JPS61232000A - 過酸化水素の新規定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は過酸化水素、特に酵素反応によって生成する過
酸化水素の新規定量法に関する。

〔発明の背景〕

過酸化水素の検出、定量は化学実験上、工業上の重要性
だけでなく、特に臨床検査の分野に於ては酵素反応によ
り生成する過酸化水素を定量することにより生体成分の
定量を行う方法が広く普及しておシ極めて重要である。

例えば、血液中のコレスチロール、トリグリセライド、
グルコース、尿酸、リン脂質、胆汁酸、コリンエステラ
ーゼ、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼなどを測定
する方法として、それぞれの系で最終的に生成する過酸
化水素を定量することにより目的物を測定する方法が開
発されており、疾病の診断上役立っていることは周知の
通りである。

過酸化水素の定量法として現在量も広く行われている方
法は、これをペルオキシダーゼ、及び発色成分である被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色
定量することにより間接的にその定量を行う方法である
。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性呈
色試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピリ
ンと、フェノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置換アニリン
系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系
化合物との組合せ試薬、２，２′−アジノビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホンり（ＡＢＴＳ）、
　　トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導
体、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール
誘導体、０−フ二二レンジアミン等が挙げられる。

しかしながら、これら被酸化性呈色試薬を用いる方法は
、例えば生体試料中の微量成分の定量に於ては、測定系
にペルオキシダーゼが存在すると、このような被酸化性
呈色試薬の酸化反応と競合して、試料中に存在する生体
内還元性物質例えば、アスコルビン酸、ビリルビン等に
よる過酸化水素の還元反応も同時に起ってしまうため、
測定値に負の誤差を生じることがしばしばあった。従っ
て、これら妨害物質を除くために、アスコルビン酸オキ
シダーゼ、ヨウ素酸塩、銅イオン−ペルオキシダーゼ−
アミノ化合物などによりアスコルビン酸を除去したり、
フェロシアン化カリウムやビリルビンオキシダーゼによ
りビリルビンの影響ヲ除く等、種々の工夫がなされてい
るが、いずれも一長一短がある。

また、リボ蛋白分画中に含まれる各脂質を測定する方法
としても、上記した如き過酸化水素定量法がしばしば用
いられており、各脂質を被酸化性呈色試薬を用い酵素法
で発色させ染色を行なっている。例えば、コレステロー
ルの場合、コレステロールオキシダーゼを作用させて生
成する過酸化水素ヲ、ペルオキシダーゼの存在下、４−
アミノアンチピリン、フェノール系化合物と反応させる
ことにより染色を行なっている。しかしながら、このよ
うにリボ蛋白分画の染色に被酸化性呈色試薬を用いる方
法は、生成した色素が後処理の洗浄工程で一部洗い流さ
れるため、染着性の面で大きな問題を有している。

〔発明の目的］ 本発明の目的は、例えば、基質、又は酵素反応により生
成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過酸化水素を
定量することにより行なう、生体試料中の微量成分の定
量に於て、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビ
ン等新元性物質の影響をより回避でき、また、例えば、
リボ蛋白分画中に含まれる各脂質を酵素反応によシ生成
した過酸化水素と、呈色試薬を甲いて染色し、定量する
場合に於て埴、水に難浴で染１性の強い色素が使用でき
、それによって、より精度の高い測定を行い得る、過酸
化水素の新規で有用な定量法を提供することにある。

〔発明の構成〕

上記目的を達成するため、本発明は次の構成からなる。

「還元型補酵素、ペルオキシダーゼ、及びアミン類又は
フェノール類（又はナフトール類）の存在下、過酸化水
素が被還元性呈色試薬を還元して生ずる着色化合物の呈
色度を測定することにより過酸化水素を定量することを
特徴とする、過酸化水素の定量方法。」 本発明者らは、例えば前記、過酸化水素を定量すること
により行なう生体試料中の微量成分の定量に於て、過酸
化水素の酸化力を測定する方法によりこれを行なう限り
は、試料中に共存するアスコルビン酸やビリルビン等の
還元性物質の影響は不可避であり、また、リボ蛋白分画
中に含まれる脂質の染色に被酸化性呈色試薬を用いる限
りは、染着不充分となることは否めないと考え、過酸化
水素の酸化力を測定する代りに、その還元力を測定する
方法について鋭意研究を重ね、本発明に到達した。即ち
、本発明者らは、薗元されて呈色する呈色試薬即ち被還
元性呈色試薬として一般に用いられているテトラゾリウ
ム塩の中には、酸化還元電位等の関係からアスコルビン
酸やビリルビンの影響を受は難いものがあること、また
、テトラゾリウム塩が還元されて生ずるホルマザン、ジ
ホルマザンの中には、水に難溶で染着性の強いものが多
いこと、に着想を得て鋭意研究を重ねた結果、本発明を
完成するに到った。

本発明の方法により過酸化水素を定量するには、通常、
過酸化水素を含む試料又は過酸化水素を生成する系に還
元型補酵素、ペルオキシダーゼ、アミン類又はフェノー
ル類（ナフトール類）、及び被還元性呈色試薬を含む試
液を加え、一定時間反応させ之後、呈色度を測定すれば
よい。

本発明の方法が還元型補酵素による被還元性呈色試薬の
還元発色でないことは、ンアホラーゼ又はフェナジンメ
トサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメ
トサルフエート　（１−メトキシＰＭＳ）等電子伝達体
がこの反応系に存在しないことから明らかであり、また
、スーパーオキシドジスムターゼの添加により反応阻害
が起らないことから、スーパーオキシドイオンによるも
の５（いことが明らかである。

このように、本発明の方法によれば、過酸化水素が定量
的に被還元性呈色試薬を還元発色させるということは、
全く意外なことである。

本発明に於て用いられる還元型補酵素としては、例えば
、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
ＤＨ）や、電光型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（ＮＡＤＰＨ）’ｌが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。

その使用濃度は特に限定されないが、通常は０．０１〜
２０　ｍｍｏ７／ｌが好ましく用いられる。

また、ペルオキシダーゼは、植物由来、動物由来、微生
物由来のペルオキシダーゼがいずれも使用できるが、通
常は西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましく用いられる
。その使用濃度は通常、呈色段階の液量に対して１００
〜１０，０００　Ｕ／１程度存在するように用いればよ
い。

アミン類としては、通常の有機アミンがいずれも使用で
き、−級、二級、三級を問わない。また、一般に脂肪族
アミンに比べ芳香族アミンの万が、少ない使用量で効果
がある。これらのアミン類の具体例としては、例えば、
アニリン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン、
Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン
、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（β−ヒドロキシエチル＞−ｍ−トルイジン、３゜５
−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−ノジウムスルホブロビル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トル
イジンナトリウム（以下、ＴＯＯ８と略す。）等が挙げ
られるが、これらに限定されるものでないことは勿論で
ある。その使用濃度は多くの場合、呈色段階で反応液中
ｏ、ｏｏｏｉ〜０．５％程度存在するように添加すれば
よい〇フェノール類としては、フェノールそのものの他
、例えば、メチル、エチル、プロピル等アルキル置換フ
ェノール、例えば、メトキシ、エトキシ。

プロポキシ等アルコキシ置換フェノール、塩素。

臭素、弗素、沃素等ハロゲン置換フェノール等各種誘導
体が使用できる。また、ナフトール類としては、ナフト
ールそのものの他、例えば、ナフトールスルホン酸類、
ナフトール方法ボン酸類等のナフトール誘導体が使用で
きる。その使用濃度は多くの場合、呈色の段階で反応液
中０．０００１〜０、５％程度存在するようにすればよ
い。

これらアミン類、フェノール類及びナフトール類は夫々
単独で用いても、任意に二種以上組み合せて用いてもか
まわない。また例えば１−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ−４
−ナフトール、４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノサリチル酸
のように、１つの化合物がフェノール類でもあり、アミ
ン類でもある化合物を使用することもできる。但し、基
質がアミンとかＬ−アミノ酸などで、オキシダーゼが夫
々アミンオキシダーゼとかＬ−アミノ酸オキシダ−ゼな
どである場合には、アミン類でなくフェノール類を用い
ることは当然である。

本発明に於て用いられる被置元性呈色試薬としては、既
存のもの未知のものを問わず還元されて呈色する化合物
は全て挙げられるが、既存のもので一般によく用いられ
るものとしては、例えば、２．２／−ジ（４−ニトロフ
ェニル）−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３
’−ジメトキシ−４゜４′−ジフェニレン〕ジテトラゾ
リウム　クロリド（以下、ニトロ−ＴＢと略す。）、２
−（４−ヨードフェニル）　−，３−（４−ニトロフェ
ニル）−５−フェニルテトラゾリウム　クロリド（以下
、ＩＮＴと略す。）、又は３−（４，５−ジメチルチア
ゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム　プ
ロミド（以下、ＭＴＴと略す。）等のテトラゾリウム塩
が挙げられる。

本発明の定量法は酸性からアルカリ性までの広いｐＨ範
囲で実施可能であるが、通常は酵素類の安定性を考慮し
て、ｐ　Ｈ４〜９が好ましく用いられる。

本発明の方法により測定可能な基質としては、例、ｔ　
ハ！ルコ・−ス、ガラクトース、コレステロール、グリ
セロール、グリセロール燐酸エステル、コリン、アシル
ＣＯＡ　、ピルビン酸、尿酸、キサンチン、乳酸、ザル
コシン又にシュウ酸等が挙げられ、これらを測定するに
当っては、夫々その基質に作用するオキシダーゼ、即ち
、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ
、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダ
ーゼ、グリセロール燐酸エステルオキシダーゼ、コリン
オキシダーゼ、アシルＣＯＡオキシダーゼ、ビルビン酸
オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、
乳酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ又はシュウ
酸オキシダーゼが組み合わせて用いられる。

また、本発明の方法によりリボ蛋白を分画する場合は、
例えば、支持体としてアガロースゲル、寒天ゲル、セル
ロースアセテート、ポリアクリルアミドゲル等を用い、
電気泳動法によりリボ蛋白を分画した後、本発明によっ
てリボ蛋白分画中に含まれる各脂質を染色し定量すれば
よい。その染色定量方法の一例を示すと、以下の如くな
る。即ち、先ず、本発明の試薬組成物を溶解した試液を
−Ｐ紙に含ませ、これで分離面の表裏２面をはさむか、
又は分離面の上に試液を積層させて、３７℃ふ卵器中３
０分間反応させる。その後、ゲル上の試ｇをよく振り切
り、エタノール：酢酸：水＝１４：１：５の混合液に約
３０分間浸漬し攪拌したのち、約３０分間水洗する。水
洗後、そのまま又は乾燥後、常法てよりデンシトメトリ
ーを行なって定量すればよい。

以下に実施例及び参考例を挙げるが、本発明はこれらに
限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１．過酸化水素の定量 ＮＡＤＨ０，６７ｍｍｏｌｌ／ｌ！％ルオ＃シタ−セｚ
ｏｏＯＵ／ｌ、フェノール　０．０２チ、トリトンＸ−
１０００，０５係、ニトロ−ＴＢ　　２００■／ｊの濃
度になるように、０．０５Ｍ）リス・塩酸緩衝液（１）
　Ｈ７，Ｏ）に溶解し、発色試液とした。

過酸化水素を夫々２．０　、４．０　、６．０　、８．
０　。

１０．０ｍｍ０ｌ／ｌ含む水溶液を調製し、試料とした
。

試料を２０μｊとり、発色試液　３．０　ｍｌを加え、
た。

第１図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。＠１
図よシ明らかな如く、各過酸化水素濃度（ｍｍｏｌ／ｌ
）に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は、原点を
通る直線となシ、検量線は良好な定量性を示している。

実施例２．　血清中の遊離コレステロールの定量ＮＡＤ
ＨＯ，６７ｍｍｏｌ／ｌ、　−ｙ　ｖステロールオキシ
ダーゼ　１５０Ｕ／＃、ペルオキシダーゼ２０００　Ｕ
／ｌ、フェノール　０．０２チ、トリトンＸ−１０００
，０５％、ニトロ−ＴＢ　　２００ｍ９／ｌの濃度にな
るように、０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝ｇ（ｐＨ７，０
）に溶解し、発色試液とした。

血清（アスコルビン酸を含まず）２０μｌをとり、発色
試液　３．０　ｍＬを加え、３７°Ｃで１０分間加温後
、試薬ブランクを対照として５（’ｉＱｎｍに於ける吸
光度を測定した。

別に、コレステロールを夫々５００　、１０００゜１５
００．２０００ｍ９／１（７）濃度になるよ’）Ｋ（ツ
ブロバノールに溶解したものをコレステロール標準液と
し、その２０μｌをとり、血清と同一操作を行なって得
た吸光度から作成した検量線（第２図）から、血清中の
遊離コレステロール濃度を求めた。

測定結果を表１に示す。

参考例１．　血清中の遊離コレステロールの定量フェノ
ール　０．１’％、４−アミノアンチピリン０．０１％
、コレステロールオキシダーゼ１００Ｕ／ｌ、ペルオキ
シダーゼ　３ｏｏｏＵ／ｌ、　　トリトンＸ−１０００
，１５％の濃度になるように、０、１　Ｍリン酸塩緩衝
液（ｐ　Ｈ７，０）に溶解し、発色試液とした。

実施例２．と同じ血清各５０μｌをとり、発色試液　３
ｍｌを加えて、３７℃で１５分間加温後、試薬盲検を対
照として５Ｑ５ｎｍに於ける吸光度を測定し友。（ＥＸ
）。別にコレステロール標準液（コレステロール　１０
０ｍｐ／ｄＬ、４）を用いて、血清と同様に操作して得
念吸光度（ＥＳ）から、下式により血清中の遊離コレス
テロール濃度を算出した。

測定結果を表１に示す。

表１に示されるように、実施例２．の値と参考例１、の
値とはよく一致し、その間に有意差ｈａめられない。

表　　　　　１ Ｙ＝１．ＯＩ　Ｘ＋ｏ、６　（ｒ＝０．９９４）実施例
３．リボ蛋白分画染色法〔総コレステロール染色〕 コレステロールエステルヒドロラーゼ２５０Ｕ／ｌ、コ
レステロールオキシダーゼ　８００Ｕ／ｌ。

ペルオキシター也６０００Ｕ／７．ＮＡＤＨＯ，７ｍｍ
ｏｌ／１．　ニドＯ−Ｔ　Ｂ　　（ｔｏ　５％、ＴＯＯ
８０，０３％、トリドアＸ−１０００，０２％の濃度に
なるように、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）
に溶解し、染色試液とした。

〔電気泳動〕

アガロースゲルを支持体（５，５Ｘ７ｃＭＬ）とし、血
清サンプル■、■及び■を夫々４μｊずつ塗布した。泳
動用緩衝液として、ベロナール−ペロナールナトリウム
緩衝液（ｐＨ８，６，イオン強度０．０５）を用い、３
０ｍＡ／プレートで３０分間電気泳動を行なった。

Ｃ染色】 電気泳動後のアガロースゲルプレートに染色試液を積層
させ、３７℃で３０分間インキュベートした後染色試液
を除き、１０％酢酸に浸漬、次いで水洗後、アガロース
ゲルを切り出し、ガラス板にのせて風乾した。

コレステロールは紫色に染色されるが、このリポ蛋自分
画像は第３図に示した。

また、リポ蛋自分画像をデンシトメーターで測定し、α
、β−リボ蛋白のコレステロール比率を求めたものを第
４図に示した。

実施例４、血清中のグルコースの定量 Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ１，ＯｍｍｏＡ／ｌ、グルコースオキシ
ターゼ　３０，０ＯＯＵ／ｌ、ペルオキシダーゼ３．０
ＯＯＵ／Ａ’５ＴＯＯ８０３０５％、ＩＮＴ２ｏｏｍｙ
／ｌの濃度になるように、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ
　Ｈ７，０）に溶解して、発色試液とした。

血清（アスコルビン酸を含まず）１０μｌをとり、発色
試液　３．０コを加え、３７℃で２０分間加温後、試薬
ブランクを対照として５００ｎｍに於ける吸光度を測定
した。

別にグルコースｉ、ｏｏｏ、２，０００．３，０００．
４．０００．５，０００■／ｌの濃度の水溶液を調製し
、その１０μｊをとり、血清と同一操作を行なって得た
吸光度から作成した検量線（第５図）から、血清中のグ
セコース濃度を求め念。

測定結果を表２に示す。

参考例２．　血清中のグルコースの定ｔグルコースオキ
シダーゼ　３ｏ、ｏｏｏＵ／ｌ、ペルオキシダーゼ１０
，０ＯＯＵ／ｌ、　４−アミノアンチビリ７　１００ｍ
９／ｌ、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン５００〜／ｌ、アジ
化ナトリウム　１，０００■／ｌの濃度になるように、
０．０５ＭＩＪン酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）に溶解し
て、発色試液とした。

実施例４．と同じ血清各１０μｌをと９、発色試液３、
Ｑ　ｒｎｌを加え、３７℃で２０分間加温後、試薬ブラ
ンクを対照として５５０ｎｍの吸光度を測定した（ＥＸ
）。

グルーｚ−Ｘ　　１．ｏｏｏｍ９／ｌの水溶液　１０ｔ
ｔｉｌをとゆ、血清と同一操作を行ない吸光度を測定し
たＣＥＳ）。

次式よシ血清中のグルコース濃度を算出した。

ＥＸ グルコース（ｍ９＃）　＝　−Ｘ　１０００Ｓ 表２に示されるように、実施例４．の値と参考例２．０
値とはよく一致し、その間に有意差は認められない。

表　　　　　　２ Ｙ＝０．９９５　Ｘ−０，９（ｒ＝０．９９９８）実施
例５．過液化水素の定量 実施例１．の発色試液組成に於て、ＮＡＤＨの代シにＮ
ＡＤＰＨＯ，６７ｍｍｏｌ／Ｉｆ用イタ発色試液全イタ
しｔｏこれを用いて実施例１．と同一操作で、実施例１
．で用いた過酸化水素水浴液の吸光度を測定した。

第６図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。＠６
図よシ明らかな如く、各過酸化水素濃度（ｍｍｏｌ／ｌ
）に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は、原点を
通る直線となり、検量線に良好な定量性を示している。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、過酸化水素の震元力を測定
することによシこれを定量する。過酸化水素の新規で且
つ有用な定量法を提供するものであり、 ■従来はその酸化力を測定する方法によってのみ行なわ
れていた過酸化水素の定量法の巾を飛躍的に広げた点。

■例えば、生体試料中の微量成分の定量に於て、テトラ
ゾリウム塩等の被還元性呈色試薬を用い、これの還元呈
色を比色定量することによってその定量を行なうことに
より、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン等
の還元性物質の影響をより少なくできる点。

■例えば、リボ蛋白分画中に含まれる各脂質を酵素反応
により生成した過酸化水素と、呈色試薬を用いて染色し
、定量する場合に於て、水に難溶で染着性の強い被遣元
性呈色試薬（テトラゾリウム塩等ンの使用が可能となり
、精度の高い測定が可能となった点。

等に顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献すると
ころ大なるものである。

【図面の簡単な説明】

＠１図は、実施例１．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（ｍｍｏ　ｌ／ｌ　）について
得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットし次点を結んだ
ものである。 第２図は、実施例２．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各コレステロール濃度（■／ｌ）について得られ
た吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 第３図は、実施例３．に於て得られたリポ蛋白分画のコ
レステロール染色隊を表わし、図中■は電気泳動時の陽
極側、ｅは陰極側を示し、■〜■の数字はサンプル猶を
示す。染色色調はいずれも紫色である。 第４図は、実施例３．に於て得られた染色家を、デンシ
トメーターで測定したデンジトゲラムである。図中■〜
■の数字は第３図に対応したサンプルｌ’！ｌを示す。 デンシトメーターはひかり電測■製デンシトマティック
８ＨＤ−２２０（フィルター　　５７０１ｍ）を使用し
た。 第５図は、実施例４．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各グルコース濃度Ｃｍ９／ｌ）について得られた
吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 第６図は、実施例５．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（ｍｍｏｌ／ｌ　）について得
られた吸光度を縦軸に沿ってプロットし次点を結んだも
のである。 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 ′ＩＪ１　　国 過酸化７に票這、７１　（、−々ジ ′！ＪｚＴＸ！１ ）１人チロール”４１Ｌ（司Ｊ／２） ■ ｓ　　　”’　　　°“−区・す、Ｔ４自コレステロー
ル″Ａ４回 葛　Ｓ回 クルコー人！Ｌ／ｌ（−トタ） 纂　ｂ　回 ＡＩＩＬ化水を濃度（飢−β） ゛二ノ 昭和６１年６月２０日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）還元型補酵素、ペルオキシダーゼ、及びアミン類
   又はフェノール類（又はナフトール類）の存在下、過酸
   化水素が被還元性呈色試薬を還元して生ずる着色化合物
   の呈色度を測定することにより過酸化水素を定量するこ
   とを特徴とする、過酸化水素の定量方法。
2. （２）過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
   素である、特許請求の範囲第１項記載の定量方法。
3. （３）過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定量に於
   て酵素反応により生成する過酸化水素である、特許請求
   の範囲第２項記載の定量方法。
4. （４）生体試料中の微量成分の定量が、基質、又は酵素
   反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する
   過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基質
   又は酵素活性の定量である、特許請求の範囲第３項記載
   の定量方法。
5. （５）基質がグルコース、ガラクトース、コレステロー
   ル、グリセロール、グリセロール燐酸エステル、コリン
   、アシルＣｏＡ、ピルビン酸、尿酸、キサンチン、乳酸
   、ザルコシン又はシュウ酸である、特許請求の範囲第４
   項記載の定量方法。
6. （６）電気泳動法により分離した分画中の基質に、酸化
   酵素を作用させて生成する過酸化水素を定量する、特許
   請求の範囲第４項又は第５項記載の定量方法。