これは配列決定反応に
一般に使用される誘導体化していないオリゴヌクレオチ
ドと置換できることにより示される。

【００２２】マキサム／ギルバート法と共に使用するＤ
ＮＡ末端標識 マキサム／ギルバート法によるＤＮＡ配列決定において
は、決定すべき配列を有するＤＮＡ断片の末端を標識せ
ねばならない。これは、従来、放射性ヌクレオチドを用
いて酵素的に行なわれている。本発明に開示する染料検
出方法と組み合せてマキサム／ギルバート法を使用する
ためには、ＤＮＡ断片を染料で標識せねばならない。こ
れを行ないうる１つの方法を図１に示す。或る種の制限
エンドヌクレアーゼは、いわゆるＤＮＡ開裂の生成物と
して知られている3'オーバーハングを生成する。これら
の酵素は、「付着性末端」すなわち二本鎖ＤＮＡの末端
における一本鎖ＤＮＡの短い延長部を生成する。この領
域はＤＮＡの相補的部分とアニールし、酵素リガーゼに
よって共有結合され二本鎖ＤＮＡとなる。このようにし
て、ＤＮＡストランドの一方が検出可能な成分に共有結
合される。この成分は染料、アミノ基または保護アミノ
基（これは化学反応の後に脱保護されて染料と反応させ
ることができる）とすることができる。

【００２３】配列決定反応 ジデオキシ配列決定反応はエー・ジェー・エッチ・スミ
スの標準法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６
５巻、第５６−５８０頁（１９８０）〕で行なわれる
が、必要に応じ、規模を拡大して検出すべき各バンドに
おいて充分なシグナル強度を与えることができる。反応
はそれぞれ異なる反応につき異なる着色プライマーを使
用して行なわれ、たとえば「Ａ」反応についてはＦＩＴ
Ｃ、「Ｃ］反応についてはＥＩＴＣ、「Ｇ」反応につい
てはＴＭＲＩＴＣ、「Ｔ］反応についてはＸＲＩＴＣが
使用される。配列決定反応には、放射標識したヌクレオ
チド三リン酸を必要としない。

【００２４】マキサム／ギルバート配列決定反応は常法
〔エス・エフ・ギル、アルドリッチヒミカ・アクタ、第
１６（３）巻 第５９−６１頁（１９８３）〕で行なわ
れるが、末端標識は１種もしくは４種の着色染料のいず
れかとし、あるいは後に染料と反応しうる遊離もしくは
保護アミノ基である。

【００２５】ゲル電気泳動 配列決定反応の１部を組み合せて、図２に示した５％ポ
リアクリルアミドカラム１０にその上方の貯槽１２から
充填する。混合物における４種の異なる反応物の相対量
は、染料／ＤＮＡ結合物のそれぞれからほぼ同じ螢光性
もしくは吸収性シグナル強度を与えるように実験的に調
整される。これにより、染料吸光係数と染料螢光収量と
検出器感度などとにおける差を補償することができる。
カラム１０に高電圧をかけて、ゲル中に標識ＤＮＡ断片
を電気泳動させる。一ヌクレオチドだけ長さの異なる標
識ＤＮＡ断片が、このゲルマトリックスにおいて電気泳
動により分離される。ゲルカラム１０の底部あるいはそ
の近傍において、ＤＮＡのバンドが互いに分離され、か
つ検出器１４を通過する（これについては、以下に詳細
に説明する）。

【００２６】検出器１４はゲル中のＤＮＡの螢光または
発色バンドを検出してその色を決定し、したがってそれ
らに対応するヌクレオチドを検出する。この情報はＤＮ
Ａ配列を与える。

【００２７】検出 ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いて、長さで分
離された標識分子を検出しうる多くの異なる方法が存在
する。以下、４種の代表的方式を説明する。すなわち、
(i)種々異なる染料につき異なる波長の光により励起さ
れた螢光の検出、(ii)種々異なる染料につき同じ波長を
有する光により励起された螢光の検出、(iii)ゲルから
の分子の溶出および化学発光による検出、並びに(iv）
分子による光の吸収による検出。方式(i)および(ii)に
おいて、螢光検出器は次の要件を満たさねばならない。
(a)励起光線は、バンドの幅よりも実質的に大きい幅を
もってはならない。これは一般に0.1〜0.5mmの範囲であ
る。このような幅狭い励起ビームを使用することによっ
てバンドの最大分離を可能にする。(b)励起波長を変化
させて種々異なる染料のそれぞれの最大吸収に適合さ
せ、あるいは４種の螢光発生剤を励起するが螢光放出の
いずれとも重ならないような単一の幅狭い高強度の光バ
ンドとすることができる。(c)光学装置は、光検出器１
４に対する散乱および反射励起光の光束を最小にせねば
ならない。散乱および反射励起光を遮光する光学フィル
タは、励起波長の変化に伴い変化される。(d)光検出器
１４はかなり低いノイズレベルを持たねばならず、かつ
染料のエミッション範囲（上記の染料につき５００〜６
００nm）にわたり良好なスペクトル反応と収量効率を持
たねばならない。(e)放出された螢光を集光するための
光学系は高い開孔度を持たねばならない。これは螢光信
号を最大化させる。さらに、集光レンズの視野の深さ
は、カラムマトリックスの全幅を含まねばならない。

【００２８】２種の代表的な螢光検出装置（系）を図３
および図４に示す。図３の装置は、単一波長の励起また
は複数波長の励起のいずれにも適する。単一波長の励起
の場合、フィルタＦ４は各染料の放出波長ピークに集中
する４種のバンドパスフィルタの１つである。このフィ
ルタは、数秒毎に切替えて４種の螢光発生剤のそれぞれ
を連続してモニターすることができる。複数波長の励起
の場合、光学素子Ｆ３（励起フィルタ）、ＤＭ（二色
鏡）およびＦ４（遮光フィルタ）を一緒に切替える。こ
の方法においては、励起光と観察されたエミッション光
との両者を変化させる。図４の装置は、単一波長の励起
の場合に良好な配置である。この装置は、可動部分を必
要としないという利点を有し、４種の染料の全てからの
螢光を同時かつ連続的にモニターすることができる。検
出の第３の方法（上記iii）は、ゲルの底部から標識分
子を溶出させてこれらをたとえば1 ,2−ジオキシエタン
ジオンのような化学発光を励起させる薬剤と結合させ
〔エス・ケー・ギル、アンドリッチヒミカ・アクタ、第
１６（３）巻 第５９−６１頁（１９８３）；ジー・ジ
ェー・メルビン、Liq・Chrom、第６（９）巻 第１６０
３−１６１６頁（１９８３）〕かつこの混合物を４種の
別々の波長で放出光を測定しうる検出器に直接流入させ
る方法である（この検出器は図４に示したものと同様で
あるが、励起光源を必要としない）。化学発光における
バックグランド信号は螢光におけるよりもずっと低く、
その結果、信号対ノイズの比率が高くなりかつ感度が増
大する。最後に、吸光度の測定により測定を行なうこと
ができる（上記iv）。この場合、可変波長のビームを、
ゲルを通過させて、標識分子による光の吸収に基づくビ
ーム強度の減少を測定する。４種の染料の最大吸収に相
当する種々異なる波長の光吸収を測定することにより、
どの染料分子が光路に存在したかを決定することができ
る。この種の測定の欠点は、吸収測定が螢光測定よりも
本質的に低い感度を有することである。

【００２９】上記検出装置をコンピュータ１６と接続す
る。それぞれの検出の時間間隔で、コンピュータ１６は
４種の着色標識のそれぞれにつきその時点の測定シグナ
ル強度に比例するシグナルを受ける。この情報は、どの
ヌクレオチドがその時点で観察窓において特定長さのＤ
ＮＡ断片の末端となるかを示す。この時点の着色バンド
の配列がＤＮＡ配列を与える。

【００３０】以上の標識から検出、配列決定までの方法
をまとめて図５を用いて説明する。図５は、従来の方法
による配列決定法、並びに本発明の改良法による配列決
定法を示す。ここでは、好適態様として、４種の標識を
使用する場合について、説明する。

【００３１】図5-IIに示されるように、放射能標識され
たＤＮＡを使用する方法は、標識としては１種類しか使
用しないので、ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、１本のレーン（トラック）では、どれがＡ、Ｇ、
Ｃ、およびＴであるかの区別がつかないため、それぞ
れ、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴに対応する４つのトラック
（レーン）が必要である。

【００３２】他方、本発明においては、４種類のそれぞ
れ識別可能な標識を使用するので、どこに、Ａ、Ｇ、
Ｃ、およびＴが存在するかがわかるので、１本のゲルを
使用すれば足りる（図5-III）。

【００３３】以下、４種の発色団あるいは螢光物質を用
いて、ＤＮＡを決定する方法を説明するが、単なる例示
であって、本発明を限定するものではない。

【００３４】チェーンターミネーション法では、以下の
工程が使用され得る： (1)ＤＮＡプライマーを４種の発色団あるいは螢光物質
で標識する（該標識はそのスペクトル特性で相互に識別
可能である）工程； (2)それぞれの４種の標識されたＤＮＡプライマーを、
それぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴのジデオキシトリヌク
レオチドを用いるプライマー延伸反応にかける工程； (3)Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴのそれぞれの反応液の一部を
とり、混合する工程； (4)Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ反応の混合液を、単一のゲル
カラムにかけ、ＤＮＡを分離する工程；および、 (5)分離されたＤＮＡを発色、あるいは螢光で検出する
工程；である。

【００３５】この方法では、発色、あるいは螢光で視覚
的に検出できる。従って、図5-IIに示すように、ゲルカ
ラムの下から順に発色を識別していけば、ＤＮＡ配列が
決定される。また、螢光物質を使用する場合は、吸光あ
るいは励起の最大値を検出することで、ＤＮＡ配列が決
定される。図5-IVは、例えば、４種の励起光をあててこ
れをモニターし、検出された順に並べることにより、配
列がＡＣＧＴＧＣ・・・と決定される。

【００３６】化学分解法では、以下の工程が使用され得
る： (1)図１に示した方法で、ＤＮＡを４種の発色団あるい
は螢光物質で標識する（該標識はそのスペクトル特性で
相互に識別可能である）工程； (2)それぞれの４種のラベルされたＤＮＡを、それぞ
れ、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴに選択的な反応に供する工
程； (3)Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴのそれぞれの反応液の一部を
とり、混合する工程； (4)Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ反応の混合液を、単一のゲル
カラムにかけ、ＤＮＡを分離する工程；および、 (5)分離されたＤＮＡを発色、あるいは螢光で検出する
工程；である。

【００３７】検出は、前記チェーンターミネーション法
と全く同様にして、できる。

【００３８】以下の例により本発明を説明する。

【００３９】例 図６は１回に１種の染料を使用するＤＮＡ配列決定装置
のブロック図を示している。アルゴンイオンレーザー１
００からのビーム（４８８０Å）をビーム操作器１０４
によってポリアクリルアミドゲル管（試料）１０２に通
す。このビームにより励起された螢光をＦ−ナンバーの
小さいレンズ１０６により集め、これを適当な組み合せ
の光学フィルタ１０８および１１０に通過させて散乱励
起光を除去し、光電子増信管（ＰＭＴ）１１２を用いて
検出する。シグナルはチャート記録紙で容易に検出され
る。ＤＮＡ配列決定反応は、フルオレセイン標識したオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて行なわれる。チャ
ート紙におけるピークは、配列決定反応で合成されかつ
電気泳動によりゲル管で分離された種々の異なる長さを
有するフルオレセイン標識されたＤＮＡの断片に相当す
る。各ピークは１０^-15〜１０^-16モルの程度のフルオレ
セインを含有し、これは放射性同位元素の検出を用いる
同等な配列決定用ゲルにおいて１バンド当りに得られる
ＤＮＡ量にほぼ等しい。これは、螢光標識が配列決定反
応においてオリゴヌクレオチドプライマーから除去され
ずあるいは分解されないことを証明する。さらに、これ
は検出感度が、この手段によりＤＮＡ配列分析を行なう
のに充分であることを示している。

【００４０】以上、本発明を実施例により詳細に説明し
たが、本発明はこれらのみに限定されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】螢光標識でＤＮＡ断片を末端標識する１手段の
説明図であって、ＰstＩおよびＴ4 ＤＮＡリガーゼは
組換ＤＮＡ技術に一般的に使用される酵素である。

【図２】自動化ＤＮＡ配列決定装置、すなわちゲル電気
泳動装置のブロック図である。

【図３】検出装置における光学配置の略図であって、Ｐ
はランプ源、Ｌ１は対物レンズ、Ｌ２は集光レンズ、Ｆ
１はＵＶ遮光フィルタ、Ｆ２は熱遮断フィルタ、Ｆ３は
バンドパス励起フィルタ、Ｆ４はロングパス放出フィル
タ、ＤＭは二色鏡、Ｃはポリアクリルアミドゲル、ＰＭ
Ｔは光電子増幅管である。

【図４】検出装置における他の光学配置の略図であっ
て、Ｆ１〜Ｆ４は種々異なる染料の最大放出に集中する
バンドパスフィルタであり、Ｐ１〜Ｐ４は光電子増幅管
であり、励起光はフィルタＦ１〜Ｆ４のいずれをも透過
しないような波長である。

【図５】図１に示した配列のＤＮＡ配列を決定するため
の従来法、および本発明の方法の比較図である。

【図６】本発明による好適なＤＮＡ配列決定装置のブロ
ック図である。

【符号の説明】

１０：カラム １２：貯蔵 １４：検出器 １００：レーザー １１２：光電子増幅管

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 マイケル・ダブリュー・ハンカピラー 米国カリフォルニア州サン・カルロス、ペ ブル・ドライブ 1333 (72)発明者 ロイド・エム・スミス 米国カリフォルニア州パサデナ、サウス・ オーク・ノル287ナンバー７ (72)発明者 テイム・ジェイ・ハンカピラー 米国カリフォルニア州パサデナ、サウス・ ウイルソン294ナンバー５

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＮＡオリゴヌクレオチド断片を分析す
   る方法であって、該方法は以下の工程：１またはそれ以
   上のＤＮＡオリゴヌクレオチド断片のセットを提供する
   工程であって、ここで、個々の該セットの該断片はポリ
   メラーゼによる鎖延伸を可能にするように発色団あるい
   は蛍光物質で標識されている、工程；１個のヌクレオチ
   ドの差異で異なるオリゴヌクレオチドを識別し得るシス
   テムによって、該１またはそれ以上の標識されたＤＮＡ
   オリゴヌクレオチド断片のセットを分離する工程；およ
   び、該分離された断片を該発色団あるいは蛍光物質によ
   り検出する工程；を包含する、方法。
2. 【請求項２】 個々の標識されたＤＮＡオリゴヌクレオ
   チド断片がプライマーオリゴヌクレオチドを含み、そし
   て該プライマーオリゴヌクレオチドが前記発色団あるい
   は蛍光物質で標識されている、特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、
   ポリマー化酵素により延伸され得る、特許請求の範囲第
   ２項に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記標識されたオリゴヌクレオチド断片
   のセットが、該標識のスペクトル特性によって、相互に
   識別され得る、特許請求の範囲第ｌ項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記オリゴヌクレオチド断片が、染料分
   子と結合するアミノ基を有している、特許請求の範囲第
   １項または第２項に記載の方法。