JPS61254196A - 菌体外分泌による蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、遺伝子工学的手法を利用した菌体外分泌によ
る蛋白質の製造法に関する。

さらに具体的には本発明は、アルカリ性ホスファターゼ
由来のゾロモーターをコードする遺伝子を具備すると共
に、その制御下にシグナル配列をコードする遺伝子をも
具備したベクターに、ｙ′ｇＴ望外来性蛋白質をコード
する遺伝子を組込んで組換ＤＮＡとし、これを宿主微生
物（以下微生物を単に「菌」と記すこともある）細胞内
に移入させることにより宿主の形質転換を行って形質転
換体を得て、これを一定条件下で培養することにより所
望蛋白質を宿主菌体外（培地中）に分泌させたのち、培
地中から所望蛋白質を回収することよりなる遺伝子工学
的手法による蛋白質の製造法に関する。

先行技術 現在、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に有用物
質を生産する方法が確立されつつあり、具体的な方法に
ついては種々の放置や文献、公開特許公報および特許公
報を参照することができる。

このような手法による物質の生産方法は、通常、ベクタ
ーに所望物質をコードする遺伝子を組込んで造成した組
換えＤＮＡを用いて宿主微生物を形質転換し、得られた
形質転換体を培養したのち、所望物質を回収することよ
りなるものである。

ところで、上記・方法によって非分泌性の蛋白質の生産
を行う場合、微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌
のプロテアーゼによって分解〔ゾロシーデイングズ・オ
シ・ナショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシズ！オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オシ・アメリカ（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　）、　７９．１８３０−１８３３（１
９８２）　）される恐れがあるので所望蛋白質を安定か
つ大量に得ることができないという問題点があった。ま
た、このような非分泌性の蛋白質を回収するに際しては
宿主微生物を物理的に破壊したのち、所望蛋白質の分離
・精製を行うものであるから、一般にこのような回収操
作は複雑であり、そのため所望蛋白質の収率が低かった
り、活性を有するものは回収操作中に失活する恐れもあ
るという問題点があった。

そこで、上記問題点に対処すべく、蛋白質の膜通過に関
与するシグナル配列［蛋白質・核酸・酵累、２６　、３
８６〜３９４（１９８１）　］　の作用を利用して、宿
主微生物細胞内で産生された蛋白質を細胞外あるいは細
胞質膜外に分泌させる方法か槙々提案された（公開特許
公報　昭５５−１９０９２号、同５５−４５３９５号、
同５６−１３７８９６号、同５６−１．４５２２１号、
同５６−１５４９９９号各公報等）。

ところで、上記シグナル配列を利用した遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造において組換えＤＮＡが移入され
得る宿主微生物は、大腸菌が普通である。この大腸菌は
ダラム陰性圀であって、このような閑には細胞質膜およ
び外膜がある（これらの膜間をペリプラズムという）と
ころ、このような菌に組換えＤＮＡを移入させて形質転
換体としてこの形質転換体を通常の培養に付すと、断水 望蛋白質はべりプラズムに蓄積させる。このペリプラズ
ムに蓄積された蛋白質は、オスモティック・ショック法
しジャーナル・オシ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、　）　、　２４０　、３６
８５（１９６５）　］　　によってペリプラズムから菌
体外へ放出させなければ回収することができない。この
オスモティック・ショック法は、ます遠心により菌体を
回収したのち、これを高濃度ショ砧液シ２０％シューク
ロース、３０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１
　ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　：）に懸
濁させてから集菌し、さらにこの菌体を冷水に懸濁させ
、そして水浴中で放置することにより所望蛋白質を含む
両分を菌体外に放出させ、ついで遠心により上清（所望
蛋白質を含む）を得る、という方法である。そして所望
蛋白質を回収するには、さらにクロマトグラフィー等に
よってこの上清を処理するのである。このように従来か
ら太１曲菌のようなダラム陰性菌を宿主とし、これに蛋
白質の分泌機能を具備した組換えＤＮＡを移入させて形
質転換体を得て、これを培養することにより所望蛋白質
を生産さぜるという方法は、ダラム陽性昭（枯草菌、酵
母菌等）を宿主とした場合に比べ余分な処理操作（オス
モティックショック法）が必要となる。

しかしなから、これらダラム陽性函を宿主とする場合は
、これらに移入された組換えＤＮＡの安定＋（ｔに問題
点を有する上、大腸菌はど宿主−ベクター系も開発され
ておらず、また酌の取扱いも大腸菌はど容易でない。

従って、大腸凶のような一般的な菌株を宿主とし、効率
よ（しかも大量に所望の蛋白質を製造する方法の開発か
望まれている。

発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、アル
カリ性ホスファターゼ由来のプロモーターをコードする
遺伝子（以下プロモーター遺伝子という）を具備し、そ
の制御下にシグナル配列をコードする遺伝子（シグナル
遺伝子）をも具備したベクターに、所望の外来性蛋白質
をコードする遺伝子（外来性蛋白質の構造遺伝子）を組
込んで組換えＤＮＡを造成し、この組換えＤＮＡを宿主
微生物細胞内に移入させて形質転換体となし、この形質
転換体を一定条件下で培養することによって所望蛋白質
を菌体外（培養液中）に分泌させ、これを回収する、と
いう遺伝子工学的手法による蛋白質の製造法を提供する
ことにより本目的を達成しようというものである。そし
て、本発明は、ダラム陰性菌（大腸＠）を本発明の方法
に従って形質転換してこれを培養すれば所望蛋白質は菌
体が溶菌することなしに菌体外（培地中）に分泌されて
いること、また所望蛋白質が菌体内（細胞質内）に殆ど
留まることがないことを確認してなされたものである。

従って本発明による菌体外分泌による蛋白質の製造法は
、下記ＦＡ）〜（Ｄ）の工程よりなること、１を特徴と
するものである。

仄）　アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターを
コードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナ
ル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿
主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意すること
。

（Ｂ）　　上記ベクターに外米性蛋白質をコーＩＳする
遺伝子を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組
換えＤＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより
宿主の形質転換を行って、形質転換体を得ること。

（Ｃ）　　上記形質転換体を、微生物の増殖過程におけ
る対数増殖期後期から停止期前ル］にかけて蛋白質合成
能の蒋専がおこるに必要プよ量の無機燐を含有する培地
での培養に付すこと。

（ＤＪ　　上記培養終了後、培地中より外来性蛋白質を
回収すること。

効果 このように本発明は、ダラム陰性菌（大腸菌）を用いた
遺伝子工学的手法による蛋白質の造成にあたり、従来の
ように所望蛋白質をペリプラズムに留めることなく菌体
外（培地中）への分泌を行うへ＜、（イ）アルカリ性ホ
スファターゼ由来のプロモーター遺伝子を具備し、その
制御下にシグナル遺伝子をも具備するものであって、か
つ（ロ）予定した宿主細胞内で増殖可能なベクターを用
意し、ついでこれに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えＤＮＡとし、これを宿主菌に移入させる
ことによって形質転換体を得て、これを一定条件下（ｂ
ｔＪ記の工程（Ｃ）で）培養することにより所望蛋白質
を菌体外（培地中）に分泌させ、これを回収することが
なる遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方法に関する
ものである。

本発明の好ましい態様は、上記（イ）および（ｏ）より
なるベクターが、そのシグナル遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を結合し得るように
仕組れたものを用いる方法である。

そしてシグナル遺伝子の直後に外来性蛋白質の構造遺伝
子の導入全容易にするならば、シグナル遺伝子の塩基対
の少な（とも一つを構成員の少なくとも一部として人工
的に創出された制限酵素認識部位を有するものを用いる
とよい。

この部位を創出するに当っては、ＤＮＡ塩基対からなる
コドンには縮重があるということを巧みに利用すること
ができる。すなわち、ｄ１１出された制限酵素認識／切
断部位を該制限酔メ（で切断すれば、その切断部位かシ
グナル遺伝子の下流（［末端に接して存在する場合は、
該制限酵素切断端と相補性の端部を上流側に形成させた
外米性遺伝子を用意してこれ全上記切断端においてシグ
ナル遺伝子と結合さぜることによってシグナル遺伝子の
下流側に外来性遺伝子を直結させることかできる。

また、シグナル遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流側末
端より上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断部位
より下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側に結
合した断片を用意して上記と同じに結合を行えは、一旦
切断されたシグナル遺伝子かＤＮＡの両鎖について復元
されると共にその下流側に外米性遺伝子が直結された構
造か実現される（詳細後記）。

このようなベクターに所望外米性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡで宿主菌
を形質転換して形質転換体を得て、これを一定条件下（
本発明の工程（Ｃ）により）で培養すれば、宿主菌が大
腸菌のようなダラム陰性菌であっても、所望蛋白質はペ
リプラズムに蓄積することなく菌体外（培養液中）−１
：で分泌される。

そして培養液中から所望外来性蛋白質を回収することに
より本発明の目的か達成される。

従って、本発明は、前記の問題点を回避するとともに下
記の利点を有するものである。

（１）遺伝子工学的手法による蛋白質の製造・回収工程
が簡素化される。

本発明の方法に従えば、上記（イ）および（ロ）の要件
を満すベクターに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組
込んでなる組換えＤＮＡで宿主微生物を形質転換して形
質転換体を得てこれを培養すれは、所望蛋白質は成熟蛋
白質として（シグナル配列は蛋白質がペリプラズムに分
泌されるときに切断されている）培養液中まで分泌され
る。すなわち、形質転換された宿主微生物をオスモティ
ック・ショック法に付することなく、培養液中から蛋白
質（１］） を回収するだけでよいのである。従って遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造・回収工程が簡素化されることに
なる。

なお、本発明方法はダラム陽性閑にも適用されるのであ
るか、枯草菌のようなダラム陽性閑はペリプラズムかな
いので、本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中に
まで分泌されるということはいうまでもない。

（２）所望蛋白質の精製が答易壬ある。

本発明の方法に従えは所望蛋白質は培養液中まで分泌さ
れ、その分泌の際にシグナル配列は膜酵累によって切断
されるのでシグナル配列が句着していない蛋白質か得ら
れる。ここで得られる蛋白質は、シグナル配列をコード
する遺伝子と所望蛋白質をコードする遺伝子との間に余
分な遺伝子（リンカ−としてのＤＮＡ遺伝子）か存在す
れば、余分なアミノ酸を付着したままで分泌される。し
かしなから、本発明の一具体例で示されたようにシグナ
ル配列をコードする遺伝子の直後に所望蛋白質をコード
する遺伝子を結合しておけは、所望蛋白質は余分なアミ
ノ酸が付着することなく完全な成熟蛋白質として培養液
中に分泌される。従って、形質転換体の培養を菌体が溶
菌していない時期に終了しておけば、培養液中には実質
的に所望蛋白質および培養液の構成分のみが存在するこ
とになる。使用した培養液はその構成成分か判っている
のであるから、従って、目的蛋白質の精製は容易である
。

発明の詳細な説明 本発明は菌体外分泌による蛋白質の製造法に係るもので
あるところ、この方法は工程（Ａ）〜ＣＤ）より本発明
に用いるベクターは、本発明の工程（Ｃ）における培養
方法か、アルカリ性ホスファターゼが無機燐の存在量に
より影響を受ける〔ビオキミカ・工・ビオフイジカ・ア
クタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　）　、　３８．４６０（１９６０）、ネー
チアー（Ｎａ−ｔｕｒｅ　）　ｒすは、　１５２９（１
９５９）］という事実を利用するものであるところから
、アルカリ性ホスファタ−ゼ由来のプロモーター遺伝子
を具備することを要件であり、そして、さらに、蛋白質
の分泌に関なもの（前記（イ）および（ロ）の要件を満
すベクター）であればよい。そして、このようなベクタ
ーとして特に好ましいものは、（イ）およＵ’　（１’
）の必須要件を具備したうえ、シグナル遺伝子の下流側
末端直後に所望の外米性蛋白質の構造遺伝子′ｆ：結合
させ得るように仕組れだものである。この好ましいベク
ター（プラスミド）の具体例としては、本発明者らの共
同研死者によって先に提案されたプラスミドＰＴＡ５２
９（特願昭５８−１．４０７４８号）、ｐＴＡ１５２９
　　（特願昭５９−１５９７０３号）、ｐＴＡ　２５３
９（特願昭５９−２７９５８５号）：４がある。これら
のプラスミドはいずれもアルカリ性ホスファターゼ由来
のプロモーターおよびシグナル配列（前二者については
アルカリ性ホスファターゼ由来、ｐＴＡ２５３９はβ−
ラクタマーゼ由米）を具備１゛るものであり、かつシグ
ナル配列をコードする遺伝子の直後に外来性蛋白質の構
造遺伝子の結合が可能なものである。ここでｐＴＡ　１
５２．９は、ｐＴＡ　５２９（ｐＹＫ　２８３［Ｅ、ｃ
ｏｌｔ　Ｋ］２Ｃ６００（ｐＹＫ　２８３）として微工
研に寄託（微工研条寄第５５６号）〕をもとにしてこれ
を特願昭５８−１．４．０７４８号の明細書に記載の方
法に従って造成したもの）とｐＨ８Ｉ　　Ｉこのアラニ
ンＰは、ｐＢＲ３２２［Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｃ６００
（ｐＢＲ３２２）として微工研に寄託（微工研条寄第２
３５号）〕全制限酵酵素ｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ　ｌｌ
で消化し、このＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　Ｉｎ部分を下
記の塩基配列（１）で示される合成リンカ−と置換した
もの（特開昭５９−７１６９２号公報参照）ｌとから造
成したものである。このプラスミドの造成操作の詳細は
特願昭５９−１５９７０３　号の明細書を参照されたい
。

ＥｃｏＲＩ　　Ｈｐａ　Ｉ　　Ｓｍａ　Ｉ　　Ｈｉｎｄ
　ｍここで破線は制限酵累切＠部位を示し、ＥｃｏＲｊ
等はその切断を行う制限酵素の名称を示す。

また、ｐＴＡ　２５３９は、ｐＴＡ　１５２９のアンピ
シリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に変換し、
さらにシグナル配列をβ−ラクタマーゼ由来のものに変
換したプラスミドである。このアラニン１：″造成の詳
細は、特願昭５９−２７９５８５号の明細書を参照され
たい。

ここでＰＴＡ　１５２９は下記の塩基配列（ＩＩ）から
なるＤＮＡ部分を含むので、シグナル遺伝子の直後に外
来性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なプラスミドであ
る。

配列（ＩＩ）はシグナル遺伝子部分（１）とその下流側
に結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているか、本
発明の一実施態様でいう［シグナル配列をコードする遺
伝子の下流側末端直後に所望外米性蛋白質をコードする
遺伝子を結合させ得るように仕組れたもの」とは、この
ようなりＮＡ部分を含むものである。なお、本発明にお
いてＤＮＡに関して「下流側」というときは、５′→３
′鎖（■鎖）を上に３′←５′鎖（ｅ鎖）を下に表示し
たときの右側を意味する。

塩基配列（Ｉｆ）は、二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ遺伝
子の一部を示すものであって、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそ
れぞれアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンを示
しく前記の（１）も同様）　、Ｌｙｓ　％Ａｌａおよび
Ｔｒｐはそれぞれリジン、アラニンおよびトリプトファ
ンを示す。この二本鎖ＤＮＡの区域（１）はシグナル遺
伝子部分であり、区域（３）は制限酵素ｆ（ｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ　の認識部位であり、破線はＨｌｎｄ　Ｉｎ切断部
位である。区域（２）は、シグナル遺伝子の下流側の直
後に結合されたＤＮＡ部分である。

本発明に用いるベクターは、シグナル遺伝子がアルカリ
性ホスファターゼ由来であるものである。

この遺伝子の塩基配列は、下流側末端のアラニンのコド
ンがＧＣＣである。

一方、上記塩基配列（１１）は、アルカリ性ホスファタ
ーゼ由来の遺伝子の部分（１）の下流側末端のアラニン
のコドンＧＣＣをＧＣＴに、さらに続く塩基ＣをＴに改
変したものに相当する。アラニンのコ１２ンには縮重が
あるから、改変後のＧＣＴもアラニンのコドンであり、
従って上記（ｌ′ｌ）のＤＮＡ部分（１）は依然として
アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝子に対応
するＤＮＡである。

ところで、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺
伝子は、その下流倶］末端のアラニンのコドンの上流側
にリジンのコドンＡＡＡおよび下流１則にアルギニンの
コドンＣＧＧを有する。

従って、アルカリ性ホスファターゼ出来のシグナル遺伝
子か本来有していた下流末端のアラニンのコドンＧＣＣ
をＧＣ，Ｔに改変し、さらにアラニンに続く塩基ＣをＴ
に改変したことによって、この末端の塩基対と上流側の
４塩基対および下流側の１塩基対とで制限酵素用ｎｄｎ
ｌ　の認識部位（３）ＡＡＧＣＴＴが現出している。す
なわち、シグナル遺伝子には、少な（とも該末端の塩基
対を構成員の少なくとも一部とする制限酵素認識部位が
６１１出されている訳である。

ｐＴＡｌ、５２９の上記（ＩＩ）の具体例では、Ｈｉｎ
ｄ　［［ｌの認識部位（３）内の切断部位は破線で示し
た通りであって、その位置はシグナル遺伝子とその下流
側直後に結合されていることあるべきＤＮＡ部分（上記
ｐＴＡ５２９に係る塩基配列（］］）では、既に結合さ
れている区域（２））との間に存在している（切断部位
の位置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味する）。

制限酵素切断部位がこのような位置に存在することは、
本発明に用いるベクターにおいて最も好ましいことであ
る。何故ならば、この切断部位はそれを利用して外来性
蛋白質の構造遺伝子をこのシグナル遺伝子に直結するだ
めのものであり、一方この雑種遺伝子が発現して生じる
雑種ないし融合蛋白はシグナル配列とそれに続く蛋白と
の間でシグナル・ペプチダーゼによって切断されるので
あるから、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダーゼ
切断位置とかこのように一致していれば、上記ｐＴＡ１
５２９　　の列でいえば外米性蛋白質の構造遺伝子（こ
の例では、ＴｒｐのコドンＴＧＧで始まっている）の吊
鎖の５′−側にＡＧＣＴを補なっておくだけで、Ｈｉｎ
ｄ　Ｉｌｌ　消化後のシグナル遺伝子の粘着末端との間
の結合か可能だからである。なＦ、外来性遺伝子のｅ鎖
の：３′−側にも塩基を補なうことを厭わなければ、制
限酵來切（析部位か上θ１を側に存在しでもよいことは
いうまでもなく、そのような切断部位の存在するベクタ
ーもまた本発明に用いられるベクターの範囲内である。

１シグナル配列をコーｒ′１−る遺伝子」は、一般にシ
グナル配列の８１類に応じて各種の塩基配列のものがあ
る。シグナル配列の具体例をいくつか挙げれは、β−ラ
クタマーゼのものしプロシーデイングズ・オシ・ナショ
ナル・アカデミ−・オシ・サイエンシズ・オシ・ユナイ
テッド・ステーツ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、’Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、）、遷、３７３７（１９７８）　）、リボ蛋白のも
のし同上、旦、１００４（１９’７７）　）、アルカリ
性フォスファターゼのものしユーロビアン・ジャーナル
・オシ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　）、９６．４９（１９７９）　１等がある
。シグナル配列については、「蛋白質・核酸・酵素」臨
時増刊号（「遺伝子操作」）、第２６巻、＄４号、第３
８６−３９４頁、を参照することができる。しかしなが
ら、本発明で使用する好ましいシグナル配列は、アルカ
リ性ホスファターゼの塩基配列のものおよびβ−ラクタ
マーゼ由来のものがある。このようなシグナル配列を具
備１−る上記プラスミドであれは、本発明の工程（Ｃ）
の培養方法を利用することにより前記したような利点が
得られるからである。

上記（ｎ）に示した本発明に用いるプラスミド（ベクタ
ー）か具備するＤＮＡ遺伝子の一具体例は、アルカリ性
ホスファターゼ出来のＤＮＡを改変してつくったもので
あるから、シグナル遺伝子ＤＮＡの部分（１）の１流側
末端直後にアルカリ性ホスファターゼ由来のＤＮＡ部分
（２）が結合している。本発明の具体例は、このＤＮＡ
部分（２）が外米蛋白をコードする遺伝子に対応するＤ
ＮＡ部分であるものである。

なお、この具体例の範調に属する本発明に用いるシラス
ミドが具備するＤＮＡ遺伝子の一例は、シグナル遺伝子
部分が天然物由来の８１５分と合成された部分とからな
るものである。すなわち、制限酵素切断部位より上流側
か天然物由来の部分であり、下流側か合成されたもので
ある。この場合の下流側の合成された部分は上記（■）
シたような切断部位の位ｌ′直の場合にはΦ鎖の４塩基
（ＡＧＣＴ）であるか、切断部位がこれより上流側に存
在ずれはθ鎖にも合成部分か必要となることはいうまで
もない。

微生物の形質転換は、組換えＤＮＡ技術の分野における
公知の常法に従って行うことかできる。

例えは、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡ（キメラプラスミド）とし、
これ金柑いて微生物を公知の方法〔例えはクシュナー法
；ジエネテイツク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　）　）Ｋ９７８　）１７（
１，９７８）］に従って形質転換したのち、所望の形質
転換体を取得（通常はシラスミドのマーカーを利用する
）する合目的的な任意の方法によって行うことができる
。

本発明によるこのようなキメラプラスミドによって形質
転換しつる微生物は、その菌体内で上記シラスミドか増
殖し得るものであればよく、具体的には大腸菌、枯草菌
および酵母菌等がある。なかでも大腸菌が比較的よ（利
用されており、そして本発明は大腸菌のようなダラム陰
性菌を宿主菌として用いるとぎに特に前記したような効
果を有するものである。大腸菌としては、例えは、Ｆ；
、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　Ｃ６００（微工研条寄第１１５号
）、ＩＣ，ｃｏｉｌ　Ｋ１２　Ｙｌ（５３７（倣工研菌
寄第７９４１号）、Ｅ、ｃｏｉｌ　ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ
’３１４４７）およびＥ、ｃｏｉｌ　ＨＢＩＯＩ（ＡＴ
ＣＣ３３６９４）　　等がある。本発明の具体例ではＥ
、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　ＹＫ５３７、Ｅ、ｃｏｌｔ　ＲＲ
ＩおよびＥ、ｃｏｌｔＨＢ　１０１を用いている。

本発明において使用したこのような形質転換体の具体例
は、シラスミｌ’　ｐＴＡ１５２９（前記）に人工的に
合成したｈ−ＥＧＦ（後記）の構造遺伝子を組込んでキ
メラシラスミドｐＴＡ１５２２　　’を造成し、ついで
このキメラシラスミ）３（組換えＤＮＡ　）を宿主菌Ｅ
、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　ＹＫ５３７、Ｅ、ｃｏｌｔ　ＲＲ
ＩおよびＩ’；、ｃｏｌ＋Ｉ（Ｂｌｏｔに移入させるこ
とにより造成した形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　Ｙ
Ｋ５３７　（ｐＴＡ１５２２）、Ｅ、ｃｏｌｔ　ＲＲＩ
（ｐＴＡ１５２２）のよひＥ、ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ（
ｐＴＡ１５２２）であり、′また、ｐＴＡ、２５３９　
　に上記と同様に人工的に合成したｈ−ＥＧＦの構造遺
伝子を組込んでｐＴＡ２５３２　　を造成し、これでＥ
、ｃｏｌ’ｉ　Ｋ１２　ＹＫ５３７　　を形質転換する
ことにより造成した形質転換体Ｐ；、ｃｏｌｔ　Ｋ１２
　ＹＫ５３７（ｐＴＡ２５３２）である。

なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経
ペプチドおよび酵素等のものか考えられる。これらの構
造遺伝子の調製方法としては、天然の染色体ＤＮＡより
取得する方法や、あるいは人工的に合成する方法等が考
えられ、実際の構造遺伝子の調製方法については柚々の
底置や文献を参照することができる。

本発明の一具体例においては、このような外来性蛋白質
の構造遺伝子としてヒト上皮細胞成長因子（ｈ−ＥＧＦ
Ａ−ＵＧ０以下ｈ−Ｆ、ＧＦ　　と記す）をコードする
遺伝子であって化学的に合成したもの（合成の詳細は特
願昭５８−１２３５２０号の明細書参照のこと）、を用
いた。

工程（Ｃ）／微生物の培養 本発明の工程（Ｃ）による培養は、アルカリ性ホスファ
ターゼ由来のプロモーターを具備するベクター（シラス
ミＰ）に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組込んでキ
メラシラスミー（組換えＤＮＡ　）とし、これを宿主微
生物に移入させることにより形質転換した微生物を対象
とするものである。そして、本工程の培養方法の特徴は
、形質転換された微生物が保持しているベクター（シラ
スミＰ）の性質、すなわち（無機燐蓋に依存して蛋白質
合成能に誘導がかかったり、かからなかったりする性質
（前記ビオケミストリー・工・ビオフイジクス・アクタ
およびネーチア）、を巧みに利用して、単一の培養系に
おいて微生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白質の
誘導とをおこなわせるということである。

このような培養方法の詳細は、下記の通りである。

■）培養法 本工程による微生物の培養方法は、形質転換された微生
物を単細胞純粋分離培養し、ついで前培養に付したのち
（以上は微生物を培養する場合の公知の常法であり、多
数の文献や底置を参照することができる。例えは、底置
「微生物学実験法」（講談社刊）、［倣生吻実１倹法−
１（共立出版刊）、１細凶学実習提要」（丸善刊）等が
ある。）、単一の培養系においてその培Ｓｔ行うことか
らなるものである。

この単一の培養系は通気攪拌培養の範喚に属するもので
あって、具体的には、培養系において菌を接種したのち
培地に無菌空気（必要に応じて純酸素を混入したもの）
を導入し、これを物理的に攪拌しつつ、ｐＨ，温度、溶
存酸素濃度等を、培養する微生物の生育条件に適合させ
て好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる
。

このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアンプが可能であること
はいうま、でもない口戊書［生物化学工学−１（上）、
（下）巻（東京大学出版会）参照］。

２）培地 本工程に用いる培地組成は、ＬＢ培地（トリプトン、酵
母エキス、ＮａＣ１）　　を基本培地とし、必要に応じ
て他の成分（例えはＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、抗生物質等
）を添加したものであって、さらに形質転換された微生
物の増殖過程における対数増殖期後期から停止期前期に
かけて蛋白質合成能の訪４を起すに必要光分散の無機燐
を含有するものより構成される。また、必要に応じて添
加する抗生物質として、本発明の具体例ではＥ、ｃｏｌ
ｔ　Ｋ１２　ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）　Ｅ、ｃｏ
ｌｔ　ＨＢｌｏｌ（ｐＴＡ１５２２）およびＥ、ｃｏｌ
ｔＲＲＩ（ｐＴＡ１５２２）　　を培養する場合はアン
ピシリンを添加し、また、Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　ＹＫ
５３７（ｐＴＡ２５３２）を培養する場合にはカナマイ
シンを添加している。これらの本発明の具体例において
各々の形質転侠体が保持しているプラスミドは、各々ア
ンぎシリン耐性、カナマイシン耐性遺伝子を具備してい
て、形質転換体は各々アンピシリン耐性、あるいはカナ
マイシン耐性となっているから、培養中で各々プラスミ
ドが脱落した菌（耐性がない）は培地中のアンピシリン
若しくはカナマイシンによって成育か抑制されるので、
プラスミドを保持している宿主菌のみが成育することに
なる。このように、培地への抗生物質の添加は、宿主菌
の生育上の便宜を図るための一手段である。

３）培養条件 （１）培養温度 培養温度は、使用する微生物の増殖または生育が可能で
、かつ産生物が安定である温度であれはよい。通常用い
る大腸菌および本発明に使用した大腸菌の場合は、３７
°Ｃが好ましい。

（２）培養時間 本工程の培養時間は、培養液中に分泌されている所望物
質の産生量が最大となる時間か好ましい。

そして、さらに好ましい培養時間は、凶が浴園せすにか
つ所望蛋白質が培養液中に多量に分泌されている時間で
ある。本発明の一具体例では、ｈ−ＥＧＦ　　を製造す
る場合は約１４時間を採用している。それ以上培養を行
うと、菌体が溶菌し、菌体中の種々の雑多な物質が培地
中に混入するに到って所望蛋白質の回収か難しくなるか
らである。このような培養時間の検討は、培地中のグル
コースおよび無機燐の定量、０Ｄ６６ｏの測定、生菌数
の測定、ペリプラズム中および培養液中の産生物質の定
量を指標として行うことができる。グルコースの定量は
グルコースオキシダーゼ法にューグルコスタット「フジ
サワ」のキットを利用。）により、生菌数はＥ、ｃ６１
１　Ｋ１２　ＹＫ５３７　（ｐＴＡ１５２２）　の場合
についていえはアンピシリン［Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｙ
Ｋ５３７　（ｐＴＡ２５３２）の場合はカナマイシン〕
を含むＬ−培地（前記）の寒天上に生育するコロニー数
を測定することにより、無機燐の定量はモリブデンブル
ー法（工場排水試験方法：　ＪＩＳ　Ｋ　０１０２）に
従って行い、また培養液中の産物ｈ−ＥＧＦの尾鷲はま
す培養液（１０ｒｎｇ）をとり、これを遠心したのち上
清をＲＲＡ法（後記）に従って行い、ペリプラズム中の
ｈ−ＥＧＦ　については菌体をオスモティック・ショッ
ク法し前記Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　］によって処理
後、この離液を遠心して上清をラジオレセプターアッセ
イ（ＲＲＡ）法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカルケ
ミストリ＝（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）。

μ５７．３０５３（１９８２）　：１によって分析する
ことによりなお、ここで、菌体内で発現されたｈ−ＥＧ
Ｆが菌体内（細胞質内）に存在しているかどうかをも調
べた。

すなわち、上記オスモチインク・ショック処理後、得ら
れた沈殿（菌体）を純水ＶＬＣ書度懸濁させたのち、超
音波処理を行って菌体を行い、ついで遠心を行って上清
を得、この上清を上記ＲＲＡ法に従って分析することに
より、菌体内（細胞質内）のｈ−ｇＧＦを定量した。

（３）培地のｐＨ ｐＨは微生物の生育可能な範囲であればよく、用いられ
る微生物によって適宜好呼しいｐＨを設定すればよい。

大腸菌を用いる場合には、大腸菌の生育可能なｐＨは通
常４．６〜８．８であり、このうちｐ　Ｈ７，０〜８゜
０の間が特に好ましい。

（４）消泡剤 培養中発泡の著しいときは、消泡剤（高級アルコール、
植物油等）を添加するのか常套手段である。本発明の場
合において用いる消泡剤は無機燐の存在量によって微生
物の蛋白質合成能を制御するのであるから、無機燐を含
有しないものであることが肝要である。そのような消泡
剤の具体例としてハ、［アンチホーム−ＡＦ−エマルジ
ョン」（牛丼化学）がある。

（５）＃存酸素（Ｄｏ） 浴存酸素とは、液相中に俗解している分子状酸素のこと
をいう。

一般に通気攪拌培養に際しては、ＤＯが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、一方ＤＯがｌｐｐｍ以下になっ
ても同様に増殖が阻害されるということか知られている
。従って、ＤＯ量を微生物生育の阻害因子とならないよ
うに制御することが好ましい。本発明の一具体例の場合
はＤｏコントロール装置〔オリエンタル電気■）ＦＣ−
４Ｗ１によりＤＯｉを４　ｐｐｍに保持している。

工程の）／蛋白質の回収 生成蛋白質の回収は、公知の常法に従って行うことがで
きる。

例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフイニテイク
ロマトグラフイー、電気泳動法、高速液体クロマトグラ
フィーあるいはこれらを種々組合せた方法等〔底置［−
生化学央験構座１タンＡり質の化学１１日本生化学金線
、東京化学同人刊（１９８２）参照〕かあり、精製する
蛋白質あるいはペゾチＰの性質にあわせて適当なものを
選択して使用すれはよい。

本発明の一実施例では、培養終了後の培養液を遠心し、
ついで得られる上清を逆層カラムに通じてグル濾過を行
ってｈ−ＥＧＦか含有されている画分を集め、ついでこ
の画分をＤＥＡＥ−’Ｉ”０ＹＯＰＥＡＲ犯（イオン父
侠）に通じることによりｈ−ＥＧＦ　画分を分離して、
所望画分を回収した。なお、本発明の方法に従って産生
された目的蛋白質をより多（しかも効率よく回収しよう
とするならば、培養液中に分泌される目的蛋白質の量が
多（かつ菌体が溶菌していない時期に培養を終了して、
培養液中から目的蛋白質を回収すると共に菌体を集菌後
にオスモチインク・ショック法に対してペリプラズム中
の目的蛋白質を回収すればよい。本発明の方法によれば
宿主菌体内で産生された目的蛋白質は菌体内（細胞質中
）に留ることなくペリプラズムあるいは培養液中のいず
れかに分泌されているので、この回収法によれは菌体内
で産生された殆んどの蛋白質か回収されるであろう。な
お、ペリプラズム中の蛋白質の回収は、例えば、本発明
者らの共同研究者らによって先に提案された特願昭印−
２２６３０号の方法によればよい。

実　　　　験　　　　例 実施例１ （１）形質転換体の造成 下記の方法に従って、形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２
ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）　　を造成した。

ｐＴＡ１５２９　（造成の詳細は％願昭５９−１５９７
０３号の明細書参照）５μｇを、５０μｌの緩衝液〔１
０ｍ　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　）（ｐＨ７，５）、Ｈ，）　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ＋２．５
０　ｍ　Ｍ　ＮａＣ］　〕　中で４単位の制限酵素Ｈｉ
ｎｄ　■Ｃタカラ〕（以下Ｈｉｎｄ　ｍ　）を用いて３
７℃で１時間加水分解した。ついで、エタノール沈殿を
行い、得られた沈殿物を、３０μｌの反応液［６７ｍ　
Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ａ−ＨＣＩ、（ｐＨ８，８）　１６．６
ｍＭ硫酸アンモニウム［以下（ＮＨ４）２ＳＯ４１，６
，７ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸下ＥＤＴＡ　）、
０．６６　ｍ　ＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　
ｄＧＴＰ　、ＴＴＰ　）中で１単位のＴ４−ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて、：３７℃で１５分間処理した。つい
で、エタノール沈殿物を、５０　μｌの反応液［６ｍ　
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）６　ｍ　Ｍ　Ｍ
ｇＣｌ２．１５０　ｍＭ　ＮａＣ１］中で４単位の制限
酵素Ｓａｌ　Ｉ　〔タカラ〕（以下、Ｓａｌ　ｌと記す
）を用いて３７℃で１時間加水分解した。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動によって、３９００ｂｐ　　の
ＤＮＡ断片（第１図中■）を得た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＵＧ［ｐＢＲ３２２（Ｅ、
ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｃ６００＜ｐＢＲ３２２＞として寄託
済み〔微工研条寄第２３５号〕）をＥｃｏＲｌおよびＳ
ａｌ　Ｉで消化したものに人工的に合成したｈ−ＥＧＦ
構造遺伝子をＥｃｏＲｌおよびＳａｌ　Ｉで消化した断
片を組み込んだもの〕５μｇを、５０μｌ　の反応液［
１００ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、５０
　ｍ　Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２　）中で
４単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　［タカラ〕を用いて３７
℃で１時間加水分解したのち、上記と同様にＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理を行い、さらにＳａｌ　Ｉ処理を行っ
たのち、アガロースゲル電気泳動によって１６０ｂｐの
　ＤＮＡ断片（第１図中■）を得た。

上記で′ＢＪ＠製した二つのＤＮＡ断片（第１図中■お
よび■）を、加μｍの反応液［２０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ１２
，１０ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ。

０．５　ｍ　Ｍ　ＡＴＰ　］　　中で３００単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ〔タカラ〕を用いて１４℃で１６時間反
応させた。

反応終了後、これで大腸菌Ｋｌ　２ＹＫ５３７の形質転
換を行って、目的のプラスミｒし以下ｐＴＡ１５２２　
）（第１図中■）を官有する形質転換株（Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２　）　）を得た。

（２）形質転換体の培養 不発明者らの共同研究者らにより組換えＤＮＡ技術によ
ってプラスミドｐＴＡ１５２２　　を用いて形質転換さ
れた微生物Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　ＹＫ５３７　（ｐＴ
Ａ１５２２）を以下のようにして培養した。単細胞純粋
分１ｊ７［ｔ　したＥ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　ＹＫ５３７
（ｐＴＡ１５２２）−白金耳をトリプトン１０ｇ／リッ
トル、酵母エキス５ｇ／リンドル、ＮａＣ１５ｇ／リッ
トル、アンピシリン２０１η／リツトルからなる培地１
００ｍＱＣ接種し、５００ｍｅ容の坂ロコルベンで３７
℃で一夜振盪培養を行った。

次に、この培養液１．０　ｍｌをとり、グルコース１．
Ｏｇ／リットル、トリプトン１０　ｇ　／リットル、酵
母エキス５ｇ／リットル、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５
ｇ／リットル、およびアンピシリン２０１η／リツトル
よりなる培地２リツトルに接種し、３リツトル谷のミニ
ジャーファーメンタ−で培養した。培養温度は３７℃、
通気量は０，５　ｖｖｍ　（１ｖｖｍはｌ　ｖｏｌｕｍ
ｅ−ｖｏｌｕｍｅ−ｍｉｎｏｔｅのことで、１分間あた
り培養ｉ１リットルに対して１リツトルの空気か導入さ
れることを意味するものである。）、ｐＨは７．２（４
Ｎ　ＮａＯＨまたは４ＮＨＣ１で調整する）、溶存酵素
（Ｄｏ）濃度はＤＯコントロール装置により攪拌速度を
変化させて４　ｐｐｍ付近に保持した。培養は、グルコ
ースおよび無機燐の定量、生菌数の測定、菌体内（細胞
中）ペリプラズム中および培養液中のｈ−１１ＥＧＦの
定量を経時的に行うことにより、培地中のｈ−ＥＧＦの
量がペリプラズム中のｈ−ＥＧＦ　より多くなるまで行
った。グルツースの定量はグルコースオキシダーゼ法に
ューｆ　／ｌ／　コスタット［フジサワ」のキットを用
いた）に従って行った。生菌数はアンピシリン２０＋ｉ
＃／！Ｊツトルを含むＬ−培地（トリプト２ニ０ 母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣ１　５　ｇ　／リンド
ル）の寒天プレート上に出現するコロニーの数を測定す
ることにより行った。０Ｄ６６ｏは菌体量の指標として
測定したものであり、無機燐の定量はモリブデンゾル−
法（前記）によって行った。菌体内（細胞質中）、培養
液中およびペリプラズム中のｈ−ＥＧＦの定量は下記の
方法で行った。すなわち培養液１０　ｍ．ｌをとり、遠
心分離したのち上清をＲＲＡ法（下記）で分析すること
により培養液中のｈ−ＥＧＦを定量し、ついでこのとき
沈殿物として得られた菌体ｆ、（２０％シュークロース
、０．０２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、Ｅ
Ｉ’ｌＴＡ　Ｏ，００］、Ｍ　　がら′１［る漬液２（
１＋＋εに懸濁させ、室温で１０分放置した。ついで、
再度遠心ｌ−で集菌し、この菌体を２０ｒｎｌｊの冷却
水（０℃〜４℃）に懸濁さ七、水中で１０分間放置した
くオスモティック・ショック法による処理）。

そしてこの懸濁液を遠心して上清を得、この」＝清をラ
ジオリセゾターアッセイ（ＲＲＡ）法によって分析する
ことによりペリプラズム中のｈ−ＥＧＦを定量し、また
、上記オスモチインク・ショック処理後に得られた沈殿
物（ｌ貞体）を純水１０　ｗ；に再懸濁したのちこれを
超音阪処理（１−クゼタインソネーターモデル２００Ｍ
１　）　（１（１分間）を行って菌体を破壊し、遠心（
２７０ｏｏｇ　、　３ｏ分間）して得られた上清をＲＲ
Ａ法（下記）に従って分析することにより、菌体中（細
胞価中）のｈ−ＥＧＦの定量を行った。

ＲＲＡ法は、下記のようにして行った。ます、ヒト鼻咽
腔癌細胞由来のＫＢ細胞（ＡＴＣＣ陥ＣＣＬ　１．７　
）　ｆ　８００　ｍｌのフラスコ中でダルベツコ変法イ
ーグル（Ｄ　ＩｖＩ　Ｅ　）培地〔日永〕中で単層培養
を行った。ついで培地を除き、０．０５％のＥＤＴＡを
含むリン酸平衡化塩溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはか
して、細胞懸濁液を作成した。その後、２０　ｍ　Ｍヒ
ープス（Ｈｅｐｅｓ）　（ｐＨ７，４）を含むハンクス
（Ｈａｎｋｓ）平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回細胞を
洗浄した。細胞をパインディング・ツルージョン（Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　　ＣＤ　ＩＶｉ　Ｅ
培地２０　ｍ　Ｍヒープス（Ｈｅｐｅｓ）　（ｐＨ７，
４）　・０．３５　ｇ　／リットルＮａ）ＩＣＯ３・１
００μｇ／ｍｌストレプトマイシン〕に懸濁後、細胞数
を計算して加万〜４０万／　０．２　ｔｒｄ；パインデ
ィング・ツルージョンとなる様調整し、チューブに０．
２ｍｌずつ分注した。ついで上記の３種の上滑を各々お
よび１２５１−　ｍＥＧＦ　　（マウス上皮細胞成長因
子（以下ｍＥＧＦ））を會む試料液０．２ｍｌをチュー
ブに加えて、３７℃で１時間インキュベートした。細胞
を水冷したＨＢＳＳで３回洗浄後、１０チのトリクロロ
鎖酸〔以下、ＴＣＡ〕にＭ濁させ、グラスフィルターを
用いて細胞を固定する。アセトンでＴＣＡを除いり後、
液体シンチレーションカウンターを用いて計数した。そ
してｈ−ＥＧＦの量をｍＥＧＦに換算した。そのときの
培養時間、０Ｄ６６ｏ１生菌数、無機燐の量、グルコー
ス量およびｈ−ＥＧＦ　　（菌体中（細胞質中）、ペリ
プラズム中および培養液中）の蛍の経時変化を第１表に
第１衣で示されるように、培養時間の経過に伴ってまず
ペリプラズム中のｈ−ＥＧＦの量が増加するが、培養液
中のｈ−ＥＧＦ　Ｏ量も増加し始め、培養開始後１２．
５時間でペリプラズム中のｈ−ＥＧＦ量より培養液中の
ｈ−ＥＧＦＨが多くなった。従って、このような粂件下
では少な（とも１２．５時間以上培養ずればよいことに
なる。なお、菌体中（細胞質中）にばｈ−ＥＦＦが殆ど
残っておらす（第１表）、本発明の方法に従えば菌体中
にはｈ−ＥＧＦは留まっていないといえる。また、第１
表中ｈ−ＥＧＦの比率優）（表中＊＊＊を付記）によれ
ば、菌体内で発現された蛋白質のうち６３チは培養開始
後１２．５時間に培養液中に分泌されていた。

（３）蛋白質の回収 上記培養液１リツトルを遠心分離（１２，０００ｇ。

１０分）して上清を得て、これを逆層クロマトグラフィ
ー（カラムサイズ：直径４．１ｃｍ×長さ８ｃｍ。

樹脂：　Ｐｒｅｐ　ＰＡＫ　５００／ｃ１８　逆層樹脂
（ウォーターズ社））に付して所望蛋白質画分を分離し
た。ついで上記クロマトグラフィーによって得られた所
望画分をＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲ郊（カラムサイズ
：直径１，５６７１１Ｘ長さ２５（：Ｉｎ）カラムに付
したのち、所望蛋白質画分を分離した。なお、ここで得
られた所望蛋白質の両分の一部をとってポリアクリルア
ミド電気泳動を行ったところ、ｈ−ＥＧＦ標品（第２図
中Ａ）と同一位置にバンド（第２図中Ｂ、Ｃ１Ｄおよび
Ｅ）が見られたので、所望蛋白質ｈ−ＥＧＦが回収され
ていることがわかる。また、第２図中のＢ、Ｃ，Ｄおよ
びＥは、所望蛋白質を含むと思われる各々異った４つの
画分白米の′眠気泳動結果を示す。

実施例２ （１）形質転換体の造成 下記の方法に従って、形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２
ＹＫ５３７　（ＰＴＡ２５３２　）を造成した。

ｐＴＡ２５３９　　←第３図中■）５μｇを５０μｍ　
の緩衝液［、６ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，６
ｍ　Ｍ　ＭｇＣ＋２．２０　ｍ　Ｍ　ＮａＣ１］　　中
で４単位の制限酵素Ｎａｅｌ　（Ｎ　。

Ｅ、Ｂ社）を用いて３７℃で１時間消化した。ついで、
エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物をさく４３） らに上記と同様にして用ｎｄｌ１１４単位を作用させた
のち、実施例１と同様にして約ｓｏｏ　ｂｐのＤＮＡ断
片を回収した（第３図中■）。

一方、ｐＴＡ２５３９５μｇを上記と同様にしてＨｉｎ
ｄ　ＩＩＩ　［タカラ１消化後、約３８００ｂｐのＤＮ
Ａ断片として回収した（第３図中■）。

さらに、ｐＢＲ３２２−ｈＵＧ　［前記］（第３図中■
）５μｇを上記と同様にしてＥｃｏＲＩ消化したのち、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行い、さらにＳａｌ　Ｉ
消化後、約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した（第３図
中■）。

そして、実施例１と同様にして上記で得た■、■および
■を結合してｐＴＡ２５３２　　を造成し、これを用い
て形質転換体Ｅ、ｃｏ口に１２ＹＫ５３７　（ｐＴＡ２
５３２　）を得た。

（２）形質転換体の培養 培地組成中アンピシリンをカナマイシンに変更した以外
は上記実施例１と同様にして、形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ
　Ｋ１２　ＹＫ５３７（ｐＴＡ２５３２）を培養した。

そのときの培養時間、ＯＤ　　、生菌数、無機燐の量、
グルコース量およびｈ−ｇＧｐｚの経時変化は第２表に
示す通りであった（なお第２表の木、＊＊特開昭６１−
２５４１９　Ｇ　（１４）第２表の結果からも、第１表
で解析されたようなことが言える。すなわち、培養開始
後】２，５時間で培養液中に分泌されたｈ−ＥＧＦＯ量
がペリプラズム中のｈ　　ＥＧＦ　量より増加し、しか
も、第１表のときと同様に比率で表せは全体の６４％か
分泌されたことになる。従って、このような条件下でも
少なくとも１２．５時間培養すればよいことになる。

また菌体中のｈ−ＥＧＦか殆ど定値されていないところ
から、菌体内で発現された蛋白質は殆どかペリプラズム
中あるいは培養液中に分泌されていることもわかる。

実施例３ 形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２　ＹＫ５３７（ｐＴＡ
１５２２）をグルコース３０　ｇ　／　’）ットル、ト
リフトン２０　ｇ　／　ＩＪットル、酵母エキス］、Ｏ
ｇ　／リットル、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１、Ｏｇ　／　
’）ットルとしｌここと以外は上記実施例１と同様の条
件、同様の方法で培養を行った。そのときの培養時間、
０Ｄ６６ｏ１生菌数、無機燐の蛍、グルコース量および
ｈ−ＥＧＦ量（培地中およびペリプラズム中）の経時変
化は、Ｋ３表に示す。

なお、ここではβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）の経時変化
も示した。ｂｌａは、アルカリ性ホスファターゼ同様ベ
リノラズム酵素であってペリプラズムに蓄積するものだ
からである。従って、本発明による所望蛋白質の培養液
中への分泌か菌体の溶菌によるものであれは、ｂｌａも
培養時間の経過とともに培養液中に漏出すると考えられ
る。本実施例では、所望蛋白質（例えばｈ−ＥＧｒ　）
の培地中への分泌が菌体の溶菌によるものでな（て本発
明の方法に従って培養を行ったために起ったということ
の一つの指標として、ｂｌａを定量したのである。

菌体のペリプラズム中および培養液中のｂｌａの定量は
下記の通りである。すなわち、培養液中のｂｌａの定量
は、培養液１（Ｄｉ／Ｉをとって遠心し、上溝を０．Ｉ
　Ｍナトリウム−リン酸緩側液（ｐＨ７，０）により適
当に希釈してサンプル浴液をつ（す、その０，５〃ｉｇ
（下式■ｒｎｌ）にＰＡＤＡＣ（ｂｌａの基質であって
、ｂｌａにより分解されて紫色→黄色に変化する。使用
に際しては、上・記緩倫液に浴解し０Ｄ５６゜Ｓ３゜０
となるように調整する（カルビオケム・ぺ−リング社（
ＣＡＬＢ　ＩＯＣＨＥＭ−ＢＥＨＲＩＮＧ　）　）　０
．５　ｍｌを加えて３７℃で１０分（下式ｔ）程度反応
を行ったのち５分間煮沸し、直ちに水中で冷却し、つい
で０Ｄ５６ｏを測定した。この測定値と対照（サンプル
溶液として上記緩衝液を上記と同様にして測定したもの
）の０Ｄ５６ｏの測定値との差（△０Ｄ５６ｏ）より、
次式を用いてｂｌａの活性を測定した。また、ペリプラ
ズム中のｂｌａの測定は、上記で得られた菌体をオスモ
チインク・ショック法（前記）に従って処理したのち、
この溶液を０．１　Ｍナトリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で適当に希釈して、以下培養液中のｂｌａの定
量と同様に行った。

ここでユニットは、基質ＰＡＤＡＣ１μｍｏｌのβ−ラ
クタム環を１分間で加水分解する酵素単位を１ユニツト
としたもので、ｔは反応時間（分）を、Ｖはサンプル浴
液の量（α）を示すものである〔「蛋白質・核酸・酵素
」、旦、３９１〜４００（１９７８）１゜ そのときの、各培養時間における０Ｄ６６０’生菌数、
無機＃量、グルコース量、ｈ−ＥＧＦ量およびｂｌａＯ
量を測定した結果を第３表に示す。ネ、」・＊および林
＊　の意味は第１表および第２表と同第３表の結果より
、所望蛋白質（ｈ−ＥＧＦ）の培地中への分泌は培養時
間とともに増加しており、培養開始１８時間後にはほぼ
１００％である。しかしながら、培養液中のｂｌａＯ値
をみると培養開始後１４時間までほぼ同様の値を示して
いるから、この時間までに培地中に分泌されたｈ−ＥＧ
Ｆは菌体の淋菌にならないことか示唆される。従って、
培養時間としては１４時間か好ましい（すなわち、菌か
淋菌すれば、培養液中に菌体内の種々の物質が混入して
、目的物の抽出・精製が困難になると予想されるからで
ある）。

実施例４ 宿主としてＥ、ｃｏｌｔ　ＲＲＩ（ＡＴＣＣ３１４４７
）　　に組換えＤ　Ｎ　Ａ　ｐＴＡ１５２２　　を移入
することにより形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　ＲＲＩ　（ｐ
ＴＡ１５２２）　　を造成し、これを前記実施例３と同
様の条件下で培養した。そのときの培養結果を第４表に
示す。なお、表中＊、＊＊　およびネ＊＊の意味は前記
したとおりである。

実施例５ 宿主としてＥ、ｃｏｌｔ　ＨＢｌｏｌ（ＡＴＣＣ３３６
９４’）に組換えＤ　Ｎ　Ａ　ｐＴＡ１５２２　　を移
入させることにより形質転換体Ｅ、ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯ
Ｉ（ｐＴＡ１５２２）を造成し、これを前記実施例３お
よび４と同様の条件下で培養した。

そのときの結果を第５表に示す。なお表中＊、＊＊実施
例６ ベータガラクトシダーゼ（以下β〜ｇａｌという）は、
細胞内に存在する酵素である。実施例３でｂｌａを定量
した目的と同様β−ｇａｌを定寸（定量は、装置［エク
スヘリメンン轡イン・モレキュラー・イ ノエネテツツクスＪ　（１ｉ：ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ　−１ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）
、３５５、（１９７２）　（コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−）刊のミラーの方法に従って行っ
た）することにより菌が溶菌しているかどうかを判断し
たしユーロビアン・ジャーナル・オプ・アゾライド・マ
イクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｎｇｙ　ａｎｄ　Ｂｌｏｔｅｃｈ
　−ｎｏｌｏｇｙ　）、１６．１．４．６−１５０（１
９８２）、同１９．５〜１２（１９８４）　］　。

ずなわち、形質転俣体Ｅ、ｃｏｌｔ　１（１２ＹＫ５３
７（ｐＴＡ１５２２）　　を、一実施例３で用いた培地
にＩＰＴＧ（Ｉａｏｐｒｏｐｙｌβ−Ｄ−Ｔｈｉｏ−ｇ
ａｌａｃｔｓｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　）ｆ　１　ｍ　Ｍ
となるように添加したものによって実施例３と同一の条
件下で培養した。そのときの各培養時間におけるＯＤ　
　　、生菌数、ペリプラズム中および培養液中のｈ−Ｅ
ＧＦ　Ｘｂｌａおよびβ−ｇａｌの定量結果を第６表に
表す。表中＊および＊＊は前記第１〜第５表と同じ意味
を示し、ｈ−ＥＧＦ。

ｂｌａおよびβ−ｇａｌの各項目のチ（林＊）は、ｈ−
ＥＧＦについては培地中、ペリプラズム中釜々の定量値
の和に対する培地中、ペリプラズム中釜々の定量値の割
合を示したものであり、ｂｌａおよびβ−ｇａｌの場合
は、培地中、ペリプラズム中、およびオスモティック・
ショック法による処理後の菌体中の定量値の和に対する
各項目の定量値の割合を示すものである。この結果から
、培養開始後１８時間たってもβ−ｇａｌはべりプラズ
ム中、培地中には殆ど存在しておらず、β−ｇａｌが培
地中で安定であると仮定するならば菌体は殆ど溶菌して
いないと考えられる。

関連微生物の菌学的性質および受託番号本発明において
開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下記の
通りである。

受託年月日 （１）昭和５６年６月９日 （２）昭和５８年４月３０日 （３）昭和５６年６月９日 （４）昭和５６年１１月１４日 本　通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託
番号 木本　　ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｌｏｎ）　’）　
”ｉ　九Ｗ　５ 菌学的性質 （１）　　Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｃ６００この菌は、ダ
ラム陰性桿菌で、胞子を作らす、通性嫌気性等の大腸菌
属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含ます、サプレッサ
ー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関与するヌク
レアーゼをコードするｒｅｃ　Ｂ　Ｃ遺伝子に欠陥を有
するものである。栄養要求性としては、トレオニンとロ
イシンをその最小培地上での増殖に必要とする。また、
分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである。

なお、本閑に関する文献は以下の通りである。

（イ）　ジエネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、憂、
４４０（１，９５４） （ロ）ネーテアー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２１７．　１１
４０（２）　　Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫ
２８３）この菌は、ダラム陰性桿繭で、胞子を作らす、
通性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子
を含ます、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子
組替えに関与するヌクレアーゼをコードするｒＢ　ＢＣ
遺伝子に欠陥を有するものである。栄養要求性としては
、トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必
要とする。ｐｈｏ　Ａ遺伝子のプロモーター−オペレー
ターｔｉＵ域ｐＡｃｙＣ１７７由来の複製開始領域およ
びｐＢＲ３２２のｂｌａ遺伝子から構成されたプラスミ
ドｐＹＫ２８３を含み、アンピシリンに対して耐性を示
す。また、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するも
のである。

なお、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除けは、こ
の菌株の蘭学的性質はその親株Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｃ
６００のそれと同じである。

（３）　　Ｅ、ｃｏｌ、ｉ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＢＲ３
２２）この菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通
性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｅ因子を
含ます、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組
替えに関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃ　Ｂ　
Ｃ遺伝子に欠陥を有するものである。栄誉要求性として
は、トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に
必要とする。また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を
含む。なお、プラスミドｐＢＲ３２２に関してはＧｅｎ
ｅ、　２．９５（１９７７）、大腸菌に１２Ｃ６’００
　　に関しては上記Ｎａｔｕｒｅ　　を参照することか
できる。ｐＢＲ３２２由来の形質を除けは、Ｅ、ｃｏｌ
ｔ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）　　の蘭学的性質
は親株のそれと同じである。

（４）　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２ＹＫ５３７太腸ｍ　Ｋｌ
　２ＹＫ５３７は、公知法であるところの大腸菌に１２
株ＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｔｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ
　、　４４．１〜５６（１９８０）　）　　の誘導体大
腸菌に１２ＲＲ１［Ｇｅｎｅ　。

２．９５（１９７７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ａｃｔａ、　。

６５５．２４３（１９８１））　　をさらに改変したも
のであり、下記の性質を示し、他の性質についてはに１
２ＲＲＩのそれと異なるところのない菌株である。

しｒｅｃ　Ａｌ　、　ｐｈｏ　Ａ８、ｐｒｏ　　〕（５
）　　Ｅ、ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ 太腸菌Ｋ大腸、２株（上記）と大腸ｉＢとをハイブリッ
ドさせて造成した菌であり、下記の遺伝子型を有する。

なおこの株に関する文献としてはジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）４１．４５９（１９６９）　　
およびメソツゾ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、６８．２４５（１９７９）
かある。

Ｆ−１ｈｓｄ　Ｓ２０　（ｒｎ　　１ｍＢ−）、ｒｅｃ
Ａ１３、ａｒａ−１４、ｐ　ｒ　ｏＡ２．１ａｃＹ１、
ｇａｌＫ２、ｒｐｓＬ２０（Ｓｍｒ）、ｘｙｌ−５、ｍ
ｔｌ−１，５ｕｐＥ４４、λ−（６）　　Ｅ、ｃｏｌｔ
　ＲＲＩ 大腸（４Ｈｎｉ−ｏｌをｒｃｃＡ＋に改変したＥ、ｃｏ
ｌｔＨＢＩＯＩの線導体である。従って、遺伝子型は［
Ｆ−１ｒｅｃＡ　以外はＨＢＩＯＩ　と同一〕である。

なを、この株に関する文献としてはジーン（Ｇｅｎｅ　
）２．９５（１９７７）およびビオキミカ・工・ビオフ
イジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｌｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｙｏ
ｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ　）、６５５．２４３（１９８
１）かある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｙ５３７を形質転換す
るために使用したプラスミｐ　ｐＴＡ１５２２　造成の
ためのフローチャートである。 第２図は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったと
きの泳動図を模写したものである。 第３図は、Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２Ｙ５３７を形質転換す
るために使用したシラスミドｐＴＡ２５３２造成のフロ
ーチャートである。 第４図は、Ｅ、ｃｏｌＩ　Ｋ１２Ｃ６００全形質転換す
るために使用したシラスミドｐＴＡ］　５２４造成のた
めのフローチャートである。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 ■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）〜（Ｄ）よりなることを特徴とす
   る、菌体外分泌による蛋白質の製造法。 （Ａ）アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターを
   コードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナ
   ル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿
   主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意すること
   。 （Ｂ）上記ベクターに外来性蛋白質をコードする遺伝子
   を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換えＤ
   ＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主の
   形質転換を行つて、形質転換体を得ること。 （Ｃ）上記形質転換体を、微生物の増殖過程における対
   数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
   導がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地での培養
   に付すこと。 （Ｄ）上記培養終了後、培地中より外来性蛋白質を回収
   すること。 ２、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターをコ
   ードする遺伝子を具備すると共に、その制御下にシグナ
   ル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿
   主微生物細胞内で増殖可能なベクターが、そのシグナル
   配列をコードする遺伝子の下流側末端直後に所望外来性
   蛋白質をコードする遺伝子を結合させ得るように仕組れ
   たものである、特許請求の範囲第１項記載の菌体外分泌
   による蛋白質の製造法。 ３、工程（Ｂ）においてベクターに組込む外来性蛋白質
   をコードする遺伝子が、ヒト上皮細胞成長因子である、
   特許請求の範囲第１項または第２項いずれかに記載の菌
   体外分泌による蛋白質の製造法。