JPS6156131A - 腫瘍壊死因子様物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、制ガン作用を有する腫瘍壊死因子様物質（
生体及び試験管内を問わず腫瘍細胞に対しては傷害効果
を示し、正常細胞に対してはそのような効果を示さない
物質；以下ＴＮＦＸと略称する）に関するものである。

従来技術 従来、各種ダラム陽性菌やエンドトキシンにより誘発さ
れ、殺腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存在
は多数報告されている。例えば、Ｃａｒｒｌｅ氏らは、
正常ラットの腹腔浸出液からの細胞にエンドトキシンを
投与することにより、各種腫瘍細胞増殖を抑制する因子
が誘発されることを見出しくＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４
２巻１６００〜１６０５頁（１９７５年）〕、その後該
因子を単離精製することによって、その因子の本体が既
知のアルギナーゼであることをつきとめ報告した［Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎ−ｄｏｎ）２７３巻７５８〜７５９頁
（１９７８年）］。またＲｅｅｄ氏らは、エンドトキシ
ン処理をすることによって正常ラットと人間の培養細胞
又は培養単核細胞上清から、Ｌｃｅｌｌ等の培養腫瘍細
胞を殺す能力を持つ分子量４５，０００の蛋白質を見出
している（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１５巻３９５〜４０
４頁（１９７５年）〕。さらにＣａ　ｒ　ｓｗｅ１１氏
らは、あらかしめｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）を投与したＣＤ−ｌ５ｗ１
ｓｓマウスに再び２週間後にエンドトキシンを静脈内注
射して得られる該マウスの血清が、培養Ｌｃｅ１１に対
して殺細胞能を有すること及びＭｅｔｈ　　Ａ　　ｓａ
ｒｃｏｍａで担癌させた（Ｂａｌｂ／ｃＸＣ５７ＢＬ／
６）Ｆ、マウスの腫瘍を出血性壊死に至らしめる現象を
見出し、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎｅｃｒｏｓｊａ　　
Ｆａｃｔｏｒ）と名ずけた（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　、Ａｃ
ａｄ、ＳｅＩ　、ＵＳＡ７２巻（Ｎｏ、９）３６６６〜
３６７０頁（１９７５年）〕。

発明が解決しようとする問題点 このように従来、Ｃａｒ８ｗｅ１１氏らは、生体（例え
ば実験動物、マウス、ウサギ等）にＢＣＧ（ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）を接取し１
４日後に菌体内毒素であるＨ　　　　　　　ＬＰＳ（Ｉ
ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＷ　　ｆ’ｒｏｍ
　　Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）を静脈注射
して２時間後に全採血し、得られた血清中に含まれたか
たしでＴＮＦを採取している。又従来の他の殺腫瘍細胞
能力をもつ因子も各種ダラム陽性菌やエンドトキシンに
より誘発されたものであった。そのため従来のＴＮＦ等
の殺腫瘍細胞能力をもつ因子は、大量に得るには何匹も
の動物が必要で、そのため−匹一匹から得られるＴＮＦ
等の含有率が不均一であった。しかも血清中に存在する
ため他の蛋白（例えばアルブミン、グロブリン等）が多
く、精製するには非常に複雑な過程と時間を要し、さら
に最終的に得られるＴＮＦは決して多くはなかった。ま
た、有害な物質を用いるため安全性の点で問題があった
。

問題を解決するだめの手段 この発明は、従来のような、生体を使用してエンドトキ
シンにより誘発され得られたＴＮＦではなく、エンドト
キシンを使用することなく、安全で容易に大量に得るこ
とのできる腫瘍壊死因子を提供せんとするものであり、
その要旨は、線雑芽様細Ｊｌｑ（Ｆｆｂｒｏｂｌａｓｔ
−ｌｉｋｅ　　ｃｅ＝３− １１　ｓ　）　、　Ｊｚ皮様細胞（Ｅｐｊｔｈｅｌｉａ
ｌ　−１４ｋ　ｅ　　ｃ　ｅ　Ｉ　Ｉ　８　）　＋リン
パ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ−１ｉｋｅ　　
ｃｅｌｌｇ）のうち少なくとも１つ以上の細胞を培養増
殖させ、これを自然にあるいは人為的に死滅又は破壊す
ることによって前記細胞より抽出きれる以下特性を有す
るＩｌ！瘍壊死因子様物質。

ａ）５６°Ｃ３０分の熱処理に耐え、７０°Ｃ６０分で
不活性化。

ｂ）分子匿　　１０００００以上 である。

作用効果 ずなわら、発明者は、培養系線維芽様細胞等（例えばＬ
９２９）にＭφ（マクロファージ；従来ＴＮＦ産生物質
と考えられている。）よりはるかに高いＩｋ１１１Ｍ壊
死因子が含まれていることを見出した。そしてこれらの
細胞を培養し人為的に死滅又は破壊することによって、
前記線維芽様細胞等に含マれているＴＮＦＸが上清液中
に抽出きれることを見出したものである。

＝４− 例えば実例をあげると、Ｍφ株（例λ−ばＣＡＭＵ−３
）と線維類細胞株（Ｌ９２９）を同条件で破壊して得た
培養液を腫瘍細胞株（例えばＭｅａｔ　ｈＡ）に加え４
８時間培養後、その傷害効果（殺生効果と増殖抑制効果
を含む効果）［（（培養液だけの生細胞数）−（ＴＮＦ
を含む培養液での生細胞数））／（培養液だけの生細胞
数）］Ｘ１００ を比較すると、前者はわずか８．８％しかなく後者はそ
の１０倍近い８３．７％と高い傷害効果を示した。さら
に」二皮様細泊株（例えばＣＡＭＵ−３−ＡＴ）では９
６．９％と同様に高い効果であった。しかもこのような
傷害効果を示す培養液を正常細胞に加えても傷害作用は
見られなかった。このことより細胞破壊液中にＴＮＦＸ
（従来のＴＮＦと同等の効果を示す。）の存在が確認さ
れた。即ち、Ｍ≠株より生産されるＴＮＦＸに対して１
０倍以上の量が得られる。また、Ｍφ株を得ることは困
難とされているのに対し、線維芽様細胞、上皮様細胞、
リンパ芽球様細胞は生体から容易に培養可能な細胞であ
り、一般にも多くの細胞株が市販されていることから入
手も容易である。さらにこれら細胞は増殖能力もＭφに
比べ非常に強く短時間で大量の細胞を得ることも可能で
ある。さらにこのＴＮＦＸは生体を使用しないため均一
な質のものが得られやすく、有害な物質を用いないため
安全性の高いものである。従来のＴＮＦは腫瘍を特異的
に破壊することより理想的な癌治療剤として開発が進め
られているが、この発明によるＴＮＦＸは従来のＴＮＦ
と同等の効果を示し、しかも入手が容易で大量培養も可
能な線維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使
用し、細胞破壊という単純な生産技術により得られるた
め速やかに量産が可能である。

実施例 以下、本発明を具体化した実施例を実験データーととも
に詳細に説明する。

まず第１のＴＮＦＸ生産例として、上皮様細胞（本例で
はＣＡＭＵ−３−Ａ、）を使用し、このＣＡＭＵ−３−
Ａ、を培養シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラ
ス壁に付着している細胞を剥離分散し採取する。次に、
採取したＣＡＭＵ−３−Ａｔに５％の新生児血清液を加
えた培養液（ＭＥＭ、ＲＰＭＩ　１６４０　、ＫＮｔ等
）にて３×１０’／ｍｌに調整して細胞浮遊液とする。

これをそのまま５％ＣＯ３下３７°Ｃ通気培養にて９６
時間培養する。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ７
は培養液中にて細胞過多となり自然死滅する。

これを遠心管に移し、２００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、にて１０
分間遠心すると遠心管の底部には細胞片が、上層部には
上清液が得られる。この上清液にはＣＡＭＵ−３−Ａ、
より抽出されたＴＮＦＸが存在するはずであるため、そ
の存在を確認すべく以下の実験を行なった。

まず実験１として、腫瘍細胞（ＭｅａｔｈＡ。

マウス肉腫細胞）を４Ｘ１０’／ｍｊ！に５％牛新生児
血清加培養液にて調整する。その中へ上記方法にて得た
上清液を等量（５０％）加え（最終濃度２ｘｔｏ’／Ｊ
）、５％ＣＯ，下３７℃下気７養にて４８時間培養する
。培養後、腫瘍細胞を採取しトリパンブルー染色法（生
細胞は染色されない）にて生細胞数を算出する。傷害効
果（以下ＣＴＡと略す）は下記の＃１算式にて求めた。

傷害効果（ＣＩＡ）（Ｘ）−［（（培養液だけの生細胞
数）−（上清液を加えた生細胞数））／ （培養液たけの生細胞数）］Ｘ１００ その結果は　ＣＴＡ　　９１．８％に達した。

なお、加える上清液の量を０％〜５０％の範囲において
変化させた実験結果を第１表に示す。

第１表 第１表によれば、加えた上清液の濃度の濃いものはどＣ
ＴＡも高く、上清液の濃度が濃いほどＴＮＦＸも多いこ
とがわかる。

次に、実験２として、上記」−清液に含まれ、上記のよ
うなＣＴＡを示ずＴＮＦＸの性質を知る目的で、上清液
を熱処理（５６°Ｃ３０分、７０°Ｃ６０分、８５°Ｃ
１５分）してみた。その結果得られたＣＴＡを第２表に
示４−０ 第２表によれば、５６℃３０分ではＣＴＡ７６．３％に
対し７０℃６０分、８５℃１５分では１７．５％、２８
．３％とＣＴＡの減少（不活化）がみられた。

このことより、抽出されたＴＮＦＸは熱により効力を失
う糖タンパクの１種と考えられる。

次に、実験３として、Ｅｌ、１に使用したＣＡＭＵ−３
−Ａ、の１×１０″／ｍ１〜４　Ｘ　１０　”／ｍｌ！
の各細巾濃度浮遊液を作り９６時間培養（自然死）後の
上清液を腫瘍細胞傷害実験に用いた。その結果得られた
ＣＴＡを第３表に示す。

第３表 １ｌ− Ｅｌ、３細胞数■ 第３表によれば、使用する細胞浮遊液の濃度が濃いはど
ＴＮＦＸも多いことがわかる。

次に第２のＴＮＦＸ生産例として、上皮様細胞（ＣＡＭ
Ｕ　　３　　Ａｔ）を使用し、このＣＡＭＵ３　　Ａｔ
を培養シャーレよりトリプシンやＥＤＴＡにてガラス壁
に付着している細胞を剥離分散し採取する。次に、採取
したＣＡＭＵ−３−Ａｔに５％の新生児血清液を加えた
培養液（ＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４０．ＫＮ、等）にて３
Ｘ１０’／ｍｐに調節して細胞浮遊液とする。

これを硬質アンプル（セラムチューブ、−１９６°Ｃに
たλ、るもの）に入れ、液体チッソ（−１９６℃）中へ
投入する（急速凍結、約５分間）、次に温水（３７°Ｃ
）へ移す（急速融解、約１０分間）、同操作を３回くり
かえす。以上の手順により、ＣＡＭＵ−３−Ａ、は培養
液中にて物理的に破壊される。これを遠心管に移し、２
０００ｒ、ｐ、ｍ、にて１０分間遠心すると、遠心管の
底部には細胞片が、上層部には上清液が得られる。この
上清液には第１のＴＮＦＸの生産例と同様なＴＮＦＸが
存在するはずである。その存在を確認する意味と、第１
のＴＮＦＸの生産例との比較を行う意味において、実験
４として、実験１に使用したＣＡＭＵ−３−Ａｙの上清
液と凍結融解にて得た上清液を用いてＣＴＡを比較し第
４表を得た。

第４表 腫瘍細胞（ＭｅａｔｈＡ） ４８時間培養後 Ｅｘｐ、４細胞破壊方法　　生細胞数　傷害効果側比較
　　　　　（ＸＩＯ’）　　　Ｘ培養液のみ　　　　７
８０ ＣＡＭＵ−３−９６時間培養　　２．４　　　９６．９
Ａ、　３Ｘ１０’ ／ｍｊ２　　　凍結融解　１．３　　９８．３第４表に
よれば、第１のＴＮＦＸの生産例の方法及び第２のＴＮ
ＦＸの生産例の方法とも同程度のＴＮＦＸが得られたこ
とが確認し得る。なお、上記ＣＡＭＵ−３−Ａ７に換λ
、て、線維芽様細胞（例えばＬ９２９）を使用して第１
のＴＮＦＸの生産例の方法により抽出したものとの比較
も表中に付記した。このように、ＣＡＭＵ−３−Ａ、に
換えてＬ９２９を使用しても、さらに、Ｌ９２９に換え
てリンパ芽球様細胞（例えばＲＬ♂−１）を使用しても
同様にＴＮＦＸが得られる。ここで、ＴＮＦＸの生産に
使用した各細胞の一般的性状を説明すると、線維芽様細
胞とは、生体より取り出した組織をトリプシンやＥ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒ
ａａｃｅｔａｔｅ　：細胞付着を防ぐ働きを持つ）で分
散させガラスジＡ・−レ等に培養した場合に、ガラス壁
に付着して紡錘形の細胞形態を取るものを言う。（アメ
リカ組織培養学会用語委員会にて承認されたもの）次に
、上皮様細胞とは、同条件下においてガラス壁に付着し
、多角形の細胞形態を取るものを言う。次に、リンパ芽
球様細胞とは、同条件下において、ガラス壁に付着せず
（一部付着しうる）培養液中に浮遊し球形の細胞形態を
取るものを言う。上記各細胞はいずれもマクロファージ
（大食細胞）が有する通常の性状（Ｆｃレセプター、Ｃ
３レセプター等）や機能（＊食能、腫瘍細胞傷害作用等
）を十分に備えていないものをいう。

また腫瘍ウィルスや発癌物質等によって腫瘍原性をもっ
た細胞も含めるものである。

次に実験５として、ＴＮＦＸの分子量の目安を知る目的
で、各分子量（ＩＸＩＯ’、３Ｘ１０’、　ｌＸｌ０”
）以下の物質しか通さない特殊な膜を用いて上清液を検
索した。その結果を第５表に示す。

第５表 第５表の結果によれば、本実験により得たＴＮＦＸは分
子鼠ｌＸ１０’以上の因子と思料される次に、実験６と
して、各種細胞を使用して実験を行ない、各種細胞別に
ＴＮＦＸの生産能の比較を行なった。その結果を第６〜
第８表に示す。

第６表 第６〜第８表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−Ａ　ｙ（
９６，９％）、Ｔ−９２９（８３，７％＞、ＲＬ　　♂
　１　　（９１，９％）。

Ｂ　ａ　Ｉ　ｂ／３　Ｔ　３　（９７，８％＞、正常マ
ウス胎児由来線維芽様細Ｊｆｉ（７５，２に）と高いＣ
ＴＡを示したのに対し、　Ｍｅ　ａ　ｔ　ｈＡ（８，３
％＞、５Ｖ−Ｔｔ（１３，５％＞、ＹＡＣ−１（１，２
２）、　Ｘ　Ｃ（３，０％＞　、！：有効なＣＴＡはみ
られなかった。

次に、実験７として、マクロファージ株ＣＡＭＵ−３−
Ｒ，ＣＡＭＵ−３１−Ｒ）にて各細胞濃度（４Ｘ１０’
／Ｊ　〜８Ｘ１０’／ｍＮ　）で４８時間培養（自然死
）後の上清液のＣＴＡを検索した。その結果を第９及び
第１０表に示す。

第１０表 第９表及び第１０表の結果によれば、マクロファージ株
では各細胞濃度いずれも有効なＣＴＡを示さなかった。

次に、実験８として、ＴＮＦＸの正常細胞に対する効果
を検討した。正常マウス（Ｂ　ａ　Ｉ　ｂ／ｃ系）の肺
臓を細分して得たリンパ系細胞、同マウス妊娠中期の胎
児を細切して得たリンパ系細胞、線維芽様細胞を腫瘍開
胸の変わりに用いてＣＴＡを検索した。その結果を第１
１表に示す。

第１１表 ※Ｎ　、　Ｄ　（ｎｏｔ　ｄｏｎｅ）　：未実験第１１
表の結果によれば、ＣＡＭＵ−３−Ａ。

の上清液及び、Ｌ９２９の上清液ともＣＴＡはのられな
かった。

以上の結果をまとめると、１）上皮様細胞、線維芽様細
胞、リンパ芽球様細胞の各細胞培養株の中に高いＣＴＡ
を示す因子が存在することが確認きれた。２）ＣＴＡを
示す因子は５６℃３０分に耐え７０°Ｃ６０分で不活化
きれ、分子量１０万以上（現時点で）と思料される。３
〉マクロファージ株には有効なＣＴＡはみられなかった
。４）上記のＣＴＡは正常細胞には傷害を示さなかった
。

このことより、この因子（ＴＮＦＸ）は従来のＴＮＦと
同等の効果を示すことが確認された。

このように第１のＴＮＦＸの生産例の抽出法によっても
、又、第２のＴＮＦＸの生産例の抽出法によっても、有
効なＴＮＦＸが抽出されたことが確認でき、さらに、第
２のＴＮＦＸの生産例の凍結融解による細胞の破壊にか
え、超音波処理、その他何らかの物理的、科学的方法で
細胞を死滅、又は破壊しても同様に有効なＴＮＦＸが抽
出できるこのように、本例ＴＮＦＸは、入手が容易な線
維芽様細胞、上皮様細胞、リンパ芽球様細胞を使用して
、それらを細胞過多の条件にて自然死させるか、又は凍
結、融解の繰り返し作業あるいは超音波処理作業等によ
ってｍ胞を破壊することにより抽出することができ、容
易にしかも安全かつ大量に生産することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 線維芽様細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ　ｃｅ
   ｌｌｓ）、上皮様細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋ
   ｅ　ｃｅｌｌｓ）、リンパ芽球様細胞（Ｌｙｍｐｈｏｂ
   ｌａｓｔ−ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ）のうち少なくとも１つ
   以上の細胞を培養増殖させ、これを自然にあるいは人為
   的に死滅又は破壊することによって前記細胞より抽出さ
   れる以下特性を有する腫瘍壊死因子様物質。 ａ）５６℃３０分の熱処理に耐え、７０℃６０分で不活
   性化。 ｂ）分子量　１０００００以上