CH666285A5 - Verfahren zur bestimmung von interferon epsilon in einer probe. - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von interferon epsilon in einer probe. Download PDFInfo
- Publication number
- CH666285A5 CH666285A5 CH2898/85A CH289885A CH666285A5 CH 666285 A5 CH666285 A5 CH 666285A5 CH 2898/85 A CH2898/85 A CH 2898/85A CH 289885 A CH289885 A CH 289885A CH 666285 A5 CH666285 A5 CH 666285A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- cells
- interferon
- sample
- virus
- incubated
- Prior art date
Links
- 102100026688 Interferon epsilon Human genes 0.000 title claims description 45
- 101710147309 Interferon epsilon Proteins 0.000 title claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 35
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 33
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 21
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 19
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 11
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 10
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 10
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 10
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 6
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims description 4
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 16
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- 101000836540 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member B1 Proteins 0.000 description 2
- 101000809450 Homo sapiens Amphiregulin Proteins 0.000 description 2
- 101000928259 Homo sapiens NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000046818 human AR Human genes 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101000635799 Homo sapiens Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht ich auf Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Interferon Epsilon, einem durch menschliche Epithelzellen erzeugten antiviralen Mittel, in einer Probe, die im Anspruch 1 bzw. im Anspruch 6 definiert sind.
Interferone sind Substanzen, die antivirale Eigenschaften haben. Sie werden durch bestimmte Typen von Zellen erzeugt, die durch Exposition mit einem Virus, bestimmten Nucleinsäuren oder Antigen/Mitogen-Komplexen stimuliert worden sind. Interferone sind extrem hochwirksame Wirkstoffe, die als klinische antivirale Mittel vielversprechend sind.
Menschliche Interferone werden im typischen Falle in drei Typen eingeteilt: Interferon Alpha, das von menschlichen Leukozyten oder lymphoblastoiden Zellen erzeugt wird: Interferon Beta, das von Fibroblasten erzeugt wird; und Interferon Gamma, das von menschlichen T-Lymphozyten erzeugt wird. Alle drei werden von den betreffenden Zellen sekretiert, nachdem die Zellen durch ein Virus oder eine analoge Exposition stimuliert worden sind.
Kürzlich wurde ein Interferon eines neuen Typs aufgefunden, das Interferon Epsilon genannt wurde.
Interferon Epsilon wirkt auf menschliche Epithelzellen und ist daher vielversprechend für die Verstärkung der ersten Verteidigungslinie des Körpers, z.B. der Haut und anderer epithelialer Oberflächen, gegen Virusbefall. Weil jedoch Interferon Epsilon nur in dem Epithel aktiv ist, sind herkömmliche Tests auf Interferon ungeeignet, um sein Vorhandensein nachzuweisen und es quantitativ zu bestimmen.
Somit besteht Bedarf für ein einfaches, wirksames Analysenverfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Interferon Epsilon und zur quantitativen Bestimmung seines Titers. Ein solches Analysenverfahren wäre klinisch sowie bei Qualiäts-kontrollverfahren bei der Herstellung von Interferon Epsilon für die therapeutische Verwendung nützlich.
Es wurde gefunden, dass das Vorhandensein von Interferon Epsilon leicht quantitativ bestimmt werden kann durch Beobachtung seiner zytopathischen Wirkungen auf Epithelzellen, insbesondere Keratinozytenzellen, die mit Proben behandelt sind, von denen man annimmt, dass sie Interferon Epsilon enthalten. Interferon Epsilon hat antivirale Aktivität in bezug auf menschliche Epithelzellen, aber keine nachweisbare Aktivität in bezug auf menschliche Fibroblasten und ist antigen verschieden von Alpha-, Beta- und Gamma-Interfe-ron. Demgemäss enthält ein Präparat, das antivirale Aktivität in bezug auf Zellen von Epithelursprung, aber keine Aktivität in bezug auf Fibroblasten zeigt, Interferon Epsilon. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage sowohl für ein quantitatives als auch für ein qualitatives Analysenverfahren für Interferon Epsilon.
Die quantitative Bestimmung ist ein Challenge-Assay, das mittels analoger Stufen ausgeführt wird, wie sie nach dem Stande der Technik zur Bestimmung des Titers anderer Interferone angewandt werden, mit der Ausnahme, dass Epithelzellen, vorzugsweise Keratinozyten, und insbesondere junge Keratinozyten, anstelle von Fibroblasten verwendet werden. Somit werden die Keratinozyten gezüchtet, in mehrere Subkulturen unterteilt und mit einer Probe behandelt, die eine unbekannte Konzentration an Interferon Epsilon und keine verunreinigenden Interferone enthält. Jede aufeinanderfolgende Zellsubkultur wird mit einem Teil der Probe behandelt, die z.B. eine zweifache Verdünnung erfahren hat. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer (2 Stunden bis ca. 2 Tage) werden die behandelten Keratinozyten einem Virus-Challenge ausgesetzt. Bei der beispielhaften Ausführungsform ist das Virus ein Vesicular-Stomatitits-Virus (VSV).
Beim Vergleich der Lebensfähigkeit von Epithelzellen, die mit einer Probe inkubiert worden sind, in der Interferon Epsilon quantitativ bestimmt werden soll, und die nach der Inkubation einem Virus exponiert worden sind, mit einem Standard wird eine Standardeinheit in der Prüfung definiert als diejenige Menge Interferon Epsilon, die erforderlich ist, um die Hälfte der exponierten Zellen vor der Infektion durch eine Standardviruskonzentration zu schützen. Eine Einheit von Interferon Epsilon kann somit als diejenige Konzentration definiert werden, die erforderlich ist, um die Hälfte einer menschlichen Keratinozytenpopulation vor der Challenge mit einer Standardviruskonzentration zu schützen. Die Anzahl von Einheiten, die in einer gegebenen nicht verunreinigten Probe vorhanden sind, kann demgemäss leicht bestimmt werden.
Wenn Interferon Epsilon durch Stimulieren von Epithelzellen mit einem Virus erzeugt wird, werden oft auch Interferon Alpha und Interferon Beta erzeugt. Diese stören die vorstehende Bestimmung. Wenn Interferon Alpha, Beta oder
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
666 285
Gamma vorhanden ist, sollten sie somit entfernt werden, oder ihre Aktivität sollte neutralisiert werden, ehe die Bestimmung durchgeführt wird.
Die qualitative Bestimmung wird im allgemeinen ausgeführt, indem man zunächst alle verunreinigenden Interferone in der Testprobe entfernt oder in anderer Weise inaktiv macht. Wenn die Probe dann bei der im Anspruch 6 beschriebenen Behandlung antivirale Aktivität in bezug auf Epithelzellen, aber keine nachweisbare Aktivität in bezug auf menschliche Fibroblasten zeigt, enthält sie Interferon Epsilon.
Die Analysenresultate müssen natürlich mit einem Standard verglichen werden, um bedeutungsvolle Daten zu erhalten. Ein Standardpräparat von Interferon Epsilon kann hergestellt werden, indem man Epithelzellen, vorzugsweise Keratinozyten, mit einem Virus stimuliert, wie z.B. im einzelnen in der BE-PS Nr. 902 633 offenbart, die überstehende Flüssigkeit erntet, nachdem die Interferone erzeugt und sekretiert worden sind, und dann das Präparat mit Alpha-, Beta- und Gamma-Antikörpern neutralisiert. Das zurückbleibende Präparat enthält Interferon Epsilon. Dieses kann der Reihenverdünnung unterworfen und zu Epithelzellenmikrokulturen zugesetzt werden, bis eine Verdünnung erreicht wird, die die Hälfte der Epithelzellen in der Kultur vor der Challenge mit einer Standardkonzentration (z.B. 1 PFU/Zelle) eines gegebenen Virus, z.B. Vesicular-Stomatitis-Virus, schützt. Diese Verdünnung enthält eine Einheit Interferon Epsilon-Aktivität.
Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur quantitativen bzw. qualitativen Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge an Interferon Epsilon in Proben, von denen man annimmt, dass sie dieses enthalten, zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den unabhängigen Ansprüchen 1 und 6 hervor.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Elektrophorese des Epithelinterferons zeigt.
Ein Interferon eines neuen Typs wird erzeugt, wenn Zellen von epithelialem Ursprung, insbesondere Keratinozyten, mittels herkömmlicher Methoden duch ein Virus stimuliert werden. Wenn das neue Material, das als Interferon Epsilon bezeichnet wird, erzeugt wird, werden auch andere Interferone erzeugt, und es war bisher schwierig, das Interferon Epsilon in Gegenwart dieser anderen Substanzen nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen.
Es wurde gefunden, dass Interferon Epsilon, das nicht durch andere bekannte Interferone verunreinigt ist, eine hohe antivirale Aktivität in Epithelzellen hat und keine nacheisbare Aktivität in bezug auf andere Zelltypen hat, die normalerweise in Interferon-Challenge-Assays verwendet werden. In der Tat hat die Definition einer Aktivitätseinheit, die in herkömmlicher Weise für andere Interferone verwendet wird, das heisst, diejenige Konzentration, die die Hälfte der Zellen in einer menschlichen Fibroblastenzellenkultur vor der Challenge mit einer Standardkonzentration von Vesicular-Stoma-tititis-Virus schützt, keine Bedeutung, wenn es sich um Interferon Epsilon handelt. Das ist deshalb der Fall, weil eine Konzentration von Interferon Epsilon, die eine signifikante antivirale Aktivität in bezug auf Epithelzellen hat, keine nachweisbare antivirale Aktivität in bezug auf Fibroblasten hat.
Diese ausgeprägte und selektive Wirksamkeit von Interferon Epsilon in menschlichen Epithelzellenkulturen, insbesondere Keratinozyten, kann als Grundlage für den Nachweis und die quantitative Bestimmung desselben dienen. Eine Einheit von Interferon Epsilon kann definiert werden als diejenige Konzentration, die die Hälfte der Zellen in einer menschlichen Keratinozytenzellkultur vor der Challenge mit 1 PFU/Zelle an Vesicular-Stomatitis-Virus schützt.
Wenn man wünscht, das Vorhandensein bzw. die Menge von Interferon Epsilon in einem Präparat, von dem man erwartet, dass es andere Interferone enthält, nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen, so kann die Aktivität der anderen Interferone durch Neutralisation mit Antikörpern gegen Gamma-, Beta- und Alpha-Interferon beseitigt werden, und das Präparat kann dann auf seine Fähigkeit getestet werden, menschliche Keratinozyten oder andere menschliche Zellen von epithelialem Ursprung vor Virusinfektion zu schützen. Das Vorhandensein von Epsilon-Interferon wird bestätigt, wenn man findet, dass eine zur Entfernung von Alpha-, Beta- und Gamma-Interferon-Aktivität gereinigte Probe antivirale Aktivität in bezug auf Zellen von epithelialem Ursprung hat, aber keine nachweisbare Aktivität in bezug auf Fibroblasten hat.
Die bevorzugten Epithelzellen für die Verwendung in dem Analysenverfahren sind Keratinozyten, insbesondere junge Keratinozyten, z.B. eine Kultur, die gerade den Zustand erreicht hat, in dem die gezüchteten Zellen das Kulturgefäss ausfüllen und/oder einander berühren. Wenn die Zellen rèi-fen, sammeln sie Keratin an, und dies kompliziert die Analyse offensichtlich, indem der Durchgang des Virus in die Zellen während der Challenge behindert wird.
Die bevorzugten Viren, die für die Challenge verwendet werden, sind diejenigen, von denen man weiss, dass sie gegen Epithelzellen zytotoxisch sind. VSV wirkt gut, aber auch Encephalo-Myocarditis-Virus (EMC), Sendaivirus oder andere Viren können verwendet werden. Es wird bevorzugt, dass das gleiche Virus, das in mit dem Standard verglichenen Assays verwendet wird, zur Bestimmung der Standardkonzentration verwendet wird. Im allgeminen hängt die Empfindlichkeit der Bestimmung von dem speziellen gewählten Virus ab.
Die Bestimmung wird vorzugsweise ausgeführt, indem man zuerst die Aktivität aller verunreinigenden Interferone, die vorhanden sein können, entfernt, die Probe dann der Reihenverdünnung unterwirft und die Reihenverdünnung mehreren Keratinozytenkulturen zusetzt. Vorzugsweise wird eine Verdünnung mit verhältnismässig hoher Konzentration oder ein unverdünnter aliquoter Teil der Testprobe auch zu einer Fibroblastenzellkultur zugesetzt. Die Kulturen können in herkömmlichen Mikrotitrierplatten enthalten sein, die z.B. 96 Vertiefungen aufweisen. Nach der Inkubation werden die Kulturen mit dem Virus exponiert. Durch Zählen der Anzahl an lebensfähigen Zellen, die in einem bestimmten Zeitpunkt, z.B. wenn eine Vergleichsvertiefung, die nicht mit der Probe behandelt wurde, keine lebensfähigen Zellen enthält, in den Vertiefungen enthalten sind, kann man den IFN-e-Titer bestimmen. Wenn die Fibroblasten enthaltende Vertiefung keine lebensfähigen Zellen enthält, aber mindestens einige der Keratinozyten geschützt worden sind, wird das Vorhandensein von INF Epsilon bestätigt.
Die Erfindung wird nun im Zusammenhang mit bestimmten Ausführungsbeispielen beschrieben. Es sollte jedoch klar sein, dass der Fachmann verschiedene Änderungen und Modifizierungen ausführen kann, ohne vom Geist oder vom Rahmen der Erfindung abzuweichen. Z.B. kann die Bestimmung mit entweder gereinigten oder ungreinigten Proben ausgeführt werden. Wenn gereinigte Proben von Interferon Epsilon verwendet werden sollen, kann die Verwendung von Glasperlen mit definierten Poren, wie sie in dem oben erwähnten, am gleichen Tag eingereichten schweizerischen Patentgesuch beschrieben ist, in dem Reinigungsprozess brauchbar sein.
Obgleich Platten mit Vertiefungen und die visuelle Beobachtung als bevorzugte Vorrichtung und bevorzugtes Verfahren zur Ausführung der Bestimmung beschrieben worden sind, sollte es ausserdem klar sein, dass verschiedene andere Zellkulturvorrichtungen und Nachweismethoden angewandt
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
666 285
4
werden können. Eine automatisierte Analyse kann z.B. im Zusammenhang mit der Erzeugung von Interferon Epsilon in grossem Massstab bevorzugt werden. Obgleich junge Keratinozyten als bevorzugte Zellen für die Bestimmung von Interferon Epsilon angegeben werden, können überdies auch andere Epithelzellen sich als brauchbar erweisen. Auch andere Viren können verwendet werden, sofern sie menschliche Epithelzellen zu infizieren vermögen.
Beispiel 1
Eine Epithelzellenkultur von epidermalem Ursprung (Keratinozyten), die von dem Laboratorium von Dr. Howard Green am Massachusetts Institute of Technology erhalten wurde, wurde bis zu einer Dichte von 1 bis 2 x 105 Zellen pro cm2 gezüchtet und verwendet, um Interferon Epsilon unter Anwendung der Newcastle-Disease-Virus-(NDV)-Induktions-methode (Baron und Issacs, I.e.) zu erzeugen. Das verwendete Virus war der Bankowski-Stamm von NDV, der von den Poultry Health Laboratories, Davis, California, erhältlich ist. Vier Proben von je 1 ml eines «minimum essential medium» (MEM, Gibco), das 2% durch Wärme inaktiviertes fötales Kälberserum («HIFCS») und NDV enthielt, mit Viruskonzentrationen von 0 bis 250 Virus-PFU pro Zelle in den Testproben wurden hergestellt und inkubiert. Die Zellkulturen wurden 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde dann geerntet, mit 0,1 -normaler HCl bis pH = 2 angesäuert und 5 bis 6 Tage lang bei 4 °C aufbewahrt, um das NDV zu inaktivieren. Dieses rohe Interferonpräparat wurde nach Neutralisation von Interferon Alpha, Interferon Beta und Interferon Gamma mit in bezug auf jeden der drei bekannten Interferontypen spezifischen Antikörpern auf seine antivirale Aktivität geprüft. Die Neutralisationstitrationen der einzelnen Interferone wurden unter Verwendung von Anti-IFN-alpha (NIH), Anti-IFN-beta (NIH und Y.H. Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada), Anti-IFN-gamma (S. Baron) und Gemischen dieser Antiseren ausgeführt. Die zurückbleibenden neutralisierten Präparate wurden dann auf Fibroblasten-kulturen (Human-FS-4) und Epithelkulturen (Human-AR) getestet. Die Resultate zeigten, dass Interferon Epsilon keine nachweisbare antivirale Aktivität in bezug auf Fibroblasten hatte, aber Aktivität gegen Viren in Epithelzellen zeigte.
Die folgende Tabelle gibt eine komplette Batterie von Tests der Neutralisation und der antiviralen Aktivität wieder.
Tabelle I
Antivirale Wirkung von Interferonpräparaten auf Human-FS-4- und -AR-Zellen
Probe Behandlung1 Interferontiter2 (Einheiten/ml)
Anti-a Anti-ß Anti-y Human-FS-4 Human-AR
IFN-e
128
64
IFN-e
+
—
—
48
32
IFN-e
—
+
—
24
32
IFN-e
—
—
+
192
32
IFN-e
+
+
—
<4
32
IFN-e
+
+
+
<4
32
IFN-a
—
—
—
64
4
IFN-ß
—
—
—
128
16
IFN-a/ß
—
—
—
512
16
IFN-y
—
—
—
32
16
IFN-a/ß/y
-
-
—
384
64
IFN-a/ß/y
+
-
-
128
48
IFN-a/ß/y
-
+
-
256
16
IFN-a/ß/y
-
-
+
N.D.
16
IFN-a/ß/y
+
+
-
<4
<4
IFN-a/ß/y
+
+
+
<4
<4
1 Die Proben wurden mit überschüssigem Antiserum, wie angegeben, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf Interferonwirkung geprüft wurden.
2 Der Interferontiter wurde durch einen viralen zytopathi-
schen Test bestimmt.
3 N.D. = Keine Daten
Es ist aus den Daten ersichtlich, dass Interferon Alpha und Interferon Beta gleichzeitig mit Interferon Epsilon erzeugt wurden. Es ist festzuhalten, dass die Neutralisation mit a-Antikörper allein oder ß-Antikörper allein die Interferonaktivität sowohl in den Fibroblasten- als auch in den Keratinozytenkulturen reduzierte. Die Neutralisation mit beiden Antikörpern und mit einem Gemisch aus a-, ß- und y-An-tikörpern zerstörte alle antivirale Aktivität des Präparates in bezug auf Fibroblasten, während eine Aktivität von 32 Einheiten pro ml in den Keratinozytenzellen zurückblieb. Dies beweist das Vorhandensein von Interferon Epsilon und bestätigt, dass dieses eine selektive Aktivität auf Epithelzellenkulturen hat. Dieses rohe Präparat enthielt 32 Einheiten Interferon Epsilon.
Beispiel 2
Die Wirkung des Kulturalters von Keratinozyten und der Viruskonzentration des induzierenden Virus auf die Erzeugung von Epsilon-Interferojn wurde untersucht. Die Interfe-ron-Epsilon-Titer wurden wie oben dargelegt bestimmt. Die Resultate sind unten in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Wirkung von Kulturalter und Viruskonzentration auf die Erzeugung von IFN-e
M.O.I.1
Interferontiter2 (Einheiten/106 Zellen)
(Virus-PFU/Zelle)
14 Tage
21 Tage
27 Tage
0
<6
<3
<4
0,1
10
<3
<4
1
53
2
8
2
79
6
16
5
210
6
16
10
157
6
16
20
210
18
32
50
210
9
32
70
ND3
12
32
90
ND
9
32
100
79
ND
ND
250
79
ND
ND
1 Viruskonzentration
2 Die Interferonproben wurden mit überschüssigen Interfe-ron-a- und -ß-Antiseren inkubiert, bevor sie auf ihre Wirkung auf Keratinozyten geprüft wurden.
3 ND = Keine Daten
Tabelle II zeigt, dass mindestens bei Epithelzellen vom Keratinozytentyp jüngere Zellen, das heisst 14 Tage alte Zellen, mehr Interferon Epsilon erzeugen als ältere Zellen.
Beispiel 3
Epithel-Interferonmaterialien, die gemäss Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden teilweise gereinigt. Die Proben wurden der Molekulargewichtsanalyse unter Anwendung der SDS-Gelelektrophorese nach der Methode von Lamelli unterworfen. Die Proben wurden bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,0% SDS, 0,05molarem Tris-HCl-Puffer (pH = 6,8), 10 Vol.-% Glycerin und 0,001% Bromphenolblau eine Stunde lang inkubiert, auf 12,5% Polyacrylamidgele aufgebracht und
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
666 285
annäherungsweise 16 Stunden lang laufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurden die Zonen, die die Molekulargewichtsstandards enthielten, angefärbt. Die Interferon enthaltenden Zonen wurden in 3-mm-Scheiben zerteilt und durch Schütteln mit 0,5 ml PBS, die 0,5% SDS enthielten, 20 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert. Analysen dieser Fraktionen wurden ausgeführt unter Anwendung des herkömmlichen Challenge-Assays unter Verwendung von Fibroblasten und mittels des erfindungsgemässen Verfahrens nach Neutralisation mit a-, ß- und y-Antikörper. Das Molekulargewicht des Hauptaktivitätsspeaks, der mit Interferon Epsilon verbunden war, wurde durch Vergleich seiner Stellung auf dem Gel mit den Molekulargewichtsstandards berechnet. «SDS» bedeutet «Natriumdodecylsulfat», und «PBS» bedeutet «phosphatgepufferte Kochalzlösung».
In Fig. 1 wird die Interferon-Epsilon-Aktiviät klar in AR-5 Epithelzellen (Keratinozyten) gezeigt. Das der epithelialen Aktivität entsprechende Protein hat ein scheinbares Molekulargewicht von ca. 20 000, und seine Aktivität wird durch Behandlung mit ß-Mercaptoethanol auch dramatisch reduziert.
io In einem separaten Experiment wurde festgestellt, dass Interferon Epsilon keine antivirale Aktivität in Mäuse- oder Rinderfibroblastenzellenkulturen hatte.
G
1 Blatt Zeichnungen
Claims (10)
- 666 2852PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Inerferon Epsilon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man Epithelzellen mit der Probe inkubiert, die inkubierten Zellen einem Virus exponiert, das die Zellen zu infizieren vermag, und die Lebensfähigkeit der exponierten Zellen mit einem Standard vergleicht.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Epithelzellen Keratinozytenzellen sind.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationsdauer im Bereich von 2 Stunden bis 2 Tagen liegt.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die inkubierten Zellen einem Vesi-cular-Stomatitis-Virus exponiert.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich die Probe der Reihenverdünnung unterwirft, getrennte Kulturen der Epithelzellen mit der der Reihenverdünnung unterworfenen Probe inkubiert und jede der Kulturen mit dem Virus exponiert.
- 6. Verfahren zur qualitativen Bestimmung von Interferon Epsilon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man Epithelzellen mit der Probe inkubiert, die inkubierten Zellen einem Virus exponiert, die Probe mit Fibroblastenzellen inkubiert, die inkubierten Fibroblastenzellen einem Virus exponiert, das die Fibroblastenzellen zu infizieren vermag, und die Lebensfähigkeit der Fibroblastenzellen beobachtet, wobei dei Tod der genannten Fibroblasten in Gegenwart der Probe in Kombination mit dem Schutz der Epithelzellen ein Anzeichen für das Vorhandensein von Interferon Epsilon ist.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Probe ein verunreinigendes Interferon enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich die Probe vor dem Inkubieren der Zellen neutralisiert, indem man sie überschüssigem typspezifischem Antikörper gegen mindestens einen bekannten Interferontyp aussetzt.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper aus Alpha-Interferon-Antikörper, Beta-Interferon-Antikörper, Gamma-Interferon-Antikörper und Gemischen davon gewählt ist.
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Gemisch von Alpha- und Beta-Interferon-Antikörpern ist.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Epithelzellen junge Keratinozytenzellen sind.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/628,612 US4675282A (en) | 1984-07-06 | 1984-07-06 | Assay for interferon epsilon |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH666285A5 true CH666285A5 (de) | 1988-07-15 |
Family
ID=24519613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH2898/85A CH666285A5 (de) | 1984-07-06 | 1985-07-05 | Verfahren zur bestimmung von interferon epsilon in einer probe. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4675282A (de) |
| JP (1) | JPS6125060A (de) |
| AU (1) | AU3857085A (de) |
| BE (1) | BE902663A (de) |
| CA (1) | CA1244345A (de) |
| CH (1) | CH666285A5 (de) |
| DE (1) | DE3515803A1 (de) |
| DK (1) | DK99185A (de) |
| FR (1) | FR2567269A1 (de) |
| GB (1) | GB2161270A (de) |
| IT (1) | IT1183809B (de) |
| NL (1) | NL8501564A (de) |
| NO (1) | NO850536L (de) |
| SE (1) | SE8500620L (de) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1299099C (en) * | 1986-03-06 | 1992-04-21 | Paul Richard Wood | In vitro assay for detecting cell-mediated immune responses |
| EP1037995A1 (de) | 1997-12-08 | 2000-09-27 | Genentech, Inc. | Menschliches interferon-epsilon: ein typ 1 interferon |
| ZA9811070B (en) | 1997-12-08 | 2000-07-03 | Genentech Inc | Type I interferons. |
| EP2327724A3 (de) | 2004-02-02 | 2011-07-27 | Ambrx, Inc. | Modifizierte humane Wachstumshormon-Polypeptide und deren Verwendungen |
| NZ586947A (en) | 2008-02-08 | 2012-11-30 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1443425A (en) * | 1972-10-25 | 1976-07-21 | Searle & Co | Interferon assay |
| US3910824A (en) * | 1973-10-18 | 1975-10-07 | Searle & Co | Interferon assay |
| US4241174A (en) * | 1978-11-24 | 1980-12-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Interferon assay |
| JPS56135420A (en) * | 1980-03-26 | 1981-10-22 | Fumiaki Taguchi | Suppressive substance of virus and its preparation |
| NO832517L (no) * | 1982-07-12 | 1984-01-13 | Damon Biotech Inc | Interferonpreparat, samt fremgangsmaate for dets fremstilling |
| IL66733A (en) * | 1982-09-07 | 1986-03-31 | Yeda Res & Dev | Assay for ifn and kit therefor |
-
1984
- 1984-07-06 US US06/628,612 patent/US4675282A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-02-07 CA CA000473754A patent/CA1244345A/en not_active Expired
- 1985-02-08 AU AU38570/85A patent/AU3857085A/en not_active Abandoned
- 1985-02-12 NO NO850536A patent/NO850536L/no unknown
- 1985-02-12 SE SE8500620A patent/SE8500620L/xx not_active Application Discontinuation
- 1985-03-04 DK DK99185A patent/DK99185A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-03-25 JP JP6051285A patent/JPS6125060A/ja active Pending
- 1985-04-30 IT IT67398/85A patent/IT1183809B/it active
- 1985-05-02 DE DE19853515803 patent/DE3515803A1/de not_active Ceased
- 1985-05-31 NL NL8501564A patent/NL8501564A/nl not_active Application Discontinuation
- 1985-06-12 FR FR8508919A patent/FR2567269A1/fr active Pending
- 1985-06-14 BE BE0/215192A patent/BE902663A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-07-05 CH CH2898/85A patent/CH666285A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-07-05 GB GB08517164A patent/GB2161270A/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3857085A (en) | 1986-01-09 |
| JPS6125060A (ja) | 1986-02-03 |
| IT8567398A0 (it) | 1985-04-30 |
| BE902663A (fr) | 1985-09-30 |
| SE8500620L (sv) | 1986-01-07 |
| NL8501564A (nl) | 1986-02-03 |
| SE8500620D0 (sv) | 1985-02-12 |
| NO850536L (no) | 1986-01-07 |
| DE3515803A1 (de) | 1986-01-16 |
| FR2567269A1 (fr) | 1986-01-10 |
| GB2161270A (en) | 1986-01-08 |
| DK99185A (da) | 1986-01-07 |
| IT8567398A1 (it) | 1986-10-30 |
| IT1183809B (it) | 1987-10-22 |
| CA1244345A (en) | 1988-11-08 |
| GB8517164D0 (en) | 1985-08-14 |
| DK99185D0 (da) | 1985-03-04 |
| US4675282A (en) | 1987-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69624593T2 (de) | Verfahren zum nachweis von bakterien | |
| DE3750782T2 (de) | Zellinie, die virale Aids-Antigene produziert, ohne infektiöse Viruspartikel zu produzieren. | |
| DE2128670A1 (de) | Immunologische Isoenzym Bestimmungs methode | |
| DE2516274C2 (de) | Verfahren zum Herstellen eines abgeschwächten Zytomegalie-Virus-Impfstoffes | |
| CH666050A5 (de) | Verfahren zur herstellung von interferon epsilon. | |
| DE2514536A1 (de) | Verfahren zur reaktivierung von interferon | |
| DE2713371C2 (de) | ||
| DE2532779C3 (de) | Verfahren zum elektroquantitativen Bestimmen von Proteinen | |
| CH666285A5 (de) | Verfahren zur bestimmung von interferon epsilon in einer probe. | |
| DE3030806A1 (de) | Verfahren zur durchfuehrung von enzymimmunobestimmungen. | |
| DD232822A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines viruspraeparates gegen die mareksche gefluegelkrankheit | |
| DE69810169T2 (de) | Verfahren zur Bewertung des sensibilisierenden und/oder irrtierenden und/oder allergenen Potenzials eines Produkts | |
| Habel et al. | Intraspinal inoculation of mice in experimental poliomyelitis | |
| CH664575A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines interferonpraeparates mit antiviraler aktivitaet. | |
| EP1510219A1 (de) | Verfahren zur Identifikation mindestens eines Aminopeptidasen-Inhibitors | |
| CH646875A5 (de) | Verfahren zur gewinnung eines interferons und interferon hergestellt nach diesem verfahren. | |
| DE102018131696B4 (de) | Verfahren für die Analyse einer Blutprobe eines Menschen auf eine Tuberkuloseerkrankung | |
| EP0183253B1 (de) | Arzneimittel enthaltend einen aus den Peyer'schen Plaques hergestellten Organextrakt zur Behandlung bei Diabetes Mellitus und Pankreatitis | |
| DE69132926T2 (de) | Diagnostischer test für lyme-krankheit | |
| DE2555188C2 (de) | Verfahren zum Nachweis von Antigen oder Antikörper von infektiöser Hepatitis A in einer Probe | |
| EP0016425B1 (de) | Diagnoseverfahren | |
| DE69731983T2 (de) | Verwendung von molt4 cd69 expression zur bestimmung der anwesenheit und der aktivität von interferoninhibitoren | |
| EP1159621B1 (de) | Verfahren zur bestimmung der avidität von antikörpern | |
| DE3009064A1 (de) | Verfahren zur herstellung eines tollwutimpfstoffes und danach erhaltener impfstoff | |
| DE1617775B1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten R¦teln-Lebendvirusimpfstoffes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased | ||
| PL | Patent ceased |