JPS61226657A - 高速液体クロマトグラフイ−用カラム - Google Patents
高速液体クロマトグラフイ−用カラムInfo
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- JPS61226657A JPS61226657A JP60067306A JP6730685A JPS61226657A JP S61226657 A JPS61226657 A JP S61226657A JP 60067306 A JP60067306 A JP 60067306A JP 6730685 A JP6730685 A JP 6730685A JP S61226657 A JPS61226657 A JP S61226657A
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- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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- B01J20/282—Porous sorbents
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は高速液体クロマトグラフィー用カラムに関する
ものである。
ものである。
（従来の技術）
高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する
）は、通常のカラムクロマトグラフィーに比べ、少量の
試料で短時間のうちに分離が終了するという特長から、
近年急速に普及し広範囲に使用されている。
）は、通常のカラムクロマトグラフィーに比べ、少量の
試料で短時間のうちに分離が終了するという特長から、
近年急速に普及し広範囲に使用されている。
ＨＰＬＣで使われているカラムには、充填剤と′ して
シリカ系、セルロース系、イオン交換樹脂系など種々の
ものがあり、被験物の種類により充填剤の使い分けがな
されている。この中で、ヒドロキシアパタイト（以下Ｈ
Ａｐと略記する）は、生体高分子の分離に優れた性質を
示し、特に他の充填剤では分離が困難とされている試料
、例えばＤＮＡの１本鎖、２本鎖やプラスミドＤＮＡを
容易に純度良く分離精製できることから、ＨＰＬＣ用の
充填剤としても利用されている。
シリカ系、セルロース系、イオン交換樹脂系など種々の
ものがあり、被験物の種類により充填剤の使い分けがな
されている。この中で、ヒドロキシアパタイト（以下Ｈ
Ａｐと略記する）は、生体高分子の分離に優れた性質を
示し、特に他の充填剤では分離が困難とされている試料
、例えばＤＮＡの１本鎖、２本鎖やプラスミドＤＮＡを
容易に純度良く分離精製できることから、ＨＰＬＣ用の
充填剤としても利用されている。
例えばこのような、従来型のＨＰＬＣ用ＨＡＰ充填剤に
は、Ａ、 Ｔｉ５ｅｌｉｕａらが発表した合成法（Ａｒ
ｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 ８
５． １３２ （１９５Ｂ）） をもとに、適宜改
良を加えた方法により製造したものをさらにＨＰＬＣ用
に粒径、結晶形状を調整したものがある、これは一般に
次のような物性を示す。
は、Ａ、 Ｔｉ５ｅｌｉｕａらが発表した合成法（Ａｒ
ｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 ８
５． １３２ （１９５Ｂ）） をもとに、適宜改
良を加えた方法により製造したものをさらにＨＰＬＣ用
に粒径、結晶形状を調整したものがある、これは一般に
次のような物性を示す。
Ｃａ／Ｐ比 １．４０〜１．５５
Ｘ線回折 回折ピークが弱い
比表面積 ６０〜１５０ｒｎ”／ｇ結晶形状
薄板状結晶 （発明が解決しようとする問題点） しかしこのＨＰＬＣ用に使用された従来型のＨＡＰのカ
ラムは、短時間のうちに少量の試料をシャープに分離す
るという目的を達成する上まだ必ずしも十分なものとは
いえなかった。また１通常ＨＰＬＣの性質上展開背圧を
より高く維持することが望まれるが、ＨＡｐ結晶は加圧
下で破壊を起す懸念があり、そのため高々５ｋｇ／ｃｍ
″程度の背圧で使用されるに留っていた。しかも、ＨＰ
ＬＣ用としてのＨＡｐは結晶形状が薄板状であるため普
通の詰め方では容易に破壊されて微粒となり、目づまり
を起しやすくなるという欠点がある。そこでこのＨＡＰ
を使用する際は、結晶が破壊されないように結晶を配向
させながら、ＨＰＬＣ用カラムに充填しなければならず
、この作業が非常に煩雑であった。
薄板状結晶 （発明が解決しようとする問題点） しかしこのＨＰＬＣ用に使用された従来型のＨＡＰのカ
ラムは、短時間のうちに少量の試料をシャープに分離す
るという目的を達成する上まだ必ずしも十分なものとは
いえなかった。また１通常ＨＰＬＣの性質上展開背圧を
より高く維持することが望まれるが、ＨＡｐ結晶は加圧
下で破壊を起す懸念があり、そのため高々５ｋｇ／ｃｍ
″程度の背圧で使用されるに留っていた。しかも、ＨＰ
ＬＣ用としてのＨＡｐは結晶形状が薄板状であるため普
通の詰め方では容易に破壊されて微粒となり、目づまり
を起しやすくなるという欠点がある。そこでこのＨＡＰ
を使用する際は、結晶が破壊されないように結晶を配向
させながら、ＨＰＬＣ用カラムに充填しなければならず
、この作業が非常に煩雑であった。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは上記の状況に鑑み、ＨＰＬＣ用として好適
なカラムの開発のため鋭意研究を重ねた結果、従来知ら
れているＨＰＬＣ用ＨＡｐとは全く異なる。Ｘ線回折的
に結晶性に優れ、比表面積が５０ｍ″／ｇ以下という小
さな値を示すＨＡｐを用いれば従来達し得なかった０、
５ｇ／ｃｍ″以上という高密度に充填することができる
こと、そしてこの高密度充填カラムがＨＰＬＣ用カラム
として極めて分離能が高いことを見出し、この知見に基
づき本発明をなすに至った。
なカラムの開発のため鋭意研究を重ねた結果、従来知ら
れているＨＰＬＣ用ＨＡｐとは全く異なる。Ｘ線回折的
に結晶性に優れ、比表面積が５０ｍ″／ｇ以下という小
さな値を示すＨＡｐを用いれば従来達し得なかった０、
５ｇ／ｃｍ″以上という高密度に充填することができる
こと、そしてこの高密度充填カラムがＨＰＬＣ用カラム
として極めて分離能が高いことを見出し、この知見に基
づき本発明をなすに至った。
すなわち本発明は、ヒドロキシアパタイトを０．５ｇ／
ｃｍ”以上の高密度で充填してなることを特徴とする高
速液体クロマトグラフィー用カラムを提供するものであ
る。
ｃｍ”以上の高密度で充填してなることを特徴とする高
速液体クロマトグラフィー用カラムを提供するものであ
る。
本発明において、その目的を達成するにはカラム中のＨ
Ａｐ充填密度を０．５ｇ／ａｍ″以上とすることが必要
である。密度が０．５ｇ／ｃｍ″未満ではＨＰＬＣにお
けるシャープな分離が実現できない。
Ａｐ充填密度を０．５ｇ／ａｍ″以上とすることが必要
である。密度が０．５ｇ／ｃｍ″未満ではＨＰＬＣにお
けるシャープな分離が実現できない。
このとき用いられるＨＡｐは比表面積は好ましくは５０
ｍ″／ｇ以下で、柱状結晶である。ここで柱状結晶とし
ては六角柱状もしくは円柱状結晶が代表的なものとして
あげられる。
ｍ″／ｇ以下で、柱状結晶である。ここで柱状結晶とし
ては六角柱状もしくは円柱状結晶が代表的なものとして
あげられる。
本発明で用いられるＨＡｐの製造方法には特に制限はな
いが、本発明者らが先に提案した■水と二相を形成しう
る有機溶媒を含む反応媒体中でカルシウム化合物とリン
化合物とを反応させる方法（特開昭５８−１９０８０７
号）■有機溶媒を含む反応媒体中でリン酸又は／及びそ
のカルシウム塩と炭酸カルシウムとを反応させる方法（
特開昭５９−１０７９１２号）などを採用することがで
きる。これらの方法で製造されるＨＡｐは、製造ロフト
間の吸着能力の差もほとんどなく、単純な操作で製造で
き、優れた物性を持った粉末である。このものはＨＰＬ
Ｃのみならず通常のカラムクロマトグラフィーにも十分
使用可能である。
いが、本発明者らが先に提案した■水と二相を形成しう
る有機溶媒を含む反応媒体中でカルシウム化合物とリン
化合物とを反応させる方法（特開昭５８−１９０８０７
号）■有機溶媒を含む反応媒体中でリン酸又は／及びそ
のカルシウム塩と炭酸カルシウムとを反応させる方法（
特開昭５９−１０７９１２号）などを採用することがで
きる。これらの方法で製造されるＨＡｐは、製造ロフト
間の吸着能力の差もほとんどなく、単純な操作で製造で
き、優れた物性を持った粉末である。このものはＨＰＬ
Ｃのみならず通常のカラムクロマトグラフィーにも十分
使用可能である。
上記方法によれば充填密度を０．５ｇ／ｃｒｒｒ以上と
できる、比表面積が５０ｍｊ／ｇ以下で六角柱状又は円
柱状結晶の集合体であるＨＡＰが製造され、これはカラ
ム充填して耐圧強度が１０ｋｇ／ｃｒｎ’以上とできる
。これは集合体が球状に近い形を示し、ＨＰＬＣとして
の優れた実用耐圧強度を有するものである。
できる、比表面積が５０ｍｊ／ｇ以下で六角柱状又は円
柱状結晶の集合体であるＨＡＰが製造され、これはカラ
ム充填して耐圧強度が１０ｋｇ／ｃｒｎ’以上とできる
。これは集合体が球状に近い形を示し、ＨＰＬＣとして
の優れた実用耐圧強度を有するものである。
本発明に使用される好ましいＨＡｐの諸物性を示すと次
の通りである。
の通りである。
Ｃａ ／ Ｐ比 １．３０〜１．９０Ｘ線回
折 回折ピークが強い。
折 回折ピークが強い。
比表面積 ５０ｒｎ’／ｇ以下結晶形状
六角柱状結晶の集合体カラム充填時耐圧強
度 １０ｋｇ／ｃｒｒ？以上（発明の効果） 従来のＨＰＬＣ用のＨＡＰのカラムは分離能がほぼ限界
に達しており、ＨＡｐの充填密度は高くても０．３ｇ／
ｃｍ”であったのに対し、本発明のＨＰＬＣ用カラムは
ＨＡｐの充填密度を０．５ｇ ／ ｃ ｍ１以上となす
もので、ＨＰＬＣ特有の展開条件下、特に高い展開背圧
で一層向上した分離能を示す。
六角柱状結晶の集合体カラム充填時耐圧強
度 １０ｋｇ／ｃｒｒ？以上（発明の効果） 従来のＨＰＬＣ用のＨＡＰのカラムは分離能がほぼ限界
に達しており、ＨＡｐの充填密度は高くても０．３ｇ／
ｃｍ”であったのに対し、本発明のＨＰＬＣ用カラムは
ＨＡｐの充填密度を０．５ｇ ／ ｃ ｍ１以上となす
もので、ＨＰＬＣ特有の展開条件下、特に高い展開背圧
で一層向上した分離能を示す。
さらに従来品カラムは、゛耐圧・耐久性に劣るのに対し
本発明のカラムにおいてＨＡｐは、結晶の集合体が球状
に近く、またＸ線的にも良好な結晶性のものを使用しう
ることから、結晶が破壊されにくく容易に０．５ｇ／ｃ
ｍ″以上の密度で充填することができ、カラムの強度も
大で少なくともＨＰＬＣの実用的な充填圧力１０ｋｇ／
ｃｍ″を満足し、さらに５００ｋｇ／ｃｍ”以上の高い
圧力をかけても全く支障がない。
本発明のカラムにおいてＨＡｐは、結晶の集合体が球状
に近く、またＸ線的にも良好な結晶性のものを使用しう
ることから、結晶が破壊されにくく容易に０．５ｇ／ｃ
ｍ″以上の密度で充填することができ、カラムの強度も
大で少なくともＨＰＬＣの実用的な充填圧力１０ｋｇ／
ｃｍ″を満足し、さらに５００ｋｇ／ｃｍ”以上の高い
圧力をかけても全く支障がない。
また、本発明のＨＡｐのカラムは従来品と異なり結晶を
配向させながらＨＰＬＣ用カラムに充填する煩雑な操作
を必要としないので、簡易にカラム充填が行えるという
利点がある。さらに上述のように耐圧性が向上したこと
がらカラムとしての寿命が長くなり、２００回以上の繰
返し使用が可能で、優れた耐久性を持つ、また圧力の調
整により流速制御ができるので展開液も従来品に比べ少
量で済むという利点もある。さらにこのＨＡｐのカラム
は分析を目的としたＨＰＬＣ以外に、分取を目的とした
分取用ＨＰＬＣカラムとしても利用でき、必要とされる
試料を短時間のうちに純度よく分離・精製することが可
能であることからその価値も大きい。
配向させながらＨＰＬＣ用カラムに充填する煩雑な操作
を必要としないので、簡易にカラム充填が行えるという
利点がある。さらに上述のように耐圧性が向上したこと
がらカラムとしての寿命が長くなり、２００回以上の繰
返し使用が可能で、優れた耐久性を持つ、また圧力の調
整により流速制御ができるので展開液も従来品に比べ少
量で済むという利点もある。さらにこのＨＡｐのカラム
は分析を目的としたＨＰＬＣ以外に、分取を目的とした
分取用ＨＰＬＣカラムとしても利用でき、必要とされる
試料を短時間のうちに純度よく分離・精製することが可
能であることからその価値も大きい。
（実施例）
以下、本発明を製造例、実施例および比較例により詳し
く説明する。
く説明する。
製造例１
第一リン酸カルシウム・−水塩
（Ｃａ （Ｈ２ＰＯ４）２−Ｈ２Ｏ）７５．６ｇ、炭酸
カルシウム（Ｃａ ＣＯａ ） ４０− Ｏｇ、水１０
０ｇ及びｎ−へキサン３５０ｇを１文官のフラスコに仕
込み、撹拌しながら昇温させ還流温度（６３℃）以下で
約２時間加熱した後１反応系内の水分とｎ−へキサンを
蒸発させ留出したｎ−へキサンと水に相当する容量のｎ
−ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作が進
行するに従って内温か上昇し、内温が６８℃を越えた時
点で加熱を中止して、冷却後生成物を溶媒よりろ別し、
これを乾燥して白色の粉末を得た。この粉末のＸ線回折
図を第９図に示す。
カルシウム（Ｃａ ＣＯａ ） ４０− Ｏｇ、水１０
０ｇ及びｎ−へキサン３５０ｇを１文官のフラスコに仕
込み、撹拌しながら昇温させ還流温度（６３℃）以下で
約２時間加熱した後１反応系内の水分とｎ−へキサンを
蒸発させ留出したｎ−へキサンと水に相当する容量のｎ
−ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作が進
行するに従って内温か上昇し、内温が６８℃を越えた時
点で加熱を中止して、冷却後生成物を溶媒よりろ別し、
これを乾燥して白色の粉末を得た。この粉末のＸ線回折
図を第９図に示す。
第９図より明らかなようにＸ線回折図は回折角度２θ＝
３１．７．３２．２．３２．８に主ピークを有し、ＡＳ
ＴＭカード９−４３２に記載のＨＡＰの特性回折ピーク
と一致した０粒形は第１１図に示すごとく球状もしくは
それに類似した形状を示し、微細な六角柱状結晶の集合
したものである。また物性分析結果を第２表に示す。
３１．７．３２．２．３２．８に主ピークを有し、ＡＳ
ＴＭカード９−４３２に記載のＨＡＰの特性回折ピーク
と一致した０粒形は第１１図に示すごとく球状もしくは
それに類似した形状を示し、微細な六角柱状結晶の集合
したものである。また物性分析結果を第２表に示す。
製造例２〜４
無水リン酸二カルシウム、リン酸二カルシウム・二水塩
、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水、有機溶媒を
第１表に示した条件で仕込み、第１表以外の条件につい
ては、実施例１と同様な操作によりＨＡｐを得た。その
物性を第２表に示す。
、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水、有機溶媒を
第１表に示した条件で仕込み、第１表以外の条件につい
ては、実施例１と同様な操作によりＨＡｐを得た。その
物性を第２表に示す。
第１表
本セロソルブ系溶媒
（三井東圧化学（株）製品）
第２表
製造例５
従来法によるＨＡｐ合成法（Ａ、ティセリウス（＾、
Ｔｉ５ｅｌｉｕｓ））らの方法Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
Ｔｉ５ｅｌｉｕｓ））らの方法Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 ８５．１３２（１９５Ｂ）） 。
３文官フラスコへ０．５ｍｏｌ／ｌのＣａ ＣｉＬ２水
溶液ｔＩＬと０−５ ｍ ｏ ｊＬ ／ ｌ （Ｄ Ｎ
ａ ２ ＨＰ Ｏ＜水溶液１１を毎分１２０滴の割合
で同時に滴下し、撹拌棒でゆっくりと攪拌しながら反応
を行った０滴下終了後、上澄み液をデカンテーションに
より除去し、残留した沈殿物を４回、各々２ｉの蒸留水
で洗浄した０次にこの沈殿物に２文の蒸留水を入れ、さ
らに４０重量％のＮａＯＨを５０ｍ１加えた後１時間煮
沸した。冷却後再びデカンテーションにより上澄み液を
除き、再度２文の蒸留水で４回洗浄した０次にｐＨ６，
８の０．０１ｍ ｏ ｆＬ ／ ｌリン酸ナトリウム緩
衝液を２ｆｔ加え沸騰する直前まで加熱した。この操作
を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５分にした０
次にｐＨ６，８の０．ＯＯ１ｍｏｊＬ／見のリン酸ナト
リウム緩衝液を２見加え２度沸１１１（１５分間）させ
た、このようにして得られたＨＡｐはｐＨ６。
溶液ｔＩＬと０−５ ｍ ｏ ｊＬ ／ ｌ （Ｄ Ｎ
ａ ２ ＨＰ Ｏ＜水溶液１１を毎分１２０滴の割合
で同時に滴下し、撹拌棒でゆっくりと攪拌しながら反応
を行った０滴下終了後、上澄み液をデカンテーションに
より除去し、残留した沈殿物を４回、各々２ｉの蒸留水
で洗浄した０次にこの沈殿物に２文の蒸留水を入れ、さ
らに４０重量％のＮａＯＨを５０ｍ１加えた後１時間煮
沸した。冷却後再びデカンテーションにより上澄み液を
除き、再度２文の蒸留水で４回洗浄した０次にｐＨ６，
８の０．０１ｍ ｏ ｆＬ ／ ｌリン酸ナトリウム緩
衝液を２ｆｔ加え沸騰する直前まで加熱した。この操作
を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５分にした０
次にｐＨ６，８の０．ＯＯ１ｍｏｊＬ／見のリン酸ナト
リウム緩衝液を２見加え２度沸１１１（１５分間）させ
た、このようにして得られたＨＡｐはｐＨ６。
８のＯ，ＯＯ１ｍｏＪｌ／１のリン酸ナトリウム緩衝液
に入れ、冷蔵庫中にて保存した。
に入れ、冷蔵庫中にて保存した。
その結果第２表に示す物性のＨＡｐを得た。また、Ｘ線
回折図を第１Ｏ図、電子顕微鏡写真を第１２図に示した
。
回折図を第１Ｏ図、電子顕微鏡写真を第１２図に示した
。
実施例１
内径８ ｍｍ、長さ１０ｃｍのＨＰＬＣ用金属カラムへ
製造例１により得られたＨＡｐを定常の方法により１０
ｋｇ／ｃｒｎ’の圧で充填し、充填終了後ＨＰＬＣ装置
にこの方ラムを装着した。充填密度は０．５２ｇ／ｃｍ
’であった。製造例１により得たＨＡＰの電子顕微鏡写
真を第１１図に示す。
製造例１により得られたＨＡｐを定常の方法により１０
ｋｇ／ｃｒｎ’の圧で充填し、充填終了後ＨＰＬＣ装置
にこの方ラムを装着した。充填密度は０．５２ｇ／ｃｍ
’であった。製造例１により得たＨＡＰの電子顕微鏡写
真を第１１図に示す。
これからもわかる通りこのＨＡｐは六角柱状結晶の集合
体である。またカラムの分離能の評価を行うためトリプ
トファン（０，１８重量％）、牛血清アルブミン（４，
６重量％）、リゾチウム（２，０重量％）、チトクロム
Ｃ（１，０重量％）を含有する混合溶液を標準試料とし
て用いて展開を行った。展開はリン酸緩衝液１０ｍＭ
（ｐＨ６，８）と３５０ｍＭ（ｐＨ６，８）による直線
密度匂配法により行い、上記標準試料を１０．０ル交注
入した。また流速は１ｍＪＬ／ｗｉｎになるように７．
５ｋｇ／ｃゴの展開圧とした。
体である。またカラムの分離能の評価を行うためトリプ
トファン（０，１８重量％）、牛血清アルブミン（４，
６重量％）、リゾチウム（２，０重量％）、チトクロム
Ｃ（１，０重量％）を含有する混合溶液を標準試料とし
て用いて展開を行った。展開はリン酸緩衝液１０ｍＭ
（ｐＨ６，８）と３５０ｍＭ（ｐＨ６，８）による直線
密度匂配法により行い、上記標準試料を１０．０ル交注
入した。また流速は１ｍＪＬ／ｗｉｎになるように７．
５ｋｇ／ｃゴの展開圧とした。
タンパク質の検出は２８０ｎｍの吸光度を測定した。こ
のカラムにより得られたクロマトグラムを第１図に示す
、第１図からも明らかなように主なピークが４カ所にあ
られれ標準試料である４次分がきれいに分離されている
ことがわかる。各ピークは左側からトリプトファン、牛
血清アルブミン、リゾチウム、チトクロムＣに対応する
ピークであることを確認した。なおチトクロムＣには、
２Ｊ！の異性体があリゼークが２つに分離している
。
のカラムにより得られたクロマトグラムを第１図に示す
、第１図からも明らかなように主なピークが４カ所にあ
られれ標準試料である４次分がきれいに分離されている
ことがわかる。各ピークは左側からトリプトファン、牛
血清アルブミン、リゾチウム、チトクロムＣに対応する
ピークであることを確認した。なおチトクロムＣには、
２Ｊ！の異性体があリゼークが２つに分離している
。
実施例２
内径８ｍｍ、長さ１０ｃｍのＨＰＬＣ用カラムに８０ｋ
ｇ／ｃｒｎ’の圧で製造例３により得られたＨＡＰを充
填し、それ以降の操作は、実施例１と同様にしてＨＰＬ
Ｃ用カラムの操作を行った。充填密度は０．６０ｇ／ｃ
ｍ″であった。その結果を第２図に示す、第２図かられ
かる通り、実施例１で得られたクロマトグラムと同じ結
果を示した。
ｇ／ｃｒｎ’の圧で製造例３により得られたＨＡＰを充
填し、それ以降の操作は、実施例１と同様にしてＨＰＬ
Ｃ用カラムの操作を行った。充填密度は０．６０ｇ／ｃ
ｍ″であった。その結果を第２図に示す、第２図かられ
かる通り、実施例１で得られたクロマトグラムと同じ結
果を示した。
実施例３
実施例２で使用したカラムに対し、標準試料の分離を２
００回行った。２００回目に得られたクロマトグラムを
第３図に示す、第３図からもわかる通り、本発明のカラ
ムは２００回の繰返し使用に対しても良い分離能を示し
、優れた耐久性を持つ。
００回行った。２００回目に得られたクロマトグラムを
第３図に示す、第３図からもわかる通り、本発明のカラ
ムは２００回の繰返し使用に対しても良い分離能を示し
、優れた耐久性を持つ。
実施例４
内径８ｍｍ、長さ１０ｃｍのＨＰＬＣ用カラムに、５０
０ｋｇ／ｃｒｎ’の圧÷製造例４により得られたＨＡｐ
を密度１．０３ｇ／ｃゴに充填し、それ以降の操作は実
施例１と同様な操作でＨＰＬＣ用カラムの操作を行った
。その結果を第４図に示す。
０ｋｇ／ｃｒｎ’の圧÷製造例４により得られたＨＡｐ
を密度１．０３ｇ／ｃゴに充填し、それ以降の操作は実
施例１と同様な操作でＨＰＬＣ用カラムの操作を行った
。その結果を第４図に示す。
第４図から、高い圧力でＨＡｐをカラムへ充填している
にも拘らず、実施例１．２で得られたクロマトグラムと
同じ結果を示し、耐圧性に優れていることがわかる。
にも拘らず、実施例１．２で得られたクロマトグラムと
同じ結果を示し、耐圧性に優れていることがわかる。
実施例５
内径２０ｍｍ、長さ２５ｃｍの分取用カラムに、８０ｋ
ｇ／ｃｒｒｆの圧で製造例２に従って得たＨＡｐを密度
０．６２ｇ／ｃｍ″に充填し、操作法は実施例１と同様
な方法でＨＰＬＣ用カラムの操作を行った。ただし標準
試料は７０ＪＬ！Ｌ注入した。これにより得られたクロ
マトグラムを第５図に示す、第５図の結果から本発明の
カラムによれば通常のＨＰＬＣと同じ結果が得られ、分
取用としても十分に使用可能であることがわかった。
ｇ／ｃｒｒｆの圧で製造例２に従って得たＨＡｐを密度
０．６２ｇ／ｃｍ″に充填し、操作法は実施例１と同様
な方法でＨＰＬＣ用カラムの操作を行った。ただし標準
試料は７０ＪＬ！Ｌ注入した。これにより得られたクロ
マトグラムを第５図に示す、第５図の結果から本発明の
カラムによれば通常のＨＰＬＣと同じ結果が得られ、分
取用としても十分に使用可能であることがわかった。
実施例６
内径８ｍｍ、長さ１０ｃｍのＨＰＬＣ用カラムに、８０
ｋｇ／ｃｒｎ”の圧で製造例４に従い得たＨＡｐを密度
０．５８ｇ／ｃｒｎ”に充填し、それ以降の操作は実施
例１と同様に行った。ただし展開中の流速が３．４ｍＪ
ｌ／ｍｉｎになるよう圧力を５０ｋｇ／ｃｒｎ’に調整
した。これにより得られたクロマトグラムを第６図に示
す、第６図からもわかる通り、分離が短時間で行われた
にも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分離してい
ることがわかる。
ｋｇ／ｃｒｎ”の圧で製造例４に従い得たＨＡｐを密度
０．５８ｇ／ｃｒｎ”に充填し、それ以降の操作は実施
例１と同様に行った。ただし展開中の流速が３．４ｍＪ
ｌ／ｍｉｎになるよう圧力を５０ｋｇ／ｃｒｎ’に調整
した。これにより得られたクロマトグラムを第６図に示
す、第６図からもわかる通り、分離が短時間で行われた
にも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分離してい
ることがわかる。
実施例７
実施例１と同条件で充填したカラムで、ＬＤＨ（乳酸脱
水素酵素）の分離を行った。
水素酵素）の分離を行った。
展開は標準試料の時と同じ条件で行い、試料は８ＩＬｌ
注入した。タンパク質の検出は２８０ｎｍの吸光度を、
酵素活性の測定は３４０ｎｍの吸光度を測定することに
より行った。
注入した。タンパク質の検出は２８０ｎｍの吸光度を、
酵素活性の測定は３４０ｎｍの吸光度を測定することに
より行った。
これにより得られたクロマトグラムを第７図に示す、第
７図からもわかる通り、タンパク質の溶出を示すピーク
と酵素活性を示すピークが右側の所で一致し、ここにＬ
ＤＨが分離されていることがわかる。また試料中に含ま
れる不純なタンパクが左側にあられれていることより、
ＬＤＨが純度良く分離・精製されていることもわかる。
７図からもわかる通り、タンパク質の溶出を示すピーク
と酵素活性を示すピークが右側の所で一致し、ここにＬ
ＤＨが分離されていることがわかる。また試料中に含ま
れる不純なタンパクが左側にあられれていることより、
ＬＤＨが純度良く分離・精製されていることもわかる。
比較例１
製造例５に従って得たＨＡｐを内径８ｍｍ、長さ１０ｃ
ｍのカラムに充填し、その後の操作は実施例１と同様な
操作で標準試料の分離を行った。
ｍのカラムに充填し、その後の操作は実施例１と同様な
操作で標準試料の分離を行った。
なお、この時の充填密度は０．２８ｇ／ｃｍ″であった
。また流速を１ｍＪｌ／ｍｉｎにするため。
。また流速を１ｍＪｌ／ｍｉｎにするため。
１ｋｇ／ｃｍ″の圧になるよう調整を行ったが。
ＨＰＬＣとしては低圧になるため、操作に困難をきたし
た。
た。
これにより得られたクロマトグラムを第８図に示す、第
８図とｗＳ１図の比較からもわかる通り、従来品を充填
したものは、全体的にブロードなピークを示した。
８図とｗＳ１図の比較からもわかる通り、従来品を充填
したものは、全体的にブロードなピークを示した。
比較例２
製造例５のＨＡｐを内径８ｍｍ、長さ１０ｃｍのカラム
に充填圧１５ｋｇ／ｃｍ’で充填した。しかし内部で結
晶が破壊され目づまりが生じ、展開を行うことができな
かった。
に充填圧１５ｋｇ／ｃｍ’で充填した。しかし内部で結
晶が破壊され目づまりが生じ、展開を行うことができな
かった。
第１図より第７図は実施例１から７により得られたクロ
マトグラムをそれぞれ示すものである。 第８図は比較例１により得られたクロマトグラムを示す
ものである。 第９図及び第１Ｏ図は製造例１及び製造例５で得たＨＡ
ｐのｘｉ回折図をそれぞれ示すものである。 第１１図及び第１２図は製造例１及び製造例５で得たＨ
ＡＰの電子顕微鏡写真をそれぞれ示すものである。 特許出願人 三井東圧化学株式会社 幕！凹 真２凹 毛３０ 寄将峙Ｖ 瓜４語 侃毎Ｓ％藺 本６凹 保埒眸讐 基７凹 ｕｖ２εＯｎｍ、０．ＱａＡＬ１Ｆ５ （クンＪぐ７＠
モニｙ−）デ果綺Ｉ９矛別 Ｌ６ 区 猥埒碍藺 ”Ｊ ｕ回 易１２副 手続補正書（方式） 昭和６０年７月２２日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 ｌ、事件の表示 昭和６０年特許願第６７３０６号 ２、発明の名称 高速液体クロマトグラフィー用カラム ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称 （３
１２）三井東圧化学株式会社代表者沢村治夫 ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区新橋３丁目７番３号ミドリヤ
第２ビル ７階 昭和６０年６月１０日 ６、補正の対象 ４、図面の簡単な説明 ７、補正の内容 明細書第１８ページ第１３〜１５行の記載を次のように
補正します。 「第１１図及び第１２［ｉＵは図面に代る写真であり、
製造例１及び製造例５で得たＨＡｐ（ヒドロキシアパタ
イト）の結晶の構造をそれぞれ示す電子顕微鏡写真であ
る。」
マトグラムをそれぞれ示すものである。 第８図は比較例１により得られたクロマトグラムを示す
ものである。 第９図及び第１Ｏ図は製造例１及び製造例５で得たＨＡ
ｐのｘｉ回折図をそれぞれ示すものである。 第１１図及び第１２図は製造例１及び製造例５で得たＨ
ＡＰの電子顕微鏡写真をそれぞれ示すものである。 特許出願人 三井東圧化学株式会社 幕！凹 真２凹 毛３０ 寄将峙Ｖ 瓜４語 侃毎Ｓ％藺 本６凹 保埒眸讐 基７凹 ｕｖ２εＯｎｍ、０．ＱａＡＬ１Ｆ５ （クンＪぐ７＠
モニｙ−）デ果綺Ｉ９矛別 Ｌ６ 区 猥埒碍藺 ”Ｊ ｕ回 易１２副 手続補正書（方式） 昭和６０年７月２２日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 ｌ、事件の表示 昭和６０年特許願第６７３０６号 ２、発明の名称 高速液体クロマトグラフィー用カラム ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称 （３
１２）三井東圧化学株式会社代表者沢村治夫 ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区新橋３丁目７番３号ミドリヤ
第２ビル ７階 昭和６０年６月１０日 ６、補正の対象 ４、図面の簡単な説明 ７、補正の内容 明細書第１８ページ第１３〜１５行の記載を次のように
補正します。 「第１１図及び第１２［ｉＵは図面に代る写真であり、
製造例１及び製造例５で得たＨＡｐ（ヒドロキシアパタ
イト）の結晶の構造をそれぞれ示す電子顕微鏡写真であ
る。」
Claims (3)
- （１）ヒドロキシアパタイトを０．５ｇ／ｃｍ＾３以上
の高密度で充填してなることを特徴とする高速液体クロ
マトグラフィー用カラム。 - （２）ヒドロキシアパタイトが比表面積５０ｍ＾２／ｇ
以下の柱状結晶であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の高速液体クロマトグラフィー用カラム。 - （３）柱状結晶が略球状の集合体であることを特徴とす
る特許請求の範囲第２項記載の高速液体クロマトグラフ
ィー用カラム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60067306A JPS61226657A (ja) | 1985-03-30 | 1985-03-30 | 高速液体クロマトグラフイ−用カラム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60067306A JPS61226657A (ja) | 1985-03-30 | 1985-03-30 | 高速液体クロマトグラフイ−用カラム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61226657A true JPS61226657A (ja) | 1986-10-08 |
| JPH0446383B2 JPH0446383B2 (ja) | 1992-07-29 |
Family
ID=13341196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60067306A Granted JPS61226657A (ja) | 1985-03-30 | 1985-03-30 | 高速液体クロマトグラフイ−用カラム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61226657A (ja) |
-
1985
- 1985-03-30 JP JP60067306A patent/JPS61226657A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0446383B2 (ja) | 1992-07-29 |
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