JPS6124520A - 腫瘍壊死因子様物質を抽出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は腫瘍壊死因子様物質（従来のＴＮＦ及びＴＮ
Ｆと同等な効果を示すものを含む、ＴＮＦと同等の効果
とは生体及び試験管内を問わず腫瘍細胞に対しては傷害
効果を示し、正常細胞に対してはそのような効果を示き
ないことをいう；以下ＴＮＦと総称する）を容易かつ大
量に抽出する方法に関するものである。

従来技術 従来、・各種ダラム陽性菌やエンドトキシンにより誘発
され、殺腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存
在は多数報告きれている。例えば、Ｃａｒｒｌｅ氏らは
、正常ラットの腹腔浸出液からの細胞にエンドトキシン
を投与することにより、各種腫瘍細胞増殖を抑制する因
子が誘発されることを見出しくＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１
４２巻１６００〜１６０５頁（１９７５年）〕、その後
該因子を単離精製することによって、その因子の本体が
既知のアルギナーゼであることをつきとめ報告した［Ｎ
ａｔ　ｕｒ　ｅ（Ｌｏｎ−ｄｏｎ）２７３巻７５８〜７
５９頁（１９７８年）〕。またＲｅｅｄ氏らは、エンド
トキシン処理をすることによって正常ラットと人間の培
養細胞又は培養単核細胞上清から、Ｌｃｅｌｌ等の培養
腫瘍細胞を殺す能力を持つ分子量４５．０００の蛋白質
を見出している（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１５巻３９５
〜４０４頁（１９７５年）〕。さらにＣａ　ｒ　ｓｗｅ
ｌｆ氏らは、あらかじめｂａｃｉｌｌｕ’ｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）を投与したＣＤ−
ｌ５ｗ１ｓｓマウスに再び２週間後にエンドトキシンを
静脈内注射して得られる該マウスの血清が、培養Ｌｃｅ
ｌｌに対して殺細胞能を有すること及びＭｅｔｈ　　Ａ
　　ｓａｒｃｏｍａで担癌させた（Ｔ３ａｌｂ／ｃＸｃ
５７ＢＬ／６）Ｆ、マウスの腫瘍を出血性壊死に至らし
める現象を見出し、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎｅｃｒｏ
ｓｉｓ　　Ｆａｃｔｏｒ）と名ずけた（Ｐｒｏｅ、Ｎａ
ｔ　、Ａｃａｄ、Ｓｅ１．ＵＳＡ７２巻（Ｎｏ、９）３
６６６〜３６７０頁（１９７５年）〕。

発明が解決しようとする問題点 このように従来の、Ｃａｒｓｗｅｌ　１氏らによるＴＮ
Ｆを得る方法にあっては、ＴＮＦは、生体（例えば実験
動物、マウス、ウサギ等）にＢＣＧ（ｂａｃｉ　１１ｕ
ｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）を接散し１４日
後に菌体内毒素であるＬＰＳ（１ｉ　ｐｏｐｏ　１ｙｓ
ａｃｃｈａｒ　ｉ　ｄｅＷ　　ｆｒｏｍ　　Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）を静脈注射して２時間後に
全採血し、得られた血清中に含まれたかたちで抽出きれ
ていたため、問題点として、ＴＮＦを大量に得るには何
匹もの動物が必要で、そのため−匹一匹から得られるＴ
ＮＦの含有率が不均一であった。しかも血清中に存在す
るため他の蛋白（例えばアルブミン、グロブリン等）が
多く、精製するには非常に複雑な過程と時間を要し、き
らに最終的に得られるＴＮＦは決して多くはない等の欠
点があった。またＴＮＦ度生創生細胞クロファージと考
えられたことより国際公開番号ＷＯ８４１０１２８Ｂテ
示された方法が本発明の発明者により呈示されたが、実
際に得られるＴＮＦ量は少な〈産業上の利用性に欠けた
ものであった。

問題を解決するための手段 この発明は、従来の生体を使用してＴＮＦを得る方法、
妨らにマクロファージ（以下Ｍφと略す）を材料として
得る方法よりも、容易にしかも大量で有効なＴＮＦを得
る方法を提供せんことを一目的とし、その要旨は、線維
芽様細胞（Ｆｉ　ｂｒｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ　　ｃｅ
ｌｌｇ）、上皮様細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−１ｉｋ
ｅ　　ｅｅｌ１６）、リンパ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏ
ｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ　　ｃｅｌｌｇ）のうち少なくと
も１つ以上の細胞を培養増殖させ、これを自然にあるい
は人為的に死滅又は破壊することによって前記細胞より
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を抽出することである。

作用効果 すなわち、発明者はＭφからＴＮＦを得る方法（国際公
開番号ＷＯ３４１０１２８８）を施行中、陰性コントロ
ールとして使用した培養系線維芽様細胞等（例えばＩ、
９２９）にＭφよりはるかに高いＴＮＦが含まれている
ことを見出した。そしてこれらの細胞を培養し人為的に
死滅又は破壊することによって、前記線維芽様細胞等に
含まれているＴＮＦが上清液中に抽出されることを見出
したものである。

例えば実例をあげると、Ｍφ株（例えばＣＡＭＵ−３）
と線維芽細胞株（Ｌ９２９）を同条件で破壊して得た培
養液を腫瘍細胞株（例えばＭｅａｔｈＡ）に加え４８時
間培養後、その傷害効果（殺生効果と増殖抑制効果を含
む効果）［（（培養液だけの生細胞数）−（ＴＮＦを含
む培養液での生細胞数））／（培養液だけの生細胞数）
コＸ１００ を比較すると、前者はわずか８．８％しかなく後者はそ
の１０倍近い８３，７％と高い傷害効果を示した。さら
に上皮様細胞株（例えばＣＡＭＵ−ａ　−Ａ　ｔ　）で
は９６．９％と同様に高い効果であった。しかもこのよ
うな傷害効果を示す培養液を正常細胞に加えても傷害作
用は見られなかった。このことより細胞破壊中にＴＮＦ
の存在が確認された。　　したがって、との方法はＭφ
を使用する方法では産業上利用しうるほど有効なＴＮＦ
がえられなかったことに対して１０倍以上のＴＮＦが得
られ、しかもＭφ株を得ることは困難とされているのに
対し、線維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞は
生体から容易に培養可能な細胞であり、一般にも多くの
細胞株が市販されていることから入手も容易である。さ
らに増殖能力もＭφに比べ非常に強く短時間で大量の細
胞を得ることも可能である。無輪生体を使用゛しないた
め均一なＴＮＦが得られやすく、有害な物質を用いない
ため安全性の高いＴＮＦを生成することが出来る。

ＴＮＦは腫瘍を特異的に破壊することより理想的な癌治
療剤として開発が進められている。この方法（発明）は
、入手が容易で大量培養も可能な線維芽様細胞、上皮様
細胞、リンパ芽球様細胞を使用し、細胞破壊という単純
な生産技術のため速やかにＴＮＦの量産が可能である。

実施例 以下、本発明を具体化した実施例を実験データーととも
に詳細に説明する。

まず第１実施例として、上皮様細胞（本例ではＣＡＭＵ
−３−Ａ、）を使用し、とのＣＡＭＵ−３−Ａ、を培養
シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラス壁に付着
している細胞を剥離分散し採取する。次に、採取したＣ
ＡＭＵ−３−Ａ、に５％の新生児血清液を加えた培養液
（ＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４０．ＫＮ？等）にて３Ｘ１０
’／ｍ、ｌ：に調整して細胞浮遊液とする。これをその
まま５％ＣＯｚ下３７°Ｃ通気培養にて９６時間培養す
る。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ、は培養液中
にて細胞過多となり自然死滅する。これを遠心管に移し
、２０００ｒ、ｐ、ｍ、にて１０分間遠心すると遠心管
の底部には細胞片が、上層部には上清液が得られる。こ
の上清液にはＣＡＭＵ−３−Ａ、より抽出されたＴＮＦ
（正確にはＴＮＦと同等の効果を示す腫瘍壊死囚、子）
が存在するはずであるため、その存在を確認すべく以下
の実験を行なった。

まず実験１として、腫瘍細胞（ＭｅａｔｈＡ。

マウス肉腫細胞）２Ｘ１０″７ｍｌを４Ｘ１０’／ｍｌ
：に５％牛新生児血清加培養液にて調整する。その中へ
上記方法にて得た上清液を等量（５０％）加え５％ＣＯ
８下３７°Ｃ通気培養にて４８時間培養する。培養後、
腫瘍細胞を採取しトリバンプルー染色法（生細胞は染色
されない）にて生細胞数を算出する。傷害効果（以下Ｃ
ＴＡと略す）は下記の計算式にて求めた。

傷害効果（ＣＩＡ）（Ｘ）＝　［（（培養液だけの生細
胞数）−（上清液を加えた生細胞数））／ （培養液だけの生細胞数）］Ｘ１００ その結果は　ＣＴＡ　　９１．８％に達した。

なお、加える上清液の量を０％〜５０％の範囲において
変化させた実験結果を第１表に示す。

第１表によれは、加えた上清液の濃度の濃いものほどＣ
ＴＡも高く、上清液の濃度が濃いほどＴＮＦも多いこと
がわかる。

次に、実験２として、上記上清液に含まれ、上記のよう
なＣＴＡを示すＴＮＦの性質を知る目的で、上清液を熱
処理（５６℃３０分、７０℃６０分、８５°Ｃ１５分）
してみた。その結果得られた第２表によれば、５６℃３
０分ではＣＴＡ７６．３％に対し７０℃６０分、８５℃
１５分では１７．５％、２８．３％とＣＴＡの減少（不
活化）がみられた。

このことより、抽出されたＴＮＦは熱により効力を失う
糖・タンパクの１種と考えられる。

次に、実験３として、Ｅ！、、１に使用したＣＡＭＵ　
　３　　ＡｔのｌＸｌ０’／ｍｊ！〜４Ｘ１０’／ｍｊ
２の各細胞濃度浮遊液を作り９６時間培養（自然死）後
の上清液を腫瘍細胞傷害実験に用いた。その結果得られ
たＣＴＡを第３表に示す。

第３表 Ｅ、、、３細胞数■ 第３表によれば、使用する細胞浮遊液の濃度が濃いほど
ＴＮＦも多いことがわかる。

次に第２実施例として、上皮様細胞（ＣＡＭＵ−３−Ａ
７）を使用し、とのＣＡＭＵ−３−Ａ、を培養シャーレ
よりトリプシンやＥＤＴＡにてガラス壁に付着している
細胞を剥離分散し採取する。

次に、採取したＣＡＭＵ−３−Ａ、に５％の新生児血清
液を加えた培養液（ＭＥＭＳＲＰＭＩ　１６４０、ＫＮ
ｙ等）にて３Ｘ１０’／ｍｊｌ！に調節して細胞浮遊液
とする。

これを硬質アンプル（セラムチューブ、−１９６００に
たえるもの）に入れ、液体チッソ（−１９６°Ｃ）中へ
投入する（急速凍結、約５分間）、次に温水（３７°Ｃ
）へ移す（急速融解、約１０分間）、同操作を３回くり
かえす。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ７は培養
液中にて物理的に破壊きれる。これを遠心管に移し、２
０００ｒ、ｐ、ｍ、にて１０分間遠心すると、遠心管の
底部には細胞片が、上層部には上清液が得られる。この
上清液には第１実施例と同様なＴＮＦが存在するはずで
ある。その存在を確認する意味と、第１実施例との比較
を行う意味において、実験４として、実験１に使用した
ＣＡＭＵ−３−Ａ７の上清液と凍結融解にて得た上清液
を用いてＣＴＡを比較し第４表を得た。

第４表によれば、第１実施例の方法及び第２実施例の方
法とも同程度のＴＮＦが得られたことが確認し得る。な
お、上記　ＣＡＭＵ−３−Ａ、に換えて、線維芽様細胞
（例えばＬ９２９）を使用して第１実施例の方法により
抽出したものとの比較も表中に付記した。このように、
ＣＡＭＵ−３−Ａ、に換えてＬ９２９を使用しても、さ
らに、Ｌ９２９に換えてリンパ芽球様細胞（例えばＲＬ
♂−１）を使用しても同様にＴＮＦが得られる。

ここで、各細胞の一般的性状を説明すると、線維芽様細
胞とは、生体より取り出した組織をトリプシンやＥ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒ
ａａｃｅｔａｔｅ：細胞付着を肪ぐ働きを持つ）で分散
させガラスシャーレ等に培養した場合に、ガラス壁に付
着してｉ鉢形の細胞形態を取るものを言う。（アメリカ
組織培養学会用語委員会にて承認されたもの）次に、上
皮様細胞とは、同条件下においてガラス壁に付着し、多
角形の細胞形態を取るものを言う。

次に、リンパ芽球様細胞とは、同条件下において、ガラ
ス壁に付着せず（一部付管しうる）培養液中に浮遊し球
形の細胞形態を取るものを言う。

上記各細胞はいずれもマクロファージ（大食細胞）が有
する通常の性状（Ｆｃレセプター、ｃ、レセプター等）
や機能（貧食能、腫瘍細胞傷害作用等）を十分に備えて
いないものをいう。また腫瘍ウィルスや発癌物質等によ
って腫瘍原性をもった細胞も含めるものである。

次に実験５として、ＴＮＦの分子量の目安を知る目的で
、各分子量（ＩＸ１０’、３Ｘ１０’、ｔｘｉｏ’　）
以下（７）物質しか通さない特殊な膜を用いて上清液を
検索した。その結果を第５表に示す。

第５表の結果によれば、本実験により得たＴＮＦは分子
量ｌＸｌ０Ｓ以上の因子と思料される。

次に、実験６として、各種細胞を使用して実験を行ない
、各種細胞の比較を行なった。その結果を第６〜第８表
に示す。

第６表 第６〜第８表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−１（９６
，９Ｘ）、Ｌ　　９　２　９　　（８３，７Ｘ）、ＲＬ
　　＠　　１　　（９１，９Ｘ）。

Ｂ　ａ　Ｉ　ｂ／３　Ｔ　３　（９７，８Ｘ）、正常マ
ウス胎児由来線維芽様細胞（７５，２％＞と高いＣＴＡ
を示したのに対し　、　Ｍｅ　ａ　ｔ　ｈＡ（８，３Ｘ
）、５Ｖ−Ｔ＊（１３，５％）、ＹＡＣ−１（１，２Ｘ
）、　Ｘ　Ｃ（３，０％）　（！：有効なＣＴＡはみら
れなかった。

次に、実験７として、マクロファージ株ＣＡＭＵ−３−
Ｒ，ＣＡＭＵ−３１−Ｒ）にて各細胞濃度（４Ｘ１０’
／ｃｎｊ！　〜８ｘ１０’／ｍｊ２　）で４８時間培養
（自然死）後の上清液のＣＴＡを検索した。その結果を
第９及び第１０表に示す。

第１０表 第９表及び第１０表の結果によれば、マクロファージ株
では各細胞濃度いずれも有効なＣＴＡを示さなかった。

次に、実験８として、上清液の正常細胞に対する効果を
検討した。正常マウス（Ｂａｌｂ／ｃ系）の肺臓を細分
して得たリンパ系細胞、同マウス妊娠中期の胎児を細切
して得たリンパ系細胞、線維芽様細胞を腫瘍細胞の変わ
りに用いてＣＴＡを検索した。その結果を第１１表に示
す。

第１１表 ＊　Ｎ　、　Ｄ　（ｎｏｔ　ｄｏｎｅ）　：未実験第１
１表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−Ａ？の上清液及び
、Ｌ９２９の上清液ともＣＴＡはみられなかった。

以上の結果をまとめると、１”）上皮様細胞、線維芽様
細胞、リンパ芽球様細胞の各細胞培養株の中に高いＣＴ
Ａを示す因子が存在することが確認された。２）ＣＴＡ
を示す因子は５６℃３０分似耐え７０°Ｃ６０分で不活
化され、分子量１０万以上（現時点で）と思料される。

３）マクロファージ株には有効なＣＴＡはみられなかっ
た。４）上記のＣＴＡは正常細胞には傷害を示きなかっ
た。

このことより、この因子は従来のＴＮＦと同等の効果を
示すことが確認きれた。

このように第１実施例の抽出法によっても、又、第２実
施例の抽出法によっても、有効なＴＮＦが抽出きれたこ
とが確認でき、さらに、第２実施例の凍結融解による細
胞の破壊にかえ、超音波処理、その他何らかの物理的、
科学的方法で細胞を死滅、又は破壊しても同様に有効な
ＴＮＦが抽出できる。

このように、本実施例の抽出法によれば、入手が容易な
線維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使用し
て、それらを細胞過多の条件にて自然死させるか、又は
凍結、融解の繰り返し作業あるいは超音波処理作業等に
よって細胞を破壊することによりＴＮＦを抽出すること
ができ、容易にしかも安全かつ大量に有効なＴＮＦを得
ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 線維芽様細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ　ｃｅ
   ｌｌｓ）、上皮様細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋ
   ｅ　ｃｅｉｌｓ）、リンパ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏｂ
   ｌａｓｔ−ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ）のうち少なくとも１つ
   以上の細胞を培養増殖させ、これを自然にあるいは人為
   的に死滅又は破壊することによって前記細胞より腫瘍壊
   死因子様物質を抽出する方法。