JPH02457A - イソアミラーゼの構造遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ配列及びイソアミラーゼから誘導されたアミノ酸
配列を単離する手段及び方法、その製造、得られろ生成
物及びその使用法に係る。

さらに詳述すれば、本発明は、酵素イソアミラーゼをコ
ードづけする遺伝子の単離及びシーフェンス及び該酵素
のアミノ酸配列による特定化に係る。

本発明は、イソアミラーゼ遺伝子又はそのフラグメント
を包含する複製可能な組換えＤＮＡ分子、及び該組換え
ＤＮＡによって形質転換されかつ遺伝子生成物を発現及
び／又は分泌する宿主微生物に係る。

さらに、本発明は、イソアミラーゼ遺伝子又はそのフラ
グメントを含有する組換えＤＮＡ分子によって形質転換
された微生物を適当な培養基で培養し、培養基又は細胞
から得られた遺伝子生成物を分離することからなる、成
熟イソアミラーゼ又は該成熟イソアミラーゼのらのと同
等の生物学的活性を発揮するイソアミラーゼのべプチド
フラグメントの製法にも係る。

１α鎖状（アミロース）又は分枝状（アミロペクチン）
のＤ（＋）グルコースポリマーの混合物でなるアミドは
酵素によって加水分解されて、デキストロース、マルト
ース及び他の少糖類を含有するシロップ又は固状物を生
成する。アミドの加水分解で使用される主な酵素は、ア
ミロース中に存在ケるｉ４グルコンド結合を切断するア
ミラーゼ及びアミノペクチンの１６グルコシド結合を攻
撃するイソアミラーゼ及びプルラナーゼである。

マルトースを工業的に製造する際に使用されるアミドの
多くは多量のアミロペクチンを含有するため、高収率（
〉９５％）でマルトースを得るためには、２種類の酵素
を組合せて使用する必要があった。

一般に、１６グルコシド結合を加水分解する酵素は、酵
母の如き単細胞真核生物（Ｍａｒｒｏ　Ｂ。

渋びＫｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ．　ｒネーチ＋　−　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）Ｊ　１６７、６０６　（Ｉ９５１）　；　
Ｇｕｎｊａ　Ｚ．Ｈ　　ら［ザ・バイオケミカル・ジャ
ーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）ｊ　８Ｌ　３９２　（
Ｉ９６１）から高級植物（Ｉ（ｏｂｓｏｎ　Ｐ．Ｎ．ら
［ジャーナル・イソ・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．　
Ｃｈｅ＋ｓ．　Ｓｏｃ．）１４５１　（Ｉ９５１））及
び細菌（Ｌａｅ　Ｅ．Ｙ．Ｃ．ら「アーカイブズ・イソ
・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（
Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．）
Ｊ１２５、１０２ｇ　（Ｉ９６８））までの広い範囲の
生物から生産される。

さらＪこ詳しくは、イソアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．　３．２
．１。

６８）（分子櫃約９００００ドルトンを有する酵素）は
、シュードモナス・アミロデラモーサ（Ｐｓｅｕｄｏａ
＋ｏｎａｓａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）の菌株から発
酵によって生産される　（Ｈａｒａｄａ　Ｔ．　　ら［
アブライド・マイクロバイオロジ−（Ａｐｐｌ．　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．）　１６、１４３９　（Ｉ９６８））
。

しかしながら、シュードモナス属のすべての菌が非一〇
ＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　
Ａｓ　Ｓａｆｅ）性であるため、この方法は、完全には
満足できるしのではない。

従って、食品工業での使用にあたり必須の安全性に関す
る要求に適合するイソアミラーゼ生産菌株を得る技術が
求められている。このような特性を（「する微生物は、
組換えＤＮＡ技術によりＧＲＡＳ生物を形質転換させる
ことによって得られる。

分子遺伝学の発達により、上記技術を使用し、品種源か
らの遺伝物質の部分をインビ旦で組合せて新たに遺伝子
の組合せを形成させ、これにより、特定の生物に新たな
遺伝特性を与えることが可能となった。一般に、組換え
ＤＮＡ技術は下記の工程を包含する。

所望のタンパク質をコードづけするＤＮＡフラグメント
を単離する工程 ト記フラグメントをクローニングベクターに挿入し、得
られたハイブリッドベクター又は組換えＤＮＡ分子を単
離する工程 上記分子を形質転換技術によって宿主生物に挿入する工
程 形質転換された生物を培養してＤＮＡフラグメントを発
現させ、所望のタンパク質を生成する工程、及び −得られた発現生成物を培養基又は宿主生物から単離し
、精製する工程 この技術は、高度レベルに達しており、当該技術分野で
は多くの研究者によって実施されてはいるが、効果的な
実験によるデータがなければ成功を予測することは困難
である。組換えＤＮＡ技術によって異種タンパク質を生
成するためには、かかるタンパク質をコードづけするＤ
ＮＡ又は遺伝子配列を得る必要がある。

これまでのところ、イソアミラーゼ又はこの酵素のアミ
ノ酸配列をコードづけする遺伝子はいずれも知られてい
ない。

本発明は、まず、イソアミラーゼ遺伝子の単離、そのシ
ーフェンス及び特定、及びヌクレオチド配列から誘導さ
れるイソアミラーゼのアミノ酸配列を開示する。

本発明は、さらに、イソアミラーゼ遺伝子をインビトロ
において発現用クローニングベクターに結合させるため
の該遺伝子の５′及び３′末端の上方及び下方の配列に
関する情報を提供する。

さらに詳述すれば、本発明では、成熟イソアミラーゼの
アミノ酸配列の直前に位置し、成熟イソアミラーゼの分
泌に応答する分泌シグナルペプチド（リーダー配列）を
コードづけするＤＮＡ末端５′配列を開示する。

これらの知見の結果として、組換えＤＮＡを介してイソ
アミラーゼを生産する手段及び方法が開発された。従っ
て、本発明の１つの目的は、純粋な形で単離されかつシ
ーフェンスされたイソアミラーゼ遺伝子を包含するＤＮ
Ａのフラグメントにある。

本発明の他の目的は、成熟イソアミラーゼのアミノ酸配
列及びその分泌シグナル配列の特定化にある。

本発明の他の目的は、ＤＮＡフラグメント又はその領域
を包含し、宿主微生物において発現する複製可能な組換
えＤＮＡ分子にある。

本発明の他の目的は、組換えＤＮＡ分子によりて形質転
換され、組換えＩ）ＮＡ分子に含有される異種ヌクレオ
チド配列からコード化遺伝生成物を発現及び／又は分泌
する宿主微生物にある。

本発明の他の目的は、イソアミラーゼ又はその領域をコ
ードづけする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子によっ
て形質転換させた宿主微生物（該微生物は成熟イソアミ
ラーゼ又は該イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有
するポリペプチドを発現及び／又は分泌する）を適当な
培養基で培養し、培養基又は微生物細胞から発現生成物
を分離、精製することからなる成熟イソアミラーゼ等の
製法にある。

本発明の他の目的は、得られた成熟イソアミラーゼ及び
該成熟イソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポ
リペプチドにある。

本発明の他の目的は、！−６グルコシド結合の加水分解
法においてイソアミラーゼ及びイソアミラーゼと同等の
生物学的活性を有するポリペプチドの使用にある。

本発明の他の目的は以下の記載及び実施例から明らかに
なるであろう。

本発明をさらに明確にするために、使用す用語について
簡単に述べる。

ゲノムバンク　Ｃｇｅｎｏｍｅ　ｂａｎｋ）これは、各
々がドナー生物由来のＤＮＡフラグメントを有する（こ
れによってバンクが得られる）宿主微生物のクローンの
すべてに関する用語である。

ゲノムバンクは、各クローンにおける各々のフラグメン
トを組み合わせてドナー生物の染色体ＤＮＡの多く　（
又はすべて）を再構成できる場合を代表例として定義さ
れる。

制限酵素 これは、特異な部位（制限酵素の認識部位と称される）
でＤｌｉＡ分子を切断する加水分解酵素をいつ。

クローニングベクター これは、宿主微生物に移される際、複製用のすべての遺
伝情報を含有するＤＮＡ分子をいう。

クローニングベクターの例としては、プラスミド及びい
くつかのバクテリオファージのＤＮＡがあ好ましくは、
組換えＤ　Ｎ　Ａ技術では、多くの細菌及び他の微生物
には細胞当たり多数のコピーが存在するため、環状のＤ
ＮＡ二重ら線を包含するプラスミドが使用される。さら
に、プラスミドＤＮＡは、宿主生物内でそれ自体を再生
成するための複製開始点だけでなく、抗生物質に対する
耐性の如き選択的な表現型特性をコードづけケる遺伝子
を含仔する。この結果、選択的培養基で培攬する際、所
望のプラスミドを含Ｈする宿主細胞を容易に認識できる
利点がある。各種の制限酵素（それぞれプラスミド０ｆ
ｆＡにおける異なる制限位置を認識４゛る）によって特
異的に切断されるため、プラスミドもａ効である。

つづいて、異質遺伝子又はそのフラグメントが切断後プ
ラスミドＤＮＡに挿入され、再び閉環して、より大きい
分子、組換えＤＮＡ分子又はハイブリッドプラスミドを
形成する。

ついで、組換えＤＮＡ分子を、形質転換と呼ばれる方法
によ−）で宿主細胞に導入する。

得られた形質転換細胞を、プラスミドに挿入された心伝
子からコード化されたポリペプチドを生成する発酵（発
現と呼ばれる工程）で使用する。

定型 これは、宿主生物か与えられた遺伝子からコードづけさ
れたタンパク質を合成する機構をいう。

これは、転写（すなわち、ＤＮＡからメツセンジャーＲ
ＮＡ　（ｍＲＮＡ）へ遺伝情報を移すこと）及び翻訳［
すなわち、Ｊ、Ｄ、　Ｗａｔｓｏｎ　ｒモレキュラー・
バイオロジー・才ブ・ザ・ジーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）Ｊ　１．＾
、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｉｎｃ、発行、第３版１９７６
）によって記載された遺伝子コードの原則（コドン、す
なわち特定のアミノ酸をコードづけするヌ々しオチド塩
居のトリブレットに関する）に従って傭１？ＮＡからタ
ンパク質に情報を移すこと］の過程を包含する。

各種のコドンか同じアミノ酸をコードづけできるが、各
アミノ酸については、これらの特殊なコドンのみであり
、他にはない。転写は、プロモーターとして公知の領域
（ポリメラーゼｌｌ？ＪＡによって認識及び結合される
）において開始する。

ついで、得られたａ＋ＲＮ＾の情報が、コード化された
アミノ酸配列をＨするポリペプチドに翻訳される。

翻訳は開始シグナル（＾ＴＧ）に従って始まり、ターミ
ネーションコドンで終了する。

プライマー これは、通常、塩基１５ないし２０個を含存し、酵素法
によってシーフェンスされるシングルら線の領域に相補
的なオリゴヌクレオチドである。

（但ヱー これは、惧造遺伝子−１すなわち成熟タンパク質をコー
ドづけする塩基の配列し転写調節配列（プロモーター及
び転写開始部位）、リボゾーム付着位置、及び分泌形タ
ンパク質の場合には、成熟タンパク質（すなわち、天然
タンパク質とは異質のアミノ酸配列をらたないタンパク
質）の分泌シグナルペプチドをコードづけするヌクレオ
チド配列］を含むヌクレオチド配列をいう。

次に、図面について説明する。

第１図は５ａｎ３Ａゲノムバンクから選ばれたいくつか
のクローンを含有するＭ９＋アミロペクチン寒天培地（
ｐＨ６，０）を示す。ヨウ素で染色した後、クローン９
（＾）及びｌ　７　（Ｂ）は、イソアミラーゼ活性を表
示する紫色のリングを示す。

第２図はクローン９から抽出されたプラスミドｐＳＭ２
５７の制限地図である。

第３図はクローン１７から抽出されたプラスミドｐＳ！
１１２５８の制限地図である。

第４図は制限酵素による消化の後、ハイブリーフドブラ
スミドの電気泳動挙動による比較分析の結果を示す。ク
ローン９　　（ｐｓＭ２５７）のプラスミドを酵素５ａ
ｒｉ３＾（２）汝びＨｐａ　ＩＩ　（５）によって消化
し、クローン１７　（ｐｓＭ２５６）からのプラスミド
（３及び６）及びシングルベクターｐＵｃＩ２　（＋及
び４）と比較した。鼠は分子量のマーカーである。

第５図は抗〜イソアミラーゼ抗体での処理によるイソア
ミラーゼの存在に関する分析の結果を示す。１はクロー
ン９によるタンパク質、２は大腸菌７１／１８からのタ
ンパク質、３は精製イソアミラーゼ１ｏＯｎ９に係る。

第６図はベクター旧３ＩＩｌｐ８におけるプラスミドｐ
ＳＭ２５７から得られたＳｍａｌ−ＢａｍＨＩフラグメ
ント（Ｉ９００ｂｐ）及びＢａｍ［Ｉ　Ｉ　−Ｘｂａ　
Ｅフラグメント（Ｉ３００ｂｐ）のクローニングのダイ
アグラムである。

第７図、第７（Ａ）図及び第７（Ｂ）図はイソアミラー
ゼ遺伝子を含有するシュードモナスＳＭＰ＋から得られ
た染色体Ｄｌｆ＾の３３３５ｂｐヌクレオヂド配列を示
す。

第８図、第８（Ａ）図及び第８（Ｂ）図はイソアミラー
ゼをコードづけする構造遺伝子のヌクレオチド配列（２
２５０ｂｐからなる）及び該ヌクレオチド配列から誘導
される酵素のアミノ酸配列（アミノ酸７５０個）を表す
。

第９図、第９（Ａ）図及び第９（Ｂ）図はイソアミラー
ゼの構造遺伝子及び調節及び分泌配列を含有するシュー
ドモナスＳＭＰＩから得られた染色体ＤＮＡのフラグメ
ントのヌクレオチド配列を表す。

イソアミラーゼ及びそのシグナル配列（ＬＳ）をコード
づけするフラグメントは２３２１１１ｂｐを含み、アミ
ノ酸７７６個を含有するタンパク質をコードづけする。

該配列において、以下の記号を使用する。

口二二二コ　−　プロモーター ｒ−＝推定の転写開始部位 ＲＢＳ　　　　＝　　リボゾーム認識部位ＬＳ　　　　
＝　　シグナル配列 ＝　イソアミラーゼの構造遺伝子 ＝ターミネーター配列 第１Ｏ図はプラスミドｐＳＭ２６２の制限地図である。

第１１図は大腸菌における発現及び分泌用のハイブリッ
ドプラスミドｐＳＭ２８９の制限地図である。

第１２図は枯草菌における発現及び分泌用のハイブリッ
ドプラスミドｐｓＭ２９０の制限地図である。

本発明によれば、上記酵素をコードづけする遺伝子を単
離するにあたり、イソアミラーゼを生産し得るシュード
モナス属に属する各種の菌を使用できる。

好ましくは、発明者らの研究室で単離され、良好な活性
及び熱安定性を有するイソアミラーゼを高収率（約１２
５υ／１１（Ｉ＞で生産し得るシュードモナス属の菌株
（シュードモナスＳＭＰＩ）を使用できる。

この菌株について、その染色体又はプラスミドにイソア
ミラーゼ遺伝子が存在するか否かを調べるため、Ｋａｄ
ｏ及びＬｉｕの技術（ジャーナル・イソ・バクテリオロ
ジ−（Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）Ｊ　１４５．
１３６５　（＋９８１））によって分析した。その結果
、この菌株は非染色体形ＤＮＡを有していないことを示
した。

従って、染色体ＤＩＩＡの消化に適する制限酵素を使用
し、シュードモナスＳＭＰ　Ｉのゲノムバンクを構成す
ることによって、イソアミラーゼの遺伝子を単離した。

さらに詳述すれば、微生物から抽出した染色体ＤＮＡを
別々に制限酵素ＥｃｏＲＩ　（ＢＲＬ）及び５ａｕ３Ａ
ＣＢＲＬ）によって消化して、シュードモナスＳＭＰ＋
の２つのゲノムバンクを構成した。消化反応を、緩衝溶
液中、温度３７℃又は約３７℃、所望の消化が達成され
るに充分な時間で実施した。

得られたＤＮＡフラグメントから、３０００ないし４０
００塩基対（ｂｐ）のサイズを有するもののみを精製し
た。

このようなサイズの選択は、イソアミラーゼの分子量が
公知であるため、その遺伝子のサイズを約３０００ない
し４０ＱＯｂｐと概算できたことによって決定したもの
である。

ついで、得られたＤＮＡのＥｃｏＲＩ及び５ａｕ３＾フ
ラグメントの２つの集団を、大腸菌における発現用クロ
ーニングベクターに、ベクター１分子当たり１つのＤＮ
Ａシングルフラグメントを結合させるに適する条件下で
挿入した。

さらに詳しくは、緩衝溶液中、第４　ＤＮ＾リガーゼ（
ＢＩ？Ｌ）の存在下、温度４ないし３７℃、好ましくは
１３ないし１８℃で反応を行った。

この目的に適するベクターは、当分野で通常使用される
大腸菌プラスミド又はバクテリオファージの中から選ば
れる。

さらに詳述すれば、Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、ら（ｒ’、’
−７（Ｇｅｎｅ）Ｊ　１９、＋５９　（Ｉ９８１））に
よって開示されたプラスミドｐＵｃ１２　（Ｉ８００ｂ
Ｐ）を使用した。

この場合、外来のＤＮＡフラグメントが合体されたクロ
ーンを区別する容易かつ迅速な方法である。

実際、プラスミドはβ−ラクタマーゼ及びβガラクトキ
シダーゼに係る遺伝子を何しており、大腸菌の宿主菌株
がアンピシリン含有培地で生育できるようになる。外来
のフラグメントがβ−ガラクトキシダーゼに係る遺伝子
に存在する制限部位（特にクローニングベクターに適す
る）間に挿入される場合には、遺伝子は破壊され、もは
や酵素を生産できない。

このように、ラクトースと類似する基質（染料減成分子
）を使用することによって、元のプラスミドを含ａする
クローン（ブルーに着色される）から組換えクローン（
着色されない）を区別することが可能である。

本発明に従い、ｐｔｌｃ１２から得たプラスミドＤＮＡ
を、制限酵素（β−ガラクトキシダーゼのヌクレオチド
配列の内側を切断する）によって消化して直鎖状とし、
反応、昆合物から沈殿、分離した後、リガーゼで処理（
７て、予めＥｅｏＲｌ及び５ａｕ３人での消化によって
得たシュードモナスＳＭＰ　＋の染色体ＤＮＡのフラグ
メントに結合さ仕た。

リガーゼによる反応の而にプラスミドか再び環化するこ
とを防止するため、プラスミドＤＮＡ分子をアルカリホ
スファターゼ（分子の５′末端から硫酸基を除去し、リ
ガーゼの存在下における３′末端０１１の縮合を阻止す
る酵素）によって処理した。

、１ガーゼによる反応を、プラスミド：　ＤＮＡフラグ
メントの比としてプラスミドが多くなる量、好ましくは
２・１で使用して実施した。

反応終了後、Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ、及びＨ４ｇａの方法（
「ジャーナル・イソ・モレキユラー・バイオロジー（Ｊ
、　ｖｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）Ｊ　５３．１５４　（Ｉ９
７０）に従って、コンピテントした大腸菌を形質転換さ
せるために２種類のりガーゼ混合物を使用し、このよう
にして２つの集団のコロニー（ゲノムバンク）を得た。

各コロニーは、プラスミドｐｔｌｃ１２及びシュードモ
ナスＳＭＰ＋の染色体ＤＩＩＡのフラグメントを含有す
るハイブリッドプラスミドを有していた。

この目的に好適な大腸菌は、エシェリキア・コリＪＭ　
８３　（ｐｒｏ、　ａｌａ、△１ａｃｐｒｏ、　５ｔｒ
ａＡ、φ８０ｄ。

１ａｃＺ　Ｍ２Ｓ）、エシェリキア・コリ　ＨＢ　１０
１　（Ｆ−、ｈｓｄ３２０　（ｒｊ、　　ｎ＋ｉ）　ｒ
ｅｃ　Ａ１３．　ａｌａ−１４，ｐｒｏＡｔ、　Ｌａｃ
　Ｙｌ。

ｇａｌＫ２．ｒｐｓ　Ｌ２０　（ＳｓＲ）、　Ｘｙｌ−
５，ａ＋ｔｌ−１，ｓｕｐ　Ｅ４４λ）エシェリキア・
コリ　ＪＭ　１０１　（ｌａｃ、　ｐｒｏｙｓｕｐＥ。

ｔｈｉ　Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、Ｉａｅ　　）及びエシェリ
キア−）す７１／１８△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、　ｔ
ｈｉ、　５ｕｐＥ、　ＣＦ’、　ｐｒｏＡＢ。

１ａｅｌ　　Ｚ旧５］から選ばれる。

形質転換した細胞を使用して、選択的なものとした培地
に置き、ハイブリッドプラスミドを含Ｈするクローン単
離した。ｐＵｃ１２はＤＮＡｕｇ当たりコロニー２ＸＩ
Ｏ’以上の効率で形質転換されている。

ついで、得られたゲノムバンクを分析して、イソアミラ
ーゼ遺伝子を含有するクローンの存在を検知した。これ
は、特殊なりＮＡプローブによるハイブリダイゼーショ
ン又は直接の発現によるスクリーニングの如き各種の方
法によって行なわれる。

第１の方法は、主にイソアミラーゼのアミノ酸配列の少
なくとも一部の決定に基づくしのである。

この情報は、小さなヌクレオチドフフラグメント［適当
にマーク付けされる際、一般に公知の技術（ｌｌａｇｎ
ｅｓｓ　Ｄ、Ｓ、　ｒｐ、＊、＾、Ｓ、Ｊ　７２．３９
６１　（Ｉ９７５）　；Ｍｅｓｏｎ　Ｐ、Ｊ、ら［ヌク
レイツク・アシッド・ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ＨｙｂｒｉｄｉｚａＬｉｏｎ）Ｊ
２４５ｐ（Ｉ９８５）、ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ発行）に従
って（＋）のクローンを決定するために使用される］の
合成に利用される。

一方、第２の方法は、イソアミラーゼ遺伝子は該遺伝子
を含有するゲノムバンクのクローンから発現されるとの
仮定に基づくものでる。

仮に、このクローンがアミロペクチンを含有する培地で
生育する場合には、アミロペクチンは減成されるはずで
あり、この減成は比色法によって検知される。従って本
発明では、アミロペクチンを含有しかつｐＩ（≦６０に
緩衝化した最小培地を使用し、直接的な発現によって、
シュードモナスＳＭＰＩの２種類のゲノムバンクの組換
えクローンを検定した。つづいて、酵素の存在によるア
ミロペクチンの減成をヨウ素蒸気によって実証した。

この方法を使用して、プレート培地での検定に対して明
らかな（＋）の応答を示す２種類のクローン（いずれも
５ａｎ３＾ゲノムバンクからのもの）を単離した。これ
ら２種類のクローンのイソアミラーゼ生産の可能性を、
ウェスタン−プロット法（ｆｌａｍｅｓ　Ｂ、Ｄ、ら［
ゲル・エレクトロホレシス・イブ・プロテインズ（Ｇｅ
ｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｒＰｒｏｔｅ
ｉｎｓ）Ｊ　２９０ｐ　（Ｉ９８１）、ＩＲＬ　ＰＲＥ
ＳＳ発行）に従い、特殊な抗−イソアミラーゼ抗体を使
用する免疫検定によって確認した。

次に、これら２種類の（＋）コロニーのノーイブリッド
プラスミドの制限地図を決定した。

実際には、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｔｌ、ｃ、ら［ヌクレイ
ツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、）Ｌ１１５１３　（Ｉ９７９））の方法を
使用して、これらのプラスミドを単離し、適当な制限酵
素によって処理した後、電気泳動によって分析した。

２つのプラスミドのうち１つ（ｐＳＭ２５７）は約３２
００ｂｐの挿入部（ＥｃｏＲＩ制限部位、ＢａＪ１部位
及び５ｓＬ１部位を含有することが判明した）を有して
いた。他のプラスミド（ｐＳＭ２５ｇ）は、第１のプラ
スミドと同じ制限部位を含有する約３０００ｂｐの挿入
部を有していた。

ついで、プラスミドを２種類の酵素（頻繁に切断を行う
）で順次消化した。該プラスミドはサイズはわずかに異
なるが、電気泳動では同じ挙動を示した。

本発明に従い、約３２００ｂｐの染色体Ｄｌ１人フラグ
メントのヌクレオチド配列を決定した。

この決定は、Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの技術（［
Ｐ。

Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　７４．５６０　（Ｉ９７７））を利用
し、ＤＮＡの特殊な減成用の化学システムを使用するこ
とにより、又はシーフェンス酵素システムに基づ＜　　
ＳａｎｇｅｒＦ　らの方法（ｒＰ、Ｎ、＾、Ｓ、Ｊ　７
４．５４６３　（Ｉ９７７））を使用することによって
行われる。

後者の方法（非常に長くかつ多少知られているＤＮＡフ
ラグメントのシーフェンスに特に好適である）では、シ
ーフェンスに供するフラグメントがシングルら線（鋳型
）及びプライマーとして定義されかつ該シングルら線の
開始領域に対して相捕的である小さいオリゴヌクレオチ
ド（塩基１５−２０側）の形状で利用できるしのである
ことが要求される。従って、本発明では、約３２００ｂ
ｐの染色体ＤＮＡフラグメントをベクター内でサブクロ
ーン化し、Ｓａｎｇｅｒ法によってシーフェンスした。

この目的に適するベクターは、ウィルス、プラスミド又
はバクテリオファージである。好ましくは、ファージベ
クター旧３ｍｐ８　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、らｒＧｅｎ
ｅＪ　１９．２６３　（Ｉ９ｇ２））及びＭＩ３Ｂ９　
（Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｋ、Ｒ，ら「バイロロギー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ月４０．７３４　（Ｉ９７０））　（クロ
ニング部位がブライマーのアニーリング部位に比べて逆
転して位置し、２つの向い合う末端からの挿入部の配列
を限定するために使用されろ）を使用できる。

本発明の目的に関してはファージベクターＭＩ３ＩＩ＋
ｐ８が特に好ましい。これは、そのＤＮＡが大腸菌の細
胞に存在する際には二重ら線形で単離され、一方その感
染サイクルの終了時、細菌細胞を出たファージが培養基
の上澄み液中に流入する際にはシングルら線形であるた
めである。

本発明では、イソアミラーゼ遺伝子を２つのフラグメン
トに分割し、各々をファージベクターＭ１３ｍｐ８に挿
入した。

さらに詳述すれば、遺伝子内にＢａｌｌ１ｌ　１部位及
び該遺伝子の前後に他の２つの部位が存在するとの利点
から、プラスミドＩ）３Ｍ２５７を制限酵素Ｂａｍ１ｌ
　ｌ　％Ｓａ＋ａ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化した。得ら
れたフラグメントの端を、ＤＮＡホリメラーゼ］酵素（
ラージフラグメント又はＫｌｅｎｏｗフラグメント）で
処理して平らにし、フラグメントを電気泳動によって分
離し、つづいて常法に従って溶出した。

得られたフラグメント　（それぞれ約１９００ｂｐ（Ｓ
ｍａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　）及び約１３００ｂｐ　（Ｂ
ａｗｌ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ　）を含有する）を、Ｓｍａ
　ｌ酵素によって直鎖状とした後、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼの存在下で旧３ｍｐ８ファーノに挿入し、ついでリガ
ーゼ混合物を大腸菌のコンピテント細胞を形質転換する
ために使用した。

組換えクローン、すなわちハイブリッドベクターをＶＴ
するクローンを同定した後、２つのフラグメントの配向
を、ｌＩ、１１限酵木により過当に切断−イ゛ることに
よ−１て決定（、た。

さらに詳述すれば、１９００ｂｐフラグメントを含ａす
るハイブリソトヘクターを、フラグメント内部でχを称
にかつヘクター内ではフラグメントのｔ＜迎＜で切断す
る制限酵素ＥｃｏＲｌで消化した。

ト想した如く、結果は配向に応して３００ｂｐ又は１６
００ｂｐのセグメントであった。同様に、１３００ｂｐ
フラグメ〉トをＨするプラスミドでは、酵素５ｓｔＩ及
びｌｌ１ｎｄＩＩＩで消化した場合、配向に応じて５０
０ｂｐ　＆び８００ｂｐのセグメントを与えた。

Ｍｅｓｇｉｎｇ　Ｊ、により１−メソツズ・イン・エン
ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）Ｊ　１０１．２０（Ｉ９８３）に記載された方
法によって、逆方向の配向の確認を行った。ついで、ク
ローンからンングルら線を抽出し、５ｔｒａｕｓｓ　Ｅ
、Ｃ，らによって開示されたｌ！！続プライマー法（［
アナリテイカル・バイオケミストリー　（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｇ＋、）Ｊ　１５４．３５３　
（Ｉ９８６））によってンークエンスした。

プラスミドｐＳＭ２５７に挿入された１）Ｎ＾フラグメ
ノトは３３３５ｂｐを含ｎＬ、一方、酵素イソアミラー
ゼをコートつ１すする領域は２３２８ｂｐ（、アミノ酸
７７６個に相当）を含イＴすることがわかった。

公知の方法に従い自動タンパク質ノークエンサーを使用
して３３３５ｂｐフラグメノトの一方の端から塩基約１
０００個の位置にある所望の酵素のアミノターミナル配
列に相当ずろ５４個のヌクレオチドの配夕１１を決定し
た。成熟イソアミラーゼの構造遺伝ｒの５′末端を正確
に同定するためこの方法を利用したらのであｉ）、２２
５０ｂｐ　（アミノ酸約７５０個に１υ当）を食合゛す
ることかわかった。

ｌ・）射影タンパク質から予想されるように、成熟イソ
１′ミラーゼの構造遺伝子の直上に、タンパク質の分ｌ
・に応答セるメチオニン（−ＡＴＧ−）で始まる代表的
なングナル配夕１１（アミノ酸２６個）　（Ｉ，ｓ）か
見られた。このＬＳは、細胞膜外にタンパク質を運ぶた
めに必要な高度に疎水性の構造によ−）で特徴づけられ
る。タンパク質の移動後、模ペプチダーゼによってＬＳ
を除去する。ベプチグーゼの認識部位はＡｌａ〜Ｉ！１
ｓ−Ａｌａの配列で同一・と見なさイ１、第２のアラニ
ンの後で切断か行われる。

これは、発明者らによ−）で精製した分泌タンパク質の
アミノターミナル配列リのデータにより確認され、該配
列はＡｌａ　−ｌｉｅ　−Ａｓｎである。

翻訳を開始させる一肩Ｇ−の前のヌクレオチド約１０個
のところに、配列ＧＧＡＧＧをａする代表的なりボゾー
ムの結合部位（ＲＢＳ）も見られた。

１．５からヌクレオチド約１３０側上方の位置に、マル
トースによる誘発に感応１ろプロモーターのコンセンサ
ス配列（−ＧＧＡＴＧＡ　−）と類似する構造（−ＧＧ
ＡＴＧ丁−）か−占られｊこ、うこの配クリの萌フｊヌ
クレオチド３５個のところに、転写の開始部とμられる
一Ｇ−残基か１７在する。

この−Ｇ−の１笥ヌクレオチドｌＯ個のところに、プル
ラナーゼしその遺伝子はマルトースによって誘発される
（Ｃｈａｎｐａｎ　Ｃ，ら１−ツヤ−ナル・イソ・バク
テリオロノ−（〕　（汀Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．）、ｉ　
１８４　（２）、６３９　（Ｉ９８５））Ｊ　０）頃似
”−１０領域に近似したＴＣＴＡＴＴ−構造がある。こ
の」（云Ｆの後方でストー！プコドンーＴＡＧ　−ｖ　
＆ヌ１１１７オ千１・約１０個のと二ろに、４へＧ　［
Ｔｉｎｏｃｏらの方法（［ネーチャー・エコー・バイオ
ロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、）　２４６
．４０（！９７３））に従ッて算定］　−２４，８Ｋｃ
ａｆ２１モルを（ｆ、１′る２次構造を影成し得る４個
のヌクレオチドノ）シー／て分離された逆方向の繰返し
配列を含（Ｔ　ｉ−る代表的な転写ターミネータ−構造
がめる。

後述の配７リデータＩこ１λつ、き、イソアミラーゼ又
は−３の６１１域をコートつけする遺伝子を含ｒｉ；ｊ
−る１）Ｎ：〜フラグメントを使用し、プラスミドの如
き復製＋ｉ工能なりローニングベクターを使用して、イ
ソアミラーゼ又（よ該イソアミラーゼと同等の生物学的
活性をａするポリペプチドをｔ１―産４゛るれｌ換えＤ
　Ｎ　Ａを構成できる。

本発明の好適な１（Ｉ体例では、成熟イソアミラーゼを
コート−）１ｆする構造遺伝ｊ−を、シ、１−トモゴー
スの配列とは異なるプロモーター渋び分泌量ソリの漫Ｕ
に位置することによってブラスミトヘクグーに挿入でき
る。二の目的は、強力なブ（Ｊモータ（−Ｊ−ｊｉ　ｈ
ら、これらの後方のａ（云ｒの斧現をｊｌミ常に効１東
的に６内で、きかつ当分野で公ｙりのブ［Ｊモ−ターの
中から選択される）によって達成されろ。

かかるプロモーターの例としては、トリプトファンシス
テム（ｔｒｐ）、ラクトースシステム（Ｉａｃ）又はｐ
ｔ及びＴ５の如きバクテリオファージにおけるらのであ
る。

しかしながら、他の多くのプロモーターら同定され、使
用されており、その配列の詳細ら５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ
らによって公表されている（［セル（Ｃｅｌｌ）Ｊ　２
０．２６９　（Ｉ９８０））。

分泌シグナルタンパク質をコードづけするヌクレオチド
配列は、組換えＤＮＡの分野で一般的に使用されている
ものの中から選択されろ。

この目的に適する配列の例としては、サブチリンン及び
ニュートラルプロテアーゼがある。

本発明の池の具体例によれば、シュードモナスの配列と
は異なる調節配列のコントロールの下、プラスミドベク
ターに、調節配列を使用することなく、イソアミラーゼ
をコードづけする遺伝子を位置せしめることによって組
換えＤＮＡ分子を構成できる。

上述の具体例のいずれかに従って操作して得られた組換
えＤＮＡ分子を、通常、細菌及び酵母から選ばれかつ各
種文献に開示された方法によってコンピテントとされた
宿主微生物を形質転換させるために使用する。

ついで、このように形質転換された微生物を使用し、イ
ソアミラーゼ又はイソアミラーゼ活性を汀ずろポリペプ
チドの発酵による製造を行う。

好ましくは、大腸菌Ｋ１２、桿菌類及びサツカロミセス
類でなる群から選ばれる。

これらの中で、ヒトに対する病原性がなく、合成された
異種タンパク質を直接培養基に分泌し得ろことから、枯
草菌が特に好適である。

この場合、つづく所望タンパク質の回収及び精製の工程
が簡単であるとの利点が得られる。

本発明の好適な具体例では、大腸菌及び枯草菌でイソア
ミラーゼを発現する組換えＤＮＡ分子を、これら細菌に
おいて複製可能なりローニングベクターに、ＬＳ及びイ
ソアミラーゼの構造遺伝子を含イ丁４−るＤＮＡフラグ
メントを挿入することによりて構成する。

さらに詳しくは、イソアミラーゼＲＢＳの直前にＮａｒ
　ｌ制限部位が存在するため、プラスミドｐＳＭ２５７
から約ｚ＜ｏｏｂｐのＤＮＡフラグメントを単離するこ
とが可能であった。該フラグメントは、シュードモナス
ＳＭＰ＋の元のプロモーターを含ａすることなく、分泌
シグナルペプチド及び成熟イソアミラーゼをコードづけ
する配列を含有する。　後述の実施例４に記載する如く
して中間プラスミドを構成した後、大腸菌での発現のた
めクローニングベクターｐＵｃ１２に上記フラグメント
を挿入した。

単離した組換えＤＦＩ八分子分子ｓＭ２８９と名付け、
大腸菌ＤＩ１１の細胞の形質転換に使用した。

これら細胞は、プレート培地又は特殊な液状培地で培養
する際、イソアミラーゼを発現及び分泌した（後述の実
施例６のデータによって示されろ）。

本発明に従い、ＬＳと共にイソアミラーゼの構造遺伝子
を含有するＤＮＡフラグメントをハイブリッドプラスミ
ドｐＳＭ２８９からＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄｌｌｌフ
ラグメントとして取り出し、枯草菌における発現及び複
製用のクローニングベクターに挿入した。

この目的のため、枯草菌における複製開始点、クロラム
フェニコールに対する耐性をコードづけする遺伝子及び
強力な合成プロモーターを含有するファージのプラスミ
ドｐｓＭ２６８　（その構成については後述の実施例５
に詳述する）を使用した。上記強力なプロモーターのコ
ントロールの下、ＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄｌｌｌフラ
グメントを配置せしめ、得られた組換えＤＮＡ分子（ｐ
ｓＭ２９０）を単離した。

クローニング操作の間に配列の再配列が生じていないこ
とを確認するため、イソアミラーゼ遺伝子とプロモータ
ーとの間の結合領域をシーフェンスした。

結果は予測したとおりの配列を示した。

ついで、Ｄｕｂｒａｕ　Ｄ、及びＤａｖｉｄｏｆｒ−＾
ｂｅｌｓｏｎ　Ｒ。

の方法（ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ　５６．２０
９　（Ｉ９７１））によってコンピテントとした枯草菌
の細胞を、ｐＳＭ２９０を使用して形質転換させた。

本発明によれば、各種機関に寄託された分譲可能な枯草
菌類の６種の菌株を使用できる。

さらに詳しくは、枯草菌ＭＳ１０８　　（ｒｅｃ−１Ｌ
ｉｓ−１ｌｅｕ−）を使用し、影響転換物質を適当な培
地（たとえばＶＹ＋クロラムフェニコール）で選択した
。

ついで、（＋）のクローンをＭ９及びＭＢ培地のプレー
ト上及び液体培地中、温度的３７℃で１６時間培ａＬだ
。

その後、培養居及び細胞抽出物中のイソアミラーゼを、
Ｙｏｋｏｌ）ａｙａｓｈｉ　Ａ、らの方法（［ビオンミ
力・工・ビオ・フィシアクタ　（Ｂｉｏｅｈｉｇ＋、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡｅＬａ）ｊ　２１２．４５ｇ−４６９（Ｉ９７０））
によって定量した。

その結果によれば、これら微生物は、酵素イソアミラー
ゼを発現できるだけでなく、元の菌株（シュードモナス
ＳＭＰＩ）によって得られろものに匹敵する櫃で分泌で
きる。

さらに、シュードモナスＳＭＰＩの場合、インキュベー
ンヨン後約７２−１２０時間でイソアミラーゼのＪ＆適
生産に達するが、枯位菌（ｐｓＭ２９０）に関しては１
６時間にすぎない。

ハイブリッドプラスミドｐｓＭ２５７　（大腸菌）７１
／　ｉｆ　（ｐＳＭ２５７）及び菌株ンノードモナスＳ
ＭＰＩについては１９８７年７月２４日にアメリカン・
タイプ・カルチャー・センターに寄託してあり、寄託番
号はそれぞれＡＴＣＣ６７４７４及びＡＴＣＣ５３６５
１である。

以下の実施例は本発明を限定することなく説明するしの
である。

実施例１ シュードモナスＳＭＰＩから染色体ＤＮＡの抽出ＨＳＭ
発酵培養基（マルトース２０９／Ｑ、グルタミン酸Ｎａ
４ｇ／ｄ、（ＮＩｌ、）、ＨＰＯ，＋、５ｇ／ｆ！、Ｋ
Ｈ！Ｐ０゜１９／’ｆ！、ＭｇＳＯ４・月１．０　０．
５９／（Ｉ，ＦｅＣ（Ｉ３−６８，ＯＯ，１９／　Ｑ、
　ＭｎＣ（！ｔ　・４Ｈ−００，１７／　Ｑ及びＮａＣ
Ｑ　Ｏ，１ｇ／ｆ２；ｐｌ　５．５）　１００籾に菌株
ンユードモナスＳＭＰ＋を接種し、撹拌しながら　（２
２０ｒｐｍ）、３０℃に５日間維持した。その後、遠心
分Ｍ機５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂモデル５Ｓ３４にお
いて４℃で遠沈して（Ｉ０分、５０００ｒｐｍ）、細胞
を培＃基から分離し、２５％シジ妨、１００ｓ＋Ｍ　Ｎ
ａＣ（２及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣρ（ｐＨ７，５
）の溶液で洗浄しく２　ｘ　ｌ　２０ｘｆ２）、前記と
同じ条件下で遠心分離し、リゾデーＡ　（ＳＩＧＭ＾）
　ＩＲ９／ＩＱを含有スル緩衝ａ　（Ｉ００ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　及Ｕ　５０ｍＭ　ＮａＣ６；　ｐＨ６，９）　１
０峠中に再度懸濁させた。得られた懸濁液を穏やかに撹
拌しながら３７℃に３０分間維持し、ついでｌＯ％ＳＤ
Ｓ　（Ｉ＆酸ドデンルナトリウム）　１１＆と混合１２
．６０℃ニｌＯ分間維持し、ｔｘｓｓｃ　（ＩＸＳＳＣ
＝０．１５Ｍ　ＮａＣＱ　′ｐＣび１５ａ＋Ｍクエン酸
ナトリウム）中、３７℃で３０分間予しめインキュベー
トしたブロナーセ４１９／ＩＱと混合し、３７℃に２時
間維持した。

Ｎ　ａ　ＣＱを添加して最終濃度ＩＭとした後、冷たい
（−２０℃）エタノール２又は３容でＤＮＡをｔｊ：殿
さけ、ガラス棒で集め、０．１ＸＳＳＣＩＱＢ中に再度
懸濁させた。この懸ｌ！！５液を穏やかに撹拌しながら
常温（２０−２５℃）に１夜維持１２、ＲＮＡ５ｅ　（
Ｉ０１１９／ＩＩＱ’）を添加した後、３７℃に３０分
間維持した。溶液の塩ａ度をｌＸ５ｓｃとした。タンパ
ク質をフェノール（Ｉ容）で抽出した後、該溶液にイソ
プロパツールを滴加することによ−てＤＮＡを沈殿させ
、穏やかに撹拌しながら常温に維持した。

ついで、遠心分離してＤＮＡを回収し、０．１ＸＳＳＣ
１ｌに再度懸濁させた。

染色体ＤＮＡの遣（分光光度計Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅ
ｒ　５１５を使用し、ＯＤ　２６０における分光測光に
よって評価）は０．６４５　ｍ９／！Ｉ７！　Ｔ：　ア
−）　タ。

実施例２ バンクの調製 前記実施例１に記載の如くして得られた染色体ＤＮＡ８
０７ノ９を緩衝液（Ｉ００ｓＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃｆ２
．５０ｍＭＮａＣＱ及びｌｏｄ　ＭｇＣＬ　；　ｐＨ７
，５）　８００μρに＠濁させ、酵Ｔ：　ＥｃｏＲＩ　
（ＢＲＬ）　３７５１位（ＩＪ）の存在下、３７℃で２
，５時間インキュベートした。

ついで、Ｉ）ＳＡ混合物をン：１塘グラデイエンド（［
０−４０％）に負荷し、Ｂｅｅｋａａｎ　５Ｗ２８　ａ
−ターにおいて２０℃で遠心分離１．た（２０時間、２
５０００ｒｐＨ１）。

その後、グラデイエンドをフラクションに分け、各フラ
クションの一部を０．７％アガロース上、２０Ｖ、１夜
の条件下における電気泳動によって分析して所望のサイ
ズ（３０００−４０００ｂｐ）を有するフラグメントを
含有するフラクションを同定した。これらフラクション
を集め、エタノールにより一２０℃でＤＮＡを沈殿させ
、１２０００ｒｐｒａで１５分間遠沈して分離した。つ
いで、ＥｃｏＲｌにより予じめ消化した大腸菌からのプ
ラスミドＩ）ＨＣｌ２にＤＮＡを挿入した。

ｐＵｃＩ２　（２８００ｂｐ）　７μ９を、上述の組成
を有する反応混合物１０μＱ中、ＥｃｏＲＩ　（ＢＲＬ
）　１００により３７℃で１時間消化した。

ついで、プラスミドＤＮＡを一２０℃でエタノールによ
って沈殿させ、遠心分離機Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆにおいて
４℃で遠沈して（Ｉ５分間、１２０００ｒｐ１１）分離
し、ＴＥ緩衝液（Ｉ０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８，
０）及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ）５０μＱ中に再度懸濁させ
、酵素ＣＩＰ　（仔ウシの腸内ホスファーゼ）　（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）ＩＵにより３７℃で３０分間処理し
た。

この溶液に■ｔｏ　４０ｔｔ　１２．　ｌ０ＸＳＴＥ　
（Ｉ０（ＩＩＩＭ　Ｔｒｉｔ；　−１１Ｃ１２，１ｍＭ
　ＮａＣＬ　ｌｋＭ　ＥＤＴＡ　；　ｐＨ８）　１０μ
（！及び１０％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）　５
μＱを添加することによって酵素反応を停止させた。

前述の如くして沈殿させたプラスミド２．６μ９を、３
０００−４（ｌＯＱｂｐ　ＤＩＪ＾フラグメントを含有
するグラデイエンドからの混合物１．３μ２と共に、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　２００の
存在下、緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ２．１
＋＠Ｍ　ＡＴＰ、　１０ｍＭ　ＭｇＣＬ及び１１０ｌ１
１ジチオトレイトール；　ｐｌ＋　７．６）　１３０ｕ
ｇ（最終審Ｍ）中、１４℃で１２時間インキスペードし
た。

リガーゼ混合物２μσずつを使用し、５０μＭＣａＣＱ
ｔによる処理（Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ及びＩｌｉｇａ　ｒＪ
、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、Ｊ　５３．１５４　（Ｉ９７０）によってコ
ンピテントとした大腸菌７１／１８細胞（Ｍｉｌｌｅｒ
　Ｊ、Ｈ，ｒエキスベリメンツ・イン・モレキュラー・
ジエネティックス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ＪＣｏｒｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂ発行（Ｉ９７２））　３００μ（
を形質転換させた。

アンピシリン５０μ９／Ｑ１１ＰＴＧ　（イソプロピル
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）　０．０５ａ＋Ｍ及
び０．２％Ｘ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−
ヨートリル−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加して選択
的とした２ｘＹＴ培地（Ｉ６９／　Ｑ　Ｂａｃｔｏ　−
ＴｒｙｐＬｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）、＋０９／（ｌ　Ｂａ
ｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ　１ＥｘＬｒａｃｔ　（ＤＩＦＣＯ
）及び１０ｇ／ρＮａ（ｔりに細胞を接種し、恒温室に
おいて３７℃で１２時間インキュベートすることによっ
て形質転換体を選別した。

リガーゼ混合物全量から、組換えコロニー６０００個を
得た。

アンピシリン５０μ９／ｌ（ｌを含有するＬｕｒｉａ寒
天培地（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　（ＤＩＦＣＯ
）、５９／ρ８ａｃｔ。

Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　（ＤＩＦＣＯ）及び５９
／Ｑ　ＮａＣ（Ｉ）のプレート上で、コロニーを１００
個の群に移した。

シュードモナスＳＭＰＩの染色体ＤＮＡ　７８μｍを、
反応緩衝液（６ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，５
）、５０ｍＭ　ＭａＣ（Ｉ及Ｕ　５ａ＋Ｍ　ＭｇＣ（！
ｔ）　１００ｕ　Ｑ中、３７℃、３０分間で酵素５ａｕ
３Ａ　（ＢＲＬ）　１６０により部分的に消化した。

このようにして消化したＤＮＡ混合物をショ糖グラデイ
エンド上に負荷し、３０００ないし４０００ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを含有するフラクションを寒天ゲル上で
の電気泳動によって同定した。操作条件は上記ａ）のも
のと同じである。

反応混合物（ｌＱａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐｆ
ｌ　８．０）、１００ｄＷａＣ（ｌ及び５ｓｊｌ　Ｍｇ
ＣＱｔ）　’ＩＱＢρ中、３７℃、２時間で酵素ＭａＩ
１１旧（ＢＲＬ）　５０Ｕによってｐｔｌｃ１２　ｒｕ
ｔを消化した。

ついで、プラスミドＤＮＡを−２０’Ｃにおいてエタノ
ールで沈殿させ、遠心分離し、前記ａ）の如く、再環化
を防止するため酵素ＣＩＰ　（仔ウシの腸内ホスファタ
ーゼ）で処理した。ＤＮＡ１６Ｑｎｇを、グラデイエン
ドから得られた３０００−４０００ｂｐフラグメントを
含有する混合物８０ｎｇと共に、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ
ｌＯＵの存在下、反応混合物ｌＯｏμＱ中、４℃におい
て１８時間インキュベートした。

リガーゼ混合物２μｅを上述の方法によってコンピテン
トした大腸菌７１／１８細胞３００μＱの形質転換に使
用し、２ＸＹＴ寒天培地上に置き、３７℃で１２時間イ
ンキュベートした。

リガーゼ混合物全体から組換えコロニー６３００個が得
られた。

アンピシリン５０μ９７Ｍ（ｌを含有するＬｕｒｉａ寒
人培地（Ｂａｃｔｏ−丁ｒｙｐｔｏｎｅ、　５９．／Ｑ
　Ｂａｃｔｏ−ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、５ｇ、／Ｑ
　ＮａＣ（りのプレート−Ｌで、コロニーをｌ　ＯＱ　
ＩＴＡｌの群に移した。

１：ｃｏｌｉ　ｌ及び５ａｕ３Ａゲノムバンクから得た
コロニーを、レプリカ平板法（Ｉｌａｙｅｓ　Ｗ、　ｒ
Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓｏ「ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎ
ｄ　ｔｈｅｉｒ　ｖｉｒｕｓｅｓＪ　ｐ１８７、Ｗｉｌ
ｅｙ発行、１９６８年）によって、Ｍ９　＋グルコース
最小培地Ｃ６９／（ｌ　Ｎａ＝ＨｐＱ、、　３９／Ｑ　
ＫＩＩ！ＰＯ，、０，５ｇ／ＱＮａＣ（！、　＋９／’
Ｑ　ＮＨ，ＣＩ２．２ｔｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、０，１ｍＭ
　ＣａＣ９ｔ、０２％グルコース、０．５％寒天及び１
％アミロペクチン　、　ｐＨ６，０）のプレート上に移
し、３７℃で４８時間（シキュベートした。

ついで、ヨウ素フレーク　２ｇ、Ｋｌ　１ｇ、ＥｔＯＨ
（９５ｏｂ）２５．ＷＱ、　１Ｉｔ０７５＋ｆ２の組成
を存する溶液（ＨａｒａｄａＴら１−Ａｐｐｌ、　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｉＪ　２８．３３６　（Ｉ９７４））を使
ＩＩＩ　ｌ、て、コロニーをヨウ素蒸気に１−２分間さ
らした。ＥｃｏＲＩゲノムバンクからのコロニーは（−
）の結果を示したが、５ａｕ３Ａゲノムバンクからの２
つのコロニー（コロニー９及び１７と称する）は、同じ
条件下でツユ−トモナスＳＭＰＩを生育させろ際に観察
されたものと同一のアミロペクチン減成リング（第１図
）を示した。これは、これらコロニーがイソアミラーゼ
を生産できることを示し、従って、コロニー内に上記酵
素をコードづけする遺伝子が存在することを示す。

形質転換していない大腸菌７１／１１１１細胞を、コン
トロールとして、Ｍ９＋アミロペクチン最小培地上、Ｐ
Ｈ６，０，３７℃で４８時間生育させ、ヨウ素蒸気で処
理したところ、減成リングを示さなかった。

さらに、最小培地において他のｐＨ値で生育させた場合
、ｐＨ＞６．０ではコロニー９及び１７が減成リングを
示さないことがわかった。

ｂ）（＋）コロニーの制限酵素による分析コロニー９及
び１７中に存在する組換えプラスミドを犬種抽出によっ
て単離し、制限酵素Ｐｓｔ　ｌ、ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉ
ｎｄｌＩＩ、５ｓｔｌ、Ｓｍａｌ、ＢａｍＨＩ、　Ｘｂ
ａｌ及び５ａｌｌによって処理した後、０．８％アガロ
ースゲル上、ｔｏｏｖ１２時間での電気泳動によって分
側斤（２た。

コロニー９から単Ｍ１、たプラスミドｐｓＭ２５７は約
：（２００ｂｐの挿入体（ＥｃｏＲＩ部位、ＢａｍＨ［
部位及び５ｓｔｌ部位を含ａしており、その正確な位置
を第２図に示す）を含有していた。

コロニー１７から単離したプラスミドｐＳＭ２５ｇは、
プラスミドｐＳＭ２５７と同じ制限部位を含有する約３
０００１）Ｐの挿入体を有していた。

このプラスミドの制限地図を第３図に示す。

−）いで、これら２種類のプラスミドを５ａｕ３＾ｌり
びｌ１ｐａ［の如き２種類の酵素（頻繁に切断する）で
消化し、同じ酵素で処理したプラスミドＰＵＣ１２２支
び分子ｉ１マーカー　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と比較
した。

得らイまた消化ハイブリッドのポリアクリルアミドでの
分析では、いずれの場合とも同じではあるが、ｐＬｌｃ
１２について得られたしのとは異なる電気泳動ネト動を
示した（第４図）。

（りウェスタン−プロットによる分析 コロニー９皮び１７から得られた細胞をＭ９＋アミｌ：
ＩべＰ７千ン培地（ｐＨ６）のプレートから採取し、Ｓ
ＴＳ緩衝液（Ｉ２５１１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　３
％２−メルカプトエタノール、３％硫酸ドデシルナトリ
ウム及び２０％グリセリン　；　ｐＨ６，８）　１０μ
ｅに溶解させた。

ついで、溶液を、不連続ポリアクリルアミドＳＴＳゲル
（Ｈａａ＋ｅｓ　Ｂ、Ｄ、　ｒＧｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｒＰｒｏｔｅｉｎｓＪ　２９０、
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ発行、１９８１年）に負荷し、１２
５Ｖ、２時間で展開した。

タンパク質を、Ｐａｒｋｅｒ　Ｒ，Ｇ、らの方法（ＪＭ
ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｉｏｌｏｇｙＪ　６５．３５ｇ　
（Ｉ９８０））によって、ゲルから低融点ニトロセルロ
ースフィルタートに移した。

同時に、ｌ昆合物３０μＱ中、２５℃、１．５時間で、
Ｍ１３ｍｐ８　ｂｌを制限酵素Ｓｍａ　Ｉ　　ＩＯＵで
消化した。

リガーゼ混合物５０μＱ中、Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼＩＵ
の存在下、２３℃、１８時間で、各フラグメントｌＯｎ
ｇをＭ１３Ｂ８ファージＤＮＡ　２００ｎ９　と結合さ
せた。

リガーゼ混合物全体を大腸菌７１／１８のコンピテント
細胞の形質転換に使用し、Ｌ寒天プレート上で組換えコ
ロニーを選別した。

ハイブリッドファージベクターを含有するコ［Ｊニーを
分析に供し、制限酵素によって適当に切断ｔろことによ
りフラグメントの配向を決定した。

たとえば１９００ｂｐフラグメントを有するハイブリッ
ドを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（フラグメント及びベクタ
ーにおいて、フラグメントの極近辺で対称的に切断する
）で消化した場合、配向によって、３００ｂｐ又は＋６
００ｂｐのフラグメントを生成した。

同様に、１３００ｂｐを存するプラスミドを酵素５ｓｔ
ｌ及び１ＩｉｎｄＩＩＩで消化した場合、５ｃｈｕｌｌ
　４５μｇフラグメントを得た後、Ｔｏｗｂｉｎ　Ｈ，
らの開示に従っテ（ｒＰＮＡｓ　ＵＳＡＪ　Ｖｏｌ、７
６．４３５０−４３５４　（Ｉ９７９））、ペルオキシ
ダーゼと共役せしめた抗−イソアミラーゼ抗体及びウサ
ギ抗−１ｇＧ抗体によってフィルターを処理した。

結果（第５図に示す）は、（＋）の反応、すなわちタン
パク質と抗−イソアミラーゼ抗体との特異な反応を示し
た。

実施例３ プラスミドｐｓＭ２５７５．２ｔｔ９を、酵素Ｓｉａ　
１（ＢＲＬ）　１００を含有する緩衝液２０μＱ中、２
５℃で１時間消化し、反応液の容量を１５μＱとした後
、ＢａｍＨＩ　　（ＢＲＬ）　１００によって３７℃で
１時間消化した。プラスミドｐＳＭ２５７２．６μりを
、緩衝液５０ｔｔＱ中、３７℃、２時間で、ＢａｍＨ’
ｉ及びＸｂａ　ｒ　（ＢＲＬ）それぞれｔｏ（Ｉによっ
て消化した。

６５℃で１０分間処理することによって酵素反応を停止
し、得られたＤＮＡフラグメントを酵素ＤＮＡポリメラ
ーゼ■（ラージフラグメント又はＫｌｅｎｏｖフラグメ
ント）　２Ｕで処理して、その端部を平らにさせた。

ついで、アガロースゲル上での電気泳動によって、Ｓｅ
ａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメント（約１９００ｂｐ）
及びＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ　［フラグメント（約１３０
０ｂｐ）を分離した。その後、これらのフラグメントか
らは、配向に応じて、それぞれ３００ｂｐ及び１６００
ｂｐのセグメント、５００ｂｐ及び８００ｂｐのセグメ
ントが得られた。２種類のフラグメントを含有するプラ
スミドをα、β、γ及びδと名付けた（第６図）。

つづいて、Ｍｅｓｓｉｎｇの方法（ｒＭｅｔｈｏｄｓ　
ｒｎＥｎｚｙｎｏｌｏｇｙＪ　１旧、２０　（Ｉ９８３
））によって逆方向の配向の確認を行った。

ついで、５ｔｒａｕｓｓらによって開示された連続プラ
イマー法（［＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｉｌ　１５４．
３５３　（Ｉ９８６））を使用し、Ｓａｕｇｅｒ　Ｆ、
らの方法（ｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　７４−１５４６３　
（＋９７７））によってシーフェンスした。プライマー
として使用したオリゴヌクレオチドはＤＮＡ自動合成装
置システム１プラス（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって合成し
た乙のである。

／−フェンス反応を、トレーサーとしてα［”Ｐ］ｄＡ
ＴＰを含有するｒＤＮ＾シークエンシングシステム（Ｎ
ＥＮ）Ｊを使用し、常法に従って実施した。

電気泳動による分離に使用した装置は、Ｍａｃｒｏｐｈ
ｏｒンークエンシングシステム（ＬＫＢ）である。

イソアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に関連するい
くつかの問題がある（ゲル上各フラグメントが同様の移
動を生ずる）。これらは、ＭｉｚｕｓａｖａＳ　らによ
って開示された方法（ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲ
ｃｓｃｒ、　Ｊ　１４　（３）、１３１９　（Ｉ９８６
））に従い、グアノシン（すなわち、７位に窒素原子が
なく、従って、近接するヌクレオチドと２次構造を形成
しうるヌクレオチドの能力を大いに低減させるＣ、デア
ザｄＧＴＰ）を使用することによって回避される。配列
の複雑な領域を明確にするための他の方法は、ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（ラージフラグメント）の代りに酵素イン
バース・トラスクリブターゼを使用することである。

シーフェンスの結果、得られたシュードモナスＳＭＰ　
Ｉの染色体ＤＩ＾のフラグメントは３３３５ｂｐを含存
し、酵素をコードづけする領域は２３２ｆ！ｌｂｐ　（
アミノ酸７７６個に相当する）を含有していた（第７−
８図）。

第９図は、遺伝子調節配列を含むイソアミラーゼの構造
遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

ヌクレオチド組成（その配列を第９図に示す）から推測
されるアミノ酸組成を下記第１表に示す（芳香族及び飽
和脂肪族残基３０％が存在するため著しい疎水特性を示
す）。

第　　１　　表 残基の敗　　　　　　　　残基の散 （全体にｚ＝ｔする別−伴驚χ（全体に対する割合％）
Ａｌａ　　　８６　　　（Ｉ１，１） Ａｒｇ　　　２６　　　（３，４） １〜ｓｎ　　　２９　　　（７，６） Ａｓｐ　　　４２　　　（５，４） Ｃｙｓ　　　　８　　　（Ｉ，０） Ｇｌｎ　　　ａ６　　　（４，６） Ｇｌｕ　　　Ｉ８　　　（２，３） Ｇｌｙ　　　７８　　　（Ｉ０，１） ｔｌｉｓ　　　　６　　　（０，８） １１ｅ　　　２５　　　（３，２） Ｅｎｄ　　　　Ｏ（０，０） （６，３） （Ｉ，８） （Ｉ，７） （４、８） （９，８） （７、５） （６，７） （５，７） 酸性（Ａｓｐ、　Ｇｌｕ） 塩梧性（Ａｒｇ、　Ｌｙｓ） ｊ谷底（Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　Ｔｒｙ）疎水性 （芳谷族＋Ｉｌｅ＋Ｌｅｕ＋ＭｅＬ＋Ｖａｌ）（７，７
） （５，２） （Ｉ３，０） （２９，９） Ａ）プラスミドｐｓＭ２２１の構成 プラスミドｐＵｃ１２５１１９を、制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄＩ［［（ＢＲＬ）によって、該酵素の供給
者が指示する方法に従って消化し、該プラスミドからポ
リリンカーを単離し、採取した。

ＥｅｏＲ１−１（ｉｎｄｌｌｌフラグメントを含有しな
いプラスミドベクターを、１８塩基対を含有しかつ下記
配列を有する合成オリゴヌクレオチド（末端にＥｃｏＲ
１制限部位及びＨｉｎｄｌＩＩ制限部位をａし、中間に
ｓｐｈ　Ｉ制限部位及び＾ｖａｌ制限部位を有する）と
りガーゼによって結合させた。

実施例４ プラスミドｐＳＭ２５７５μ９を、制限酵素Ｓｐｈ　１
及びＳｓａ　Ｉ　　（ＢＲＬ）　２００によって、該酵
素の供給者が指示する方法に従って消化した。

消化混合物を、酵素反応を停止するため６５℃で１０分
１１Ｘ１処理した後、５％アクリルアミドゲル上に負荷
し、イソアミラーゼ遺伝子を含Ｈする約２４００　ｂｐ
のＳｐｈ　ｌ　−３Ｉｌａ　Ｉフラグメントを溶出した
１、 ついで、ｆしめ酵素Ａνａ１で消化し、挿入体のＳ１１
末端に適合するようにＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｖフラグメントで処理し、最後に制限酵素Ｓｐｈ　Ｉ
で処理したブラスミＦ　ｐｓＭ２２１　（Ｉμｇ）に、
ｌ−記フラグメント　ｌμ９を挿入した。

Ｓｐｈ　ｌ　−Ｓｅａ　Ｉフラグメントと上記の如く消
化したプラスミドｐＳＭ２２１　との間のりガーゼ反応
を、リガーゼ後衛Ｌ＆（５０μσ）中、Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼＩＵの存ｔＥＦ、１４℃、１８時間で実施した。

反応終了後、ノガーゼ混合物１ＯｕＱを使用シテ、５０
ｄ　ＣａＣＱｌでの処理によ−てコンピテントとした大
腸菌７１／１８細胞２００μりの形質転換を行った。

５（ｌ　ｑｙ、／４　Ｔンヒシ’）　：／、０．０５　
ｍＭ　ＩＰＴＧ　（イソプロピルロー千才ガラクトピラ
ノシド）及び０．０２％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−
クロロ−３−ヨートリル−１）−ガラ′アトピラノンド
）を添加することによって選択的なものとした２ＸＹＴ
培地（Ｉ６ｙ／／２Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、　１
０　ｇ／Ｑ　ＢａｃＬｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ
、１９／Ｑ　Ｎａ（Ｊ）上に展開し、恒温室において３
７℃で１２時間インキュベートした。組換えプラスミド
［Ｂｉｒｎｂｏｉａ　Ｈ，Ｃ及びＤｏｌｙ　Ｊ、の方法
（ｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、Ｊ　７．１５
１５　（Ｉ９７９）によって抽出］を制限酵素によって
分析した。

良好な割合のコロニーが予想したように挿入された所望
のフラグメントを含有することが確認された。

これらプラスミドの１つ（ｐＳＭ２６２）は第１θ図に
示す制限地図によって特徴づけられる。

Ｃ）プラスミドＰＳＭ２８９の構成 プラスミドｐｓｋ１２５７１０μンを制限酵素Ｎａｒ　
１（ＢＲＬ）　４００によって３７℃、１時間で消化し
、特殊な緩衝液１００μｅ（最終容量）中、３０分間、
常温（２０−２５℃）においてＫｌｅｎｏｖ　ＤＮ＾ポ
リメラーゼｌと反応させて、その端部を平らにした。

ついで、混合物を３７℃、１時間で制限酵素ＢａｍＨＩ
　　４０１Ｊによって消化し、５％アクリルアミドゲル
上に負荷し、リーダーペプチド及びイソアミラーゼ構造
遺伝子の最初のヌクレオチド３９０個を含有する　５１
１ｂｐ　Ｎａｒ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメント（ａ）
を溶出した。

残りの部分、すなわち遺伝子の２０１０ｂｐ　（ｂ）を
、プラスミドｐＳＭ２６２　（５ｔｔ９）を制限酵素８
ａｓ）Ｉ　Ｉ２０ｔｌ及びｌｌ１ｎｄ［ｌ　（ＢＲＬ）
　２００で消化することによって得た。

同時に、ベクターｐＵｃ１２　（ｃ）　５μ９を、まず
制限酵素Ｓ＋＋＋ａ　ｌ　　２０Ｕによって該酵素の供
給者が指示する緩衝液中、２５℃、１時間で消化し、Ｎ
ａＣＱを添加して塩の濃度を最終濃度５０ＩＩＩＭに変
化させた後、制限酵素１１ｉｎｄＩ［ｌ　２０ｕにより
　３７℃、１時間で消化した。

リガーゼ緩衝液５０μρ（最終濃度）中、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼｔＵの存在下で、ベクター（ｃ）　１００口９
、挿入体（ｂ）　ｔｏｏｎ９及び挿入体（ａ）　３５ｎ
９を１４℃において１夜反応させた。

反応終了後、リガーゼ反応混合物１０ｎｌを使用して、
Ｈａｎａｈａｎによって開示されたように（「Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｊ　１６６．５５７−８５０　（Ｉ
９８３））塩化ルビジウムによってコンピテントとした
大腸菌ＤＩ（ｌ細胞［Ｆ−ｒｅｃ　ＡｔＳｅｍｄ　ＡＩ
Ｓｇｒｙ　Ａ２Ｂ、ｔｈｉ−Ｌ　５ｕｐＥ４４、ｈｓｄ
　Ｒ１７（ｒ、、、ｍｉ）］　１００μ１２の形質転換
を行った。

ついで、２ＸＹＴ培地のプレート上　（３７℃、１８時
間）で形質転換体を選別した。形質転換クローンから組
換えプラスミドを抽出した。制限酵素による分析では、
予想したパターンを示した。

この組換えプラスミド（９３Ｍ２８９）の制限地図を第
１１図に示す。

実施例５ 枯草菌における発現及び分泌用ｐｓＭ２９０組換えＤＮ
Ａ分子の構成 Ａ）プラスミドｐｓＭ２６８の構成 ＰＳＭ２１４　ＡＴＣＣ６７３２０３容　（各々１μ９
）を３７℃、１時間でＢｇｌ■　５ｕ及びＢａｎ＋ＨＩ
　　５０で消化した。

得られたＤＮＡフラグメントをヌクレアーゼＢａ１３１
０．３Ｕと２３℃において、２．３　及び４分間インキ
ュベートすることによってその端を侵食させ、つづいて
標準条件下、ＤＮＡポリメラーゼ１ラーンフラグメント
で修繕した。

得られた各種の鎖長を有する分−子を、１４℃、１夜で
のＴ４　ＤＮＡリガーゼによる処理によって再環化させ
た。

ついで、リガーゼ反応混合物を使用し、ＤｕｂｎａｕＤ
　及びＤａｖｉｄｏｆｊ−＾ｂｅｌｓｏｎ　Ｒ，によっ
て開示された方法（ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ　
５６．２０９　（Ｉ９７１））によりコンピテントとし
た枯草菌の菌株５Ｍ５１０８（ｒｅｃ−、ｈｉｓ−、Ｉ
ｅｕ−）を形質転換させた。

形質転換体を、クロラムフェニコール５μ９／ｌｌ１ｅ
を含有するｖｙプレート　（２５９／ｆｆ　Ｖｅａｌ　
ＩｎｆｕｓｉｏｎＢｒｏｔｈ、　５９／Ｑ　Ｙｅａｓｔ
　Ｅｘｔｒａｃｔ）上で選別した。

得られたクローンから抽出したプラスミドを各種制限酵
素によって分析した。

組換えプラスミド（ｐＳＭ２６ｇ）は、枯草菌の複製開
始点及び抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を
コントロールする遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）を含有するも
のの最小（約５０００ｂｐ）のものであった。

該プラスミド１０μ９を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄＩ［［各４Ｕにより、３７℃、１時間で消化した。

６５℃に１０分間維持して酵素反応を停止させた後、消
化混合物を低融点アガロースゲル上に負荷し、枯草菌の
複製開始点及びＣＡＴ遺伝子を含有するＥｃｏＲ［−Ｈ
ｉｎｄＩＩ［フラグメント　（４２００ｂｐ）を溶出し
、ｒＧｅｎｅ　ｃｌｅａｎＪシステム（Ｖｏｇｅｌｓｔ
ｅｉｎ　Ｂ、及びＧｉ目ｅｓｐｉｅ　Ｄ、　ｒＰ、Ｎ、
Ａ、ｓ、Ｊ　７６．８１５　（Ｉ９７９））によって精
製した。

同時に、プラスミドｐＳＭ２８９　（５μ９）を、緩衝
剤混合物２０ｐＱ中、３７℃、１時間でＨｉｎｄｌＩＩ
　１００によって消化し、得られた切断生成物をアガロ
ースゲル上での電気泳動によってチエツクした後、３７
℃、１５分間でＥｃｏＲｒ　　５０によって消化した。

ついで、アガロースゲル上での電気泳動及びエレクトロ
溶出によって、消化混合物からＤＮＡのＥｃｏＲＩ　−
）１ｉｎｄｌｌｌフラグメント　（約２４００ｂｐ）を
単離した。

Ｂ）　ｐｓＭ２９０の構成 ４２００ｂｐフラグメント　５００ｎ９及び２４００ｂ
ｐフラグメント　ｌｔｉ’ｉを、リゲーンヨン緩衝液１
５μρ中、Ｔ４　ＤＮＡＩＪガーゼＩｋｌ　＋７）存在
ド、１５℃、１夜の豪件で結ｉ）さｌｉ゛た。該反応混
合物３０Ｏｎ７を使用１ノご枯／、Ｙｌ’＋！ｊ　５Ｍ
５１０８のコンピテント細胞１００μＣを形′ｌτ転換
させ、り［１ラムフエニコールを混合したＶＹ培地ｌで
形質転換体を彦別した。

ｉ：Ｊら４またクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し
、４．１ｊ限酵讃を使用して分析した。

分析したプラスミドのうち２つが予想した構造のイソア
ミラーゼ遺伝子を含ａするＥｃｏＲＩＩｔ　ｉ　ｎｄ　
ＩＩＩ　７’ラゲメントを白゛していることが確認され
た。

これらのプラスミドの１つ（ｐｓＭ２９０）は第１２図
に・卜す制限地図によって特徴づけられる。

ｆ−ｐｕｅ　ノークエンソングキットＪ　（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）を使用して、プラスミドｐｓＭ２９０の正
確な構成をチエツクするヌクレオチド配ダリを得た。

実施例６ １１ａｒａｄａによって開示されノ；イソアミラーゼ活
性を証明する方法（Ｓｕｇｉ＋ｎｏｔｏ　Ｔ　　らｒＡ
ｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｊ　２８．３３６　（Ｉ９
７４））を変形して、各種組換えクローンからイソアミ
ラーゼを生産するクローンをビ＝・クアップした。

プラスミドｐＳＭ２８９を含ｆ￥　１−６大ｍ菌ＤＨＩ
　ｗｈ胞を、最小培地Ｍ９＋０．２％グルコース及び／
又はマルトース（６ｉ？／　Ｑ　ＮａｔＨＰＯ−１３ｇ
／Ｉ　ＫＩＩＩＰＯ，，０，５９／Ｑ　ＮａＣＬ　１９
／Ｑ　ＮＨ，Ｃｉ２．２ＩＩｉＭ　Ｍｇ５Ｏ，、Ｏ，１
ｄＣａＣＱ　！、１．５％寒天）＋１％アミロペクチン
（基質及びインデューサーとして）及び５０μ９ＩＲＱ
アンピシリンで生育させた。培地のｐＨをＩＩｃＱによ
って６．８とした。

プラスミドｐｓ１４２９０によって形質転換させた枯草
菌ｓｙｓｉｏｇの細胞を、１％アミロペクチン、５μｇ
／Ｉ（！クロラムフエニクール及び５０μ９／１ＱＮｉ
ｓｉｄｉｎａ及びロイシンを混合したＭ９培地＋０．２
％グルコース及び／又はマルトースで生育させた。

枯草菌に関して使用した他の培地は、０２％グルコース
及び／又はマルトースを含ａするＭＢ培Ｉｌ！！（２り
＃　　（ＮＩｌ、）ｔｓｏ、、１８．３？／ｆ！　　Ｋ
！ｌ＋Ｐｏ４・３Ｈ７０，６ｙ／ｒ　ＫＨ＋ｌ”Ｏ，、
ｌｙ／（！　クエン酸Ｎａ　・２１ＬＯ１０，２ｙ／’
Ｑ　Ｍｇ５Ｏ，・７１１，０）　＋　　１％アミロペク
チン、１．５％寒天、５μｙ／ｍＯクロラムフェニコー
ル及び５０ｔｌＷ７フＱ１−述のアミノ酸である。

これら培地のｐＨを６．０に調整した。

コロニーを３７℃で約２４時間生育さけ、ついでヨウ素
蒸気（ヨウ素フレーク　２９、Ｋｌ　１９、エタノール
（９５動）２５す堤び水２５す）にさらした。

；２分間さらした後、イソアミラーゼを生産する入腸菌
Ｄ１１２（ｐＳＭ　２８９）のコロニーは目送つ青色の
」ングを小し、枯草菌ＳＭ５１０ｇ（ｐｓＭ２９０）の
クローンは、−Ｆ記菌株によ−）で生産されたα−アミ
ラーゼによる干渉のため、より淡いリングを示した。

旧液中におけるイソアミラーゼ活性の検定ξ陽画ＤＨ２
（ＰＳ＠２ｇ９）及び枯草菌ＳＭＳ１０ｇ（ｐｓＭ２９
０）の細胞を、それぞれＭ９培ｈｈ　５０ｉ（！ＳＭ９
培地及びＭＢ培地３５０＊９に接種し、穏やかに撹拌し
ながら３７℃で１６時間培ＩＣた。

ついで、入場菌細胞から周辺質を抽出し、友揚閑皮び枯
草菌から全タンパク質を抽出した。

実際には、Ｋｏｓｈｌａｎｄ及びＢｏＬｓｔｅｉｎの方
法（ｒｃｅｌｌＪ　２０　（３）、７４９−７８０　（
Ｉ９８０））に従い、下記の如く操作して、周辺質タン
パク質を抽出した。

細菌培養基２１をＥｐｐｅｎｄｏｒｒａ心分離において
、１２００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。

ついで、ベレットを回収し、３０ＩＩ＋Ｍ酢酸塩緩衝液
（ｐｆ＋　４）及び５０ｍＭ　ＮａＣσで２回洗浄し、
上述の如く遠心分離し、最後に２０％ンヨ糖、３０ｆｆ
ｉＭ酢酸塩緩衝液（ｐｌ＋　４）及びｌｄ　ＥＤＴＡの
溶液１７１Ｑ中に懸濁させた。

得られた懸詞液を常温（２０−２５℃）に５分間推持し
、一定時間毎に撹拌し、４°Ｃで５分間遠心分離し、最
後に４℃に維持した蒸留水目σ中に懸濁させた。

得られた＠濁液を水浴中で１０分間インキュベートし、
・１℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、Ｌ澄み
夜中に所望の周辺質フラクションを得た。

使用した溶液のいずれにら、プロテアーゼ阻害剤、すな
わちＰＭＳＦ　（塩化フェニル−メチル−スルポニル）
及びＥＤＴＡを最終濃度それぞれ１ｍＭ及び５ｍＭで含
Ｈする。

このフラクンヨン４００μＱ（必要であれば、ＡＭＶＣ
ＯＮシステムによって濃縮する）をイソアミラーゼ活性
の検定に使用した。

一方、各細菌培養基１０ｎ（ｌを４℃、５０００ｒｐｍ
で５分間遠心分離することによって全タンノくり質を抽
出した。

得られた細胞ペレットを、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
４）、５０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ（！、ｌａ＋Ｍ　ＰＭＳＦ及
び５ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡのＬ′Ｂ液１容によって２回洗浄
し、上述の如く遠心分離した。

ついで、ペレットを、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有するｌ０
ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４）　ＳｘＱ中に再び懸濁させ
た。

細胞懸７＋！５液をＦｒｅｎｃｈｉ−ｐｒｅｓｓ　（Ａ
ＭＩＮＣＯ）により２５００ｐｇｉで処理して細菌の細
胞壁を破壊し、細胞成分を放出させた。

枯草菌細胞の場合、Ｆｒｅｎｃｈｉ　−ｐｒｅｓｓによ
る細胞融解前に、リゾチーム５ａｇ／　ｘ（ｌと３７℃
で１０分間インキュベートして細胞壁の抵抗性を低減さ
せた。

ついで、上澄み液、細胞抽出物及び周辺質抽出物中にお
けるイソアミラーゼ活性を、Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ＾
、らによって記載された方法（ｒＢ、Ｂ、＾、Ｊ　２１
２．４５８−４６９　（Ｉ９７０））に従って測定した
。

実際には、４０℃に維持した１％（Ｗ／Ｖ）アミロペク
チン（ＳＩＧＭ＾）水溶液２ｘ（ｌを、酢酸塩緩衝液（
ｐＨ４）　４００ｕ（ｌ及び被検定溶液４００μ（！と
混合した。

得られた混合物を４０℃に１時間推持し、反応開始時（
Ｔｏ）及び反応終了時（Ｔ１）に分析用サンプル（４０
０ｕｇ）を採取した。

比色反応及び分光光度計による読み取りを行う前に、サ
ンプルをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機において常温、
１１０００ｒｐで３０秒間遠心分離して、吸収の測定を
妨害する懸濁物質を除去した。

遠心分離後、サンプルを、ヨウ素試薬（０，２％（ｖ／
ｖ）　ｌ、２％（ｗ／ｖ）　Ｋｌ及び０．２％（ｖ／ｖ
）　ＨｔＳＯ４を水で２０ｘρとしたもの）４００μＱ
と混合し、常温に約１５分間維持した。

分光光度計Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩＩＩＩｅｒ　５５１Ｓに
おいて、上述の如く調製したブランク　（サンプルの代
わりに酢酸塩緩衝液を使用したもの）に対する６１０ｎ
ｍの吸収を測定した。

純粋なイソアミラーゼを使用して、（＋）のコントロー
ルも調製した。

用語「イソアミラーゼ単位Ｊは、６１０ｒ＋ｍにおける
分光光度計の読みを４０’Ｃ１１時間で０．０１０Ｄ上
昇させるイソアミラーゼの量をいう。

大腸菌及び枯草菌に関して得られた結果をそれぞれ第２
表及び第３表に示す。

第　　２　　表 ブランク 大腸菌（ｐＳＭ２８９）培養基 〃　　　　細胞抽出物 〃　　　　周辺質 第　　３　　表 （Ｕ／３１１２） ４．２ノ／ １３．５　　　　〃 ８．２ノＩ ブランク　　　　　　　　　　　　　　　０（Ｕ／次Ｑ
）イソアミラーゼ（２０ｒ１９）　　　　　　　　８．
９　　〃枯草菌（ｐＳＭ２６８）培養基　　　　　　０
　　〃〃　　　　細胞抽出物　　　　０　　〃枯草菌（
ｐｓｖｚ９ｏ）培養基　　　　　　８９．４　　〃〃　
　　　細胞抽出物　　　　７，８〃シユ一ドモナスＳＭ
ＰＩ培養基　　　１０２．３　　〃第３表のデータによ
って示されるように、枯草菌は、プラスミドｐｓＭ２９
０によって形質転換された際には、元のソニートモナス
ＳＭＰＩのらのに匹敵する量でイソアミラーゼを合成で
きるだけでなく、特に培養基内に該酵素を分泌できる。

さらに、該酵素の最適生産レベルに関し、ンユードモナ
ス５ｖｌｌ’ｌ　Ｔ：　ｉｊ　５　ｒｌテア７）ノＬ：
対し、枯草菌（ｐｓＭ２９０）ではｆ）十か１６時間で
最適生産レベルに達する。

【図面の簡単な説明】

第１図は彩質転換されたクローンを選別する際の状態を
示す図、′ｆ、２図はプラスミドｐＳＭ２５７の”１，
１１限地図を示゛４−図、第３図はプラスミドｐＳＭ２
５ｇの制限地図を示す図、第・１図はハイブリッドプラ
スミドの電気泳動挙動による比較分析の結果を示す写α
、第５図はイソアミラーゼの存在に関する分析の結果を
示す写真、第６図はベクターＭＨｘｐ８にお＋するプラ
スミドｐＳＭ２５７から得られた５ｓｉａ　ｌＢａｍ１
ｌ　Ｉ　７ラグメント（Ｉ９００ｂｐ）及びＢａａＨｌ
　−Ｘｂａ　１フラグメント（Ｉ３００ｂｌ））のクロ
ーニングの進行をｋすグイアゲラム、第７図、第７（Ａ
）図及び第７（８）図はイソアミラーゼ遺伝子を含存す
るシュードモナスＳＭＰ　Ｉから得られた染色体ＤＮＡ
の３３３５ｂＰヌ′ルオチド配列を示す図、第８図、第
８（Ａ）図汝び第８（Ｂ）図はイソアミラーゼをコード
づけする横−遺伝子のヌクレオチド配列及び該ヌクレオ
チド配ダリから誘導される酵素のアミノ酸１列を表ず図
、第９図、第９（Ａ）図及び第９（Ｂ）図はイソアミラ
ーゼの構造遺伝子及び調節及び分泌配列を含存するシュ
ードモナスＳＭＰＩから得られた染色体ＤＮＡのフラグ
メントのヌクレオチド配列を表す図、第１０図はプラス
ミドｐＳＭ２６２の制限地図を示す図、第Ｕ図は大腸菌
における発現及び分泌用のハイブリッドプラスミドｐＳ
Ｍ２８９の制限地図を示す図、及び第１２図は枯借菌に
おける発現及び分泌用のハイブリッドプラスミドｐｓＭ
２９０の制限地図を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記の式（ I ）で表されるヌクレオチド配列を有
   することを特徴とする、イソアミラーゼの構造遺伝子。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ２　請求項１記載のものにおいて、遺伝子が５′末端に
   ＡＴＧを有する、イソアミラーゼの構造遺伝子。 ３　請求項１記載のものにおいて、前記遺伝子が、５′
   末端に、イソアミラーゼの分泌シグナルペプチドをコー
   ドづけする下記の式（II）で表される配列を有する、イ
   ソアミラーゼの構造遺伝子。 （５′）【遺伝子配列があります】 ４　シュードモナス属に属する細菌の染色体ＤＮＡによ
   って得られたものである、請求項１記載のイソアミラー
   ゼの構造遺伝子。 ５　請求項４記載のものにおいて、前記細菌がシュード
   モナスＳＭＰＩＡＴＣＣ５３６５１である、イソアミラ
   ーゼの構造遺伝子。 ６　下記の式（III）で表されるポリペプチドをコード
   づけするものである、請求項１記載のイソアミラーゼの
   構造遺伝子。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ７　アミノ末端アラニン（Ａｌａ）がメチオニン（Ｍｅ
   ｔ）に結合する前記式（III）のポリペプチドをコード
   づけするものである、請求項１記載のイソアミラーゼの
   構造遺伝子。 ８　アミノ末端アラニン（Ａｌａ）が下記の分泌シグナ
   ルペプチドに結合する前記式（III）のポリペプチドを
   コードづけするものである、請求項３記載のイソアミラ
   ーゼの構造遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ９　請求項１−３記載のイソアミラーゼの構造遺伝子又
   はイソアミラーゼと同等の生物学的活性を有するポリペ
   プチドをコードづけする前記構造遺伝子の領域。 １０　下記の式（IV）（式中、ＧＧＡＴＧはプロモータ
   ー、■は転写開始の推定部位、ＲＢＳはリ ボゾーム付着部位、ＬＳは分泌シグナル配列及びＴはイ
   ソアミラーゼ遺伝子の転写のターミネーター配列である
   ）で表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とす
   る、請求項１−３記載のイソアミラーゼの構造遺伝子を
   含有するＤＮＡフラグメント。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 １１　シュードモナス属の細菌の染色体ＤＮＡから得ら
   れたものである、請求項１０記載のＤＮＡフラグメント
   。 １２　請求項１０記載のものにおいて、前記細菌がシュ
   ードモナスＳＭＰＩ　ＡＴＣＣ５３６５１である、ＤＮ
   Ａフラグメント。 １３　クローニングベクターを請求項１、２、３又は１
   ０のいずれかに記載のＤＮＡと結合することによって得
   られた、宿主微生物において発現する複製可能な組換え
   ＤＮＡ分子。 １４　請求項１３記載のものにおいて、請求項１−３記
   載のイソアミラーゼの遺伝子が、シュードモナス属細菌
   のものとは異なるプロモーター及び／又は分泌シグナル
   配列によってコントロールされる、組換えＤＮＡ分子。 １５　請求項１３又は１４記載のものにおいて、前記ク
   ローニングベクターがプラスミド又はバクテリオファー
   ジの中から選ばれるものである、組換えＤＮＡ分子。 １６　請求項１５記載のものにおいて、前記クローニン
   グベクターが、大腸菌、桿菌類及び酵母類における発現
   用の複製可能なプラスミドである、組換えＤＮＡ分子。 １７　エシェリキア・コリ７５／１８（ｐＳＭ２５７）
   ＡＴＣＣ６４４７４としてアメリカン・タイプ・カルチ
   ャー・センターに寄託された請求項１３−１５記載の組
   換えＤＮＡ分子。 １８　大腸菌、桿菌類及び酵母類の中から選ばれる微生
   物を請求項１３−１７のいずれかに記載のＤＮＡ分子に
   よって形質転換させてなる、形質転換微生物。 １９　エシェリキア・コリＤＨ１である、請求項１８記
   載の形質転換微生物。 ２０　バシラス・サチリスＳＭＳ１０８である、請求項
   １８記載の形質転換微生物。 ２１　請求項６−９記載のポリペプチドの製法において
   、宿主微生物を請求項１３−１７のいずれかに記載の組
   換えＤＮＡ分子によって形質転換させ、炭素源、窒素源
   及び無機塩の存在下、液状環境において、ｐＨ６、温度
   ３０ないし４０℃で前記微生物を培養し、溶解処理した
   細胞又は培養基からポリペプチドを採取することを特徴
   とする、ポリペプチドの製法。 ２２　請求項２１記載の製法において、前記宿主微生物
   が、大腸菌、桿菌類及び酵母類の中から選ばれるもので
   ある、ポリペプチドの製法。 ２３　請求項２２記載の製法において、前記微生物が大
   腸菌であり、溶解処理した細胞からポリペプチドを採取
   する、ポリペプチドの製法。 ２４　請求項２２記載の製法において、前記微生物が枯
   草菌であり、ポリペプチドを培養基から採取する、ポリ
   ペプチドの製法。 ２５　請求項６−８記載のアミノ配列を有することを特
   徴とするポリペプチド及び天然イソアミラーゼのものと
   同等の生物学的活性を有する該ポリペプチドのフラグメ
   ント。 ２６　１−６グルコシド結合の酵素加水分解における請
   求項２５記載のポリペプチドの使用法。 ２７　アミドからのマルトースの生成における請求項２
   ５記載のポリペプチドの使用法。２８　培養基中、良好
   な生物学的活性及び熱安定性を有するイソアミラーゼを
   多量に生産するシュードモナスＳＭＰＩＡＴＣＣ５３６
   ５１。