JPS61235752A - 細胞分離材、分離器および分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、動物細胞、特に付着性動物細胞群の浮遊液の
中から目的とする細胞ポピユレーションを分離する細胞
分離材、分離器および分離方法に関する。

［従来技術およびその問題点」 近年、医学分野において、臨床検査は勿論、一連の生体
防御機構増強物質の基礎的評価などを含む免疫診断ある
いは免疫治療を目的として、細胞浮遊液の中から目的と
する細胞群を分離することが行なわれている。しかしな
がら、例えばリンパ球の中からＴ細胞、Ｂ細胞、Ｋ細胞
、ＮＫ細胞などを分離する場合、未だそのポピユレーシ
ョンを変えずに分離する方法はなく、細胞浮遊液の中か
ら目的とする細胞をそのポピユレーションを変えずに分
離する技術の完成が強く望まれている。

特開昭５７−２０４４５４号、特開昭５８−１４０８８
６号には、酸性官能基を有する粒状体や微細孔を有する
疎水性かつ水不溶性の粒状体、さらに具体的にはエチレ
ン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、スチレン、
ジビニルベンゼン、アクリロニトリル、メタクリル酸メ
チルの重合体および共重合体、あるいはナイロン、ポリ
カーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエス
テル共重合体およびこれらにスルホン基、カルボキシル
基、ホスホン基あるいはフェノール基等を導入した誘導
体を利用した一段階の分離手段でＴ細胞を獲得する手法
が提案されている。しかしながら、この細胞分離方法で
は、粒状体の平均粒径が小さいのでカラムが詰まりやす
く、また化学重合体自身あるいは残留低分子物質が細胞
活性に及ぼす毒作用があるという問題点がある。

また、現在学術上国際的に公認されていｉ細胞分離材お
よび分離方法は、いずれも、分離前の準備に多大の時間
がかかり、細心の処理過程を必要とし、操作が複雑で時
間と手間がかかり、使用材料の製造ロフトによってその
分離能と分離パターン（細胞ポピユレーションのスペク
トル）に太きな差異が発生して再現性に乏しいという問
題点を持っている。

具体的代表例として、架橋デキストラン・セルを用いる
セファデックスＧＩＯ法は、その原理が完全には解明さ
れていないが、細胞付着性の大小関係が主役を演じてい
ると考えられており、マクロファージやサイズの大きい
付着性を持つアクセサリ−細胞が付着によって分離され
、Ｔ細胞やＢ細胞が通過する。しかしながら、この方法
では、非付着性の小型アクセサリ−細胞は通過してしま
うし、また最近の研究によるとＴ細胞のサブポピユレー
ションのあるものは付着してしまうので、Ｔ細胞ポピユ
レーションを完全な形で得ることができず、免疫診断学
上のネックポイントになっている。

他の具体的代表例として、ナイロンウールを用いる分離
カラムが公認されている。これは、Ｔ細胞に富む分離細
胞群を得る手段として使用されるが、ターゲット細胞の
実質的収率は概して低く、°１２〜２５％といわれてい
る。そして、比較的純度の高い子細胞が得られるが、分
離前の細胞浮遊液中のＴ細胞ポピユレーションが通過後
置ってしまう欠点を有している。この方法では、ナイロ
ンウールを秤量して用いるが、製造ロフトの違いや、ウ
ールのほぐし方やカラムへの詰め方、洗浄の仕方によっ
て分離能や分離パターンが変動する。なお、このような
特性は有機系の分離材に共通するものである。

このように、細胞の付着性を利用する細胞分離方法は、
現在実用の緒についたばかりであり、分離方法自体の改
良や分離材の改良、あるいは新材料の開発によって、一
段と高能率、高速度、高精度になることが強く期待され
、広くバイオテクノロジーの分野や免疫診断学や免疫治
療学など重要な医学分野において今後益々その改良発達
が要望されている。

「発明の目的」 本発明の目的は、細胞分離のための事前処理、事前操作
および分離操作そのものを簡略化することにある。また
１本発明の他の目的は、細胞の分離能率を向上させ、分
離パターンを制御することにある０本発明のさらに他の
目的は、再現性の高い分離法とそれに適する材料を提供
することにある。

「発明の構成」 本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結
果、特定粒径のハイドロキシ・カルシウム拳アパタイト
焼結体が免疫細胞群に対する優れた吸着活性を有するこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の細胞分離材は、ハイドロキシ鳴カル
シウム・アパタイト焼結体からなり、平均粒径５０〜２
０００　ｐ、　ｍであることを特徴とする。

また、本発明の細胞分離器は、ハイドロキシ・カルシウ
ム拳アパタイト焼結体からなり、平均粒径５０〜２００
０）ｂ　ｒａである細胞分離材を、細胞浮遊液の出入口
を有し、前記細胞分離材の分散を防ぐフィルターが配置
されたカラム内に充填したことを特徴とする。

さらに、本発明の細胞分離方法は、ハイドロキシ・カル
シウム・アパタイト焼結体からなり、平均粒径５０〜２
０００ルｍである細胞分離材に、細胞浮遊液を接触させ
て、特定細胞を前記分離材に吸着させることを特徴とす
る。

本発明で用いるハイドロキシΦカルシウム・アパタイト
焼結体は、平均粒径５Ｇ〜２０００　ｐ、　ｒａとされ
る。平均粒径が５０ＪＬ１１未満では、対象細胞の大き
さと芽球形態から流れが悪く、詰まりやすいという問題
が生じ、平均粒径が２０００１Ｌｔａを超えると。

吸着表面積の低下に起因して分離能が低下するという問
題が生じる。

また、本発明で用いるハイドロキシΦカルシウム・アパ
タイト焼結体の組成において、ＣａとＰとの配合比は１
．４≦Ｃａ／Ｐ≦１．８とされることが好ましい＊　Ｃ
ａ／Ｐが上記範囲を外れると、吸着能が低下し、ひいて
は分離能が低下するという問題が生じる。

さらに、本発明で用いるハイドロキシ・カルシウム・ア
パタイト焼結体製造に際して、その焼成温度は６００〜
１３５０℃とすることが好ましい。焼成温度が６００℃
未満ではモノサイトの吸着性が低下するという問題が生
じ、焼成温度が１３５０℃を超えると７パタイト自身が
分解してセラミックスが形成できないという問題が生じ
る。

本発明によれば、細胞を免疫的に刺激することなく、従
来法に比べて極めて安定にかつ高い分離能を持って分離
することができる。また、分離操作は大きく簡略化され
、分離の所要時間は従来法の数分の−あるいは士数分の
−に短縮される。すなわち、分離材の保水率が極めて小
さいのでワンステップ法が利用でき、直接細胞浮遊液を
流し込むことができて、目的によっては洗浄も不要であ
る。滅菌されたカラム（小規模の目的には注射器でよい
）と滅菌された分離材（１００℃〜５００℃の任意の温
度で加熱滅菌可）を用いれば１分離材のカラムへの装着
は極めて簡単で短時間に使用可使にセットされるので、
準備操作の面でも極めて経済的である。勿論実用上は、
使い捨てカラムに分離材等を詰めて完全滅菌条件下で市
場に提供することも極めて容易である。

ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体が免疫細
胞群に対して示す吸着性は、この物質が本来を推動物の
骨成分と同一物質である事実に由来するものと考えられ
る。この物質は、バイオアクチブ・マテリアルであり、
生きた細胞に対するその特異的吸着性、接着性およびそ
の制御可能性においてこの右に出うる材料はなく、付着
性細胞分離材として最適である。

なお、本発明において、ハイドロキシ・カルシウム・ア
パタイト焼結体の顆粒表面には、例えば生体由来のヒア
ルロン酸、フンドロイチン硫酸、キチン誘導体、フィブ
ロネクチン、オステオネクチンあるいはその他の多糖体
やムコ多糖体、およびその誘導体を部分吸着させ、基質
表面の物理化学的性質あるいは免疫学的性質を変調して
対象細胞群のそれぞれに対する吸着活性を巧妙に変化さ
せることもできる。これによって、カラムの分離特性を
効果的に変化させ、シャープな溶出パターンを与える分
離特性や１分離スペクトラムの制御を行なうことが可能
となる。さらに、細胞のサブポピユレーションの各々に
対する吸着効果が変調されて、特定のサブポピユレーシ
ョンを選択分離することも可能となる。

また、大量の細胞を処理するカラムに対しては、多段の
カスケード構造の利用や、吸着特性の不均一分布構造の
利用、あるいはＵ字管方式の利用により、細胞浮遊液の
通過スピードの自在な制御も可能となる。さらに、微細
な分離パターンを得るために、無重力下の対流フリー、
純拡散のみのカラム通過を行なってもよい。

「発明の実施例」 以下１本発明をリンパ細胞の分離に適用した実施例を挙
げるが１本発明は他の付着性細胞にも適用可能である。

なお、以下の実施例は、いずれも図に示すような細胞分
離器を用いて実施したものである。この細胞分離器は、
細胞浮遊液の入口４および出口５を有するカラム１内に
フィルター３　（プラスチック、ガラス、セラミックス
などの通気性多孔体や繊維が用いられる）が配置され、
それにハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体か
らなる分離材２が充填されてできている。

実施例１ 内容積５国文のカラムに、ガラスウール０．０２ｇｒを
０．８ｍＭになるように詰め、これに７００℃で焼成し
た平均粒径４００〜５００ＪＬ１１のハイドロキシ・カ
ルシウム・アパタイト焼結体（Ｃａ／Ｐ−１，８７）を
５国文になるようにタップしながら充填し、細胞分離器
とした。

細胞分離器の洗浄は、始め生理食塩水を流し、次に３７
℃に保温した培地（ＲＰＭｌ　１８４０）を流し、最後
に３７℃に保温したウシ胎児血清を１０％含む培地（Ｒ
ＰＭＩ　１８４０）を流した。

次に、あらかじめ比重遠心法により正常人末梢血から分
離した単核細胞を、ウシ胎児血清を１０％含む培地（Ｒ
ＰＭｌ　１８４０）に浮遊させ、そノ０．μｍｌをカラ
ムにのせ、浸透させて３７℃で１時間インキュベートし
た。その後、培地（ＲＰＭｌ　１８４０）で細胞を流出
させた。

この細胞分離器の分離源の評価は、次の二方法で行なっ
た。その一つは、カラム通過前と通過後の細胞数をヘモ
サイトメータを用いて数え、細胞の回収率を調べる方法
である。この結果を第１表に示す、他は細胞分離状態を
調べる方法で、カラム通過後の細胞を蛍光標識抗体Ｌｅ
ｕ　１　、　Ｌｅｕ　１２）Ｌｅｕ　［３でラベルし、
ＦＡＣＳ　（Ｎａｕｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ　ｃｅｌｌ　５ｏｒｔｅｒ）を用いてＴ細胞、Ｂ細胞
およびモノサイトの陽性率（ｚ）を調べた。結果を第２
表に示す。

実施例２ 内容積５ｍｆＬのカラムにガラスウール０．０２ｇｒを
ほぼ０．８層文になるように詰め、これに１２００℃で
焼成した粒径４０θ〜５００　ｐ、ｔａのハイドロキシ
・カルシウム・アパタイト焼結体（Ｃａ／Ｐ＝１．１３
？）を５ｍＭになるようにタップしながら充填し、これ
を細胞分離器とした。

以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同様に行な
った０分離能の評価の結果を第１表および第２表に示す
。

実施例３ 内容１！１５ｔａｌのカラムにガラスウール０．０２ｇ
ｒヲはぼ０．８＋ｓｌになるように詰め、これに７００
℃で焼成した粒径６００〜１０００　ｇ　ｍのハイドロ
キシ・カルシウム・アパタイト焼結体（平均的Ｃａ／Ｐ
＝１．８７）を５ｍＪｌになるようにタップしつつ充填
して細胞分離器とした。

以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同様に行な
った０分離能の評価の結果を第１表および第２表に示す
。

実施例４ 内容積５＋Ｊｌのカラムにガラスウール０．０２ｇｒを
ほぼ０．８ｍＭになるように詰め、これに７００℃で焼
成シタ粒径１００〜２００　ｐ、ｒａのハイドロキシ・
カルシウム螢アパタイト焼結体（平均的Ｃａ／Ｐ＝１．
８７）を５＋＋ｕになるようにタップしつつ充填して細
胞分離器とした。

以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同様に行な
った６分離能の評価の結果を第１表および第２表に示す
。

比較例１ 内容積５ｍＪｌのカラムにナイロンウール０．２５ｇｒ
をほぼ３ｍＭになるように充填し、細胞分離器とした。

以下１分離器作、分離能の評価は実施例１と同様に行な
った０分離能の評価の結果を第１表および第２表に示す
。

実施例５ 内容積５１Ｊｌのカラムにガラスウール０．０２ｇｒを
ほぼ０．８＋ｉｌになるように詰め、これに７００℃で
焼結した粒径４００〜５００　用ｔａのハイドロキシ・
カルシウム・アパタイト焼結体（Ｃ：ａ／Ｐ−１，８７
）を５ｍＭになるようにタップしながら充填して細胞分
離器とした。そして、実施例１と同様な方法で採取した
単核細胞を分離カラムに１ｍ文（１，８Ｘ　１０’個）
通し、さらに培地（ＰＲＮｒ　１８４０）を流し、流出
した細胞を回収した。

以下１分離能の評価は実施例１と同様にして行ない、そ
の結果を第１表および第２表に示す。

実施例１，３．４によれば、ハイドロキシ串カルシウム
・アパタイト焼結体を分離材として用いることにより、
安定した回収率と分離能が得られることがわかる。特に
、ナイロンウールを用いた比較例Ｉと比べると、非常に
高い回収率となっている。また、実施例２によれば、ハ
イドロキシ會カルシウム・アパタイトの焼成温度を高く
することによってモノサイトの混入を最小限（０，８％
）に抑えることができることがわかる。さらに、実施例
５によれば、洗浄、インキュベートなどの操作なしでも
高い回収率と高分離能が得られることがわかる。

（以下、余白） 第１表細胞回収率 第２表　陽性率 「発明の効果」 以上説明したように、本発明によれば、特定粒径ノハイ
ドロキシ・カルシウム曝アパタイト焼結体を細胞分離材
として使用するので、細胞を免疫的に刺激することなく
、従来法に比べて極めて安定にかつ高い分離能を持って
分離することができる。また、分離材の保水率が極めて
小さいのでワンステップ法が利用でき、直接細胞浮遊液
を流し込むことができて、目的によっては洗浄も不要で
あるため１分離器作を大幅に簡略化することができる。

さらに、ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体
の顆粒表面に種々の物質を部分吸着させて、基質表面の
物理化学的性質あるいは免疫学的性質を変調して対象細
胞群のそれぞれに対する吸着活性を巧妙に変化させるこ
とにより、細胞の分離能率をさらに向上させ１分離パタ
ーンを制御することもできる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明による細胞分離器の一実施例を示す断面図で
ある。 図中、１はカラム、２は細胞分離材、３はフィルター、
４は入口、５は出口である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体か
   らなり、平均粒径５０〜２０００μｍであることを特徴
   とする細胞分離材。
2. （２）特許請求の範囲第１項において、前記ハイドロキ
   シ・カルシウム・アパタイト焼結体は、６００〜１３５
   ０℃で焼結され、造粒されたものである細胞分離材。
3. （３）特許請求の範囲第１項または第２項において、前
   記ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体は、Ｃ
   ａ／Ｐが１．４〜１．８とされている細胞分離材。
4. （４）ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体か
   らなり、平均粒径５０〜２０００μｍである細胞分離材
   を、細胞浮遊液の出入口を有し、前記細胞分離材の分散
   を防ぐフィルターが配置されたカラム内に充填したこと
   を特徴とする細胞分離器。
5. （５）特許請求の範囲第４項において、前記ハイドロキ
   シ・カルシウム・アパタイト焼結体は、６００〜１３５
   ０℃で焼結され、造粒されたものである細胞分離器。
6. （６）特許請求の範囲第４項または第５項において、前
   記ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体は、Ｃ
   ａ／Ｐが１．４〜１．８とされている細胞分離器。
7. （７）ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体か
   らなり、平均粒径５０〜２０００μｍである細胞分離材
   に、細胞浮遊液を接触させて、特定細胞を前記分離材に
   吸着させることを特徴とする細胞分離方法。
8. （８）特許請求の範囲第７項において、前記ハイドロキ
   シ・カルシウム・アパタイト焼結体は、６００〜１３５
   ０℃で焼結され、造粒されたものである細胞分離方法。
9. （９）特許請求の範囲第７項または第８項において、前
   記ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体は、Ｃ
   ａ／Ｐが１．４〜１．８とされている細胞分離方法。