JPS6125060A - インタ−フエロン−イプシロンの検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 利用分野 本発明はイムノアッセイの方法、特にインターフェロン
−イプシロン、すなわちヒト上皮細胞により産生される
抗ウィルス剤を検出する検定法に関する。

インターフェロンは抗ウイルス特性を有する物質である
。それらは、ウィルス、特定の核酸または抗原／染色体
複合体にさらされることによって刺激された特定タイプ
の細胞によって産生きれる。インターフェロンは臨床上
の抗ウィルス剤として大きな作用を示す非常に有効な薬
物である。

ヒトインターフェロンは典型的には３つのタイプに分け
られる： ヒト白血球またはリンパ芽球細胞により産生されるイン
ターフェロン−アルファ；線維芽細胞により産生される
インターフェロン−ベータ；およびヒトＴ−リンパ球に
より産生されろインターフェロン−ガンマ。これら６つ
のインターフェロンはすべて細胞がウィルスまたは同様
の攻撃を受けて刺激された後に各々の細胞から分泌され
る。

新しいタイプのインターフェロンである、いわゆるイン
ターフェロン−イプシロンは最近発見された。

インターフェロン−イプシロンはヒト上皮細胞に対して
活性であり、したがって、ウィルスに対する身体の防御
の最前線、たとえば皮膚および他の上皮表面を保護する
役割を担っている。

しかし、インターフェロン−イプシロンは上皮において
のみ活性なので、従来のインターフェロンのための試験
では検出方法としておよび定量方法として不適当である
。かくして、インターフェロン−イプシロンの存在を検
出し、その定量をする簡便で効率的検定法の必要性があ
る。

そのような検定法は実験室的規模ばかりでなく治療用イ
ンターフェロン−イプシロンの製造における品質管理工
程においても有用であろう。

発明が解決しようとする問題点 インターフェロン−イプシロンの存在は、インターフェ
ロン−イプシロンを含むと考えられろ試料で処理された
上皮細胞、特にケラチノサイト細胞に対する細胞病理的
作用を観察することによって容易に定量できることが発
見された。

インターフェロン−イプシロンはヒト上皮細胞に対して
抗ウィルス活性を有するがヒト線維芽細胞に対して何ら
検出できる活性を有せず、インターフェロン−アルファ
、ベータおよびガンマとは抗原的に異なる。したがって
、上皮細胞に対して抗ウィルス活性を示すが線維芽細胞
に対して何ら活性を示さない製剤はインターフェロン−
イプシロンを含有する。これらの観察がインターフェロ
ン−イプシロンの定量的検定法の根拠となっている。

この定量的検定法は、上皮細胞、好ましくはケラチノサ
イト、もつとも好ましくは幼若ケラチノサイトが線維芽
細胞の代りに使用されている以外は他のインターフェロ
ンの力価を測定する先行技術に使用されている工程と類
似の工程によって行なわれる攻撃検定である。このよう
にして、ケラチノサイトは生育され、複数の二次培養物
に分けられ、未知濃度のインターフェロン−イプシロン
を含み、何ら他のインターフェロンの混入がない試料で
処理される。各継代細胞二次培養物をたとえば２倍希釈
された試料の一部で処理する。適当なインキュベーショ
ン期間（２時間〜約２日）後、処理されたケラチノサイ
トをウィルスによる攻撃にさらす。例えば攻撃するウィ
ルスは／Ｊ＼水泡・駐日内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌ
ａｒ　５ｔｏｒｎｉｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）　（ＶＳ
Ｖ）である。

インターフェロン−イプシロンの１単位はヒトケラチノ
サイト細胞数の半分を標準的ウィルス濃度の攻撃から保
護するに要する濃度と定義される。特定の混入物なしの
試料に存在するインターフェロン−イプシロンの単位数
は容易に決定できる。

インターフェロン−イプシロンが、上皮細胞をウィルス
によって刺激されることによって産生される場合、イン
ターフェロン−アルファとインターフェロン−ベータも
しばしば産生される。これらのインターフェロンは上記
検定法を妨害するであろう。したがって、インターフェ
ロン−アルファ、ベータまたはガンマが存在する場合、
それらを除去し、または検定を行う前にそれらの活性を
中和しておかなくてはならない。

上記定量的検定法は、まず、試料中の混入しているイン
ターフェロンを中和または除去することにより行なわれ
る。そして該試料が上皮細胞に対して抗ウィルス活性を
示すがヒト線維芽細胞に対して何ら認め得る活性を示さ
ないときは、該試料はインターフェロン−イプシロンを
含有する。

もちろん、検定結果を標準物と比較して有意のデータを
得る。インターフェロン−イプシロンの標準的調製物は
、上皮細胞、好ましくはケラチノサイトを上述のインタ
ーフェロン−イプシロンの出願に詳細に開示されたよう
にしてウィルスで刺激し、インターフェロンが産生され
分泌された後上清を回収し、調製物をアルファ。

ベータおよびガンマ抗体で中和することによってつくる
ことができる。残りの調製物はインターフェロン−イプ
シロンな含むであろう。これは特定ウィルス、たとえば
水泡性口内炎ウィルスの標準的濃度Ｃたとえば、１　ｐ
ｆｕ／ａ胞）のものによる攻撃から培養物中の上皮細胞
の半分を保護するであろう希釈物に達する迄上記調製物
を連続的に希釈ｔ７上皮細胞のミクロ培養物に加える。

この希駅物はインターフェロン−イプシロン活性１単位
を含有するであろう。

本発明の目的はインターフェロン−イプシロンが存在す
ると見られる調製物中のインターフェロン−イプシロン
の存在と量を測定する方法を提供することである。

本発明の他の目的は以下の記載及び特許請求の範囲から
明らかとなろう。

問題を解決するだめの手段 新しいタイプのインターフェロンは上皮細胞、特にケラ
チノサイトが従来方法によりウィルスによって刺激され
たとき産生される。この新規物質（インターフェロン−
イプシロン）が産生されるとき、他のインターフェロン
も産生されるが、他のインターフェロンの存在下にイン
ターフェロン−イプシロンを検出し定量することは困難
であった。

他の既知インターフェロンが混入していないインターフ
ェロン−イプシロンは上皮細胞において高い抗ウィルス
活性を有し、インターフェロン攻撃検定に通常使用され
る他のタイプの細胞には何ら検出１〜得る活性がない。

事実、他のインターフェロンに通常使用される活性の単
位の定義、すなわち標準的濃度の小水泡性口内炎ウィル
ス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉ
ｒｕｓ）による攻撃からヒト線維芽細胞培養物中の細胞
の半分を保護する濃度は、インターフェロン−イプシロ
ンについては伺ら意味がない。これは、上皮細胞に対し
て有意の抗ウィルス活性を有する濃度のインターフェロ
ン−イプシロンが線維芽細胞においては何ら検出し得る
活性を有しないからである。

ヒト上皮細胞、特にケラチノサイトの培養物のインター
フェロン−イプシロンのこの顕著且つ選択的効力は、イ
ンターフェロン−イプシロンを検出し定量するための根
拠となっている。

インターフェロン−イプシロンの１つの単位は１　ｐｆ
ｕ／細胞の水泡性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕ−ｌａ
ｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）による攻撃か
らヒトケラナノサイト細胞培養中の細胞の半数を保護す
る濃度として定義できる。

他のインターフェロンを含有しているとみられる調製物
中のインターフェロン−イプシロンの存在またはレベル
を決定および／または定Ｉすることが望まれる場合、他
のインターフェロンの活性はガンマ、ベータおよびアル
ファ−インターフェロンに対する抗体によって中和する
ことにより除去でき、該調製物を次いで、ウィルス感染
からヒトケラチノサイトまたは他のヒト上皮細胞を保護
する能力について試験する。

インターフェロン−イプシロンの存在は、精製されてア
ルファ、ベータおよびガンマ−インターフェロン活性を
除去された試料が上皮細胞に対して抗ウィルス活性を有
するが線維芽細胞に対しては何ら検出し得る活性を有し
ない場合に確認される。

この検定に使用される好適上皮細胞はケラチノサイトで
、もつとも好適なものは幼若ケラチノサイト、たとえば
合流させたばかりの培養物である。細胞が成熟するにつ
」ｔてケラチノサイトはケラチンを蓄積し、これは明ら
かにウィルスによる攻撃の間にウィルスが細胞内へと侵
入するのを妨害することによって検定を困難にする。

攻撃に使用するのに好適なウィルスは上皮細胞に対して
細胞毒性であることが知られているものである。小水泡
性口内炎ウィルスは良好であるが、脳心筋炎ウィルス（
Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ　Ｍｙｏｃａｒ−ｄｉｔ、ｉｓ　Ｖ
ｉｒｕｓ）（ＥＭＣ）、センダイウィルス（Ｓｅｎ−ｄ
ａｉ　ｖｉｒｕｓ）　　または他のウィルスが使用でき
る。

同じウィルスを使用して、標準物と比較される検定にお
いて使用されるようにして標準濃度を決定するのがよい
。一般に検定法の感度は選択された特定のウィルスによ
るであろう。

この検定法は好ましくは、まず存在するかもしれない混
入インターフェロンの活性を除去し、次いで試料を連続
的に希釈し、連続希釈物を複数のケラチノサイト培養物
に加えることによって行う。好ましくは、比較的高濃度
の希釈または試料の未希釈アリコツトを線維芽細胞にも
加える。これらの培養物は通常のミクロ筒板、たとえば
９６穴のものに入れてもよい。培養後、培養物をウィル
スにより攻撃する。たとえば試料で処理されていない対
照の穴が生細胞を含んでいないときは各穴に含まれる生
細胞の数を一度に計数することによってＩＦＮ−Ｅ力価
を決定できる。もし、線維芽細胞を含む穴に何ら生細胞
が含まれていないが少くともいくつかのケラチノサイト
が保護されているときは、ＩＮＦ−イプシロンの存在が
確認される。

実　　施　　例 本発明は特定の実施例により説明されるが、本発明の趣
旨と範囲から逸脱することなく変化と修飾が行なわれ得
ることは当業者には明らかである。たとえば、本検定法
は精製された試料でも未精製試料によっても行える。イ
ンターフェロン−イプシロンの精製試料が使用されると
きは、精製工程においてコントロールされり孔のあるガ
ラス粒子を係属中の発明の名称がインターフェロン−イ
プシロンである出願に記載のようにして使用するのが有
用である。

さらに、筒板と肉眼による観察が検定を行うのに好まし
い装置および方法として記載されているが、種々の他の
培養装置および検定方法も使用できる。たとえば自動分
析もインターフェロン−イプシロンの大規模製産にとっ
て好ましい。さらに、幼若ケラチノサイトがインターフ
ェロン−イプシロンを検定するための好適細胞と認定さ
れているが、他の上皮細胞も有用であることが証明され
ている。他のウィルスもヒト上皮細胞を感染させ得るも
のなら使用できる。

例１ マサチューセッツエ科犬学のＨｏｗａｒｄ　Ｇｒｅｅｎ
博士の実験室から得られた表皮の上皮細胞培養物ｃケラ
チノサイト）を１〜２　Ｘ　１０５細胞／ｃｎ？の密度
まで生育させ、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａ
ｓｔｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＶ）　
　誘導法（Ｂａｒｏｎ　ａｎｄ　ｌ５ｓａｃｓ、上記文
献）を使用してインターフエロンーイプシロンを産生ず
るのに使用される。使用されたウィルスはカリフォルニ
ア州ディビスのボウルトリー・ヘルス・ラボラトリ−か
ら入手されたＮＩ）Ｎのパンコツスキ（Ｂａｎｋｏｗｓ
ｋｉ　）菌株であった。２％心臓不活性牛脂児血清Ｃゝ
Ｉ（ＩＦＣ８“）および試料中ｎ〜２５０ウィルスｐｆ
ｕ／細胞の範囲の感染の重複度までＮＤＶを含有する最
小限の必須培地（ＭＥＮ、　Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌずつの
４つの試料をつくり、インキュベートした。細胞培養物
を２４時間インキュベートした。次いで培地を回収し、
ｏ、　ｉ　ＮＨｃｚでｐＨ２に酸性化し、４°Ｃで５〜
６日間保存してＮＤＶを失活させた。この粗製インター
フェロン調製物をインターフェロン−アルファ、インタ
ーフェロン−ベータおヨヒインターフェロンーガンマを
各々の既知インターフェロンに対して特異的な抗体で中
和後、抗ウィルス活性について試験した。各インターフ
ェロンの中和滴定は、抗ＩＦＮアルファ（ＮＩＨ）、抗
ＩＦＮベータ（ＮＩＨとカナダのアルベルタのカルガリ
ーのカルガリー大学のＹ、　Ｈ，Ｔａｎ）、抗ＩＦＮガ
ンマ（Ｓ、　Ｂａｒｏｎ）およびこれらの抗血清の混合
物を使用することによって行われた。残りの中和された
調製物を線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ　ＦＳ−４）と上皮細
胞（Ｈｕｍａｎ　ＡＲ）培養物について試験した。結果
は、インターフェロン−イプシロンが線維芽細胞に対し
ては伺ら検出し得る抗ウィルス活性を示さないが上皮細
胞に存在するウィルスに対して活性を示すことを示した
。

下表は中和と抗ウイルス活性試験の完全な試験結果をま
とめたものである： 気層　　　　　　　　　　　　　　　　　　＼＼＼＼＼
＼草１１１１１１１１１１１１１１１ １　各試料を過剰の抗血清で３７℃で１時間インキュベ
ートしてからインターフェロン活性を検定する。

２、インターフェロンカ価はウィルスの細胞病理学的検
定法により決定された。

３、　　Ｎ、Ｄ、−データなし。

インターフェロン−アルファおよびインターフェロン−
ベータはインターフェロン−イプシロンとともに産生さ
れることが上記データから明らかである。アルファ抗体
単独またはベータ抗体単独による中和によって線維芽細
胞とケラチノサイトの両方の培養物のインターフェロン
活性の単位が低下する。アルファ抗体とベータ抗体の両
方およびアルファ抗体、ベータ抗体およびガンマ抗体に
よって中和すると線維芽細胞に対する上記調製物のすべ
ての抗ウィルス活性を消失せしめるが、ケラチノサイト
細胞においては６２単位／ｍｌの活性が残った。これは
、インターフェロン−イプシロンの存在を示し、インタ
ーフェロン−イプシロンが上皮細胞培養物に対して選択
的活性を有することを確認するものである。この粗製調
製物は６２単位のインターフェロン−イプシロンを有し
ていた。

例２ ケラチノサイトの培養年令および誘導ウィルスの感染の
重複度がインターフェロン−イプシロンの産生に及ぼす
効果について研究した。インターフエロンーイプシロン
カ価を上述のように測定した。結果は下表■にまとめた
。

表■ インターフェロン−イプシロン産生 に対する培養年令とＭ、Ｏ９工、の効果０．１　　　　
１０　　　　＜３　　　　　＜４５　　　２１０　　　
　６　　　　１／Ｓ９０　　　　　ＮＤ　　　　　９　
　　　３２１００　　　　７９　　　　ＮＤ　　　　　
ＮＤｌ　感染の重複度 ２、インターフェロン試料は過剰のインターフェロン−
アルファ及びベータ抗血清とともにインキュベートして
からケラチノサイトに対する活性を測定した。

３、　　Ｎ、Ｄ、−データなし。

表■は少くともケラチノサイトタイプの上皮細胞につい
ては、幼若細胞、すなわちほとんど合流して１４日令の
細胞が老いた細胞よりもインターフェロン−イプシロン
をより多く産生ずることを示している。

例３ 例１によって産生された上皮インターフェロン物質は部
分的に精製された。これらの試料をＬａｍｅｌｌｉの方
法によってＳＤＳゲル電気泳動を使用して分子量分析し
た。これらの試料を室温宅１時間、１．０　％　Ｓ　Ｄ
　Ｓ、０．０５　Ｍ　）　＋、Ｉ　ス−ＨＣＡ（ｐＨ６
，８）緩衝液、１Ｄ％（Ｖ／Ｖ　）グリセリン、および
０．００１　％ブロムフェノールブルーの存在下にイン
キュベー）Ｌ、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に
担持させ、約１６時間電気泳動した。電気泳動後、分子
量標準物を含むレーンを染色した。インターフェロン含
有レーンヲ３　ｍｍの切片に薄切りにし、０．５％ＳＤ
Ｓを含む０．５ｍｌのＰＢＳとともに２０時間寥温で振
とうすることによって抽出した。これらのフラクション
の検定は線維芽細胞を使用した従来の攻撃検定法を使用
してアルファ、ベータおよびガンマ抗体による中和抜本
発明の検定によって行なわれた。インターフェロン−イ
プシロンに関連した主たる活性ピークの分子量はそのゲ
ル上の位置を分子量標準物と比較することによって計算
された。

第１図においてはインターフェロン−イプシロン活性は
ＡＲ上上皮Ｃケラソノサイト細胞においてはっきり示さ
れている。上皮活性に対応する蛋白質は見かけ上の分子
量約２０，０００で、ベーターメルカプトエタノールで
処理することにより活性が激的に低下する。

別の具体例において、インターフェロン−イプシロンが
ネズミまたはウシ線維芽細胞培養物において何ら抗ウィ
ルス活性を有しなかった。

本発明はその精神と範囲から逸脱することなく他の形で
具体化され得る。したがって、他の具体例も本発明の範
囲内に含まれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の上皮インターフェロンの電気泳動を示
すグラフである。 （外５名）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターフェロン−イプシロンの存在について試
   料を検定する方法であって、上皮細胞を上記試料ととも
   にインキュベートし；インキュベートされた細胞を該細
   胞を感染させる能力を有するウィルスで攻撃し；攻撃さ
   れた細胞の生存率を標準物と比較すること、からなる方
   法。
2. （２）上皮細胞がケラチノサイト細胞である特許請求の
   範囲第１項の方法。
3. （３）インキュベーション時間が約２時間ないし約２日
   の範囲にある特許請求の範囲第２項の方法。
4. （４）インキュベートされた細胞が小水疱性口内炎ウィ
   ルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖ
   ｉｒｕｓ）で攻撃される特許請求の範囲第１項の方法。
5. （５）該細胞の生存率を標準物と比較する工程が、該検
   定におけるインターフェロンの標準単位を、攻撃された
   細胞の半数を感染から保護するに要するインターフェロ
   ン−イプシロンの量として標準ウィルス濃度別に測定す
   ることをさらに含む特許請求の範囲第１項の方法。
6. （６）試料を線維芽細胞とインキュベートし；インキュ
   ベートした線維芽細胞を、該線維芽細胞を感染させる能
   力を有するウィルスで攻撃し；線維芽細胞の生存率を観
   察し、その際上皮細胞の保護と組合わされた上記試料存
   在下での線維芽細胞の死亡がインターフェロン−イプシ
   ロンの存在を示す付加段階をさらに含む特許請求の範囲
   第１項の方法。
7. （７）試料が汚染インターフェロンを含み、上記細胞を
   インキュベートする前に上記試料を少くとも１つのタイ
   プの既知インターフェロンに対する過剰のタイプ特異的
   抗体にさらすことによって上記試料を中和する付加段階
   をさらに含む特許請求の範囲第１項の方法。
8. （８）抗体がアルファ−インターフェロン抗体、ベータ
   −インターフェロン抗体、ガンマ−インターフェロン抗
   体およびその混合物からなる群より選択される特許請求
   の範囲第７項の方法。
9. （９）抗血清はアルファ−およびベータ−インターフェ
   ロン抗血清の混合物である特許請求の範囲第８項の方法
   。
10. （１０）上記試料を連続的に希釈し、上皮細胞の別個の
    培養物を上記連続的に希釈された試料とともにインキュ
    ベートし、各培養物を上記ウィルスで攻撃する追加段階
    を含む特許請求の範囲第１項の方法。
11. （１１）上記上皮細胞が幼若ケラチノサイト細胞である
    特許請求の範囲第１項の方法。