JPS61227800A - α−アミラ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、ｆｒ規な基質、即ちオリゴサツカライド誘導
体を基質として使月することを特徴とするａ−アミラー
ゼ活性測定法に関する。

【従来の技術］ α−アミラーゼは澱粉、及びグルコースの比較的低分子
の重合体、及びオリゴマー中のグルコース単位間の７７
−１１４−結合を加水分解する酵素である。この酵素は
人体中では主として膵臓、及び唾液腺中で産生され、又
古くから各種の疾患との関連が研究された酵素である。

最近、各種の介Ｉ＆基質による酵素活性の測定も注目さ
れており、各種の測定法が数多く発表され、又各様の測
定用キットも多数発売されている。

従来よりα−アミラーゼ活性測定方法については各種の
方法論が知られている１例えば、■ヨード澱粉反応を利
用し、有色の減退を測定するヨード澱粉法は、キャラウ
ェイの方法に代表されるが、共存蛋白が澱粉とヨウ素の
呈色を阻′、キすること、或いは反応時間が短いため再
現性が悪いこと、更ｉ二この方法は自動分析へで社なわ
せることが困難である等の問題点を有している。■色素
を結合させた澱粉を基質とし、加水分解により遊離した
色素を測定する色素法は、いわゆるブルースターチ法に
代表されるが、この方法は測定操作で遠心４作を要する
ため煩雑であり、分析の自動化には困難性を有している
。■澱粉溶液の還元性の増加を測定する糖化法は、ンモ
クーの方法に代表されるが、この方法は試料中のグルコ
ースにより正の誤差を生じ、又振作が繁雑である等の問
題点を有している。〔生物試料分析＋　Ｖｏｌ、７　、
Ｎｏ、２　＋　２５−４４（１９８４））。

一方、マルトテトラオース、マルトペンタオース等の一
連のマルトオリゴ糖を基質として利用する方法〔特開昭
５０−５６９９８号公報〕では、生成する糖は主として
マルＦ−ス、グルコース等であり、予め試料中の糖質を
完全に消去しておかねばならないこと、又酵素反応で生
成するグルコースをグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）
、ベルオキシグーゼ（ＰＯＤ）、　クロモデン系をｍい
て測定する場合に、試料中のグルコースの影響を補正す
る必要があると共に、多鼠のＣＯＤを必要とする。

更に、試料中に存在する７スコルビン酸やビリルビン等
の還元４＃質の影響をまぬがれない等々の問題点を有し
ている。

更に、修飾マルトオリゴ糖を用いた方法も各種発表され
ている０例えば、−ｍ＝トロフェノールの結合したマル
トペンタオース、或いはマルトヘキサオースをａ−アミ
ラーゼの基質とし、ａ−アミラーゼの作用によって生成
したｐ−二）　０．フェノールの結合したマルトース、
マルト）リオース、グルコース等にａ−グルコシダーゼ
を作用させて生成するｐ−二トロフェノールを測定する
方法〔特公昭５７−５３０７９号公報〕がある。この方
法は、ｐ−ニトロフェノールを４１０　ｎｍの吸光度で
測定してその量を算出するのであるが、ｐ−ニトロフェ
ノールの発色度は測定ｐｔｌや測定温度の影響を受は易
いことと、４１０　＊ｔ−付近に吸収を示す試料中のビ
リルビンの影響を受は易い、又、ハロゲン化フェニル基
が結合したマルトペンタオースをα−アミラーゼの基質
とし、ａ−アミラーゼを含む試料を作用させた後、ａ−
グルコシダーゼ、及びβ−グルコシダーゼを作用させて
遊離するハロゲン化７エノールを測定する方法〔特開昭
５６−３５９９８号公報〕がある。この方法は、遊離す
るハロゲン化フェノールを、例えば、４−７ミノ７ンチ
ピリンと酸化縮合させ、生成する色素の呈色強度をＳ　
ＯＯ、、で測定するため、この波長域−二光学的な吸収
を有する溶血血清中のヘモグロビンの影響を受は易く、
更に、この方法で尿を試料として尿中のａ−アミラーゼ
の測定を行なうと、尿中にしばしば認められる７エ７−
ル顛似物質が呈色試薬に上り発色するため、正誤差を与
えるというｆｆ１ｌ！ｆ１点を有している。

［５！！明が解決しようとする問題点１本発明者は、上
記従来のａ−アミラーゼ活性測定法の問題点を解消すべ
く鋭意研究を重ねた結果、ｐ−７ミノフエニル基が還元
性末端に結合したマルトオリゴ糖を基質として使用すれ
ば、これらの問題点が克服されることを見出し、本発明
を完成するに到った。

［ＩｔＩＪ′Ｍ点を解決するための手段］本発明は、ａ
−アミラーゼを測定するに際し、ｐ−７ミノフエニル基
が還元性末端に結合したマルトオリゴ糖を基質とし、α
−アミラーゼを含有する試料を作用させた後、遊離する
一二７ミ／７エ／−ルを測定することを特徴とするα−
アミラーゼ活性測定法である。

本発明におけるマルトオリゴ糖とは、ａ　　１＋４−グ
ルコシド結合でグルコースが２〜１０個程度結合した糖
類をいうが、特にマルトテトラオース（Ｇ４）、マルト
ペンタオース（Ｏｓ）　、マルトヘキサオース（Ｇ６）
、マルトヘプタオース（Ｇ１）がα−アミラーゼ活性測
定の基質として好ましい。

本５！明において遊離するｐ−７ミノフエノールは公知
の方法で測定する０例えば、ｐ−７ｔノ７−エンールは
カブクーとしてフェノール系、ナフトール系化合物の中
から７二ノール、サリチル酸、０−クレゾール、−一ク
レゾール、２．３−キシレノール、２，５−キシレノー
ル、１−す７トール、１−す７トールー８−スルホン酸
、１−す７トール−４−スルホン酸、１−す７トールー
２−スルホン酸、２−す７トールー６−スルホン酸、２
−す７）−ルー３，６−ジスルホン酸等から選択した化
合物と酸化剤の存在下で、カップリングさせ生成するイ
ンドアエノール色素を比色測定することにより、Ｃｌ−
７９ラーゼ活性を求める。酸化剤としでは、メタ過ヨウ
素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、次亜塩素酸ナト
リウム、過硫酸アンモニウム、７エリシアン化カリウム
、過酸化水素等を用いることができる。緩衝剤としては
、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル
酸塩、及びトリス−（ヒトミキシメチル）−７ミノメタ
ン等のグツド緩衝剤が用いられる。

本発明にｍいるｐ−７ミノフエニル基が還元性末端に結
合したマルトオリゴ糖は、市販のｐ−二トロフェニルー
α−マルトオリゴ糖を原料として常法に従って合成する
１例えば、白金黒、又はラネーニッケル等を触媒に用い
、水素化還元を行ないニトロ基をアミ７基に変換させる
ことにより合成できる〔ハウス最新有機合成反応、ｆｆ
ｉ二版＋ｐ１〜３７　、１９８３年、履用書店参照〕。

本発明方法では通常、測定用共役酵素としてａ−グルコ
シダーゼを作用させてｐ−７ミノフエノールをｉｓさせ
る。このａ−グルコシダーゼは試料中の（１−７ミラー
ゼと同時に作用させることも、或いは基質のマルトオリ
ゴ糖と試料中のａ−アミラーゼとの反応後、作用させる
ことも可能である。

シカし、グルコースが２〜４個程度結合した基質を用い
るときには、ａ−グルコシダーゼは特・に用いなくても
よい。

［作用］ 本発明方法によれば、ｐ−７ミ／フエニル基が還元性末
端に結合したマルトオリゴ糖をα−アミラーゼ活性測定
用の基質として用いているため、基質の構造、及び氷解
生成物の構造が明確であり、標準的測定法〔生物試料分
析、　Ｖｏｌ、　７　、　Ｎｏ、２　、２５〜４４　（
１９８４）　］の基質の選択条件に適している。

又、アミラーゼの作用により基質から遊離するｐ−７ミ
ノフエノールを測定することにより、試料中の還元糖、
還元物質等の影響がなく、従って、試料中にグルコース
が多量シニ存在していても、グルコースを除く前処理の
必要がない、更に、尿を試料とした測定のときしばしば
問題となるフェノールＵ似物質による妨害もまったくな
いα−アミラーゼ活性の測定法が可能になる。

以下、実施例により本発明を説明する。

参−可倒 ρ−７ミ／　７　ｘニル−α−マルトオリゴ糖の合成法 ７ｔＴＩＩｊノｐ−ニトロフェニル−ａ−マルトオリゴ
糖２００　ｍｇを１００％ツタノー／Ｉ／　２０　ｄと
７ンモニア水０．Ｚｘｌに溶ＭＬ、２％白金黒４０即を
加えて常圧室温にて５時間水素化還元を行なう１反応終
了後、触媒を濾過して波浪を減圧濃縮して、エタノール
を加えて再び減圧濃縮することにより白色結晶（粉末）
のｐ−７ミノフエニルーα−マルトオリゴ糖を得る。収
率はマルトテトラオース約６０％、マルシペンタオース
約６０％、マルトヘキサオース約５０％、マルトヘプタ
オース約５０％である。これらの合成物は、薄層クロマ
トグラフィーにて単一のスポットを示した。

試験例 本発明法と従来法（４−アミ７アンチビリンと酸化縮合
）の発色系にす（ける検体ブランクの比較。

１、本発明法の試液の調整 ■試Ｖｌ−１５０＋ａＭリン酸−カリウムー水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６，９） ■試液−２０，２Ｎ水酸化カリウムに１．９−Ｍ過ヨウ
素酸カリウム、及び１０ １Ｉ１０１Ｉキンレノールを含有する 溶液。

ｌＩＭｐ−キシレノールを含有する 溶液。

■、従来法の試液の、Ｗ整 ■試液−１３、５ａＭ　４−アミノ７ンチビリンを含む
５０−Ｍパイブス（Ｐ ＩＰＥＳ）緩衝液（ｐｒｌ　６．９　）■試液−２１０
ｍＭ過ヨウ素酸カリウムを含む１３３　ｍＭホウ酸−水
酸化カ リウム緩衝液（耐１８．５　） ■、操作法 １０種類の尿試料を各々２０μｌ′／＞注し、前記Ｉ５
及び■の試液−１を各々ｌ１１１添加し、室温で１０分
間放置後、前記Ｉ、及び「の試！−２を各々２　ｙｌ加
えて攪拌し、発色させ、本発明法ではＧ　ＯＯ＊ｔｌｌ
にて、従来法では４９０　ｎｍにて吸光度を測定した。

■、結　果 表 以上の結果より、本発明による方法を用いた場合は、従
来法に比べて検体ブランクの影響が極めて少ない、この
結果、本発明法では検体ブランクをとる必要がなくなる
ことが明らかになった・ 実施例１゜ １、Ｉｊ４定試液 ■試Ｑ　−１５０＋＊Ｍ塩化ナトリウム、１−Ｍ塩化カ
ルシウム、２．５ｍＭｐ−７ ミノフエニルーａ−マルＦテト ラオース、及び５０　Ｘ　１０’Ｕ／１α−グルコシダ
ーゼを含む５０ ｍＭリン酸−カリウムー水酸化ナ トリウム緩衝Ｕ（ｐＨ６，５） ■試Ｖ１．−２１００ａＭ水酸化カリウムに１゜９ｍＭ
過ヨウ素酸ナトリウム、及 びｌ　ＯａＭ　ｐ−キシレ／−ルを含 有する溶液。

■、操作法 試液−１を１１１とり、これに血清試料０．０２１１を
加え、３７℃で１５分間加温する０次いで試［−２を２
　ａ１加えて攪拌し、室温５分間放置後、Ｑ　ＯＯ＋ｎ
＋＋における吸光度を測定する。この時の試料の希釈度
と吸光度変化の関係をｍｉ図に示す。

実施例２゜ ■、測定試液 ■試液−１５０ｍＭ塩化ナトリウム、　１　ｍＭ塩化カ
ルシウム、２　ｍＭ　ｐ−７ミ ノフエニルーα−マルトペンタ オース、及び５０Ｘ１０コＵ／１ α−グルコシダーゼを含む５０ ＋ｍＭリン酸−カリウムー水酸化ナ トリウムａ衝液新液Ｈ６，５） ■試ａ−２実施例１．の測定試液の試液−２と同様。

＋＋、操作法 実施例１．の操作法と同様に行なう、この時の試料の希
釈度と吸光度変化の関係を第２図に示す。

実施例３゜ １、測定試液 ■試液−１実施例２．の測定試液の試液−１と同様。

■試８１−２　　実施例１．の測定試液の試液−２と同
様。

１０＊ｆｆｉと唾液０．５社を混合して調製）とし、実
施例１．の操作法と同様に打なう、二の時の試料の希釈
度と吸光度変化の関係を第３図に示す。

実施例４゜ １．８１１！定試液 ■試液−１５０ｉ＊Ｍ塩化ナトリウム、　１　ｍＭ塩化
カルシウム、２鴫Ｍｐ　　７ミ ／フェニル−α−マルトヘキサ オース、及び５０ｘ１０コＵ／１ α−グルコシダーゼを含む５０ −Ｍリン酸−カリウムー水酸化ナ トリウム緩ＩＩｉ液（ｐＨ６，５） ■試液−２実施例１．の測定試液の試液−２と同様。

■、操作法 実施例１．の操作法と同様に行なう。この時の試料の希
釈度と吸光度変化の関係を第４図：こ示す。

実施例５゜ ■、測定試液 ■試？ｌｌ　　１　　５０＋ａＭ塩化すトリウム、１　
ｍＭ塩化カルシウム、２．５ｍＭｐ　　７ ミ／フェニル−ａ−マルトヘプ タオース、及び５０Ｘ１０コＵ／１ ａ−グルコシダーゼを含む５０ ｍＭリン酸−カリウムー水酸化ナ トリウム緩衝）ｉ！（ｐｌｒ　６．５　）■、操作法 実施例１．の操作法と同様に行なう、この時の試料の希
釈度と吸光度変化の関係を１１５図）こ示す。

【図面の簡単な説明】

第１図、及び第２図は、実施例１、及び２における血清
試料の希釈度と吸光度変化との関係を示す、第３図は、
実施例３における尿試料の希釈度と吸光度変化との関係
を示す、第４図、及び第５閃は、実施例４、及び５にお
ける血清試料の希釈度と吸光度との関係を示す。 特許出願人　株式会社シ／テスト研究所悟ＬＩｆ１ アミラーグう省１１’ｌ（’／も灸華イＩｄｌ）第２日 ？ミラーＢ”５（５／ｌ’Ｅ−（’／Ｅ”、：’−！／
−４ｉＬ／ｃＪｔ　）＄９ｍ アミラーゼ°う舌Ｉ台ムひ／Ｅ９−剃丸／ｄｔ　）第４
図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｐ−アミノフェニル基が還元性末端に結合したマルトオ
   リゴ糖を基質とし、α−アミラーゼを含有する試料を作
   用させた後、遊離するｐ−アミノフェノールを測定する
   ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。