JPS61236799A - エトサキシミド試験法、トレーサー、イムノゲンおよび抗体 - Google Patents

エトサキシミド試験法、トレーサー、イムノゲンおよび抗体

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JPS61236799A JP7264486A JP7264486A JPS61236799A JP S61236799 A JPS61236799 A JP S61236799A JP 7264486 A JP7264486 A JP 7264486A JP 7264486 A JP7264486 A JP 7264486A JP S61236799 A JPS61236799 A JP S61236799A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １、技術分野 本発明は液体、特に血清、血漿又は尿の様な生物学的液
体中のエトサキシミド量測定の螢光偏光免疫試験法とそ
の試薬およびその製法に関する。特に本発明は（１）試
料中のエトサキシミド量測定用試薬（トレーサーと抗体
）、（２）抗体をあげるにつかうイムノゲン化合物、（
３）（トレーサーとイムノゲン化合物製造用）合成法お
よび（４）試験にあたっての分析法に関する。
２、従来技術 エトサキシミドはペチーマールてんかんによっておこる
急発に減少する。エトサキシミドは胃腸系統、胃粘膜系
統および神経系統の重大な逆反応を他の副作用の他にお
こしうる。
４０乃至１００μ２／ｍ／量の血漿は治療に有効と信じ
られまた１００μｍ／−以上の素は有毒と信じられてい
る。エトサキシミドの血漿量は個々の楽品運動学におけ
る広い変化により広く患者間で変る。また同じ患者にお
いてもその状態が変ると運動速度は変りうる。したがっ
て患者血液中のエトサキシミド量の監視は安全有効な治
療に推奨されている。
従来患者の血清又は血漿エトサキシミド量は通常高性能
液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法、ガスクロマトグラ
フ（ＧＣ）法、酵素免疫試験（ＥＩＡ）および基質結合
螢光免疫試験（ＳＬＦＩＡ）で測定されている。これら
の方法は薬品濃度検出に適当に特定しているが欠点がな
いわけではない。ＨＰＬＣとＧＣ法は試料抽出を要し試
験時間が長い。ＥＩＡとＳ　ＬＦ　Ｉ　Ａは酵素試験が
あり次の欠点をもつ：（１）試薬が比較的不安定である
、（２）　Ｅ　Ｉ　Ａ、！＝　５ＬＦＩＡの酵素反応に
影響をもつ生物学的試料中の成分（酵素抑制剤又は同じ
反応を接触する酵素の様な）が試験結果に影響をもつ、
および（３）　Ｅ　Ｉ　Ａと５ＬＦＩＡは吸光又は螢光
のいづれかを測定しまた吸光又は螢光（脂質、ヘモグロ
ビン、ビリルビン又は他の発色団又は螢光団の様な）に
影響する生物学的試料中の化合物はこの試験から見られ
る結果の精度に影響をもつ。
他の物質の試験において競争結合免疫試験は更に満足な
別法を与えている。一般に競争結合免疫試験は試験試料
中の配位子測定に使われている。（本記述の目的のため
“配位子１は競争結合免疫試験法により定量測定される
生物学興味ある物質である。）配位子は配位子又は配位
子同族体に特定の抗体上の一定数の受体結合位置をラベ
ル付試薬又は“配位子同族体゛又は“トレーサー゛と争
う。試料中の配位子濃度は抗体に結合する配位子同族体
の量を決定する。
配位子と配位子同族体の各々はその濃度に比例して抗体
と結合するので結合する配位子同族体量は試料中の配位
子濃度に逆比例する。
螢光偏光は競争結合免疫試験で生成されたトレーサー−
抗体共役物量の定量測定法となる。螢光偏光法は螢光ラ
ベル付き化合物が平面偏光によって励起されたときその
回転速度に逆比例する偏光度をもつ螢光を放出するとい
う原理に基づく。したがって螢光ラベルをもつトレーサ
ー−抗体共役物が平面偏光によって励起されると光が吸
収されまた放出される時間の間螢光団が回転から拘束さ
れるので放出光は非常に偏光されたままでいる。反対に
結合していないトレーサーが平面偏光によって励起され
るとその回転は対応するトレーサー−抗体共役物のそれ
よシずつと速い。結果として非結合トレーサー分子から
放出された光は消偏される。
この螢光偏光法は螢光団としてトリアジニルアミノ−フ
ルオレジイン部分使用に関するワンプらの米国特許第４
４２（１５６８号に応用されている。エトサキシミド抗
原共役物および抗体はソファ−らのカナダ特許第Ｌ０３
７．４７５号およびバラフラーらの１９８３年５月１９
日のヨーロッパ特許出願第８３−１０４９２９．１に記
載されている。エトサキシミドの螢光偏光免疫試験は英
国ロンドンのインターナショナルラボラトリーサーヴイ
セズから１９８３年出版された“エトサキシミドの偏光
螢光免疫試験ゝに記載されている。
本発明は非常に敏感なトレーサー、その製法およびトレ
ーサーを使う試験法がエトサキシミドの測定に提供され
る点で従来技術以上にこの技術の発達をすすめる。本発
明によってなされる試験は下記するとおシ特に正確であ
る。
発明の要旨 本発明はエトサキシミドの螢光偏光試験、試験に使うト
レーサー、イムノゲ／および抗体、およびトレーサー、
イムノゲンおよび抗体の製法に関する。
本発明の第１形態は新規構造をもつ独特のトレーサーと
イムノゲンの発見に関する。本発明の第１形態によシト
レーサーとイムノゲンは共に式２（式中Ｒ１はＨ又は−
Ｒ−Ｚ−Ｑを表わし；Ｒ２はＲ１がＨであるとき−ＣＨ
２−Ｒ−Ｚ−ＱでありまたＲ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであると
きはＲ２はメチル又はエチルであり；Ｒ３はメチル又は
エチルを表わし；Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ
酸）誘導体又は他の免疫学的活性担体又はフルオレスセ
イン又はフルオレスセイン誘導体ヲ表ワし；２はＱがフ
ルオレスセイン又はフルオレスセイン誘導体である時は
ＮＨ，Ｃｏ、　Ｃ８，Ｓ（ｈ又はＣ＝ＮＨであシまたＱ
がポリ（アミノ酸）又はポリ（アミノ酸）誘導体又は他
の免疫学的に活性な担体であるときはＮ１ＮＨ１Ｎ＝Ｎ
又はＣＨ２であシ；かつＲはＱがポリ（アミノ酸）、ポ
リ（アミノ酸）誘導体又は他の免疫学的活性担体である
時はへテロ原子７までを含みまたＱがフルオレスセイン
又はフルオレスセイン誘導体である時はへテロ原子１０
までを含みかつ直鎖又は分岐鎖に配置された炭素原子と
へテロ原子合計Ｏ乃至２０をもちまた２までの環構造を
もつ結合基を表わすが、但しＲ，が−Ｒ−Ｚ−Ｑであり
、Ｑがフルオレスセインのアミノ酵導体であシ、ｚがＣ
ＯでありかつＲが通常アルキル鎖であるときはＲは少な
くも３炭素原子をもたねばならない）で示される構造式
で表わされる。
Ｑがポリ（アミノ酸）、その誘導体又は他の免疫学的に
活性な担体でるるときは化合物はイムノゲンとして使用
できる。Ｑがフルオレスセイン又はその誘導体であると
きは化合物はトレーサーとして使われる。
本発明の第２形態は新規イムノゲンによってできた抗体
に関する。本発明の第２形態によればＱがポリ（アミノ
酸）又はその誘導体又は他の免疫学的活性担体であると
きは特許請求の範囲第１項に記載の化合物に応じて抗体
が製造される。
本発明の第３形態によりイムノゲンは式２（但し式中Ｒ
１はＨ又は−Ｒ−Ｘを表わし；Ｒ２はＲ，がＨのとき−
ＣＨ２−Ｒ−ＸであシまたＲ１が−Ｒ−Ｘのときメチル
又はエチルであり；Ｒ３はメチル又はエチルを表わし；
ＸはＮＨ２、Ｃ４Ｂｒ、　　Ｉ又はＯＨを表わし；かつ
Ｒは７までのへテロ原子をもち直鎖又は分岐鎖に配列し
た炭素原子とへテロ原子合計０乃至２０をもちまた２ま
での環構造をもつ結合基を表わす）で示される化合物を
ポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は他の免
疫学的に活性な担体とカップルさせる方法によって製造
される。
本発明の第４形態によシ式２（式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−
Ｙを表わし；Ｒ２はＲ１がＨのときは−ＣＨ２−Ｒ−Ｙ
を表わしまたＲ１が−Ｒ−Ｙのときはメチル又はエチル
を表わし；Ｒ３はメチル又はエチルを表わし：Ｙは−Ｎ
Ｈ，、−ＣＯＯＨ。
−８０ｓＨ，”’５ＯｚＣ１，ＳＨ，−ＣＨｏ、　−Ｃ
Ｎ又は−ＯＨを表わし；Ｒはへテロ原子１０までを含み
また直鎖又は分岐鎖の形の炭素原子とへテロ原子合計Ｏ
乃至２０をもちまた２までの環構造をもつ結合基を表わ
す、但しＲ１が−Ｒ−Ｙであり、Ｒが通常アルキル鎖で
あシまたＹがＣ０ＯＨであるときはＲは少なくも３炭素
原子をもつことが必要である。）で示される化合物をフ
ルオレスセイン又はその誘導体とカップルさせるトレー
サーの製法が提供される。
本発明の第５形態によりエトサキシミド濃度の測定法が
提供される。試料をエトサキシミド抗血清およびエトサ
キシミド抗血清の存在に対し検出できる螢光偏光反応を
なしうるエトサキシミド誘導体を含むフルオレスセイン
と接触させる。計画偏光を溶液にとおして螢光偏光反応
をえた後この反応は試料中のエトサキシミド量の尺度と
して検出される。
更に本発明の目的と伴なう利点は図式と実施例と共に本
明細誓によってよく諒解されるであろう。
構造式の説明 下記構造式中“ｐｔ″はフルオレスセイン部分を表わし
また種々の他の記号は下記する。式中のＲ２とＲ３およ
び（又は）メチルとエチル基のオリエンテーションは特
定エナンチオマー又はジアステレオマーを暗示する意味
でもなく排除もしない。
式１は本発明により定量測定されるエトサキシミドの一
般構造式を示す。
式２は本発明のトレーサーおよびイムノゲン並びにこれ
ら製造に使われる槓々の反応体の一般構造式を示す。
弐３は本発明のトレーサーに含まれたフルオレスセイン
部分の別々の構造式と名を示している。
式４は式２がトレーサーの先駆物質を表わすとき先駆物
質にフルオレスセイン部分を結合する種々の結合基を示
している。
式５から２０までは本発明によるトレーサーの構造式の
種々の例を示している。
式２１から２４″！！では本発明に用いるイムノゲン生
成に使う種々のハプテン反応体の構造式の例を示してい
る。
式１．　　　　　　　　　式２ ラクトン 酸 式３ 式４−１　　　　　　式４−２ −Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｆｌ　　　−ＮＨ−Ｃｏ−ＮＨ−
Ｆ１式４−６　　　　式４−７ 一正−Ｃ８−ＮＨ−Ｆｌ　　　−０−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆ１
式４−８　　　　式４−９ −Ｏ−Ｃ８−ＮＨ−Ｆｌ　　　−８（ｈ−Ｎｕ−Ｆ１式
４−１０　　　　式４−１１ −　Ｏ−Ｃｏ　−ＮＨ−８０２−ＮＨＦ　１式４−１２ Ｈ υ 式５ 式６ 式９ 式１２ 式１５　　　則 式１８Ｈｄ 式２１　　　　　　式２２ 発明の説明 本発明の棧々の形態を今や構造式に関連して詳細説明す
る。
本発明はフルオレスセインとその誘導体の使用を含む。
特にフルオレスセインとその誘導体のトレーサー化合物
利用に対する必要特性はフルオレスセインの螢光である
。フルオレスセインは環境の酸濃度（ｐＨ）によって式
３に示すとおシ２互変異性体形で存在する。開放（酸）
型では多数の共役２束結合があシ、それＫよってフルオ
レスセイン（およびフルオレスセイン部分をもつ化合物
）のこの形が青光を吸収し約４ナノセコンドの励起状態
寿命の後縁螢光を放出できる様になる。開放型と閉止型
が共存するときは両者の分子の相対濃度がｐＨ調節によ
って容易に変えられる。一般に本発明のトレーサー化合
物はナトリウム、カリウム、アンモニウム等の様な生物
学的に許容される塩としてｆａｇ中にるり、それは本発
明の分析法を用いたとき化合物を開放螢光形で存在させ
る。存在する特定塩はｐＨ調節に使った緩衝剤によるだ
ろう。例えばりん酸ナトリウム緩＃液の存在で本発明の
化合物は一般にナトリウム塩として開放形で存在するだ
ろう。
本明細書で使う個々の化合物又は大化合物の成分として
のいづれかの“フルオレスセイン“とはそれらが特定分
子に対して存在するならば螢光の関係において以外は開
放型と閉止型いづれも含むことを意味する。開放型は螢
光をおこすに必要である。
フルオレスセイン分子の炭素原子の番号は分子の開放型
と閉止型のどれを考えるかによって変る。したがってフ
ルオレスセインとその化合物に関する文献は炭素原子番
号に関して一定しない。閉止型においてフェニル環上の
ラクトンのカルボニルに対するパラ−炭素は６番である
。開放型のフェニル環上のカルボン酸基に対するパラ炭
素は５番である。１式３参照）合成に使われた原料がこ
の系によって一番普通に番号をつけられているので本明
細書では閉止型の番号を採用している。フルオレスセイ
ンとその化合物。
カルボキシル基と反対の炭素原子はしたがって本明細書
の目的に対し“６′″と番号をつけている。
抗体に複合していない溶液中のトレーサーは螢光の吸収
と再放出に必要な時間以内で回転する自由である。結果
として再放出光は比較的ランダム罠配向されているので
抗体に複合していないトレーサーの螢光偏光は小さくゼ
ロに近い。特定抗体と複合すると生成したトレーサー−
抗体複合物は比較的小トレーサー分子の回転よシおそい
回転をして認められる偏光を増す。したがって配位子が
トレーサーと抗体位置をとシ合うときはえられた遊離ト
レーサーとトレーサー−抗体複合物の混合物の認められ
る螢光偏光はトレーサーのそれとトレーサー−抗体複合
物のそれとの中間値となる。試料が高濃度の配位子を含
むならば認められる偏光値は遊離配位子のそれに接近し
て小さい。試験試料が低濃度配位子を含むならば偏光値
は結合配位子のそれによシ近く高い。免疫試験の反応混
合物を垂直偏光次いで水平偏光で連続して励起し放出光
の垂直偏光成分のみを分析することによって反応混合物
中の螢光偏光を正確に測定できる。
偏光と測定される配位子濃度の間の詳細な関係は既知濃
度の補正物質の偏光値測定によって確立される。配位子
の濃度はこの様につくられた標準曲線から挿入できる。
本発明により生成された特定抗体とトレーサーは下記す
るとおシ非常によい試験法をつくることが発見されてい
る。
１、試薬 本発明のイムノゲンとトレーサーの両方は本発明要旨お
よび式２に示した左おり一般構造式によって表わすこと
ができる。
目的は抗体の認識位置に対するエトサキシミドとトレー
サー間の競合をもつことにある。ハプテンとトレーサー
の構造の大変化はこの目標を獲得させる。本発明の目的
に対し“ハプテン゛はイムノゲンの先駆物質であり、一
般に免疫学的に活性な担体に結合するに適する基をもつ
置換サクシニミド誘導体を成す。
使用可能の抗体が種々のサクシニミド誘導体から生成で
きる。環の１又は３位置のいづれかに反応性化された化
合物からつくったイムノゲンは動物中に抗体を生成でき
る。
この抗体は適当なトレーサーと組合せたとき本発明によ
るエトサキシミド試験に便利である。
本発明のイムノゲンは式２で示される一般構造式をもち
また本発明の好ましい形のイムノゲンは式２をもつ一般
構造式から誘導される。イムノゲンは式２に示す橿の化
合物を下記合成法又は実施例の関係で記載する様なポリ
（アミノ酸）又はその誘導体又は免疫学的に活性な担体
とカップルさせて製造できる。
本発明の好ましい形のイムノゲンは式２で示される構造
式をもつ。１又は３位置いづれかの置換基が構造上同様
に好ましいが、環上１位置の誘導体において出発物質が
より容易に入手できまた合成がずっと簡単となる。しか
し与えられた動物から便利な抗血清がえられる確率は３
位置の誘導体の方がより大きいと思われる。牛血清アル
ブミンがこの好ましい形のポリ（アミノ酸）であるが、
アルブミン、血清蛋白質、例えばグロブリン、眼レンズ
蛋白質、リポプロティン等の様な種々の蛋白質担体も使
用できることは諒解されるべきである。蛋白質担体例に
は牛血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、卵オパルフミン、十ガンマーグロブリン、チロキシ
ン結合グロブリン等がある。別にアスパルテートの様な
十分な数の有効カルボキシレート基をもつ合成ポリ（ア
ミノ酸）も使用できるし、同様に反応性官能基をもつ他
の合成又は天然重合体物質も使用できる。また免疫学的
担体として使用できる炭水化物、酵母、多糖類又は他の
物質もハプテンに共役させてイムノゲンを生成できる。
本発明のトレーサーの構造における可能な変更はそのハ
プテンの構造のそれよりもずっと大きい。本発明のトレ
ーサーは式２で示す一般構造式をもつ。本発明の好まし
い形のトレーサーは式５に示す構造式をもつ。
トレーサーはエトサキシミド誘導体であり、それは例え
ば式４に示すとおジアミド、アミジノ、トリアジニルア
ミノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイル、チ
オカルバモイル又はスルホニルカルバモイル基によって
フルオレスセイン誘導体に結合している。トレーサーは
適当なフルオレスセイン誘導体をアミノ、カルボン酸、
スルホン酸、メルカプト、ヒドロキシ、イミデート、ヒ
ドラジド、インシアネート、チオインシアネート、クロ
ロホーメイト、クロロチオホーメイト、クロロスルホニ
ルカルバモイル又ハ下記合成法や実施例に関してあげら
れる様な同様の基をもつエトサキシミド誘導体に結合さ
せて製造できる。
例として次のフルオレスセイン誘導体が使用できる；Ｆ
Ｌ−ＮＨｚ　　　　　　　フルオレスセインアミノＦｔ
−ＣＯｚＨカルボキシフルオレスセインＦ２−ＮＨＣＯ
ＣＨｚＩ　　　Ｑ−アイオドアセトアミドフルオレスセ
イン ＦＬ−ＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ　　　Ｑ−プローｅニア＊ド
アミド７ＡオＬ／スセイン Ｆ２−ＮＣ５フルオレスセインチオイソシアネート２、
抗体 本発明の抗体は上記イムノゲンに対する兎の反応を引出
して製造される。イムノゲンはこの分野の知識ある者に
よく知られた方法で動物又は免疫成分細胞の試＃管内培
養物に一連の接種法によって投与される。兎は詳記した
実験のエトサキシミドイムノゲンに対する好ましい免疫
宿主であったが、ここに示した構造に対し抗体を生成で
きるどんな生体内又は試験管内宿主も使用できるのであ
る。
式にオイテＲｔ　ＦｉＨ又は−Ｒ−Ｚでよい：Ｒ１がＲ
−ＺであればＲ２はメチル又はエチルでろ’）　：　Ｒ
ｔがＨであればＲ２はＲ−Ｚであり；Ｒ３はメチル又は
エチルである。式中のＲ２とＲ３の配向はどの特定光学
的対掌体を含む意味でも除外する意味でもない。Ｒは製
造がイムノゲンを目標とする場合は７″ｌ！でのヘテロ
原子を含みまた製造がトレーサーを目ざす場合は１０ま
でのへテロ原子を含みかつ直鎖又は分岐鎖中に炭素原子
とへテロ原子合計Ｏ乃至２０をもち２までの環構造をも
つ結合基であり；また２は製造がイムノゲンを日ざす場
合はＮＨ２，ＮＨＲ３、Ｃ１，Ｂｒ、　　Ｉ又はＯＨで
あシまた製造がトレーサーを目ざす場合はＮＨ２、Ｃ０
ＯＨ。
ＣＮ、　５ＯｘＣ１，ＳＨ又はＯＲである。
ａ、イムノゲンの合成 本発明のイムノゲンは一般式２（ＸがＮＨ２、Ｃｔ、　
　Ｂｒ。
■又はＯＨである場合）によって示される様なハプテン
をポリ（アミノ酸）又は免疫学的に活性な担体とカップ
ルさせて製造される。ポリ（アミノ酸）又は他の担体部
分はアミド、チオエーテル、エーテル又はジアゾ結合に
よってハプテンに結合される。好ましい実施態様におい
てポリ（アミノ酸）は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）であ
りハプテンは式２１の構造をもつ。これらの反応体はこ
の分野でよく知られたアミド結合に通常側われる条件の
もとで結合させられる。カルボジイミド法はこの関係で
好ましいアミド結合をさせるに最も効果あるからこの方
法を使うことが最も好ましい。
イムノゲンは−ＮＨ２、−ＣＯＮＨＮＨ２、Ｃ２２、Ｂ
　ｒ　％　Ｉ又はＯＨ基をもつハプテンをポリ（アミノ
酸）又は他の免疫学的に活性な担体と結合させて製造さ
れる。−ＮＨ２の場合はジアゾニウム塩を生成させこれ
をポリアミノ酸）に加えて、又は−ＮＨ２基の存在でポ
リアミノ酸上のカルボン酸基を活性化してカップルさせ
る。ジアゾニウム塩法は芳香族アミノに対してのみなさ
れ一般に酸性液中でアミノを亜硝酸ナトリウムと混合し
てつくられる。ポリ（アミノ酸）上のカルボン酸基の活
性化はハプテンとポリ（アミノ酸）を１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ
Ｃ）、Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モル７オリノ
エチル）カルボジイミドメト−ルーｐ−トルエンスルホ
ネート等と混合してすることができる。
−ＣＯＮＨＮＨ２の場合は非芳香族アミノ場合と同様に
カップルさせる。アルキルクロロ、ブロモ、およびアイ
オド−誘導体とスル７オネートエステルは強アルカリ性
条件のもとで担体蛋白質中のチロシン残基のフェノール
性ヒドロキシル基をアルキル化してアルキルアリールエ
ーテルとしまた遊離スルフヒドリル基システィンのいお
りをアルキル化してチオエーテルとする。これらの反応
の好ましい誘導体はアイオダイドおよびスルホネートエ
ステルである。スルホネートエステルは第３級アミノ塩
基の存在でアルコール誘導体からスルホン酸ハライド又
は無水物との反応によってう１く生成される。
上記ハプテン（イムノゲン先駆物質）の合成は一般２方
法のいづれかで行なわれる。式２は本発明の方法の好ま
しい実施態様によるイムノゲン先駆物質を示している。
ｌ−位置誘導体の製造は適当な２置換こはく酸および１
端に第１アミノと他端に望む官能基（又はその保護され
た形又は潜在形）をもつ選ばれた結合基から進行する。
環化反応は溶液中の反応体混合物をＮ、Ｎ’−ジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の様な脱水性試薬と
処理し又は単に反応体の緊密混合物を１００°より高い
が反応体や生成物のひどい熱分解が開始する温度よシ低
い温度に加熱して行なわせることができる。潜在の又は
保護された反応性度は次に現わされて化合物はポリ（ア
ミノ酸）又は他の担体にカップルさせられる。
３−位置酵導体の製造にはクネーフェナーゲル反応方法
が好ましい。適当なケトンとマロン酸又はその誘導体を
ピペリジン、モルフォリン等の様な塩基の存在で縮合さ
せてα、β−不飽和カルボン酸、ジニトリル、ジエステ
ル又はニトリルエステルを生成する。このカルボン酸誘
導体をアルカリ金属シアン化物と反応させ加水分解させ
て２酸化炭素を除去して置換こはく酸をえる、これはア
ンモニアの存在で対応するサクシニミドに環化できる。
潜在する又は保護された反応性度は次いで現わされて化
合物は担体にカップルする。
１−位置における芳香族誘導体は適当なアニｌＪン又は
アラルキルアミノから製造される。１−位置におけるア
ルコールは必要なアミノアルコールから製造される。対
応するカルボン酸はこれらからジョーンズ試薬の様なり
ロム主体の酸化剤で酸化して見られる。ヒドラジド誘導
体はカルボン酸からヒドラジン塩との活性エステルカッ
プリングによって製造される。
芳香族アミノは適当な芳香族化合物からサクシニミド環
の環化前又は後のいづれかに硝化し、好ましくは接触水
素添加又はナトリウムジチオナイトの様な化学還元剤に
より還元して製造できる。
アミノはサクシニミト１からヒドロキシル基をはなして
いる３以上の原子をもつアルコールを上記のとおシバラ
イドに変え又はメタンスルホネート、トルエンスルホネ
ート等の様なスルホネートエステルに変え、これをアル
カリ金属又は第４級アンモニウムアザイド等からのアザ
イドイオンで置換し見られたアジド基を接触水添又は化
学還元剤で還元して製造できる。サクシニミド環から７
ミノ基を分離している２又は３原子をもつアミノは１ア
ミノ基がジベンジルアミノの様な保護された又は滞在形
である様なジアミノ上に適当なこはく酸を環化した後接
触水添等の様なサクシニミド環構造と適合する試薬によ
りアミノを脱保護又は顕現して製造される。アミノはま
たアルデヒドからアンモニウムアセテートとナトリウム
シアノポロハイドライドによる還元アミノ化反応によっ
て製造される。次いでこれらのアミノ誘導体は担体にカ
ップルさせてイムノゲンを生成するに適当である。
アルキルハライドはアルコールを塩化水素、臭化水素又
はよう化水素と処理し又は５塩化シん、３臭化シん、塩
化チオニル等の様なハロゲン化剤と処理して製造できる
。これらのハライドは比較的中性条件のもとて担体上の
遊離スルフヒドリル基に又は強塩基性条件のもとてポリ
（アミノ酸）中のチロシル残基のそれの様なフェノール
に直接結合する。
３−位置において環に結合している多くのエトサキシミ
ド誘導体は潜在反応性度として末端オレフィンを用いて
うまく製造される。この好ましい実施態様においてメチ
ルオメガ−アルケニル又はエチルオメガ−アルケニルケ
トンは上記クネーフエナーゲル法によってサクシニミド
に変えられる。次いで末端オレフィンはオゾン分解され
た後ジメチルサルファイド又は接触水添によシ緩還元さ
れてアルデヒドとなり又はナトリウムポロハイドライド
の様な還元剤を使いよシ激しく還元されて末端アルコー
ルとなシ又はジョーンズ試薬などの様なりロム主体の酸
化剤で酸化されて対応するカルボン酸となる。
本発８Ａ（ｒ）　）レーサーはフルオレスセイン部分又
はその誘導体を式２（式中Ｒ１はＨ又は−Ｒ−Ｙを表わ
し：Ｒ１が−Ｒ−ＹであればＲ１はメチル又はエチルで
ありＲｓがＨであればＲ２はＣＨ２−Ｒ−Ｙであり；Ｒ
３はメチル又はエチルを表わし；Ｒはへテロ原子１０ま
でを含み直鎖又は分岐鎖として並んだ炭素原子とへテロ
原子合計Ｏ乃至２０をもちまた２までの環構造をもつ結
合基を表わし；かつＹは−ＮＨｔ　、　５ＯｓＨ，Ｃ０
ＯＨ，ＣＮ％　８０雪ＣＬ、ＣＨＯｌＳＨ又はＯＨを表
わす）で示される化合物とカップルさせて製造される。
フルオレスセイン部分は式４に示す様なアミド、アミジ
ン、ウレア、チオウレア、カルバメート、チオカルバメ
ート、トリアジニルアミノ、又はスルホニルカルバメー
ト結合によってアミノ、カルボキシル、イミデート又ハ
アルコキシ官能基に結合できる。現在好ましい実施態様
においてフルオレスセイン誘導体は６−カルポキシフル
オレスセイン（カリホルニア州うジオーラのカルビオケ
ムから市販）であシ、これは式２　（Ｒ１＝ＨＸＲ３エ
ステル、Ｒ２＝（ｃＨｚ　）ｓＮＨｚ　）をもつ先駆物
質にカップルされる。６−カルポキシフルオレスセイン
は先づ６−カルポキシフルオレスセインの活性エステル
を生成して３−メチル−３−アミノプロピルサクシニミ
ドにカップルされる。好ましい活性エステルはＮ−ヒド
ロキシサクシニミド活性エステルであシ、好ましい方法
は乾燥ピリジン中のＮ　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカ
ルボジイミド活性化による方法である。他の１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノールおよび
カルボニルジイミダゾールの様な活性化基も使用でき、
またジメチルホルムアミドやジメチルズル７オキシドの
様な他の溶媒も使用できる。反応体はアミド結合を生成
する条件のもとてカップルさせるとよい。活性エステル
法ヲ使うと最もよい。使用できるトレーサーは種々のエ
トサキシミド酵導体から製造できる。
アミノ、ヒドラジニル、ヒドラジド等の様な末端アミノ
基をもつすべてのエトサキシミド誘導体は活性エステル
法又は混合無水物法によってカルボキシフルオレスセイ
ンにカップルさせられ、また単に溶液中２物質混合によ
りフルオレスセインインシアネート、ＤＴＡＦ又はアル
コキシＤＴＡＦ’にカップルさせられる。アミノ基はホ
スゲンおよびチオホスゲンとの反応によシそれぞれイン
シアネートおよびチオイソシアネートに変えられる。次
いでこれらはアミノフルオレスセインと縮合させられト
レーサーを生成する。
末端カルボン酸基、例えばカルボン酸、（アミノヒドロ
キシ）アルキルカルボン酸等をもつすべてのエトサキシ
ミド誘導体は活性エステル法によりアミノフルオレスセ
インにカップルさせられる。
末端ヒドロキシ基をもつすべてのエトサキシミド誘導体
は溶液中ＤＴＡＦＸａ−アイオドアセトアミドフルオレ
スセイン、ａ−プロ無アセトアミドフルオレスセイン又
はフルオレスセインイソチオシアネートとの反応によシ
フルオレスセインにカップルさせられる。ヒドロキシ基
はクロロスルホニルイソシアネート、ホスゲンおよびチ
オホスゲンとそれぞれ反応してクロロスルホニルカルバ
モイル、クロロホーメイトおよびクロロチオホーメート
基に変えられる。
これらの誘導体は次いで溶液中でアミノフルオレスセイ
ンにカップルさせられトレーサーを生成する。
末端メルカプト基をもつエトサキシミド誘導体はアザイ
ドについて上記したとおシバライド又はスルホネートエ
ステルとアルカリ金属硫化物から製造される。これらは
溶液中ａ−アイオドアセトアミドフルオレスセイン又は
ａ−プロモアセトアミドフルオレスセインとカップルさ
せられる。
末端ニトリル基をもつエトサキシミド誘導体はアザイド
について上記したとおシバライド又はスルホネートエス
テルから製造できる。これらは塩化水素ガスの存在で無
水アルコール中イミデートに変えられる。次いでイミデ
ートは溶液中フルオレスセインアミノにカップルさせて
トレーサーを生成する。
エトサキシミド誘導体の檀々の７ミノ、ヒドロキシおよ
び芳香族−導体の製蓬はイムノダン製造法中で記載して
いる。
スルホン酸は上記条件のもとで適轟なタフリンの様なア
ミノアルキルスルホン酸から環化して製造される。これ
らは塩化チオニル、塩化ホスホリル、５塩化シん等の様
な塩化剤との反応によって対応する塩化スルホニルに変
えられる。芳香族環に塩化スルホニル基の直接導入はク
ロロ硫酸との処理によってできる。次いでスルホニルノ
・ライドは普通第３級アミノ塩基の添加によってアミノ
フルオレスセイン又は反応性アミノ基をもつフルオレス
セイン誘導体と反応させられる。
３、試験法 本発明の特殊トレーサーと抗体は血清と血漿中のエトサ
キシミド濃度を正確明確に測定するために発見されてい
る。
式１は本発明によって定量測定できるエトサキシミド薬
剤の構造式である。本発明の方法は分析前に試料処理を
要しないし、試薬は化学的に熱的に安定であるしまた試
験法はエトサキシミドに似た化合物に対し最小限のクロ
ス−反応性をもつので、従来法よりも迅速便利なエトサ
キシミド試験法となる。
本発明の分析法、即ち本発明のトレーサー化合物とイム
ノゲンを用いる螢光免疫試験法によるエトサキシミド―
ｊ定法によシエトサキシミドを含む又祉含むと思われる
試料をトレーサーの生物学的に許容される塩およびエト
サキシミドとトレーサーに特定の抗体と相互混合する。
抗体は上記の様なイムノゲンを用いて生成される。エト
サキシミドとトレーサーは限定された抗体位置をせシ合
い複合物を生成する。トレーサーと抗体の濃度を一定に
保つことによってエトサキシミド抗体複合物の生成され
たトレー丈−−抗体複合物に対する比率は試料中のエト
サキシミド量に直接比例する。したがって混合物を線状
偏光子励起しトレーサーとトレーサー抗体複合物によっ
て放出された螢光偏光を測定することによって試料中の
エトサキシミドが定量測定できる。
結果は正味ミリポーラリゼーション単位、スパンＣミリ
ポーラリゼーション単位で）および比較強さで定量でき
る。
ミリポーラリゼーション単位の測定はエトサキシミドの
全くないとき最大量のトレーサーが抗体に結合したとき
の最大偏光を示す。正味ミリポー２リゼーシヨン単位の
高い程トレーサーの抗体への結合はない。スパンは抗体
に結合したトレーサーの最大量と最小量の点における正
味ミリポーラリ９〜７３７間の差を示す。より大きなス
パンはよりよい分析数値を与える。強さは背景以上の信
号強さの尺度である。故によシ大きな強さはよシ正確な
測定を与えるだろう。強さは本発明の好ましいトレーサ
ーに対し垂直偏光強さプラス水平偏光強さの２倍の合計
値として約０．５乃至２．０ナノモルにおいて測定され
る。トレーサー信号の強さはトレーサー製置と他の試験
変数により背景ノイズの約３乃至約３０倍の範囲である
。本発明の目的に対し背景ノイズの少なくも８乃至１０
倍の強さが好ましい。
表１から■までは本発明の檀々の実施態様で見られた結
果をスパン、ミリポーラリゼーション単位および強さで
示している。すべての場合蛋白質担体として牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を便用した。表■に本明細書記載の種
々のトレーサーと本発明の１新規イムノゲンに対しあげ
られた抗血清の結合によシ生成された試験結果が示され
ている。表■は本発明の３−位置トレーサーが従来のイ
ムノゲンに対しあげられた適当な抗血清と共に使用でき
ることを示している。結局表■は本発明の１−位置サク
シニミド誘導体であるトレーサーも適当な抗血清と結合
したとき便利であることを示している。これらの結果か
られかるとおシ、式２１をもつハプテンからつくられた
イムノゲンから式５をもつトレーサーと混合して生成さ
れた試験物はよい結果を与える。したがってこの組合せ
は本発明の現在最もよい形である。また式２１と８、式
２１と７、式２２と７および式２３と５の組合せによっ
て表わ−さ゛れるハプテンートレーサ二混合物もよい結
果を生じ別の好ましい組合せである。
表１ 式５　　　２０２　　　１５３　　１８式６　　　１９
７　　　１４０　　１３式７　　　２０３　　　１４８
　　１７奈　　ミリポーラリゼーション単位で示してい
る。
軸　正味強さの背景ノイズに対する比率で示している。
表■ 式２２　　　式５　　２２０　　１２８　　１８式２２
　　　式６　　１８５　　４０　　１７式２２　　　式
７　　２１０　　１５３　　１３式２２　　　式８　　
２５２　　１１０　　１７式２３　　　式５　　　１９
７　　１４８　　１８来　ミリポーラリゼーション単位
で示している。
４１＊正味強さの背景ノイズに対する比率で示している
。
表■ 式９　　１８７　　１０７　　７ 、　　　　　　　　式１０　　　　１５５　　　　１０
７　　　５式１１　　　　１８６　　　　７４　　１１
式１２　　　　２６８　　　　５７　　　８式１３　　
　　１９８　　　　５６　　　１５式１４　　　　２９
２　　　　５１　　　２４式１５　　　　２１０　　　
　５１　　　５式１６　　　　１７３　　　　４７　　
１１式１７　　　２５２　　　　３９　　１３式１８　
　　　１９０　　　　３６　　１６式１９　　　　２３
２　　　　３８　　　３式２０　　　　２１４　　　　
３７　　　６秦　　ミリポーラリゼーション単位で示し
ている。
未来　正味強さの背景ノイズに対する比率で示している
。
本発明の方法実施のｐＨはトレーサーのフルオレスセイ
ン部分をその開放形にするに十分でなければならない。
ｐＨは約３乃至１２、好ましくは約５乃至１０、最も好
ましくは約６乃至９である。試験笑施中ｐＨを適当にし
保つため種々の緩衝剤を使用できる。代表的緩衝剤には
ボレート、チトレート、アセテート、ホスフェート、カ
ーボネート、トリス、バルビタール等がある。使う特定
緩衝剤は本発明に重要ではないが、トリスとホスフェー
ト緩衝剤が好ましい。緩衝剤の陽イオン部分は一般に溶
液中のトレーサー塩の陽イオン部分を決定するだろう。
本発明の好ましい改良試験法について今や詳述する。こ
の試験法は“均質試験法１であシ、それは溶液中の結合
トレーサーが非結合トレーサーから分離されない様な溶
液から最終偏光読みがとられることを意味する。これは
結合トレーサーが読みをとられる前に非結合トレーサー
から分離されねばならない様な異質の免疫試験法よシも
明らかに利益である。
本発明の螢光偏光試験用試薬はエトサキシミドとトレー
サーに特定な抗体よシ成る。またエトサキシミド予処理
溶液、稀釈緩衝剤、エトサキシミド補正剤およびエトサ
キシミド対照液を含む殆んど普通の溶液がつくられる。
これらの試薬の代表的溶液はそのいくつかは上記したが
、イリノイ州アボットパークのアボットラボラトリーズ
から出ている試験箱で入手できる。
本明細書で示されているパーセントはすべて特に断らな
い限９重量／容量である。現在好ましいトレーサー調合
はｐＨ５，５のトリス緩衝剤０．１モル；５−スルホサ
リチレート５％およびナトリウムアザイド１％の溶液中
トレーナ−７０ナノモルである。抗血清調合液はｐ　Ｈ
７，５のトリス緩衝剤０．１モル、ナトリウムアザイド
０．１％、牛ガンマーグロブリン０，０１％およびエチ
レングリコール２％（Ｖ々）の溶液で兎血清を稀釈した
液である。稀釈緩衝液はｐＨ７，５の０．１モルナトリ
ウムホスフェート溶液、ナトリウムアザイド０゜１％お
よび牛ガンマーグロブリン０．０１％よシ成る。
予処理調合液はｐＨ５，５の０．１モルトリス緩衝液、
５−スルホサリチレート５％、ナトリウムアザイド０．
１％よシ成る。補正液はナトリウムアザイド保存剤０．
１％溶液とリットル当シ通常人血清中のエトサキシミド
濃度０．０．１０．・２５．５０，１００および１５０
”９より成るものが便利である。通常人血清中のエトサ
キシミドよシ成る対照品はリットル当＃）３５．７０お
よび１２０■濃度で保存剤としてナトリウムアザイド０
．１％を加えて用意される。
テキサス州アービングのアボットラボラトリーズから市
販されているアボツ）ＴＤＸ＠偏光分析器と共に使われ
る好ましい方法が特に工夫されている。５０μｔの血清
又は血漿が必要である。ＴＤＸ試料カー）　ＩＪツヂの
試料びんに補正液、対照液および未知試料をピペットで
直接とる。この方法の１利点は試料の特別処理が必要な
いことである。
ＴＤＸエトサキシミド試験箱をＴＤＸ分析器と共に使う
ならば、試料を試料回転器中に直接人へ　３試薬容器の
各々から栓をと＃）ＴＤＸ分析器内の指定ウェルに入れ
、この時点から試験法は完全自動化される。
手動試験をするならば、試料を稀釈緩衝液中の予処理溶
液と混合し背景読みをとる。トレーサーを次に試料と混
合する。次に抗体を最後に試験液に混入する。培養後螢
光偏光読みをとる。
補正液、対照液又は試料の各螢光偏光値が測定されアボ
ツ）ＴＤＸ螢光偏光分析器の様な装置のテープにプリン
トされる。非直線回帰分析を用いて各補正液の偏光対濃
度をプロットして装置の標準曲線がつくられる。各対照
液又は試料の濃度は補正曲線を読みとって出てくるテー
プ上にプリントされる。・ 前記の好ましい方法に関し重要なことはトレーサー、抗
体、予処理液、補正液および対照液は約２乃至約８℃で
貯えねばならないが、稀釈緩衝液は大気温で貯えねばな
らな勝ことである。標準曲線と対照液は２週間毎に試験
を必要としまた各補正液と対照液は２回試験が必要であ
る。対照液は毎日試験が必要であシまた試料は全部望む
ならば２回試験するとよい。
前記明Ｍ５８と下記実施例は本発明の範囲を示すための
ものであり、本発明範囲を限定するものでないことは諒
解されるべきである。この技術分野の知識ある者には種
々の修正法も明らかとなるであろう。したがって本発明
の範囲は特許請求範囲によってのみ決定されるものと考
えるものでおる。
実施例 実施例ＩからＸＬＶまでは本発明の概念によってなされ
た実験を記載している。実施例Ｉは抗体生成に便利なイ
ムノゲン製造に関し、実施例■からＸＸＩＸまではイム
ノゲンとトレーサーの先駆物質の合成に関しまた実施例
η■からｘｒ、、ｖまではトレーサーの製造に関するも
のである。
好ましい試験用イムノゲンは牛血渭アルブミン２９ａｖ
を含む０．１　Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ５，０）２−
中に式２１をもつ化合物の塩酸塩２９岬をとかしてつく
った。液を室温で攪拌しｐＨを５．０から５．５に保ち
ながら１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジアミド１４０■を１０−１５ηづつ３．５
時間にわたシ加えた。えた溶液を０．９％塩溶液に対し
徹底的に透析した後１０００　ｒｉｍで３０分遠心分離
した。溶液を免疫法に使うまで冷凍貯蔵した。
シニミド塩酸塩 ５−クロロ−２−ペンタノンエチレンケタール６．５８
ｔとジベンジルアミノ７、８８９を窒素雰囲気のもとで
油浴中１３０℃に３８時間熱した。冷した残渣をクロロ
ホルムにとり２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗い溶媒除去
した残渣を再び窒素のもとで２４時間加熱した。第２塩
基を洗いＨｃｔ除去後残渣を頁に３回目４８時間加熱し
た。蟻終塩基を洗った後粗生成物を５５０２シリカゲル
上クロマトグラフ法によシヘキサンージクロロメタンー
エチルアセテートを用いて５−ジベンジルアミノ−２−
ペンタノンエチレンケタール８．８ｆを殆んど無色油と
してえた。このケタール６．５４ｆをテトラヒドロ７ラ
ン２０ｄにとかし　１．５　Ｍ塩酸１６ｍを加えた。室
温で４時間反応させた後混合物をエーテルと稀Ｋｌとの
間に配分した。水層を冷やし固体水酸化カリウムで塩基
性としジクロロメタンに抽出した。乾かし溶媒除去後５
−ジベンジルアミノ−２−ペンタノン５．５２を無色油
としてえた。このケトン２．８１ｆ”ｔベタ９フ０、３
（１、アンモニウムアセテート０．１１Ｐおよびピペラ
ジン０．１２Ｆを加えた。混合物を２４時間還流加熱し
留出水をディーンスタークトラップで除去した。冷した
液を飽和炭酸カリウム溶液で４回抽出し固体炭酸カリウ
ム上で乾かし５ｇシリカゲルをとおし濾過し更にベンゼ
ンで洗った。
溶媒を蒸発して殆んど純エチル２−シアノ−６−シベン
ジルアミノー３−メチル−ヘキサノニー）３．２４Ｆを
えた。
この不飽和シアンエステル２．２６ｔをエタノール９ｄ
と蒸留水３−にとかしナトリウムシアナミド０．３５ｊ
’を加えた。
型温４０分攪拌後混合物を油浴上５０℃に３０分加熱し
た。
溶媒を除去し残渣をジクロロメタン中にと多濾過し溶媒
を除去して結晶性固体２．２８９をえた。この物質２ｔ
を１０チ水酸化ナトリウム液１０ｄ中にとシ１５時間還
流加熱した。反応混合物を冷しＨｃｔでｐＨ　２．　５
酸性とし濃縮乾固した。残渣を無水メタノール５０ゴ中
にとシ塩を濾過除去した。Ｆ液を濃縮して固体２．６９
をえた。その２．５１をメタノール１５ｍ１と濃アンモ
ニア水１５ゴとにとかした。溶媒を蒸発し残渣を油浴中
１６５℃で３０分加熱し粗生成物を薄層クロマトグラフ
法で梢製し５％メタノールを含むクロロホルムを用いて
３−メチル−３−（３−ジベンジルアミノプロビル）サ
クシニミド０．４８９をえた。この物質０、３５９をエ
タノール５０ｍ１と濃Ｈｅ／．　８　５ゴ中で木炭上１
０％パラジウム０．０７Ｐと共に初圧３気圧で水素添加
してベンジル保護基を除去した。４日後触媒を戸別し白
色固体３−メチル−３−（３−アミノプロピル）サクシ
ニミド塩酸塩０．２５ｆをえた。
ド ベンゼン２５ｍ１中に１−ヘキセン−５−１２４，５Ｆ
とエチルシアノアセテ−）２８．２５Ｆをとかした。酢
酸２．８６−とアンモニウムアセテ−）１．９：ｌを加
え混合物を６時間還流加熱し留出水をディーンスターク
トラップで捕集した。溶液を冷し分別ろ−とに移し２回
水洗した。溶媒を真空除去し残渣を水５０ｄとエタノー
ル５０１１Ｉｇの混合液にとかし水浴中で冷しシアン化
ナトリウム１２．５Ｆを加えた。
１５分後に水浴をとシ去り室温中２時間反応を進めた。
回転蒸発機上エタノールを除去した後混合物のｐＨをＨ
ＣＪａで５に調節した。溶液をエーテルで３回洗いｐＨ
を約１に下げた。エーテル抽出液を併せ硫酸マグネシウ
ム上で乾かし濾過し真空濃縮して金色油３７．８　Ｆを
えた。この物質ｌｆｔ２Ｍ水酸化ナトリウム液２−中に
とり９０℃油浴中で４時間熱し更に２Ｍ水酸化ナトリウ
ム液１−を加え更に２時間加熱した。この物質全体を２
：１水−メタノール液に加え■ンでｐＨ３とし溶媒を除
去し残渣を無水メタノールとすシつぶした。濾通抜溶媒
を除いて淡黄色油１ｆをえた。
これを５艷の濃アンモニア水にとかし１００℃に熱して
水を留出させ更に１４０−１５０℃で３時間熱した。冷
した残渣をシリカゲル上でクロマトグラフ処理しジクロ
ロメタン−エーテルを使い白色結晶３−メチル−３−（
３−ブテニル）サクシニミド０．７７　Ｆをえた。融点
７５℃。　　　　　　　　　　　４クシニミド ３−メチル−３−（３−ブテニル）サクシニミド３ｆ（
１８ミリモル）をエタノール５０ｄＫとかしドライアイ
ス−イソプロパツール浴中で冷しオゾン１当量と処理し
た。
過剰オゾンを窒素で追出しナトリウムボロハイドライド
６８４１１ＩＩ（１８１モル）を加えた。混合物を除々
に室温まであたため濃塩酸数滴を加えて消した。溶媒を
除去し残渣を再びジクロロメタンにとかし硫酸マグネシ
ウム上で乾かしシリカゲル少々と処理し濾過し再びスト
リップした。
残った無色波２．８０ｔをＮＭＲと質量分析計によジア
ルコールと同定した。
エタノールアミノ１．２２Ｆ（２０ミリモル）と２−エ
チル−２−メチルこはく酸３．２０ｒ（２０ミリモル）
を溶媒なしで混合し油浴中で加熱し除々に温度をあげて
２時間で１２０−１６０℃とした。蒸留頭をフラスコ上
につけ１３１−１３２℃、０．５Ｔｏｒｒ圧力で蒸留し
て無色波２．８４ｆをえた。
３−アミノ−１−プロパツール１．５０ｒ（２０ミリモ
ル）と２−エチル−２−メチルこはく酸３．２０？＜２
０ミリモル）を溶媒なしで油浴中で加熱し除々に温度を
あげ２時間で１２０−１６０℃とした。蒸留頭をフラス
コ上につけて圧力０．３６Ｔｏｒｒで１２６−１２８℃
で蒸留する無色波２７５ｔをえた。
ノ寸ン ジペンジルアミノ２．９６Ｆ（１５ミリモル）と３−ブ
ロモプロピル７タルイミド４．０２Ｆ（１５ミリモル）
をメタノール１０−とテトラヒドロフラン２ｍｌの混合
液中にとシ合計３０時間４０−４５℃に加熱した。２４
時間後に炭酸カリウム１当量（２，０７Ｆ）を加えた。
反応混合物をジクロロメタンと１Ｍ水酸化カリウム液に
配分し有機層を更に２回水酸化カリウム液で洗い無水炭
酸カリウム上で乾かし濃縮した。準結晶性残渣をクロロ
ホルム−メタノールから晶出させて１−ジベンジルアミ
ノ−３−７タルイミドプロパン２．４６９をえた。融点
１１１．５−１１２．５℃。
１−ジベンジルアミノ−３−フタルイミドプロパン１．
９２Ｆ（５ミリモル）とヒドラジン水化物１．２５Ｆ（
２５ミリモル）を温エタノール２０ｔｎｌ中にとかした
。還流温度まで加熱をつづけると白色結晶性固体が沈澱
した。１時間後反応混合物を冷し固体を種水酸化ナトリ
ウム液にとかし回転蒸発機上でエタノールを殆んど除去
した。溶液を固体水酸化カリウムで強塩基性としエーテ
ルで抽出した。有機層を塩基水液で洗い無水炭酸カリウ
ム上で乾かし濾過し凝縮して無色油１．２６Ｆをえた。
１−アミノ−３−ジベンジルアミノプロパン１．０２Ｐ
Ｃ４ミリモル）と２−エチル−２−メチルこはく酸０．
６４ｔ　（４ミ＋）モル）を溶媒なしで混合し油浴中で
１４０℃にＬ５時間加熱した。冷粗生成物をジクロロメ
タンとエチルアセテートの混合物にとかし脱色のため少
量のシリカゲルで処理した後−過し凝縮させて無色油１
．３８ｔをえた。この物質の大半をジクロロメタンにと
かし無水塩化水素と処理した。溶液から晶出もおこらず
溶媒を除去しても残渣は固化しなかった。
無水エタノール５０ｄに３−メチル−３−エチル−１−
（３−ジベンジルアミノプロビル）サクシニミド塩酸塩
１．０１　？　（２，４ミリモル）をとかし木炭上１０
％パラジウム上で初圧２気圧において水素添加した。触
媒を濾過し反応中２回交換し全体で約４８時間反応させ
た。無色前生成物０．５７ｆをえた。
４−アミノ−１−ブタノール２７０ｑ（３ミリモル）と
α−メチル−〇−エチルこはく酸４８０■（３ミリモル
）を溶媒なしで混合し油浴中１３５−１４０℃で３．５
時間加熱した。冷却生成物をジクロロメタン中にとシ少
量のシリカゲルで処理して脱色した。濾過し溶媒を除去
して無色油５３７１１１ｖをえた。
ジル）プロピオン酸 アセトン５ｍｌ中に３−メチル−３−エチル−１−（４
−ヒドロキシ−１−ブチル）サクシニミド２１３■（１
ミリモル）をとかしジョーンズ試薬２．６７Ｍ溶液０．
４５ｍ（１，２ミＩＪモル）を加えた。室温で２時間混
合後イソプロパツール数滴を加えて過剰試薬を消耗させ
た。更に１５分攪拌後溶液を５ｍｌのジクロロメタンで
稀め硫酸マグネシウムで乾かしセライトで濾過した。溶
媒を除去して酸２０７岬を無色油としてえた。
５−アミノ−１−ペンタノール３１０■（３ミリモル）
と２．２−ジメチルこはく酸を混合し油浴中１２５−１
３５℃に４時間加熱した。冷した残渣をジクロロメタン
にとか　　　　　　　　１し少量のシリカゲルで脱色し
濾過した。溶媒を除去して透明無色油として４３−ジメ
チル−１−（５−ヒドロキシペンチル）サクシニミド５
６９■をえた。
アセトン５ｄ中に４３−ジメチル−１−（５−ヒドロキ
シ−１−ペンチル）サクシニミド２３６１Ｗ（１，１１
ミリモル）をとかしジョーンス試薬２．６７Ｍ溶液５２
０−を加えた。混合物を室温で２時間攪拌し過剰試薬を
消すためイソプロパツール４Ｍを加えた。更に１５分混
合後溶液をジクロロメタン５ゴで稀め硫酸マグネシウム
と処理し濾過し濃縮し無色油として酸２５０■をえた。
６−アミノ−１−ヘキサノール５８６η（５ミリモル）
とａ−メチル−ａ−エチルこはく酸８０１１１１（５ミ
リモル）を溶媒なしで混合し油浴中１３０℃で３時間加
熱した。室温に冷した後残渣をジクロロメタン中にとシ
少量のシリカ　　　　　　　七ゲルで脱色し濾過した。
溶媒を蒸発して無色油１−（６−ヒドロキシヘキシル）
−３−メチル−３−エチルサキシニミド９５９ｍ１Ｐを
えた。
アセトン１５−中に１−（６−ヒドロキシヘキシル）−
３−メチル−３−エチルサキシニミド７０５Ｗｌ！（２
，９ミリモル）をとかし′２．．６７Ｍジョーンズ試薬
溶液２．０ｄ（３，３ミリモル）を加えた。室温で２時
間混合後インプロパツール数滴を加えて過剰試薬を分解
した。混合物を等量のジクロロメタンでうすめ硫酸マグ
ネシウムと処理しセライトでヂした。溶媒を蒸発し油と
して酸７３５”９をえた。
シペンチル）サクシニミド 実施例Ｘ■の方法により首題化合物を５−アミノ−１−
プロパツール４．１２Ｐ（４０ミリモル）と２−エチル
−２−メチルこはく酸６．４０ｔからつくシ殆んど無色
の油８．４８Ｆをえた。
アセトン２０ｍ１中の３−メチル−３−エチル−１−Ｃ
５ヒドロキシペンチル）サクシニミド９０８１１９の溶
液を室温において２．６Ｍジョーンズ試薬溶液１．５−
と処理した。反応が適尚な時間に完了しなかったので更
に０．４５　ｍｌのジョーンズ試薬液を加えた。１時間
後イソプロパツール５滴を加えて過剰試薬を分解した。
混合物を妨イトでＦし溶媒を除去した。残渣をジクロロ
メタンにとり硫酸マグネシウムと処理し再び濾過し溶媒
を除去して無色油として表題化合物９７８Ｍ９をえた。
４−ニトロアニリン２．７６ｆ（２０ミリモル）とａ−
メチル−ａ−エチルこはく酸をよく混合し油浴中１５０
−１６０℃に２時間加熱した。冷却してえた固体生成物
をメタノール−水から再晶出させて殆んど白色の結晶を
えた。
融点１２４−１２５℃。
エタノール５〇−中の４−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）ニトロベンゼン５００■（１，９
１ミリモル）を木炭上１０％パラジウム５０■と共に初
圧２気圧のもとて水素添加した。２０分混触媒を戸別し
溶媒を除去して約５００■の無色油をえて放置すると晶
出した。メタノールから再晶出させたものは融点１４０
−１４３℃であった。
実施例ＸＭ　　３−（３−メチル−３−エチル−１−サ
クシニミジル）ニトロベンゼン ３−ニトロベンゼンＺ、７６ｔ（２０ミリモル）とａ−
メチル−ａ−エチルこはく酸３．２０ｒ（２０ミリモル
）をよく混合し溶媒なしで油浴中１５０−１６０℃に２
時間加熱した。冷し固体生成物をメタノールから晶出さ
せること２回合計３．７２ｆの結晶をえた。融点８７．
５−８＆５℃。
エタノール５０ｄ中の３−（３−メチル−３−エチル−
１−サクシニミジル）ニトロベンゼン５００１１Ｐ（１
，９１ミリモル）を木炭上１０％パラジウム５ＯＮｆを
使い初圧２気圧において水添した。３０分混触媒をＦ別
し溶媒を除いて無色油４８０■をえて一夜おくと晶出し
た。メタノール−水から再晶出させて無色固体をえた。
融点１．００−１０２℃。
実施例ＸＸｌｌ１１−ベンジル−３−メチル−３−エチ
ルサクシニミド ペンジルアミノ２．１４Ｆ（２０ミリモル）とａ−メチ
ル−〇−エチルこはく酸３．２０ｔ（２０ミリモル）を
溶媒なしで混合し油浴中１４０℃で２時間加熱した。物
質を冷しジクロロメタンにとかし少量のシリカゲルを使
って脱色しＦ別した。溶媒を除去して殆んど無色油１−
ベンジルー３−メチル−３−エチルサクシニミド４．３
２ｔをえた。
実施例ＸＸ１ｖ　４−（３−ｙｌｆルー３−ｘｆシル−
−ｆｌジクロロ硫酸３ｄ中に１−ベンジル−３−メチル
−３−エチルサクシニミド９２４１Ｒｇ（４ミリモル）
をとかし初めの発熱反応がおさまった後混合物を４０℃
浴中で１５分あたためた。これを砕氷上に注入しジクロ
ロメタンで抽出した。
有機層を飽和塩溶液で２回洗い硫酸マグネシウム上で乾
かしシリカゲル床で濾過した。溶媒を除去して無色油と
してスルホニルクロライド９２６ｗｇをえた。
実施例ＸＸＶ　　２−（３−１ｆｋ−３−ｘｆシル−−
ｔクシこの化合物を本質的に実施例Ｘ■とＸＸ■におけ
るとおシフエネチルアミノとα−メチル−ａ−エチルこ
はく酸から製造した。生成物は殆んど無色の油であった
。
実施例ハ（Ｖｌ　　２−（２−（３−メチル−３−エチ
ル−１−酢酸無水物４＃！／中に２−（３−メチル−３
−エチル−１−サクシニミジル）エチルベンゼン９９０
Ｗ（３，７５ミリモル）をとかし攪拌しながらこれに濃
硝酸０．５−と水冷無水酢酸２−の混合物を加えた。室
温で１５分後反応混合物を５０℃浴中で１時間熱した。
これに水を加えて冷し揮発物質を除去した。残渣を水と
エーテルに配分しＶ積層を水洗し硫酸マグネシウム上で
乾かし濾過し蒸発乾固した。粗生成物の約％を予備薄層
板上でクロマトグラフ処理し未反応出発物質を含まない
パラ−とオルト−異性体の油状混合物３５０１”ｆをえ
た。この混合物３００Ｗをエタノール７５−中木炭上１
０％パラジウムｔ−使い初圧２気圧において水素添加し
た。反応は１時間以内で完了した。生成混合物を薄層ク
ロマトグラフ法で分離しベンゼン−エチルアセテートで
展開してパラ−異性体１２０■とオルト−異性体８０キ
をえた。
５−（３−メチル−３−エチルーサクシニミド−１−イ
ル）−１−ペンタノール９０８■（４ミリモル）ト）Ｉ
ＪＩ−チルアミノ５５８ｄ（４ミリモル）をジクロロメ
タン１０Ｍ１にとかし氷水浴中で冷した。メタンスルホ
ニルクロライド２７７ｄ（４ミＩＪモル）を加え混合物
を３０分攪拌したが５分後に水浴をとった。反応が完了
しなかったのでトリエチルアミノ１００ｍ１とメタンス
ルホニルクロライド４５−を爽に加えて４５分つづけた
。反応混合物を稀Ｈｃｔとジクロロメタン間に配分し有
機層を１０％重炭重炭酸ナト リム水溶液で洗い硫酸マグネシウム上で乾かし溶媒を除
去した。えたメシレー）１．１５Ｆは無色前であった。
ジメチルホルムアミド５−中に５−（３−メチル−３−
エチルサクシニミ）”−１１ル）−１−ペンチルメタン
スルホネー）０．９２Ｆ（３ミリモル）とナトリウムア
ザイド０．３９Ｆ（６ミリモル）の混合物を１４０℃に
おいて１時間加熱攪拌した。ジメチルホルムアミドを真
空除去し少量のシリカゲルを便って脱色し更に少量シリ
カゲルで戸遇した。溶媒を除去した殆んど無色前０．８
６ｆｔ’ｉＮＭＲと質量分析によってアザイドと同定さ
れた。
実施例″ＸＸｌＸ５−（３−メチル−３−エチルサクシ
−ミド−１−イル）−１−ペンチルアミノ塩酸塩この化
合物はＨｃｔ１当量を含むエタノール中で５−（３−メ
チル−３−エチルサクシ−ミド−１−イル）−１−ペン
チルアザイドの木炭上パラジウム触媒水素添加法により
製造した。
実施例ＸＸＸ　　６−（３−（３−メチル−３−サクシ
ニミジル）フロビルアミノカルボニル〕フルオレスセイ
ン６−カルボキシフルオレスセイン２１５ＷとＮ−ヒド
ロキシサクシニミド６３ｑを無水ピリジン５−にとかし
Ｎ。
Ｎ′−ジシクロへキシルカルボジイミド１２４岬を加え
た。
混合物を室温で２時間混合し３−メチル−３−（３−ア
ミルプロピル）サクシニミド塩酸塩１０３１９を加え九
。混合物を室温で２０時間混合し粗生成物を予備薄層ク
ロマトグラフ法によシ３：１クロロホルムーメタノール
で２回と１：１：１ベンジル−エチルアセテート−アセ
トンで１回処理して精製しトレーサーをえた。
本化合物は５−カルボキシフルオレスセイン１０１１９
、ジシクロへキシルカルボジイミド６．２■、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール（Ｎ−ヒドロキシサクシニミ
ドよりむしろ）４．２■および３−メチル−３−（３−
アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩５岬から出発して
実施例℃■の方法によって製造した。クロロホルム−メ
タノールを使い１回だけクロマトグラフ法を行なつ九。
ジクロロメタン１−に３−メチル−３−（３−ヒ）”０
−？シー１−プロピル）サクシニミド２２＋ｖ（０，１
３ミリモル）をとかし、これをジクロロメタンｌ−中に
クロロスルホニルインシアネー）１４Ｍｌ（０，１６ミ
リモル）の水冷攪拌溶液に満願した。水浴をとシ去°れ
更に２０分攪拌した後溶媒を除去し残渣をアセトニトリ
ル０．５　ｒＲｔとジメチルホルムアミド０．２　ａ！
混合液にとかした。この液の半分を６−アミツフルオレ
ス造イン２０ａＦ（０，Ｏｓ５ミリモル）およびピリジ
ン０．００５２ｍＮ　Ｏ，０６５ミリモル）と室温で７
時間反応させた。シリカゲル薄層板上でベンゼン−エチ
ルアセテート−アセトンを用いてクロマトグラフ法によ
シ生成物を分ｌｌた。クロロホルム−メタノールを用い
て第２回り。
マドグラフ法により残った少量の副成物を除去した。
メタノール０．２　ｄに３−メチル−３−（３−アミノ
プロピル）サクシニミジル岬と６−（４６−ジクロロ−
Ｌ３，５−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレスセ
イン８．５ｗｆをとかしトリエチルアミノ０．００６３
−を加え混合物を室温で一夜混合した。生成物をシリカ
ゲル薄層板上クロロホルム−メタノールを用い更にベン
ゼン、エチルアセテートおよびアセトンの混合物を用い
てクロマトグラフ法によって分離した。
ホニルアミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン５−中に３−メチル−３−エチル−１−
（２−ヒドロキシエチル）サクシニミド３７３η（２ミ
リモル）をとかしこれにジクロロメタンＩＩＲｔ中にク
ロロスルホニルイソシアネー）０．１７３ｍ１（２ミリ
モル）の液を加えた。混合物を１０分混合し少量の沈澱
を戸別し溶媒を除去した。残渣を０．７０　ｍのピリジ
ンにとかし、この液０．１０ｄをピリジン０．１０ｄ中
に６−アミツフルオレスセイン１０４Ｗ（０，３ミ！Ｊ
モル）の液に混合した。反応を室温で４時間進め予備薄
層クロマトグラフ法によジクロロホルム−メタノールで
２回展開して生成物を分離した。
実施例ＸＸＸＶ　　６−Ｃ３−（３−メｆｋ−３−工ｆ
ｋ−１−サクシニミジル）−１−プロポキシカルボニル
アミノスルホニルアミノ〕フルオレスセイン ジクロロメタン１−中にクロロスルホニルインシアネー
）ｘ８ｗｉ（０，１２５ミリモル）の攪拌水冷溶液にジ
クロロメタン１．　Ｏａｔ中に３−メチル−３−エチル
−１−（３−ヒドロキシプロピル）サクシニミド２０ｗ
Ｉ！（０，１モル）の液を満願した。１０分混触の半分
をとシ溶媒を除去した。残渣をアセトニトリル１５０ｄ
とピリジン５０ゴの混合液にとり６−アミツフルオレス
セイン１７．３ａＦ（０，０５ミリモル）を加えた。混
合物を室温で２．５時間混合しシリカゲル予備薄層クロ
マトグラフ板上にすしをつけた。ベンゼン一二チルアセ
テートーアセトンで展開し主生成物をえてそれをクロロ
ホルム−メタノールで再精製してトレーサーをえた。
実施例ＸＸＸＶｉ　　５−　［：　３−　（３−メチル
−３−エチル−１−サクシニミジル）−１−プロピルア
ミノチオカルボニルアミノ〕フルオレスセイン ピリジン０．１０　ｍｌ中に３−メチル−３−エチル−
１−Ｃ３−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩７．５
■およびフルオレスセイン−５−イソチオシアネート１
１．７Ｗの液を室温で４時間混合した。これを予備薄層
クロマトグラフ法によりベンゼン−゛エチルアセテート
ーアセトンで展開して生成物を分離した。
実施例ＸＸＸ■　６−Ｃ３−（３−メチル−３−エテル
−１−サクシニミジル）プロピルカルボニルアミノ〕フ
ルオレスセイン ジメチルホルムアミド０．２　ａｔ中に３−（３−メチ
ル−３−エチル−１−サクシニミジル）プロピオン酸１
５ｍｇとトリエチルアミノ９．２　ａｔをとかし氷浴中
で冷しインブチルクロロホーメイト９−を混入した。混
合物を２時間かけて室温まであたため６−アミツフルオ
レスセイン２３キを加えた。−夜カツブリング反応させ
て溶媒を真空除去した。残渣をメタノールにとりシリカ
ゲル薄層板上クロマトグラフ法ニよシ５：１クロロホル
ムーメタノールを用い未反応フルオＶスセインアミノ直
上のバンドをとった。
実施例ＸＸ潤　５−［４−（３−（３−メチル−３−エ
チル−１−サクシニミジル）−１−プロピルアミノ）−
６−クロロ−１，ａ５−トリアジン−２−イルアミノ〕
フルオレスセイン メタノール０．５０ｄ中３−メチル−３−エチル−１−
（３−アミノプロピル）サクシニミド塩酸塩１０．５＋
＋ｖ、５−（４６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン
−２−イルアミノ）フルオレスセイン２３．８■および
トリエチルアミノ０．００６ｆｆ／の液を室温において
一夜混合した。２回目トリエチルアミノ０．００６ｍｊ
を加え史に４日間室温でつでけた。
シリカゲル薄層板上でクロマトグラフ法によりクロロホ
ルム−メタノールで展開して生成物を分離した。
ニミジル）−１−ブチルカルボニルアミノ〕フルオレス
セイン ａ３−ジメチル−１−Ｃ４−カルボキシ−１−ブチル）
サクシニミド１４．５１１ｑとトリエチルアミノ８．３
コを２００ｒａｔのジメチルホルムアミドにとかし混合
物を氷塩浴中で冷しインブチルクロロホーメイト８．７
Ｗを混入した。氷がとける様に２時間混合をつづけ５−
アミノフルオレスセイン、２２岬を加えた。混合物を一
夜室温で混合し予備薄層クロマトグラフ法により５：１
クロロホルム−メタノールで展開して生成物を分離した
。
実施例ＸＬ　　５−（４−（３−メｆｋ−３−エチルー
１−オレスセイン ピリジン２５０ｄ中に４−（３−メチル−３−エチル−
ｉ−サクシニミジルメチル）ベンゼンスルホニルクロラ
イド２６１９と５−アミノフルオレスセイン２７．４■
をとかし室温で４５分混合した。薄層クロマトグラフに
よシ４：１クロロホルムーメタノールで展開し未反応ア
ミノフルオレセイン直上を移動したバンドをとって生成
物を精製した。
ルオレスセイン メタノール１ｍ７！中に２−［２−（３−メチル−３−
エチル−１−サクシニミジル）エチル〕アニリン２８ｑ
（０，１ミリモル）、トリエチルアミノ２０１ｍ１（０
，２ミリモル）および５−（４６−ジクロロ−Ｌａ５−
トリアジン−２−イルアミノ〕フルオレスセイン４２．
５１１ＩＩ（０，０８ミリモル）をとシ混合し２４時間
室温で放置した。薄層クロマトグラフ法で精製しクロロ
ホルム−メタノールで溶離して生成物をえた。
レスセイン 乾燥ジメチルホルムアミド０．５Ｃ１ｄ中に３−メチル
−３−エチル−１−（４−カルボキシブチル）サクシニ
ミド４８＃ｖとトリエチルアミノ２８ゴの溶液を氷塩浴
中で冷しイソブチルクロロホーメイト２６−を加えた。
混合物を２時間で室温まであたためこの液の半分を３５
１１１！の６−アミノフルオレセインに加え液を室温で
一夜攪拌した。シリカゲル薄層板上クロマトグラフ法に
より展開溶媒としてクロロホルム−メタノールを用いて
生成物を精製した。同じ条、件で第２回クロマトグラフ
法を行ない純トレーサーをえた。
ジメチルホルムアミド０．２０ＩＩｌｌ中に１−（５−
カルボキシペンチル）−３−メチル−３−エチルサクシ
−ミド９．２岬とトリエチルアミノ０．００４８ｍの液
を氷水浴中で冷しインブチルクロロホーメート４．７ｍ
を加えた。混合物を１時間四分攪拌し氷はとけた。フル
オレスセインアミノ（５−異性体）１２．５岬を加え室
温で一夜攪拌をつづけた。薄層クロマトグラフ法により
５：１クロロホルム−メタノールを用い未反応フルオレ
スセインアミノより速く移動したバンドをとってトレー
サーを精製した。
実施例Ｘ［ｊｖ　５−Ｃ４−（４−（３−’ｆ−に−３
−工ｆｋ−ｉ−サクシニミジル）ペンチルアミノ−６−
クロロ−先メタノール０．２０ｄ中に４−（３−メチル
−３−エチル−１−サクシニミジル）アニリン２．：３
ｖと５−［４６−ジクロロ−Ｌ３５−　トリアジン−２
−イルアミノ〕フルオレスセイン５．３ｍｇをとかし室
温で一夜混合した。薄層クロマトグラフ法により溶媒と
してクロロホルム−メタノールを用いて純生成物をえた
。
３−（３−メチル−３−エチル−１−サクシニミジルア
ニリン３．７岬と６−１１４６−ジクロロ−１，３５−
トリアジン−２−イル）アミノ〕フルオレスセイン８ｗ
ｑをメタノール０．２５ｄ中で室温において３６時間攪
拌した。シリカゲル薄層板上予備クロマトゲラン法によ
ジクロロホルム−メタノールで展開し最も移動性バンド
をとって純生成物をえた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１はＨ又は−Ｒ−Ｚ−Ｑを表わし；Ｒ＿２は
    Ｒ＿１がＨであれば−ＣＨ＿２−Ｒ−Ｚ−Ｑを表わしＲ
    ＿１が−Ｒ−Ｚ−Ｑであればメチル又はエチルを表わす
    ；Ｒ＿３はメチル又はエチルを表わし；Ｑはポリ（アミ
    ノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体、又は他の免疫学的に
    活性な担体又はフルオレスセイン又はフルオレスセイン
    誘導体を表わし；ＺはＱがフレオレスセイン又はフルオ
    レスセイン誘導体であればＮＨ、ＣＯ、ＣＳ、ＳＯ＿２
    又はＣ＝ＮＨを表わしまたＱが（ポリアミノ酸）、ポリ
    （アミノ酸）誘導体又は他の免疫学的に活性な担体であ
    ればＮ、ＮＨ、Ｎ＝Ｎ又はＣＨ＿２を表わす；かつＲは
    Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は他
    の免疫学的に活性な担体であればヘテロ原子７までをも
    ちまたＱがフルオレスセイン又はフルオレスセイン誘導
    体であればヘテロ原子１０までをもち、かつ直鎖又は分
    岐鎖に配列された炭素原子とヘテロ原子合計０乃至２０
    をもち２までの環構造をもつ結合基を表わし、但しＲ＿
    １がＲ−Ｚ−Ｑであり、Ｑがフルオレスセインのアミノ
    誘導体であり、ＺがＣＯでありＲが普通のアルキル鎖で
    あるときはＲは少なくも３炭素原子をもつていなければ
    ならない。）で示されることを特徴とする化合物。 ２、Ｑが牛の血清アルブミンである特許請求の範囲第１
    項に記載の化合物。 ３、Ｑがフルオレスセインのアミノ、アミジノ、ウレア
    、カルバメート、チオカルバメート、トリアジニルアミ
    ノ、スルホンアミド又は（カルボキシアミノ）−スルホ
    ンアミド誘導体である特許請求の範囲第１項に記載の化
    合物。 ４、Ｑが４−クロロ−６−（フルオレスセイン−５−イ
    ルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル、４−
    クロロ−６−（フルオレスセイン−６−イルアミノ）−
    １，３，５−トリアジン−２−イル、４−メトキシ−６
    −（フルオレスセイン−５−イルアミノ）−１，３，５
    −トリアジン−２−イル、４−メトキシ−６−（フルオ
    レスセイン−６−イルアミノ）−１，３，５−トリアジ
    ン−２−イル、フルオレスセイン−５−イルカルボニル
    、フルオレスセイン−６−イルカルボニル、（フルオレ
    スセイン−６−イル）アミノ又は（フルオレスセイン−
    ５−イル）アミノである特許請求の範囲第１項に記載の
    化合物。 ５、Ｑがポリ（アミノ酸）又はポリ（アミノ酸）誘導体
    又は他の免疫学上活性な担体である特許請求の範囲第１
    項に記載の化合物。 ６、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１はＨ又は−Ｒ−Ｘを表わし；Ｒ＿２はＲ＿
    １がＨであるときは−ＣＨ＿２−Ｒ−Ｘを表わしまたＲ
    ＿１が−Ｒ−Ｘであるときはメチル又はエチルを表わし
    ；ＸはＮＨ＿２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＯＨを表わし；か
    つＲはヘテロ原子７までをもち直鎖又は分岐鎖に配列さ
    れている炭素原子とヘテロ原子合計０乃至２０をもちか
    つ環構造２までをもつ結合基を表わす。）で示される先
    駆物質をポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又
    は他の免疫学的に活性な担体と結合させる工程より成る
    ことを特徴とするイムノゲンの製法。 ７、ポリ（アミノ酸）が牛の血清アルブミンである特許
    請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、水溶性カルボジイミド結合反応によつて反応を行な
    わせる特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ９、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１はＨ又は−Ｒ−Ｙを表わし；Ｒ＿２はＲ＿
    １がＨであるときは−ＣＨ＿２−Ｒ−Ｙを表わしまたＲ
    ＿１が−Ｒ−Ｙであるときはメチル又はエチルを表わし
    ；Ｒ＿３はメチル又はエチルを表わし；Ｙは−ＮＨ＿２
    、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿２Ｃｌ、−ＳＨ
    、−ＣＨＯ、−ＣＮ又は−ＯＨを表わし；Ｒはヘテロ原
    子１０までをもち直鎖又は分岐鎖に配列されている炭素
    原子とヘテロ原子合計０乃至２０をもち環構造２までを
    もつ結合基を表わす。但しＲ＿１が−Ｒ−Ｙであり、Ｒ
    が通常アルキル鎖でありかつＹがＣＯＯＨである場合は
    Ｒは少なくも３炭素原子をもつていなければならない。 ）で示される先駆物質をフルオレスセイン又はフルオレ
    スセイン誘導体と結合させる工程より成ることを特徴と
    するトレーサーの製法。 １０、（ａ）液体試料をエトサキシミド抗血清およびエ
    トサキシミド抗血清の存在に対し検出できる螢光偏光反
    応を生じうる特許請求の範囲第１項に記載の化合物と接
    触させ、（ｂ）工程（ａ）からえた溶液に平面偏光をと
    おして螢光偏光反応をえて、 （ｃ）工程（ｂ）の溶液の螢光偏光反応を試料中のエト
    サキシミド量の尺度として検出する工程より成ることを
    特徴とするエトサキシミドの濃度測定法。
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