JPH0816103B2 - 化学発光性アクリジニウム塩 - Google Patents

化学発光性アクリジニウム塩

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JPH0816103B2
JPH0816103B2 JP62267581A JP26758187A JPH0816103B2 JP H0816103 B2 JPH0816103 B2 JP H0816103B2 JP 62267581 A JP62267581 A JP 62267581A JP 26758187 A JP26758187 A JP 26758187A JP H0816103 B2 JPH0816103 B2 JP H0816103B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は化学発光法（化学ルミネセンス法）および化
学発光物質、詳細には化学発光性アクリジニウムおよび
フェナントリジニウム塩に関連する方法および物質に関
するものである。
発明の背景および先行技術 化学発光とは、化学反応による光の発生と定義するこ
とができる。殆どの化学発光の機序（メカニズム）は詳
細には知られていないが、一般的機序は以下のように概
略説明することができる： Ａ→B*→Ｂ＋ｈν 化合物Ａが化学反応を起こし（通常は酸化反応）、電
子励起状態の生成物「B*」が生成される。この生成物が
基底状態（Ｂ）に戻るにつれ、光「ｈν」の形態でエネ
ルギーが放出される［シュスター（Shuster）らの物理
有機化学の進歩（Advance in Physical Organic Chemis
try）、187-238（1984）］。
競合的な暗反応は全反応の効率を１％以下にまで下げ
ることもあるが、ある種の生物的発光系では60-70％の
効率が達成されることもあり、更に多くの場合、フェム
トモル（10-15）からアトモル（10-18）の範囲の検出限
界が記録されている。
化学発光は、分析化学の分野に於いて、他の方法では
適度な感度が得られない様々の目的に使用されている。
従って、免疫診断学に於いて、化学発光免疫検定法（CL
IA）は、放射免疫検定法（RIA）又は酵素免疫検定法（E
IA）の感度に匹敵し、あるいはそれよりも優れているも
のと言えるかもしれない［キルカ（Kircka）らの「診断
医療（Diagnostic Medicine）」、1、45-52（198
4）］。
ルミノールおよびイソルミノール誘導体は、免疫検定
法の化学発光試薬として最も広範に使用されているもの
である。この発光反応は、ミクロペルオキシダーゼ（mi
croperpxidase）又は遷移金属イオン類などの触媒の存
在下、アルカリ性過酸化水素による酸化によって開始さ
れる。光りの放出は、約465nmにて起こり、これは生成
物アミノフタル酸の蛍光放出に対応するものである。ア
ミノブチルエチルイソルミナール（ABEI）は、免疫検定
法に於ける標識物として使用することができ、これは市
販されている。
化学発光試薬の第２の群、シュウ酸アリール類［ギル
（GIll）らのアルドリッチキミカ・アクタ（Aldrichimi
ca Aacta）、16、59-61（1983）、およびカセラール（C
atherall）らのジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイア
ティー、ファラディ訳２（J.Chem.Soc.Faraday Trans.
2）、80、823-834（1984）］は、市販された冷光源とし
て使用され［例えばトセング（Tseng）らの米国特許第
4,338,213号を参照］、更に高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）検出器に使用されている［コバヤシ（Kobaya
si）らのアナリテアイカル・ケミストリー（Anal.Che
m.）、52、424-427（1980）、およびミヤグチ（Miyagut
i）らのジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J.Chr
omatogr,）、303、173-176（1984）］。これらの誘導体
は、緩衝化又は非緩衝化溶媒中、過酸化水素と反応し、
急速に分解して励起状態のCO2を生成するジオキセタン
−ジオンを与えることが知られている。この時に、エネ
ルギーは電子移動によって、光りを放出する蛍光性分子
に転移される。
第３番目の試薬、10−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボン酸・アリールエステル類は、アルカリ性過酸化水
素が存在し、触媒が存在しない場合の化学発光物質であ
る。この機序は、ヒドロペルオキシド・アニオンが最初
に攻撃し、次いでフェノレート（脱離基）を分子内転移
して歪んだジオキセタン−オンを生成することに関連し
ていると考えられている。この歪んだジオキセタン−オ
ンは、分解してCO2と、430nmの光りを放出する励起状態
のＮ−メチル−アクリドンとになる。カルボキシ置換ア
クリジニウム塩は、免疫検定の標識物として使用されて
いる［ウィークス（Weeks）らのクリニカル・ケミスト
リー（Clin.Chem.）、29、1474-79（1983）；カンペル
（Campell）らの欧州特許出願第82,636号；およびマッ
クカプラ（McCapra）らのイギリス国特許第GB1,461,877
号］。更に、このアクリジニウム・アリールエステル類
の異性体である５−メチルフェナントリジニム−６−カ
ルボン酸・アリールエステル類も免疫検定に於ける標識
物として使用されている［リン（Lin）らの欧州特許出
願第170,415号］。
他方、免疫検定法に於いて、これらが有用であるにも
かかわらず、抗体−コンジュゲート（接合）10−メチル
−９−アクリジニウムカルボン酸フェニルは、pH4.0以
上（−20℃から40℃）の加水分解に基づいて不安定であ
り、３日以内に活性が10％以上失われてしまう。アクリ
ジニウム・エステル類はpH4.0以下では安定であるが、
抗体コンジュゲート体は、しばしばこのpH領域では安定
でないことがある。
トセングら（既述）は、ビス−Ｎ−アルキル−Ｎ−ト
リフルオロメチル・スルホニル・オキサルアミド類が、
対応するアリールエステル類よりも安定であることを確
認し、更に、これと同様に有効であることを示唆してい
る。フェノールおよびトリフルオロメチル・スルホンア
ミドの環離脱性（nucleofugacity）が同等であること、
即ち各々のpKaが約７であることを確認している。ギル
（既述）は、“より高度な”量子的有効性を有するシュ
ウ酸塩の例として、具体的にスルホニル・オキサルアミ
ドを挙げ、その発展性を“期待”している。
発明の要旨 本発明は、一般式： で示される化学発光性化合物、および一般式： ［式中、Ｒ、Ｒ′、Ｒ″、X1、X2およびX3は有効な化学
発光を妨げない置換分である。但し、Ｒ−X3、Ｒ′−X2
およびＲ″−X1はそれぞれ水素であってもよい。］ で示される異性体などのその異性体を提供するものであ
る。より詳細にはＲ、Ｒ′およびＲ″は介在鎖（spacer
arms）であってよく、X1、X2およびX3はそれぞれ水
素、カルボキシ、カルボアルコキシ、カルボキサミド、
カルボアリールオキシ、シアノ、カルボキシイミド、イ
ソシアネート、イソチオシアネート、スルホ、ハロゲン
化スルホニル、ハロゲン化カルボニル、Ｎ−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルおよびＮ−マレインイミド基か
らなる群の中から選ばれる基であってよい。Ｙは適当な
反対イオンであり、スルフェート、アルキルスルフェー
ト、ハロスルフェート、ハロボレート、ハロアセテー
ト、ハロホスフェート、ホスフェート、ハライドおよび
トリフルオロメタンスルホネートからなる群の中から選
ぶことができる。
Ｒ、Ｒ′およびＲ″はそれぞれアルキレン、アリー
ル、置換アルキレンおよび置換アリール基からなる群の
中から選ばれる基であって、これらの基に於けるひとつ
若しくはそれ以上の水素原子が、アルキル、アリール、
置換アルキル、置換アリール、アルコキシ、アリールオ
キシ、ハロゲン、アミノ、保護アミノ、置換アミノヒド
ロキシ、保護ヒドロキシ、オキソ、チオ、イミノ、ニト
ロ、メルカプト又は置換メルカプト基によって置換され
ているか、又はこれらの基に於けるひとつ若しくはそれ
以上の炭素原子がヘテロ原子によって置換されている基
であってよい。このヘテロ原子は、窒素、リン、硫黄お
よび酸素からなる群の中から選ぶことができる。
Ｒ′−X2およびＲ−X3は、一方がフェニル、イソプロ
ピル、ｎ−ブチル又はベンジル５−カルボキシペンチル
から選ばれるときは他方はニトロベンゼンであってよ
く、又は一方がｎ−ブチル又はフェニルから選ばれると
きは他方はジニトロベンゼンであってよい。
また、Ｒ−X3、Ｒ′−X2およびＲ″−X1はそれぞれ水
素であってもよい。但し、Ｒ′−X2およびＲ−X3のいず
れか一方において、X2又はX3がカルボペンタクロロフェ
ノキシ、カルボ−ｐ−ニトロフェノキシ、カルボキシイ
ミド、イソチオシアネート、Ｎ−マレインイミドおよび
Ｎ−スクシンイミジルカルボキシから選ばれた基であ
り、かつＲ′−X2およびＲ−X3の他方が水素、アルキ
ル、アリール、ベンジル又は置換アリール又は置換ベン
ジル（置換基はアルコキシ、アリールオキシ、アミノ又
はヒドロキシ）であるときは、X1は水素ではなく、また
Ｒ″−X1も水素ではない。
更に、Ｒ、Ｒ′およびＲ″は、それぞれ一般式： −（CH2）ｎ− （式中、ｎは０〜50である） で示される介在鎖であってもよい。詳細には、Ｒ″は−
CH2−であることができ、X1は−Ｈであることができ
る。
化学発光免疫検定法に使用する上で、通常最も好まし
い本発明に係る化合物は、10−メチル−Ｎ−［２−カル
ボキシエチル］−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・カ
ルボキサミド、10−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（２
−カルボキシエチル）−Ｎ−トシル−９−アクリジニウ
ム・カルボキサミド、および10−（３−スルホプロピ
ル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−９−
アクリジニウム・カルボキサミドである。
化学発光化合物を製造するための、本発明に係る方法
は、式： X3−Ｒ−NH2 で示されるアミンを、不活性溶媒中、塩基の存在下に
式： Ｗ−SO2−Ｒ′−X2 で示されるハロゲン化スルホニルと接触させて式： X3RNHSO2Ｒ′X2 で示されるスルホンアミドを生成させ、該スルホンアミ
ドを不活性溶媒中、塩基と接触させて、 式： M+ X3−Ｒ−N-−SO2−Ｒ′−X2 ［式中、Ｗはクロロおよびフルオロ基からなる群から選
ばれるものであり、ＭはLi、NaおよびＫから選ばれるも
のであり、その他全ての記号は前記と同意義である］ で示されるスルホンアミド・アニオンおよび金属イオン
を形成させる工程、並びに本発明に係る活性９−アクリ
ジンカルボキシレート化合物を用いてアシル化する工程
からなるものである（ここに、活性基はハロゲン、イミ
ダゾロ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルおよびアジド
基から選ばれる基である）。
本発明に係るコンジュゲート体は、抗体、ハプテン、
抗原、核酸プローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリ
ヌクレオチド（例えばDNA又はRNA）を、本発明に係る化
学発光化合物に共有結合させることにより製造すること
ができ、化学発光免疫検定を実施する方法は、コンジュ
ゲート体と特異的に反応する物質、例えば特異抗原、特
異抗体又は相補的ポリヌクレオチド（例えば本発明に係
るポリヌクレオチド・コンジュゲート体と配列特異的に
水素結合を形成するポリヌクレオチド）の存在を確認す
るために、被検試料をコンジュゲート体に暴露させる工
程を特徴とするものである。
発明の構成および効果 本発明は、アクリジニウム・アリールエステルの不安
定さの問題を、脱離基をフェノレートからスルホンアミ
ド・アニオンに変換することによって解決しようとする
ものである。これらの脱離基は両方ともpKa約10である
が、アクリジニウム・スルホニルアミドはアミド結合に
伴った付加的な安定性を有している。このことは赤外ス
ペクトルに於けるアリールエステルのカルボニルの伸縮
振動（1730cm-1）と、スルホニルアミドの伸縮振動（16
80cm-1）との比較に反映されている。
アクリジニウム塩の一種、10−アルキル・Ｎ−アルキ
ル（アリール）・スルホニル−Ｎ−アルキル（アリー
ル）・９−アクリジニウム・カルボキサミド塩類を、添
付の図面の一般的反応式に従って製造した。図中、Ｒ、
Ｒ′およびＲ″は介在鎖、溶解性改良部および／又は反
応性改良部として機能できるが、化学発光反応を妨げな
い置換分である（ここに、「妨げる」という用語は本明
細書では「有効な化学発光の発生を妨害すること」、即
ち化学発光化合物が適用目的に有用でなくなる程に化学
発光の発生を妨害することを意味する）。図中、X1、X2
およびX3は溶解性増強部、および／又は分析物に架橋す
るための反応基、又は当業者周知の方法によりこのよう
な反応基若しくは架橋基に容易に変換できる基として機
能できる置換分である。図中、Ｙは反対イオンである。
図に示した反応式によって製造される塩類は、アルカ
リ性過酸化水素による酸化反応により光を発生する。こ
れらの化合物を、容易に入手できるアミン類（X3−RN
H2）および塩化スルホニル（X2−Ｒ′SO2Cl）から製造
した。９−クロロカルボニル・アクリジンを用いてアシ
ル化を行えば、中間体スルホンアミド（X3−RNH−SO
2Ｒ′−X2）から新規な種類のアクリジン化合物が得ら
れ、この化合物をアルキル化すれば、アクリジニウム塩
類が得られる。同様に、この反応式に於いて６−クロロ
カルボニル・フェナントリジンをアクリジンと置き代え
ると新規な種類のフェナントリジニウム塩類が得られ
る。これらのアクリジニウムおよびフェナントリジニウ
ム塩類は、診断試験に使用されているタンパク質、核酸
および小分子を化学発光標識する上で有用である。
診断法、特にCLIAへの用途に適用な比活性および安定
性を有する幾つかのアクリジニウム・スルホニルアミド
類を製造した。これらの化合物の合成法に例えば、抗体
を標識する上で使用することのできる各種の官能基
（X1、X2、X3）を導入することができる。更に、化学発
光反応の速度は、スルホンアミド脱離基に結合する置換
分（Ｒ、Ｒ′）の選別によって制御することができる。
これらの化合物の効果を、0.1N HCl（300μｌ）を用
いて化合物の10-9M溶液20μｌを希釈し、次いで0.2N Na
OH中0.03％H2O2150μｌを加えて化学発光反応を誘発さ
せることによって評価した。化学発光は、光子計数ルミ
ノメーター（photon-counting luminometer）を用いて
測定した。光の出力を、光子の全カウント数として記録
し、このカウント数を用いて各化合物の効果をカウント
数／モルとして計算した。光子計数の効率は機器によっ
て左右されるので、これらは相関した数である。同じ機
器を用いて化合物を直接的に比較した。その結果を第１
表に示す。第１表に於いては、使用した化合物の構造は
一般式： ［式中、Ｒ″−X1はCH3であり、Ｒ′−X2およびＲ−X3
は第１表中に記載されているものである］ で示され得るものであり、化学発光の出力を「CTS/MOL
E」、全ての光の出力に要した時間を「INT.TIME」、光
の出力のピークに達した時間を「PEAK CTS」と各々略語
を用いて記載している。
被検化合物は全て効果を示した（５−20×1018カウン
ト／モル）。比活性は、前記で示したＲおよびＲ′基の
位置に関係しないが、光出力のピークに達するのに要し
た時間および全ての光が出力するのに要した時間から、
最も速い化合物と最も遅い化合物とでは50係数異なって
いた。ＲおよびＲ′位に於いて、電子求引基は反応速度
を速め、かさばった（bulky）電子供与基は反応速度を
遅らせる。化学発光の寿命が2-10秒である本発明に係る
化学発光化合物は、免疫検定には好ましい化合物であ
り、それよりも短い寿命の化合物は強いパルス光の供給
源として使用することができ、またそれよりも長い寿命
の化合物は「冷光」の供給源として使用することができ
る。
本発明に係る方法によって製造される化合物の安定性
を、幾つかの方法によって評価した。まず第一に、この
化合物をpH5-7の水性緩衝液中、濃度がサブナノモル/l
（sub-nanomolar）の溶液にまで希釈した。この溶液を
室温でインキュベートし、更に45℃でインキュベートし
ながら、この間に化学発光の減速を経時的にモニターし
た。これにより、定性結果を得、一方、化合物の相対的
安定性を検定した。洗浄剤、タンパク質等を添加するこ
とにより、化合物がインキュベーション容器に非特異的
に吸着するために起こる異常結果を、最小限度に抑え
た。逆相高速液体クロマトグラフィー「逆相HPLC」によ
り化合物の溶液（濃度ミリモル/l）をモニターして定量
結果を得た。これらの化合物の安定性は、化学発光反応
の速度論と同様の態様でＲおよびＲ′によって影響を受
けた。即ち、電子求引基は化合物を不安定にし、かさば
った電子供与基は化合物を安定にした。
抗体を標識するためには種々の方法を行えるが、本発
明ではNHS活性化法が好ましい。本発明に都合よく機能
する他の物質にはポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、Fab抗体フラグメントが挙げられ、これら全ては
本明細書に於いて以下「抗体」と記載する一般的用語に
包含され、更に、ハプテン、抗原、核酸プローブ、およ
び、相補的な小分子量分析物と結合することのできるタ
ンパク質（例えば葉酸と結合する葉酸結合タンパク質、
ビタミンB12と結合する内因子）と結合する非抗体が挙
げられる。抗体コンジュゲート体は、45℃で４週間加熱
した後でも80％以上の化学発光を保持している。
Ｂ型肝炎表面抗原「HBsAg」［アボット・ラボラトリ
ーズ、アボット・パーク、イリノイ州］に関して固相サ
ンドウィッチ免疫検定法を行い、本発明に係るCLIAをRI
Aと比較した。この試験では、抗体被覆ビーズ、希釈
液、インキュベーション条件、洗浄条件および抗体調製
物は２方法とも同様に行ったが、RIA法ではクロラミン
Ｔを用いて抗体を125Iによって標識し、CLIA法ではNHS
活性化Ｎ−スルホニル−９−アクリジニウム・カルボキ
サミドを用いて抗体を標識した。ヒト甲状腺刺激ホルモ
ン（hTSH）に関する固相サンドウィッチ免疫検定法を行
い、CLIAをEIA［アボット・ラボラトリーズ、アボット
・パーク、イリノイ州］と比較した。EIAでは西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（HRPO）−標識化抗体を使用し、CL
IAではNHS活性化Ｎ−スルホニル−９−アクリジニウム
・カルボキサミドを使用した。
本発明を以下の実施例によってより詳細に説明する。
実施例１には、本発明に係る化合物を組み立てるのに有
用なスルホンアミド類の製造法を記載している。実施例
２には、本発明に係るＮ−スルホニル−９−アクリジン
カルボキサミド類の製造法を記載している。実施例３に
は、10−メチル・Ｎ−スルホニル−９−アクリジニウム
・カルボキサミド類の製造法を記載している。実施例4-
6には、本発明に係るｐ−トルエンスルホニル（トシ
ル）化合物の合成法を記載している。実施例７には、ア
クリジンカルボキサミド類の製造法を説明している。
実施例8-10には、本発明に係る幾つかのアクリジニウ
ム・カルボキサミド類およびこれらの製造物を合成する
方法を記載している。実施例11には、本発明に係るＮ−
スルホニル−アクリジニウム・カルボキサミド化合物の
化学発光の評価法を記載している。実施例12は、本発明
に係るアクリジニウム・カルボキサミドの安定性試験の
結果を記載している。実施例13では、本発明に係るアク
リジニウム・カルボキサミドの温度およびpH安定性をア
クリジニウムカルボキシレートの温度およびpH安定性と
比較している。実施例14には抗体、具体的には免疫グロ
ブリンＧ「IgG」抗体を本発明に係る化合物にコンジュ
ゲートする方法を記載している。実施例15には、実施例
14に記載したコンジュゲート体の熱安定性試験の結果を
記載している。実施例16には、抗−HBsAgアクリジニウ
ム標識化コンジュゲート体の製造法、並びにこれらのコ
ンジュゲート体を用いたCLIAおよびRIA検定法によって
認められた感度の比較結果を記載している。実施例18に
は、本発明に係るフェナントリジニウム化合物の合成法
を記載している。実施例17は、抗hTSHアクリジニウム標
識化コンジュゲート体に関し、EIA法と比較して説明し
ている。
実施例１ スルホンアミド類の一般的な製造方法． 化合物1-13および17-21の出発物質であるアミンは、
アルドリッチ・ケミカルCo.（Aldrich Chemical Co.ミ
ルウォーキー、ウィスコンシン）から入手できる。化合
物14-16および22-25に関しては、適当なアミンカルボン
酸（アルドリッチ・ケミカルCo.から入手）を、標準的
な発表されている方法によってエステル化して出発物質
とした。
本発明に係るスルホンアミドを製造するために、対応
するアミン（200モル％）を、無水塩化メチレンに溶解
し、これを、塩化スルホニル又は無水スルホニルの溶液
（100モル％）を滴下して０℃にて処理した。この溶液
を無水エーテル（５容量）に注加し、1.4M H3PO4（25m
l）次いで塩水（25ml）を用いて洗浄し、MgSO4で乾燥し
た。濾過して蒸発させた後、粗スルホンアミド類を適当
な溶媒から結晶化させた。
以下に記載のスルホンアミド類は、このような方法に
よって製造したものである。各化合物の名前と共に記載
した語を下記に説明する： 略語「MS」は、質量スペクトルを示し、記号「＠」に
よって特定された位置（即ちm/e）に於けるピークを例
えば基準ピークならば「M+」のように表している。融点
は「Mp」で表し、物質が室温で液体の場合はその旨を例
えば「油」と示し、あるいは溶解する前に分解するもの
に関しては「decomp.」と示しているものもある。各化
合物は「化合物番号」（本実施例では1-25）、次いで
「同定番号」（例えば13513-227）および化合物名によ
って特定している。
1.13513-227 Ｎ−フェニル−ｐ−トルエンスル ホンアミド MSM+＠247 Mp100-102℃ 2.13513-228 Ｎ−フェニル−ｐ−ブロモベンゼ ンスルホンアミド MSM+＠311 Mp115-117℃ 3.13513-229 Ｎ−フェニル−ｏ−ニトロベンゼ ンスルホンアミド MSM+＠278 Mp112-113℃ 4.13513-231 Ｎ−フェニル−ｐ−ニトロベンゼ ンスルホンアミド MSM+＠278 Mp168-170℃ 5.13513-232 Ｎ−フェニル−2,4−ジニトロ ベンゼンスルホンアミド MSM+＠323 Mp110-113℃ 6.13513-233 Ｎ−フェニル−トリフルオロメ タンスルホンアミド MSM+＠225 Mp65-67℃ 7.13514-001 Ｎ−イソプロピル−ｐ−トルエン スルホンアミド MSM+＠213 Mp50-51℃ 8.13514-002 Ｎ−イソプロピル−ｐ−ブロモベ ンゼンスルホンアミド MSM+＠277 Mp95-96℃ 9.13514-003 Ｎ−イソプロピル−ｏ−ニトロベ ンゼンスルホンアミド MSM+＠244 Mp 119-120℃ 10.13514-004 Ｎ−イソプロピル−トリフルオ ロメタンスルホンアミド MS（M-1）＠190 油 11.13514-006 Ｎ−イソプロピル−ｐ−ニトロベ ンゼンスルホンアミド MSM+＠244 Mp113-114℃ 12.13514-025 Ｎ−ブチル−2,4,6−トリメ チルベンゼンスルホンアミド MSM+＠255 Mp45℃ 13.13514-026 Ｎ−ブチル−2,4,6−トリイ ソプロピルベンゼンスルホンア ミド MSM+＠339 Mp104℃ 14.13514-032 ６−（Ｎ−トシルアミノ）ヘキサ ン酸ベンジル MSM+＠375 油 15.13514-057 ｔ−ブチル・Ｎ−トシル−β−ア ラニン MSM+＠242（M-57） 油 16.13514-058 ５−（Ｎ−トシルアミノ）ペンタ ン酸ベンジル MSM+＠361 油 17.13513-170 Ｎ−ブチル−ｐ−トルエンスルホ ンアミド MSM+＠227 Mp42-44℃ 18.13513-173 Ｎ−ブチル−ｐ−ブロモベンゼン スルホンアミド MSM+＠241 Mp53-54℃ 19.13513-172 Ｎ−ブチル−ｏ−ニトロベンゼン スルホンアミド MSM+＠258 Mp58-60℃ 20.13513-174 Ｎ−ブチル−ｐ−ニトロベンゼン スルホンアミド MSM+＠258 Mp80-81℃ 21.13513-213 Ｎ−ブチル−2,4−ジニトロベ ンゼンスルホンアミド MSM+＠304 Mp60-62℃ 22.13513-085 ６−（Ｎ−トリフルオロメチルス ルホニルアミノ）ヘキサン酸ベン ジル 油 23.13513-083 ベンジル・Ｎ−（トリフルオロメ チルスルホニル）−４−（カルボ キシメチル）アニリン 24.14973-1A ベンジル・Ｎ−（５−カルボキシ ペンチル）−ｐ−ブロモベンゼン スルホンアミド MSM+＠439 Mp52-56℃ 25.14973-37A ベンジル・Ｎ−（５−カルボキシ ペンチル）−ｐ−ニトロベンゼン スルホンアミド MSM+＠406 Mp86-88℃ 実施例２ Ｎ−スルホニル−９−アクリジンカルボキサ
ミド類の製造法． 新しい昇華性tert−ブトキシル化カリウム（200モル
％）およびトリ−ｎ−ブチルベンジルアンモニウム・ブ
ロミド（１モル％）を、窒素雰囲気下、トルエン中に懸
濁させた。選択したスルホンアミド（200モル％）を加
え、得られた混合物を10-30分間攪拌した後、蒸発乾固
して得られた乾燥物質を溶媒に再度懸濁させた［別法と
して、相転移触媒を用いずに、テトラヒドロフラン中で
適当なアニオンを生成させてもよい］。９−クロロカル
ボニルアクリジン塩酸塩（100モル％）を添加した後、
得られた反応混合物を、薄層クロマログラフィー（TL
C）で変化が認められなくなるまで、室温にて３から14
時間攪拌した。この反応液をエチルエーテル（10容量）
で希釈し、塩水（25ml）を用いて洗浄した。MgSO4で乾
燥し、濾過して蒸発させた後、得られた粗生成物をクロ
マトグラフィーにかけた［ハリソン・リサーチ（Harris
on Research、パロ・アルト、カルフォルニア州）から
市販されているクロマトロンTM（ChromatotronTM）クロ
マトグラフにて、2mmシリカ・ローターを使用し、溶離
溶媒には酢酸エチル／ヘキサンの傾斜溶離剤を使用し
た］。生成物を含有している分画を集め、蒸発させてエ
ーテル／ヘプタンより結晶化させた（即ち、分画をエー
テルに溶解した後、混合物が白濁化するまでヘプタンを
加えた）。
以下に記載の化合物を、括弧内に示した出発物質から
製造した。但し、括弧内には、出発物質が本明細書にて
製造される場合は実施例１若しくは本実施例にて付記し
ている番号を示してあり、出発物質が本明細書にて製造
されていない場合は各々その入手元を示している。他の
全ての表記法は実施例１に説明している。
26.13513-234 Ｎ−フェニル−Ｎ−ｐ−トルエン スルホニル−９−アクリジンカ ルボキサミド ［化合物１］ MS M+＠452 Mp 200℃ 27.13513-236 Ｎ−フェニル−Ｎ−ｐ−ブロモベ ンゼンスルホニル−９−アクリ ジンカルボキサミド ［化合物２］ MS M+＠516 Mp 218-219℃ 28.13513-240 Ｎ−フェニル−Ｎ−ｏ−ニトロベ ンゼンスルホニル−９−アクリ ジンカルボキサミド ［化合物３］ MS M+＠483 Mp 197-200℃ 29.13513-242 Ｎ−フェニル−Ｎ−ｐ−ニトロベ ンゼンスルホニル−９−アクリ ジンカルボキサミド ［化合物４］ MS M+＠483 30.13513-243 Ｎ−フェニル−Ｎ−トリフルオ ロメタンスルホニル−９−アク リジンカルボキサミド ［化合物６］ MSM+＠430 Mp 162℃ 31.13514-007 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ｐ−トル エンスルホニル−９−アクリジ ンカルボキサミド ［化合物７］ MSM+＠418 Mp 163-164℃ 32.13514-009 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ｐ−ブロ モンベンゼンスルホニル−９−ア クリジンカルボキサミド ［化合物８］ MSM+＠482 Mp 205℃ 33.13514-012 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ｏ−ニト ロベンゼンスルホニル−９−ア クリジンカルボキサミド ［化合物９］ MSM+＠449 Mp 215℃ 34.13514-001 Ｎ−イソプロピル−Ｎ−トリフ ルオロメタンスルホニル−９− アクリジンカルボキサミド ［化合物10］ MSM+＠396 35.13514-028 Ｎ−ブチル−2,4,6−トリメ チルベンゼンスルホニル−９− アクリジンカルボキサミド ［化合物12］ MSM+＠460 Mp 88-90℃ 36.13514-031 Ｎ−ブチル−2,4,6−トリイ ソプロピルベンゼンスルホニル −９−アクリジンカルボキサミ ド ［化合物13］ MSM+＠544 37.13514-042 ベンジル・Ｎ−トシル−Ｎ−（５ −カルボキシペンチル）−９−ア クリジンカルボキサミド ［化合物14］ MSM+＠550 油 38.13514-062 ベンジル・Ｎ−トシル−Ｎ−（４ −カルボキシブチル）−９−アク リジンカルボキサミド ［化合物16］ MSM+＠566 39.13514-069 ｔ−ブチル・Ｎ−トシル−Ｎ−（２ −カルボキシエチル）−９−アク リジンカルボキサミド ［化合物15］ MSM+＠504 Mp 157-158℃ 40.13513-186 Ｎ−ブチル−Ｎ−ｐ−トルエンス ルホニル−９−アクリジンカル ボキサミド ［化合物17］ MSM+＠432 Mp 122-123℃ 41.13513-191 Ｎ−ブチル−Ｎ−ｏ−ニトロフェ ニルスルホニル−９−アクリジ ンカルボキサミド ［化合物19］ MSM+＠463 Mp 170℃ 42.13513-195 Ｎ−ブチル−Ｎ−ｐ−ニトロフェ ニルスルホニル−９−アクリジ ンカルボキサミド ［化合物20］ MSM+＠463 Mp 210℃ 43.13513-218 Ｎ−ブチル−Ｎ−（2,4−ジニ トロフェニルスルホニル）−９− アクリジンカルボキサミド ［化合物21］ MSM+＠508 Mp 95℃ 44.14973-9C ベンジル・Ｎ−（５−カルボキシ ペンチル）−Ｎ−ｐ−ブロモベン ゼンスルホニル−９−アクリジ ンカルボキサミド ［化合物24］ MS（Ｍ＋Ｈ）＠645 45.14973-40C ベンジル・Ｎ−（５−カルボキシ ペンチル）−Ｎ−ｐ−ニトロベン ゼンスルホニル−９−アクリジ ンカルボキサミド ［化合物25］ MS（Ｍ＋Ｈ）＠645 46.14973-88A Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−９ −アクリジンカルボキサミド ［ｐ−トルエン・スルホンアミド（ア ルドリッチ）］ Mp 276℃ 47.14973-21C Ｎ−アリル−Ｎ−ｐ−トルエンス ルホニル−９−アクリジンカル ボキサミド ［化合物46］ Mp 136-138℃ 48.13513-202 Ｎ−ブチル−Ｎ−ｐ−ブロモベン ゼンスルホニル−９−アクリジ ンカルボキサミド MSM+＠496/498 Mp 148-149℃ 実施例３ 10−メチル・Ｎ−スルホニルアクリジニウム
・カルボキサキド類の製造． Ｎ−スルホニルアクリジン・カルボキサミド類のメチ
ル化を、以下の方法に従い行った。アクリジン・スルホ
ンアミドを各々無水塩化メチレンに溶解した。この溶液
に無水Na2CO3（スルホンイミドの５倍重量）を加え、次
いでメチル・トリフレート（methyl triflate）（スル
ホンアミドの20倍重量）を加えた。得られた懸濁液を窒
素雰囲気下、40℃までの室温で14-48時間攪拌した。反
応をTLC（逆相）によってモニターした。反応物を濾過
して溶媒および過剰のメチルトリフレートを蒸発させて
生成物を得た。得られた固体残留物を温ベンゼンを用い
たトリチュレートによって、又は逆相HPLCによって精製
した。
以下に製造した化合物を挙げる。これらは実施例１又
は実施例２で使用した番号付法、記号および略語を用い
て記載している。
49.13513-246 10−メチル−Ｎ−フェニル− Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−９ −アクリジニウムカルボキサミ ド・トリフルオロメタンスルホ ネート ［化合物26］ MS M+＠467 Mp 210-24℃（decomp.） 50.13513-247 10−メチル−Ｎ−フェニル− Ｎ−ｐ−ブロモベンゼンスルホニ ル−９−アクリジニウムカルボ キサミド・トリフルオロメタン スルホネート ［化合物27］ MS M+＠531、533 Mp 240℃（decomp.） 51.13513-248 10−メチル−Ｎ−フェニル−ｏ −ニトロベンゼンスルホニル− ９−アクリジニウムカルボキサ ミド・トリフルオロメタンスル ホネート ［化合物28］ MS M+＠490 Mp 248-50℃（decomp.） 52.13513-249 10−メチル−Ｎ−フェニル− Ｎ−トリフルオロメタンスルホ ニル−９−アクリジニウムカル ボキサミド・トリフルオロメタ ンスルホネート ［化合物30］ MS M+＠445 53.13513-250 10−メチル−Ｎ−フェニル−ｐ −ニトロベンゼンスルホニル− ９−アクリジニウムカルボキサ ミド・トリフルオロメタンスル ホネート ［化合物29］ MS M+＠484 54.13514-013 10−メチル−Ｎ−イソプロピ ル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル −９−アクリジニウムカルボキ サミド・トリフルオロメタンス ルホネート ［化合物31］ MS M+＠433 Mp 214℃ 55.13514-014 10−メチル−Ｎ−イソプロピ ル−Ｎ−ｐ−ブロモベンゼンスル ホニル−９−アクリジニウムカ ルボキサミド・トリフルオロメ タンスルホネート ［化合物32］ MS M+＠497/499 Mp 200℃（decomp.） 56.13514-018 10−メチル−Ｎ−イソプロピ ル−Ｎ−ｏ−ニトロベンゼンスル ホニル−９−アクリジニウムカ ルボキサミド・トリフルオロメ タンスルホネート ［化合物33］ MS M+＠464 57.13514-021 10−メチル−Ｎ−イソプロピ ル−Ｎ−トリフルオロメタンス ニホニル−９−アクリジニウム カルボキサミド・トリフルオロ メタンスルホネート ［化合物34］ MS M+＠411 58.13514-037 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −（2,4,6−トリメチルベンゼ ンスルホニル）−９−アクリジニ ウムカルボキサミド・トリフル オロメタンスルホネート ［化合物35］ MS M+＠475 Mp 227℃（decomp.） 59.13514-038 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −（2,4,6−トリイソプロピル ベンゼンスルホニル）−９−アク リジニウムカルボキサミド・ト リフルオロメタンスルホネート ［化合物36］ MS M+＠559 Mp 231℃（decomp.） 60.13514-044 ベンジル・10−メチル−Ｎ− トシル−Ｎ−（５−カルボキシペ ンチル）−９−アクリジニウムカ ルボキサミド・トリフルオロメ タンスルホネート ［化合物37］ 61.13514-079 ｔ−ブチル・10−メチル−Ｎ− トシル−（２−カルボキシエチル） −９−アクリジニウムカルボキ サミド・トリフルオロメタンス ルホネート ［化合物39］ MS M+＠519 Mp 207℃（decomp.） 62.13513-211 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −ｐ−トルエンスルホニル−９− アクリジニウムカルボキサミド・ トリフルオロメタンスルホネー ト ［化合物40］ MS M+＠447 63.13513-212 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −ｐ−ブロモベンゼンスルホニル −９−アクリジニウムカルボキ サミド・トリフルオロメタンス ルホネート ［化合物48］ MS M+＠511 Mp 126℃ 64.13513-215 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −ｏ−ニトロフェニルスルホニル −９−アクリジニウムカルボキ サミド・トリフルオロメタンス ルホネート ［化合物41］ MS M+＠478 Mp 232-234℃ 65.13513-216 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −ｐ−ニトロフェニルスルホニル −９−アクリジニウムカルボキ サミド・トリフルオロメタンス ルホネート ［化合物42］ MS M+＠478 Mp 201℃ 66.13513-230 10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ −（2,4−ジニトロフェニルス ルホニル）−９−アクリジニウム カルボキサミド・トリフルオロ メタンスルホネート ［化合物43］ MS M+＠523 Mp 215-220℃ 67.14973-31B 10−メチル−Ｎ−アリル−Ｎ −ｐ−トルエンスルホニル−９− アクリジニウムカルボキサミド ・トリフルオロメタンスルホネ ート ［化合物47］ MS M＋２＠433 68.14973-47A ベンジル・10−メチル−Ｎ−（５ −カルボキシペンチル）−Ｎ−ｐ −ニトロベンゼンスルホニル− ９−アクリジニウムカルボキサ ミド・トリフルオロメタンスル ホネート ［化合物45］ MS M+＠626 Mp 139-141℃ 69.14973-90A 10−メチル−Ｎ−メチル−Ｎ −ｐ−トルエンスルホニル−９− アクリジニウムカルボキサミド・ トリフルオロメタンスルホネー ト ［化合物46］ MS M+＠405 70.14973-25A ベンジル・10−メチル−Ｎ−（５ −カルボキシペンチル）−Ｎ−（ｏ ブロモベンゼンスルホニル）− ９−アクリジニウムカルボキサ ミド ［化合物44］ 実施例４ 10−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（６−ヘキサ
ノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−９−アクリ
ジニウムカルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネ
ートの合成． 化合物37（450mg、0.78mmol）を、窒素雰囲気下、50
℃にて２時間、酢酸中31％HBr6mlで処理した。この溶液
を水30mlに注加し、冷却した。濾過操作によってカルボ
ン酸化合物71、13514-045［Ｎ−トシル−Ｎ−（５−カ
ルボキシペンチル）−９−アクリジンカルボキサミド］
を分離した。
化合物71（100mg、0.2mmol）を乾燥塩化メチレン（5m
l）に溶解し、次いで、窒素雰囲気下、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（23mg、0.2mmol）およびジシクロヘキ
シルカルボジイミド（41mg）で12時間処理した。反応が
終了した後、溶液を濾過し、次いで蒸発乾固して活性エ
ステルである化合物72、13514-052［Ｎ−トシル−Ｎ−
（６−ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）
−９−アクリジンカルボキサミド］を得た。
化合物72を実施例３の如くメチル化して化合物73を得
た。実施例１で説明した番号付、記号および略語を用い
て化合物71、72および73を以下に記載する。
71.13514-045 Ｎ−トシル−Ｎ−（５−カルボキ シペンチル）−９−アクリジンカ ルボキサミド ［化合物37］ MS M+＠240 Mp 150-152℃ 72.13514-052 Ｎ−トシル−Ｎ−（６−ヘキサノ イル−Ｎ−ヒドロキシスクシン イミド）−９−アクリジンカルボ キサミド ［化合物71］ MS M+＠588 73.13514-054 10−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ −（６−ヘキサノイル−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド）−９−ア クリジニウムカルボキサミド・ トリフルオロメタンスルホネー ト ［化合物72］ 実施例５ 10−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（５−ペンタ
ノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−９−アクリ
ジニウムカルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネ
ートの合成． 化合物38、13514-062を実施例４に記載の如く、処理
し、化合物74、13514-065［Ｎ−トシル−Ｎ−（４−カ
ルボキシブチル）−９−アクリジンカルボキサミド］を
得た。
化合物74を実施例４に記載の如くＮ−ヒドロキシスク
シンイミドとカップリングさせて化合物75、13514-06
7、Ｎ−トシル−Ｎ−（５−ペンタノイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド）−９−アクリジンカルボキサミド
を得た。この化合物を、実施例３に記載のようにメチル
化して化合物76、13514-078［10−メチル・Ｎ−トシル
−Ｎ−（５−ペンタノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド）−９−アクリジニウムカルボキサミド・トリフル
オロメタンスルホネート］を得た。
実施例１で説明した番号付、記号および略語を用いて
化合物74、75および76を以下に記載する。
74.13514-065 Ｎ−トシル−Ｎ−（４−カルボキ シブチル）−９−アクリジンカ ルボキサミド MS M+＠476 Mp 152-155℃ 75.13514-067 Ｎ−トシル−（５−ペンタノイル −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ド）−９−アクリジンカルボキサ ミド ［化合物74］ MS M+＠573 76.13514-078 10−メチル−Ｎ−トシル−（５ ペンタノイル−Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミド）−９−アクリ ジニウムカルボキサミド・トリ フルオロメタンスルホネート ［化合物75］ 実施例６ 10−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボ
キシエチル）−９−アクリニジウムアルボキサミド・ト
リフルオロメタンスルホネートの合成． 化合物61（13514-079）50mg（0.072mmol）を、窒素雰
囲気下、０℃にてトチフルオロ酢酸（TFA）2mlに溶解し
た。15分間攪拌した後、TFAを蒸発させて得られた残留
物をメタノール／エーテルから再結晶させた（即ち、こ
の残留物をメタノールに溶解し、白濁化するまでエーテ
ルを加えた）。あるいは、化合物61を1N塩酸中で１時間
還流させた。その水性溶液を蒸発乾固して残留物を残
し、得られた残渣を調製用（preparative）逆相HPLCに
よって精製した。上記いずれかの方法により、化合物7
7、13514-081［10−メチル・Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カ
ルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミ
ド］を得た。化合物77を、実施例１で説明した番号付、
記号および略語を用いて記載する。
77.13514-081 10−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ −（２−カルボキシエチル）−９ −アクリジニウムカルボキサミ ド・トリフルオロメタンスルホ ネート ［化合物61］ MS（Ｍ＋14）＠477 MS M+＠463 Mp 227℃（decomp.） 実施例７ アクリジンカルボキサミド類の製造． アミン（110モル％）およびトリエチルアミン（220モ
ル％）を塩化メチレンに溶解した。９−クロロカルボニ
ルアクリジン100モル％を塩化メチレン溶液にして滴下
により加えた。この反応物を窒素雰囲気下で３時間攪拌
した。得られた溶液をシリカゲルに通して濾過し、濾液
を蒸発させて残留物を得た。次いで、この残留物を適当
な溶媒（化合物78はイソプロピルエーテルを用い、化合
物79はエチルエーテルを用いた）で再結晶した。
製造したアミン類を、実施例１で説明した番号付、記
号および略語を用いて以下に記載する。
78.14973-15A Ｎ−アリル−９−アクリジンカ ルボキサミド ［アリルアミン（アルドリッチ）］ MS M+＠262 Mp 192℃ 79.14973-6A ベンゼン・Ｎ−（５−カルボキシ ペンチル）−９−アクリジンカル ボキサミド ［６−アミノカプロン酸（アルド リッチ）］ MS M+＠458 Mp 86℃ 実施例８ アクリジニウムカルボキサミド類の合成． エステル（化合物44又は化合物68のいずれか）を1N塩
酸に加え、3-4時間還流させた。冷却して、得られた懸
濁液を濾過して生成物を捕集するか、又はクロロホル
ム：イソプロパノール（3:2）混液を用いて抽出するか
いずれかの操作を行い、次いで蒸発させて所望の生成物
（それぞれ化合物80又は81）を得た。化合物80および81
を、実施例１で説明した番号付、記号および略語を用い
て以下に記載する。
80.14379-27A 10−メチル−Ｎ−（５−カルボ キシペンチル）−Ｎ−ｐ−ブロモ ベンゼンスルホニル−９−アク リジニウムカルボキサミド・ト リフルオロメタンスルホネート ［化合物44］ MS M+＠569、571 Mp 148-150℃ 81.14973-51A 10−メチル−Ｎ−（５−カルボ キシペンチル）−Ｎ−ｐ−ニトロ ベンゼンスルホニル−９−アク リジニウムカルボキサミド・ト リフルオロメタンスルホネート ［化合物68］ MS M+＠536 実施例９ 10−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−
Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカ
ルボキサミドの合成． プロパンスルトン（260モル％）をｔ−ブチル・Ｎ−
トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジ
ンカルボキサミド（化合物39、13514-069）と共に110-1
20℃で２時間加熱した。これを冷却した後、得られた固
体物をメタノールに取り、濾過した。濾液を蒸発乾固し
て得られた残留物をベンゼンを用いてトリチュレート
し、非４級化物質を除去した。
粗生成化合物を０℃にてトリフルオロ酢酸で処理した
後、15分間25℃で温めた。蒸発させて得られた残留物
を、調製用厚相クロマトグラフィー・プレート［ワット
マン（Whatman）（クリフトン、ニュージャージー）か
ら入手したC-18 PLKC 18F、20×20cm、1000M］を用い、
メタノール70部/0.5％酢酸水溶液30部を用いて溶出させ
るクロマトグラフ法によって精製し、次いでセレックス
−DTM（Cellex-DTM）樹脂［バイオラド・ラボラトリー
ズ（BioRad Laboratories）、リッチモンド、カルフォ
ルニア］による８％ギ酸を用いたイオン交換法により生
成物、化合物82を溶出させて更に精製を行ったた。以下
に、実施例１で説明した番号付、記号および略語を用い
て得られた化合物82を記載する。
82.14496-243 10−（３−スルホプロピル）− Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキ シエチル）−９−アクリジニウム カルボキサミド ［化合物39］ MS M+＠572 実施例10 10−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−
Ｎ−（３−スルホプロピル）−９−アクリジニウムカル
ボキサミドの合成． Ｎ−トシル−９−アクリジンカルボキサミド（化合物
46、14973-88A）50mgを、プロパンスルトン500mgを入れ
た封管中、アルゴン雰囲気下で140-150℃にて３時間加
熱した。冷却後、過剰のプロパンスルトンを、ベンゼン
を用いた（5ml×３）トリチュレートによって除去し
た。得られた粗生成物を、バイオラドAG-1-X4ホルメー
ト体［バイオラド・ラボラトリーズ］を用い、ギ酸水溶
液の傾斜溶離剤で溶出させる陰イオン交換クロマトグラ
フィーによって精製した。実施例１で説明した番号付、
記号および略語を用いて得られた生成物、化合物82を以
下に記載する。
83.30253-020 10−（３−スルホプロピル）− Ｎ−トシル−Ｎ−（３−スルホプ ロピル）−９−アクリジニウム カルボキサミド ［化合物46］ MS M＋Ｈ＠621 実施例11 Ｎ−スルホニルアクリジニウムカルボキサキ
ドの化学発光の評価． 化学発光に関して試験するべきアクリジニウム化合物
群を、ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、次いで
0.05Mクエン酸ナトリウム（pH5.0）又は0.05Mリン酸ナ
トリウム（pH7.0）緩衝液を用いて希釈し、約３×10-9M
の溶液にした。各々の緩衝化溶液12μｌを0.1N塩酸300
μｌで希釈し、0.2N NaOH中0.03％H2O2を用いて化学発
光を誘発させた。
発生した光りを光子計数ルミノメーターを用いて10秒
間隔で記録した（但し、これよりも長い間隔の場合は第
２表中に表示した）。第２表には、各化合物の比活性を
カウント／モルの形式で示している。
実施例12 化合物62（13513-211）の安定性試験． 化合物62（2mg）をメタノール1mlに溶解した。この溶
液を50μｌを、下記の緩衝液に各々添加した： １）0.05Mリン酸ナトリウム（pH5.0）500μｌ。
２）0.05Mリン酸ナトリウム（pH5.5）500μｌ。
３）0.05Mリン酸ナトリウム（pH6.0）500μｌ。
４）0.05Mリン酸ナトリウム（pH6.5）500μｌ。
５）0.05Mリン酸ナトリウム（pH7.0）500μｌ。
得られた各溶液を、逆相カラムを用いたパーキン−エ
ルマー（Parkin-Elmer）・シリーズ4 HPLC［C-18μボン
ダパック（Bondapak）、3.9mm×30cm、ウォーターズ・
アソシエト（Waters Associates、ミルフォード、マサ
チューセッツ）から入手］にかけて分析した。溶出は、
１％酢酸水溶液中75％メタノールおよび25％5mMペンタ
ンスルホン酸を用い、流速1ml/分で行った。溶出液を25
4nmにてモニターした。
室温で４週間経過した後、pH5.0、pH5.5およびpH6.0
の溶液からは、分解が認められず、pH6.5およびpH7.0の
溶液からはそれぞれ20％および70％の分解が確認され
た。
実施例13 アクリジニウム化合物の緩衝液中（pH7.2）
に於ける温度およびpH安定性の比較． ３つの異なるアクリジニウム化合物、即ち化合物62
（13513-211）、ウィークスらのクリニカル・ケミスト
リー（Clin.Chem.）、29、1474-79（1983）に従って製
造した番号13514-020と同定される化合物［４−（カル
ボベンジルオキシメチル）−フェニル−10−メチル−９
−アクリジニウムカルボキシレート・トリフルオロメタ
ンスルホネート］、および化合物83（30253-020）を、
温度およびpH安定性について比較した。この比較は、メ
タノール又は水中、濃度1.0mg/ml（これは1.6×10-3Mと
だいたい等濃度である）で行った。各試料を、0.1N塩酸
一部およびリン酸緩衝化食塩水（PBS）pH6.8一部を含有
した酸溶液中0.01％トゥイーン20R（Tween20R）［シグ
マ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company、
セントルイス、ミズーリ州）から入手］を用いて1:100
に希釈した。希釈溶液の最終的pHは約1.5であった。こ
れら溶液のモル濃度は各々1.6×10-5Mであった。
各溶液のモル吸光係数を求め、吸光スペクトルの認知
できる相違を確認するために、各溶液を走査してUV−可
視吸収スペクトルを記録した。これらアクリジニウム化
合物のUV−可視吸光スペクトルを第３表に示す。
これら３つの化合物は全て、ε37018,000およびε
26387,000であった。
これらのスペクトルにより、３つの化合物間のUV−可
視吸光度又はモル吸光係数のいずれにも殆ど差がないこ
とが分かる。実際、実験誤差の限界内ではスペクトルの
差は、殆ど認められないか、あるいは全く認められなか
った。
これら３つの化合物の貯蔵溶液（1.6×10-5M）を0.01
Mリン酸ナトリウム中0.05％健常人血清（pH4.8）を用い
て、無菌的に10倍に希釈した。更に、PBS（pH7.2）中0.
01％Tween20Rを用いて無菌的に10倍に希釈した。
一般的に、アクリジニウム化合物は、酸性pHでより安
定であることが知られているので、pH4.8緩衝液で希釈
した試料から得られたカウント数が、最大の化学発光出
力を有する最大の安定性を示すであろうと仮定した。３
つの化合物を全て10倍に希釈して最終濃度1.6×10-10M
にした。各試料の部分標本10μｌを0.05N塩酸90μｌに
加えた。0.25N NaOH中0.03％H2O2200μｌを用いて化学
発光を誘発させ、ルミノメーターによって６秒間カウン
ト数をモニターした。第４表にその結果を示す。第４表
の結果は、各々３回試行したものである。
第４表 化合物番号 同定番号 カウント/6秒 62 13513-211 92,669 91,241 91,995 83 30253-020 138,791 141,962 145,133 13514-020 59,438 59,443 59,449 以下の第５表に示されているように、実験誤差内で
は、ルミノメーターに於ける化学発光出力は、化合物間
に相違はなかった。
第５表 pH4.8に於ける化学発光出力 化合物番号 同定番号 カウント/モル 62 13513-211 5.7×1019 83 30253-020 8.7×1019 13514-020 3.7×1019 これら同じ化合物群の溶液10μｌをPBS緩衝液（pH7.
2）90μｌ中0.01％Tween20Rを用いて1.6×10-10Mに希釈
し、既述した化学発光出力の検出を行うまで酸性にしな
かった。得られた結果には若干相違が認められ、第６表
に示しているように特にアクリジニウムカルボキシレー
ト化合物13514-020が異なっていた。各３回試行した結
果を第６表に示す。
第６表 pH7.2に於ける化学発光出力 化合物番号 同定番号 カウント/6秒 62 13513-211 88,633 89,135 90,394 83 30253-020 133,560 137,929 142,299 13514-020 8,185 7,274 6,363 番号13514-020と同定される化合物は、pH7.2緩衝液中
では4.4×1018カウント／モルしか発光せず、殆どがpH
4.8に於ける発光に比べ少ない桁数のカウントであっ
た。これは、よりアルカリ性のpHであるため、分子の比
率が大きくなり、偽塩基が生成されることに基づくもの
かもしれない。この偽塩基とは、化学発光が、それに対
応する陽性に帯電したアクリジニウム化合物よりも実質
的に小さいものである。
Ｎ−スルホニルアクリジニウムカルボキサミド化合物
は、pH7.2でインキュベートした時、カウントはごく少
量しか減少しなかった。このことは、これらが、認識で
きる程度、少なくともこのpHまででは偽塩基を形成しな
いことを示すものである。
３つのアクリジニウム化合物溶液のpH7.2緩衝液によ
る全ての希釈系列を、室温にて一晩放置し、その後に分
析にかけた。２つのＮ−スルホニルアクリジニウムカル
ボキサミド化合物は、実際化学発光に変化が見られなか
った。アクリジニウムカルボン酸フェニルでは、室温で
の20時間後には化学発光に有意な減少が認められた。
次いで、試料を45℃のインキュベーターに入れた。試
験期間中は毎日、これらをインキュベーターから取り除
き、室温まで冷やしてPBS緩衝液（pH7.2）90μｌ中に希
釈した部分標本10μｌを化学発光に関して試験した。
Ｎ−スルホニルアクリジニウムカルボキサミドはいず
れも、0.05N塩酸又はPBS（pH7.2）のいずれかで希釈し
た場合も、化学発光出力に関しては有意な差が認められ
なかった。しかし、アクリジニウムカルボキシレート13
514-020は、0.05N塩酸又はPBS（pH7.2）のいずれかで希
釈した時には有意な差が認められた。PBS緩衝液（pH7.
2）で希釈した時は、アクリジニウムカルボキシレート
は常に0.05N塩酸に希釈した時よりも少なくとも10倍少
ないカウント数を示した。
10,N−ビス−（３−スルホプロピル）アクリジニウム
カルボキサミド（化合物83、30253-020）は、pH7.2、45
℃に於いては極めて安定なようである。このような条件
下で10日経過した後では、化学発光には認知できる減少
が認められなかった。化合物13513-211は、これよりも1
0倍少ないカウント数を示し、アクリジニウムカルボキ
シレート13514-020は、同条件で103倍少ないカウント数
を示した。
実施例14 標識化IgGの調製． ジスルホプロピル化合物83（30253-020）を、アセト
ニトリル中、アルゴン雰囲気下45℃で12時間、オキシ塩
化リンと処理することによって活性化させた。溶媒およ
び過剰のPOCl3を、減圧下で除去し、得られた活性化化
合物を直接、標識化反応に使用した。
即ち、家兎IgG［シグマ・ケミカル・カンパニー］10m
gを、１％Tween80Rを含有させた0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（2ml、pH7.0）に溶解した。この溶液1mlをビス
−スルホニルクロリド約2mgと混合した。得られた溶液
を音波処理によって周期的にかきまぜ、１時間室温にて
攪拌した。
この反応溶液の部分標本（0.5ml）をセファデックスR
G‐25（10cm×0.75cm）のクロマトグラフィー［ファル
マシア（Pharmacia）、ピスカッタウェイ、ニュージャ
ージー］にかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出し
た。
標識化タンパク質は、弱い緑色の蛍光帯として溶出さ
れた。更に、得られた標識化タンパク質を、バイオーシ
ルR（Bio-SilR）TSK-250カラム［バイオラド］を用いた
HPLCにかけた。得られたコンジュゲート体（30253-34）
に関して370nm（ε10,000、アクリジニウム塩）と280
nm（ε210,000、IgG）との吸光度の比をとり、このコ
ンジュゲート体には0.8標識物／タンパク質が含有され
ていることが分かった。
実施例15 熱安定性試験 実施例14で調製したコンジュゲート体30253-34を、無
菌的に３つの緩衝液［0.1Mリン酸ナトリウム、0.01％Tw
een20R（pH6.3）;0.01Mリン酸ナトリウム、0.15M NaC
l、0.01％Tween20R（pH6.8）；および0.01Mリン酸ナト
リウム、0.15M NaCl、0.01％Tween20R（pH7.2）］に10
倍希釈し、IgG濃度２×10-9Mおよびアクリジニウム濃度
1.6×10-9Mにした。pH6.3、pH6.8又はpH7.2のPBS緩衝液
90μｌで希釈して希釈系列を準備し、次いで0.25N NaOH
中0.03％H2O2200μｌを用いて化学発光を誘発させ、試
料10μｌを取り、初期カウントを記録した。PBS緩衝液1
00μｌを各系列の対照として使用した。
第７表に示しているカウント数は、希釈系列を調製し
た日に測定した２つの複製試料に於ける結果の平均値で
ある。第７表に示した濃度は、希釈前の試料の濃度であ
る。第７表の各見出し語の括弧内に示した量は試料中に
存在するコンジュゲート体の量である。
初期カウントの読み取りを行った後、各希釈系列を45
℃、温空気インキュベーターに入れた。各試料について
毎日読み取りを２回行い、その値の平均をとった。
コンジュゲート体をpH6.8、温度45℃で保存した時、1
5日間に渡る観察ではどの希釈度にも標識物の化学発光
活性に減少は認められなかった。コンジュゲート体をPB
S緩衝液中、pH7.2で保存した場合は、本質的に同じ結果
が得られた。
実施例16 CLIAとRIAとの比較． A.アクリジニウム標識化抗−HBsAgコンジュゲート体． 化合物75（13514-081、実施例６）12.5μmolをDMF200
μｌに溶解してNHS（DMF50μｌに溶解）およびジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（DMF50μｌに溶解）で処理
し、室温にて12時間攪拌した。この活性化エステル溶液
を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.3）中、マウス
・モノクローナル抗−HBsAgとモル比100:1で４℃にて12
時間混合した。
次いで、得られたコンジュゲート体をPBS緩衝液（pH
6.3）を用いた透析にかけ、これを透析液の吸光度が遊
離の標識物の存在を示さなくなるまで行った。UVスペク
トル分析により２から６標識物／抗体（実施例14に記載
した吸光度の比により測定）であることが確認された。
B.HBsAgの検定 Ad型又はAy型HBsAg（200μｌ）を、牛胎仔血清にて希
釈し、これを、50％牛胎仔血清、10％ヒト血清、0.05％
Tween20Rおよび5mM EDTAを含有したPBS（pH6.3）中、ア
ウスザイムTM（AuszymeTM）［アボット・ラボラトリー
ズ］モノクローナル抗体ビーズ並びに２×105カウント
の125I−標識化マウス・モノクローナル抗−HBsAg抗体
（40μｌ）［RIAの場合］又はアクリジニウム標識化マ
ウス・モノクローナル抗−HBsAg抗体（40μｌ）［CLIA
の場合］と40℃にて３時間反応させた。次いで、ビーズ
を水で６回洗浄し、これらの活性をカウントした。ネガ
ティブ対照（コントロール）には牛胎仔血清を使用し
た。
CLIAでは、吸着して結合したコンジュゲート体を有す
るポリスチレンを、ルミノメーターに好適に使用される
ガラス製バイアル中で、0.5mMリン酸（pH5.3）250μｌ
と混合した。試料を測定する位置に置き、次いで0.25N
NaOH中0.03％H2O20.2mlをガラス製バイアルに注入し
た。放出された光りを、ルミノメーターで測定した。読
み取りは、化学反応の開始前0.012秒に始め、これを６
秒間続けた。
これらの結果を第８表に示す。
記述した条件下では、CLIAに対する感度はAd型および
Ay型HBsAgの両方とも0.125ng/ml以下であった。RIAに関
しては、Ad型およびAy型の両方とも1.0ng/mlであった。
標識物切断のカウントはネガティブコントコールの2.1
倍であった。
第８表により、本発明に係る化学発光免疫検定は、比
較し得るラジオイムノアッセイよりも感度が良好である
ことが分かる。
実施例17 CLIAとEIAとの比較． A.標識化抗−hTSH（30234-207）の調製． アセトニトリル200ml中、化合物75（13514-081、実施
例６）2mg（4.3μmol）を、アセトニトリル100μｌ中１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カル
ボジイミド塩酸塩（シグマ）10μmolと、25℃暗所にて1
2時間処理した。
得られた活性エステルを、0.5％３−［（３−コール
アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン
−スルホネート（CHAPS）を含有したPBS緩衝液（pH6.
5）中、抗−hTSHと混合した［抗体と活性エステルの比
率50:1］。25℃に於ける３時間のカップリング反応の
後、標識化抗体を透析に付した。即ち、透析液に遊離の
標識物が存在しないことがUVによって確認されるまで、
0.5％CHAPSを含有したPBS緩衝液（pH6.5）を用いた透析
を行った。
UVスペクトルによれば、コンジュゲート体は抗体一つ
当たり10個の標識物を有していた。
B.hTSHの分析 アボットhTSH-EIAキット（アボット・ラボラトリー
ズ）を用い（但し、CLIAに関してはキット抗−hTSH-HRP
Oコンジュゲート体の代わりに抗−hTSHアクリジニウム
コンジュゲート体を使用して）,CLIAおよびEIAの比較を
行った。即ち、キット標準品をキットビーズと共に37℃
で１時間インキュベートした後、３回洗浄することによ
って、標準曲線を描いた。CLIAに関しては、前記のよう
に製造したコンジュゲート体を、牛胎仔血清50％、正常
マウス血清１％、TweenR20 0.05％および2mM EDTAを含
有したPBS緩衝液（pH6.3）を用いて希釈した。この溶液
100μｌを、前記のビーズと共に37℃にて１時間インキ
ュベートし、次いで４回洗浄した。
得られたビースを一個づつルミノメーターの反応バイ
アル（水400μｌを含有）に移し、0.2N NaOH中0.03％H2
O2 200μｌと反応させた。
EIAは、クオンタムIIR（Quantum IIR）スペクトル光
度計（アボット・ラボラトリーズ）のキット説明書に従
い行った。
これらの結果を第９表に示す。
これらの条件下ではCLIAの感度は0.016μIU/ml（標準
０＋2SD）であり、EIAでは感度0.05μIU/mlであった。
実施例18 ５−メチル−６−［Ｎ−トシル−Ｎ−（２−
カルボキシエチル）］フェナントリジニウムカルボキサ
ミドの製造． フェナントリジン−６−カルボン酸（400mg、1.8mmo
l）［ウィテック（Wittig）らのジャスタス・リービッ
クス・アナルス（Justus Liebig's Ann.）、577、１（1
952）の方法に従って製造］を、塩化メチレン（20ml、P
2O2から蒸留）に懸濁させ、窒素雰囲気下０℃に冷却さ
せた。塩化オキサリル（320μｌ、3.6mmol）［アルドリ
ッチ・ケミカルCo.］を加えた後、DMF（５μｌ）を加え
た。反応混合物を０℃にて１時間、更に25℃にて30分間
攪拌して全てのカルボン酸を溶解させた。得られた溶液
を蒸発乾固して酸クロリドを得、これを、精製操作を加
えずに使用した。
メチル−β−アラニン（アルドリッチ・ケミカルC
o.）、およびトシル・クロリドから、実施例１の手順に
従い、メチル・Ｎ−トシル−β−アラニンを製造した。
カリウム・ｔ−ブトキシド（600mg、5.4mmol、新たに分
取）を、メチル・Ｎ−トシル−β−アラニン1.3g（5.4m
mol）のTHF50ml溶液に加えた。窒素雰囲気下、室温にて
15分間攪拌した後、懸濁液を蒸発乾固させた。メチル・
Ｎ−トシル−β−アラニンのカリウム塩を、THF20mlに
再び懸濁させ、前記の酸クロリド（THF20ml中）と混合
し、12時間攪拌した。
得られた懸濁液を、酢酸エチル100mlに注加し、水50m
lを用いて洗浄し、更に塩水25mlで２回洗浄した。MgSO4
で乾燥し、蒸発乾固した後、得られた残留物をクロマト
グラフィーにかけた［クロマタトロンTMクロマトグラフ
ィー（ハリソン・リサーチより入手）、4mmシリカ・ロ
ーターを使用し、25/75酢酸エチル／ヘキサンの傾斜溶
離剤で溶出］。生成物（Rf値0.2）を捕集し、次いでベ
ンゼン／ヘキサンから再結晶させ［即ち、生成物をベン
ゼンに溶解し、白濁化するまでヘキサンを加えた］、メ
チル・６−［Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチ
ル）］フェナントリジニウムカルボキサミド、化合物84
（13514-225）130mgを得た。
実施例３の方法に従い、得られた化合物84（13514-22
5）をメチル化し、メチル・５−メチル−６−［Ｎ−ト
シル−Ｎ−（２−カルボキシエチル）］−フェナントリ
ジニウムカルボキサミド、化合物85、13514-227を得
た。化合物85を、実施例８に記載の手順に従い加水分解
して５−メチル−６−［Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボ
キシエチル）］フェナントリジニウムカルボキサミド、
化合物86（13514-228）を得た。
化合物84、85および86を、実施例１で説明した数字、
記号および略語を用いて記載する。
84.13514-225 メチル・６−［Ｎ−トシル−Ｎ− （２−カルボキシエチル）］フェナ ントリジンカルボキサミド MS M＋Ｈ＠463 85.13514-227 メチル・５−メチル−６−［Ｎ− トシル−Ｎ−（２−カルボキシエ チル）］フェナントリジニウムカ ルボキサミド MS M+＠477 Mp 136℃ 86.13514-228 ５−メチル−６−［トシル− Ｎ−（２−カルボキシエチル）］フェ ナントリジニウムカルボキサミ ド MS M+＠463 上述のように好ましい態様に関して本発明を説明して
きたが、当業者ならばこれらの変形および改良も存在し
得ることを理解できるであろう。
例えば、本明細書に示した結果に照らせば、本発明に
有用な付加的な化合物として、一般式： ［式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、a1、b1、c1、d1はそれぞれ
水素、アルキル、アリール、アミノ、置換アミノ、カル
ボキシ−アルキル、スルホアルキル、アルコキシ、アリ
ールオキシ、スルホ、チオアルコキシ、チオアリールオ
キシ、アミノアルキル、保護アミノアルキル、ヒドロキ
シアルキル、保護ヒドロキシアルキル、ハロアルキルで
あってよく、又はこれらは、隣接しているあらゆる位置
と結合してアクリジン骨格に接合した芳香環を形成して
もよい］で示され得る化合物を予想することができる。
更に、シェーハン（Sheehan）らの米国特許第3,539,5
74号には、本発明にも有用であると思われる化学発光ア
クリジニウム化合物が開示されている。他の異性体であ
るアクリジンカルボン酸類、キノリンカルボン酸類、イ
ソキノリンカルボン酸類、他の活性化アクリジンアミド
類、および他の活性化アクリジンエスエル類も本発明に
有用であると期待できる。前記の化合物群には以下に示
している化合物群が挙げられるが、これらに限定される
ものではない： 一般式： で示されるヒドロキサメート類、一般式： で示されるエナミド類、一般式： （式中、ＸおよびY1は電子求引基である） で示されるアリールアミド類、一般式： （式中、ＸおよびY1はそれぞれＯ、Ｓ、Ｐ、ＮまたはＣ
であり得る） で示されるＮ−ヘテロ環、一般式： で示されるチオールエステル類若しくは一般式： で示されるチオエステル類などの活性エステル類、一般
式： 若しくは一般式： で示されるアクリジン酸類、一般式： 若しくは一般式： で示されるキノリン酸類、又は一般式： 若しくは一般式： で示されるイソキノリン酸類。
当業者ならば、前記の具体例によって、本発明に係る
化合物に、標識物を分析対象物に結合させるための反応
官能基を導入できることが理解できるであろう。
また、本発明に係る化合物が、DNAプローブを標識す
るのに使用でき、更にこれを、酵素反応の生成物が化学
発光性化合物である酵素基質に組み込ませることがで
き、更にエネルギー転移若しくは蛍光消滅に関連するシ
ステムに組み込ませることができることも理解できるで
あろう。
その上、本発明に係る化合物は、柱状カラムHPLCの検
出システムに於ける標識試薬として該化合物を使用する
システムに組み込ませることができ、細胞内のH2O2濃度
を定量するなどの他の分析システムに於いて、H2O2を測
定するために使用でき、更に強力なパルス光の供給源と
して使用することもできる。
従って、本発明は、上記の変形型および改良型が特許
請求されている本発明の範囲内ならば全て包含するもの
である。
【図面の簡単な説明】
図は、本発明に係る10−アルキル−Ｎ−スルホニル−９
−アクリジニウムカルボキサミドの合成経路を示してい
る反応式である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/00 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 21/76 33/52 Ｚ 33/532 Ｂ

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式 又は ［式中、Ｒ、Ｒ′およびＲ″はそれぞれアルキレン、ア
    リール、置換アルキレンおよび置換アリール基からなる
    群の中から選ばれる基であって、これらの基に於けるひ
    とつ若しくはそれ以上の水素原子が、アルキル、アリー
    ル、置換アルキル、置換アリール、アルコキシ、アリー
    ルオキシ、ハロゲン、アミノ、保護アミノ、置換アミ
    ノ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、オキソ、チオ、イミ
    ノ、ニトロ、メルカプト又は置換メルカプト基によって
    置換されていてもよく、又はこれらの基に於けるひとつ
    若しくはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子によって置換
    されており； X1、X2およびX3はそれぞれ水素、カルボキシ、カルボア
    ルコキシ、カルボキサミド、カルボアリールオキシ、シ
    アノ、カルボキシイミド、イソシアネート、イソチオシ
    アネート、スルホ、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化
    カルボニル、Ｎ−スクシンイミジルカルボキシおよびＮ
    −マレインイミド基の中から選ばれる基であり；又は Ｒ′−X2およびＲ−X3は、一方がフェニル、イソプロピ
    ル、ｎ−ブチル又はベンジル５−カルボキシペンチルか
    ら選ばれるときは他方はニトロベンゼンであってよく、
    又は一方がｎ−ブチル又はフェニルから選ばれるときは
    他方はジニトロベンゼンであってよい； Y-は適当な反対イオンであり； また、Ｒ−X3、Ｒ′−X2およびＲ″−X1はそれぞれ水素
    であってもよい。但し、Ｒ′−X2およびＲ−X3のいずれ
    か一方において、X2又はX3がカルボペンタクロロフェノ
    キシ、カルボ−ｐ−ニトロフェノキシ、カルボキシイミ
    ド、イソチオシアネート、Ｎ−マレインイミドおよびＮ
    −スクシンイミジルカルボキシから選ばれた基であり、
    かつＲ′−X2およびＲ−X3の他方が水素、アルキル、ア
    リール、ベンジル又は置換アリール又は置換ベンジル
    （置換基はアルコキシ、アリールオキシ、アミノ又はヒ
    ドロキシ）であるときは、X1は水素ではなく、またＲ″
    −X1も水素ではない］で示される化合物および10−メチ
    ル−Ｎ−アリル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−９−ア
    クリジニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンス
    ルホネートから選ばれる化学発光性化合物。
  2. 【請求項２】Y-がスルフェート、アルキルスルフェー
    ト、ハロスルフェート、ハロボレート、ハロアセテー
    ト、ハロホスフェート、ホスフェート、ハライドおよび
    トリフルオロメタンスルホネートからなる群の中から選
    ばれる反対イオンである特許請求の範囲第１項に記載の
    化学発光性化合物。
  3. 【請求項３】該ヘテロ原子が窒素、リン、硫黄および酸
    素からなる群の中から選ばれる特許請求の範囲第１項に
    記載の化学発光性化合物。
  4. 【請求項４】Ｒ、Ｒ′およびＲ″が、それぞれ式： −(CH2)ｎ− （式中、ｎは０〜50である） で示される介在鎖である特許請求の範囲第１項に記載の
    化学発光性化合物。
  5. 【請求項５】Ｒ″が−CH2−であり、X1が−Ｈであり、
    Ｒ′−X2が式： で示される基である特許請求の範囲第１項に記載の化学
    発光性化合物。
  6. 【請求項６】該化合物が10−メチル−Ｎ−（２−カルボ
    キシエチル）−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・カル
    ボキサミドである特許請求の範囲第５項に記載の化学発
    光性化合物。
  7. 【請求項７】該化合物が10−メチル−Ｎ−（４−カルボ
    キシブチル）−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・カル
    ボキサミドである特許請求の範囲第５項に記載の化学発
    光性化合物。
  8. 【請求項８】該化合物が10−メチル−Ｎ−（５−カルボ
    キシペンチル）−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・カ
    ルボキサミドである特許請求の範囲第５項に記載の化学
    発光性化合物。
  9. 【請求項９】Ｒ″が−(CH2)3−であり、X1が−SO3−で
    あり、Ｒ′−X2が式： で示される基である特許請求の範囲第１項に記載の化学
    発光性化合物。
  10. 【請求項１０】該化合物が10−（３−スルホプロピル）
    −Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−トシル−９−ア
    クリジニウム・カルボキサミドである特許請求の範囲第
    ９項に記載の化学発光性化合物。
  11. 【請求項１１】該化合物が10−（３−スルホプロピル）
    −Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル−９−アク
    リジニウム・カルボキサミドである特許請求の範囲第９
    項に記載の化学発光性化合物。
  12. 【請求項１２】Ｒ′−X2が式： で示される基であり、Ｒ−X3が式： で示される基である特許請求の範囲第１項に記載の化学
    発光性化合物。
  13. 【請求項１３】該化合物が10−メチル−Ｎ−フェニル−
    Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・カルボキサミド・ト
    リフルオロメタンスルホネート、10−メチル−Ｎ−フェ
    ニル−Ｎ−（ｐ−ブロモベンゼンスルホニル）−９−ア
    クリジニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンス
    ルホネート、10−メチル−Ｎ−フェニル−Ｎ−（ｐ−ニ
    トロベンゼンスルホニル）−９−アクリジニウム・カル
    ボキサミド・トリフルオロメタンスルホネート、10−メ
    チル−Ｎ−フェニル−Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホ
    ニル）−９−アクリジニウム・カルボキサミド・トリフ
    ルオロメタンスルホネート、および10−メチル−Ｎ−フ
    ェニル−Ｎ−トリフルオロメタンスルホニル−９−アク
    リジニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンスル
    ホネートから選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の化
    学発光性化合物。
  14. 【請求項１４】該化合物が10−メチル−Ｎ−イソプロピ
    ル−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・カルボキサミド
    ・トリフルオロメタンスルホネート、10−メチル−Ｎ−
    イソプロピル−Ｎ−（ｐ−ブロモベンゼンスルホニル）
    −９−アクリジニウム・カルボキサミド・トリフルオロ
    メタンスルホネート、10−メチル−Ｎ−イソプロピル−
    Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）−９−アクリジ
    ニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネ
    ート、および10−メチル−Ｎ−イソプロピル−Ｎ−トリ
    フルオロメタンスルホニル−９−アクリジニウム・カル
    ボキサミド・トリフルオロメタンスルホネートから選ば
    れる特許請求の範囲第１項に記載の化学発光性化合物。
  15. 【請求項１５】該化合物が10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ
    −（2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニル）−９−ア
    クリジニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンス
    ルホネート、10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ−（2,4,6−
    トリ−イソプロピル−ベンゼンスルホニル）−９−アク
    リジニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンスル
    ホネート、10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ−トシル−９−
    アクリジニウム・カルボキサミド・トリフルオロメタン
    スルホネート、10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ−（ｐ−ブ
    ロモベンゼンスルホニル）−９−アクリジニウム・カル
    ボキサミド・トリフルオロメタンスルホネート、10−メ
    チル−Ｎ−ブチル−Ｎ−（ｏ−ニトロフェニルスルホニ
    ル）−９−アクリジニウム・カルボキサミド・トリフル
    オロメタンスルホネート、10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ
    −（ｐ−ニトロベンゼンスルホニル）−９−アクリジニ
    ウム・カルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネー
    ト、10−メチル−Ｎ−ブチル−Ｎ−（2,4−ジニトロベ
    ンゼンスルホニル）−９−アクリジニウム・カルボキサ
    ミド・トリフルオロメタンスルホネート、および10−メ
    チル−Ｎ−アリル−Ｎ−トシル−９−アクリジニウム・
    カルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネートから
    選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の化学発光性化合
    物。
  16. 【請求項１６】該化合物がメチル・６−［Ｎ−トシル−
    Ｎ−（２−カルボキシエチル）］フェナントリジンカル
    ボキサミド、メチル・５−メチル−６−［Ｎ−トシル−
    Ｎ−（２−カルボキシエチル）］フェナントリジニウム
    カルボキサミド、および５−メチル−６−［Ｎ−トシル
    −Ｎ−（２−カルボキシエチル）］フェナントリジニウ
    ムカルボキサミドから選ばれる特許請求の範囲第１項に
    記載の化学発光性化合物。
  17. 【請求項１７】式： X3−RNH2 で示されるアミンを、不活性溶媒中、塩基の存在下に
    式： Ｗ−SO2−Ｒ′−X2 で示されるハロゲン化スルホニルと接触させて式： X3RNHSO2Ｒ′X2 で示されるスルホンアミドを生成させ、該スルホンアミ
    ドを不活性溶媒中、塩基と接触させて、 式： M+ X3−Ｒ−N-−SO2−Ｒ′−X2 で示されるスルホンアミド・アニオンおよび金属イオン
    を形成させ、次いで得られた化合物を、 ａ）一般式： ［式中、Ｒ、Ｒ′およびＲ″はそれぞれアルキレン、ア
    リール、置換アルキレンおよび置換アリール基からなる
    群の中から選ばれる基であって、これらの基に於けるひ
    とつ若しくはそれ以上の水素原子が、アルキル、アリー
    ル、置換アルキル、置換アリール、アルコキシ、アリー
    ルオキシ、ハロゲン、アミノ、保護アミノ、置換アミ
    ノ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、オキソ、チオ、イミ
    ノ、ニトロ、メルカプト又は置換メルカプト基によって
    置換されているか、又はこれらの基に於けるひとつ若し
    くはそれ以上の炭素原子が窒素、リン、硫黄および酸素
    から選ばれるヘテロ原子によって置換されているもので
    あるが、但し、Ｒ−X3、Ｒ′−X2およびＲ″−X1はそれ
    ぞれ水素であってもよく； X1、X2およびX3はそれぞれ水素、カルボキシ、カルボア
    ルコキシ、カルボキサミド、カルボアリールオキシ、シ
    アノ、カルボキシイミド、イソシアネート、イソチオシ
    アネート、スルホ、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化
    カルボニル、Ｎ−スクシンイミジルカルボキシおよびＮ
    −マレインイミド基の中から選ばれる基であり；又は Ｒ′−X2およびＲ−X3は、一方がフェニル、イソプロピ
    ル、ｎ−ブチル又はベンジル５−カルボキシペンチルか
    ら選ばれるときは他方はニトロベンゼンであってよく、
    又は一方がｎ−ブチル又はフェニルから選ばれるときは
    他方はジニトロベンゼンであってよい； 但し、Ｒ′−X2およびＲ−X3のいずれか一方において、
    X2又はX3がカルボペンタクロロフェノキシ、カルボ−ｐ
    −ニトロフェノキシ、カルボキシイミド、イソチオシア
    ネート、Ｎ−マレインイミドおよびＮ−スクシンイミジ
    ルカルボキシから選ばれた基であり、かつＲ′−X2およ
    びＲ−X3の他方が水素、アルキル、アリール、ベンジル
    又は置換アリール又は置換ベンジル（置換基はアルコキ
    シ、アリールオキシ、アミノ又はヒドロキシ）であると
    きは、X1は水素ではなく、またＲ″−X1も水素ではな
    い； Y-は適当な反対イオンであり； Ｗはクロロおよびフルオロから選ばれるものであり； ＭはLi、NaおよびＫよりなる群から選ばれるものであ
    り； Ｚはハロゲン、イミダゾロ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
    ミジルおよびアジド基よりなる群から選ばれるものであ
    る］ で示される活性９−アクリジンカルボン酸を用いてアシ
    ル化して式： で示される化学発光化合物又は10−メチル−Ｎ−アリル
    −Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−９−アクリジニウム・
    カルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネートを得
    る工程、又は ｂ）一般式： ［式中、Ｒ、Ｒ′、Ｒ″、X1、X2、X3、Ｙ、Ｗ、Ｍおよ
    びＺは前記と同じ］ で示される活性フェナントリジン−６−カルボン酸を用
    いてアシル化して式： で示される化学発光化合物を得る工程 を特徴とする化学発光性化合物の製造方法。
  18. 【請求項１８】式： X3−RNH2 で示されるアミンを、不活性溶媒中、塩基の存在下に
    式： Ｗ−SO2−Ｒ′−X2 で示されるハロゲン化スルホニルと接触させて式： X3RNHSO2Ｒ′X2 で示されるスルホンアミドを生成させ、該スルホンアミ
    ドを不活性溶媒中、塩基と接触させて、 式： M+ X3−Ｒ−N-−SO2−Ｒ′−X2 で示されるスルホンアミド・アニオンおよび金属イオン
    を形成させ、次いで得られた化合物を、 ａ）一般式： ［式中、Ｒ、Ｒ′およびＲ″はそれぞれアルキレン、ア
    リール、置換アルキレンおよび置換アリール基からなる
    群の中から選ばれる基であって、これらの基に於けるひ
    とつ若しくはそれ以上の水素原子が、アルキル、アリー
    ル、置換アルキル、置換アリール、アルコキシ、アリー
    ルオキシ、ハロゲン、アミノ、保護アミノ、置換アミ
    ノ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、オキソ、チオ、イミ
    ノ、ニトロ、メルカプト又は置換メルカプト基によって
    置換されているか、又はこれらの基に於けるひとつ若し
    くはそれ以上の炭素原子がヘテロ原子によって置換され
    ており； X1、X2およびX3はそれぞれ水素、カルボキシ、カルボア
    ルコキシ、カルボキサミド、カルボアリールオキシ、シ
    アノ、カルボキシイミド、イソシアネート、イソチオシ
    アネート、スルホ、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化
    カルボニル、Ｎ−スクシンイミジルカルボキシおよびＮ
    −マレインイミド基の中から選ばれる基であり；又は Ｒ′−X2およびＲ−X3は、一方がフェニル、イソプロピ
    ル、ｎ−ブチル又はベンジル５−カルボキシペンチルか
    ら選ばれるときは他方はニトロベンゼンであってよく、
    又は一方がｎ−ブチル又はフェニルから選ばれるときは
    他方はジニトロベンゼンであってよい； また、Ｒ−X3、Ｒ′−X2およびＲ″−X1はそれぞれ水素
    であってもよい。 但し、Ｒ′−X2およびＲ−X3のいずれか一方において、
    X2又はX3がカルボペンタクロロフェノキシ、カルボ−ｐ
    −ニトロフェノキシ、カルボキシイミド、イソチオシア
    ネート、Ｎ−マレインイミドおよびＮ−スクシンイミジ
    ルカルボキシから選ばれた基であり、かつＲ′−X2およ
    びＲ−X3の他方が水素、アルキル、アリール、ベンジル
    又は置換アリール又は置換ベンジル（置換基はアルコキ
    シ、アリールオキシ、アミノ又はヒドロキシ）であると
    きは、X1は水素ではなく、またＲ″−X1も水素ではな
    い； Y-は適当な反対イオンであり； Ｗはクロロおよびフルオロから選ばれるものであり； ＭはLi、NaおよびＫよりなる群から選ばれるものであ
    り； Ｚはハロゲン、イミダゾロ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
    ミジルおよび アジド基よりなる群から選ばれるものである］ で示される活性９−アクリジンカルボン酸を用いてアシ
    ル化して式： で示される化合物を生成させ、ついで該化合物を式： Ｙ−Ｒ″−X1 で示されるアルキル化剤と接触させて式： で示される化学発光化合物又は10−メチル−Ｎ−アリル
    −Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−９−アクリジニウム・
    カルボキサミド・トリフルオロメタンスルホネートを得
    る工程、又は ｂ）一般式： ［式中、Ｒ、Ｒ′、Ｒ″、X1、X2、X3、Ｙ、Ｗ、Ｍおよ
    びＺは前記と同じ］ で示される活性フェナントリジン−６−カルボン酸を用
    いてアシル化して式： で示される化合物を生成させ、ついで該化合物を式： Ｙ−Ｒ″−X1 で示されるアルキル化剤と接触させて式： で示される化学発光性化合物を得る工程 を特徴とする化学発光性化合物の製造方法。
  19. 【請求項１９】該ヘテロ原子が窒素、リン、硫黄および
    酸素からなる群の中から選ばれる特許請求の範囲第17項
    又は第18項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】特許請求の範囲第１項に記載の化学発光
    性化合物にコンジュゲートされた抗体又は抗原によって
    形成されるコンジュゲート体。
  21. 【請求項２１】特許請求の範囲第１項に記載の化学発光
    性化合物にコンジュゲートされた核酸プローブによって
    形成されるコンジュゲート体。
  22. 【請求項２２】試料を特許請求の範囲第20項に記載のコ
    ンジュゲート体に暴露させる工程を特徴とする、特許請
    求の範囲第20項に記載の抗原又は抗原に対する抗体の存
    在を試験するための化学発光免疫検定を行うための方
    法。
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