JPS61257931A - インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 - Google Patents
インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法Info
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- JPS61257931A JPS61257931A JP60099262A JP9926285A JPS61257931A JP S61257931 A JPS61257931 A JP S61257931A JP 60099262 A JP60099262 A JP 60099262A JP 9926285 A JP9926285 A JP 9926285A JP S61257931 A JPS61257931 A JP S61257931A
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- JP
- Japan
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- polypeptide
- aqueous solution
- guanidine
- interleukin
- cell
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、インターロイキン２ （ＩＬ−２）の回収
方法に関し、詳しくは、微生物細胞内に顆粒状に蓄積さ
れているＩＬ−２ポリ−ｅオチドを回収する方法に関す
る。
方法に関し、詳しくは、微生物細胞内に顆粒状に蓄積さ
れているＩＬ−２ポリ−ｅオチドを回収する方法に関す
る。
ＩＬ−２は−Ｔａ胞増殖因子としての作用を有するリン
ホカインの一種であり、医薬としての用途が期待されて
いる。
ホカインの一種であり、医薬としての用途が期待されて
いる。
従来の技術
ＩＬ−２の製造法の一つとして、組換えＤＮＡ技術によ
シ造成された微生物を用Ａる方法が知られている（欧州
特許出願公開第００９１５３９号）。このような微生物
を用いてＩＬ−２ｉ製造しようとする場合、ＩＬ−２，
ｆ？ポリペプチド、微生物細胞内に顆粒状に蓄積される
ことが多い。顆粒状に蓄積され九ＩＬ−２ポリペプチド
を可溶化し、ＩＩ、−２活性を有するポリペプチドとし
て回収するには、従来煩雑な工程を必要とし、また得ら
れたポリペプチドの比活性も低く、更にポリペプチドの
回収率も高いものでＦｉなかった。
シ造成された微生物を用Ａる方法が知られている（欧州
特許出願公開第００９１５３９号）。このような微生物
を用いてＩＬ−２ｉ製造しようとする場合、ＩＬ−２，
ｆ？ポリペプチド、微生物細胞内に顆粒状に蓄積される
ことが多い。顆粒状に蓄積され九ＩＬ−２ポリペプチド
を可溶化し、ＩＩ、−２活性を有するポリペプチドとし
て回収するには、従来煩雑な工程を必要とし、また得ら
れたポリペプチドの比活性も低く、更にポリペプチドの
回収率も高いものでＦｉなかった。
顆粒状に微生物細胞内に蓄積された蛋白質を採取するた
めに、微生物細胞を先ずリゾチームに接触させ、ついで
超音波によシ細胞を破砕し、破砕物よシ遠心分離によシ
蛋白顆粒を分離する方法が知られている（例えば、牛生
長ホルモンについて、バイオテノノロジ−（Ｂｉｏｔａ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ）＋ １５１−１５４．１９８５年
２月を参照）。また、得られた蛋白顆粒をグアニジン塩
酸塩等によシ可溶化することも知られている（例えば、
インターフェロンについて、米国特許第４，４７６，０
４９号参照）。更に、一般の可溶性蛋白質分子中の２つ
のチオール残基全グルタチオン等で酸化してジスルフィ
ド結合を形成せしめることも知られている（例えば、バ
イオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ９
（１９７０）５０１５〜５０２２ ）。
めに、微生物細胞を先ずリゾチームに接触させ、ついで
超音波によシ細胞を破砕し、破砕物よシ遠心分離によシ
蛋白顆粒を分離する方法が知られている（例えば、牛生
長ホルモンについて、バイオテノノロジ−（Ｂｉｏｔａ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ ）＋ １５１−１５４．１９８５年
２月を参照）。また、得られた蛋白顆粒をグアニジン塩
酸塩等によシ可溶化することも知られている（例えば、
インターフェロンについて、米国特許第４，４７６，０
４９号参照）。更に、一般の可溶性蛋白質分子中の２つ
のチオール残基全グルタチオン等で酸化してジスルフィ
ド結合を形成せしめることも知られている（例えば、バ
イオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） ９
（１９７０）５０１５〜５０２２ ）。
しかしながら、微生物細胞内に顆粒状に蓄積されたＩＬ
−２ポリペプチドについては、より比活性が高いポリペ
プチド全よシ高い回収率で得るには、どのような回収方
法が適しているのか、知られていない。
−２ポリペプチドについては、より比活性が高いポリペ
プチド全よシ高い回収率で得るには、どのような回収方
法が適しているのか、知られていない。
特にＩＬ −２ポリペプチドは、他の蛋白質と比べると
、水に溶けにくい。加えて顆粒状ポリペプチドを可溶化
したときは、分子中に３箇のチオール残基が生じ、この
ようなポリペプチドは、ＩＬ−２活性を有しない。従っ
て、これら３つのチオール残基よシジスルフィド結合を
形成せしめる必要があると考えられるが、いずれか二つ
のチオール残基よシ選択的にジスルフィド結合を形成せ
しめなければならない。これらの点から、従来の顆粒状
に蓄積された蛋白に比べ、ＩＬ −２ポリペプチドの回
収については、よシ困難が予想される。
、水に溶けにくい。加えて顆粒状ポリペプチドを可溶化
したときは、分子中に３箇のチオール残基が生じ、この
ようなポリペプチドは、ＩＬ−２活性を有しない。従っ
て、これら３つのチオール残基よシジスルフィド結合を
形成せしめる必要があると考えられるが、いずれか二つ
のチオール残基よシ選択的にジスルフィド結合を形成せ
しめなければならない。これらの点から、従来の顆粒状
に蓄積された蛋白に比べ、ＩＬ −２ポリペプチドの回
収については、よシ困難が予想される。
発明が解決しようとする問題点
従って、本発明の目的は、微生物細胞内に顆粒状に蓄積
されたＩＬ −２ポリペプチドを、可溶性のＩＬ−２活
性を有するポリペプチドとして、よシ高い比活性であっ
てより高い回収率で、回収する方法を見込出すことにあ
る。
されたＩＬ −２ポリペプチドを、可溶性のＩＬ−２活
性を有するポリペプチドとして、よシ高い比活性であっ
てより高い回収率で、回収する方法を見込出すことにあ
る。
問題点を解決するための手段
鋲止のような状況下で本発明者らは、ＩＬ −２ポリベ
ゾチドを顆粒状で細胞内に蓄積している微生物細胞を、
リゾチームと接触せしめた後、超音波にて細胞を破砕し
、ついで破砕物を重力場において沈降物を採取し、沈降
物を１Ｍから６Ｍグアニジン水溶液に入れ、これを弱い
酸化的条件下に置き、最後にグアニジン水溶液中に溶解
されているルー２／リペプチドを採取することにょシ、
高い比活性のポリペプチドが高い回収率で得られること
を見い出した。
ゾチドを顆粒状で細胞内に蓄積している微生物細胞を、
リゾチームと接触せしめた後、超音波にて細胞を破砕し
、ついで破砕物を重力場において沈降物を採取し、沈降
物を１Ｍから６Ｍグアニジン水溶液に入れ、これを弱い
酸化的条件下に置き、最後にグアニジン水溶液中に溶解
されているルー２／リペプチドを採取することにょシ、
高い比活性のポリペプチドが高い回収率で得られること
を見い出した。
組換えＤＮＡ技術によシ造成されたＩＬ−２生産能を有
する微生物及びその微生物を培養してＩＬ−２ポリペプ
チドを生成せしめる方法は、欧州特許出顧公開第００９
１５３９号に記載されている。
する微生物及びその微生物を培養してＩＬ−２ポリペプ
チドを生成せしめる方法は、欧州特許出顧公開第００９
１５３９号に記載されている。
ＩＬ−２ポリペプチド全顆粒状に蓄積している微生物細
胞ヲリゾチームに接触せしめる方法は、微生物菌体を好
ましくは湿重ｔｏ、００５〜０．２ｆｉ／−となるよう
に、ｐ？１６から８の低張緩衝液あるいは培養液にけん
濁し、リゾチームｔ−２，５００からｓｏ、ｏｏｏ単位
／ｌｎｔとなるように加え、好ましくはＯから３０℃の
範囲に、通常３０分以上保てばよい。けん濁液中には０
．１から１００ｍμのＥＤＴＡ ｔ−添加すれば、好ま
しい結果が得られることがある。
胞ヲリゾチームに接触せしめる方法は、微生物菌体を好
ましくは湿重ｔｏ、００５〜０．２ｆｉ／−となるよう
に、ｐ？１６から８の低張緩衝液あるいは培養液にけん
濁し、リゾチームｔ−２，５００からｓｏ、ｏｏｏ単位
／ｌｎｔとなるように加え、好ましくはＯから３０℃の
範囲に、通常３０分以上保てばよい。けん濁液中には０
．１から１００ｍμのＥＤＴＡ ｔ−添加すれば、好ま
しい結果が得られることがある。
リゾチームに接触させた細胞は、９から２５ ｋＨｚの
超音波によシ破砕される。装置は、通常、細胞や組織の
破砕・ホそジエナイジングに用いられる超音波発生装置
を用いればよく、試料に超音波を伝達するホーンは投込
式のもの、カップ式のもの、いずれも使用できる。超音
波出力は、使用する超音波発生装置に適したものでよい
が、通常２０Ｗから１ ｋＷが用いられる。処理時間は
、処理液量。
超音波によシ破砕される。装置は、通常、細胞や組織の
破砕・ホそジエナイジングに用いられる超音波発生装置
を用いればよく、試料に超音波を伝達するホーンは投込
式のもの、カップ式のもの、いずれも使用できる。超音
波出力は、使用する超音波発生装置に適したものでよい
が、通常２０Ｗから１ ｋＷが用いられる。処理時間は
、処理液量。
出力、使用するホーン等に応じ適宜選択すればよい。細
胞の破砕状態は顕微鏡下に容易に観察することができる
。適切な破砕が行なわれると、 ＩＬ−２ポリペプチド
の顆粒以外の細胞構成物（細胞壁。
胞の破砕状態は顕微鏡下に容易に観察することができる
。適切な破砕が行なわれると、 ＩＬ−２ポリペプチド
の顆粒以外の細胞構成物（細胞壁。
細胞膜等）は、微細な破片となり、もとの形をとどめな
い。また超音波処理は発熱を伴うので、けん濁液の熱変
性を防ぐため細胞の破砕は通常４℃とできるだけ低い温
度下で行なわれる。
い。また超音波処理は発熱を伴うので、けん濁液の熱変
性を防ぐため細胞の破砕は通常４℃とできるだけ低い温
度下で行なわれる。
破砕によシ得られたＩＬ−２ポリペプチド顆粒は重力場
におき、沈降物として採取される。遠心分離はＩＬ−２
ポリペプチド顆粒が沈降する条件で行えばよいが、通常
２，０００〜３０，０ＯＯＸ、！ｉ’、好ましくは１０
，０００Ｘ＃、５分程度行なわれる。また、蔗糖等の密
度勾配遠心分離を行ってもよい。このようにして得られ
る沈降物は、通常５Ｏｅｓ以上のＩＬ−２ポリペプチド
を含有する◎ 得られた顆粒状Ｉ Ｌ−２ポリペプチドよりなる沈降物
を１Ｍから６Ｍの範囲のグアニジン溶液中に、好ましく
は、ｏ、ｏｉから０．２１１／ｌの濃度となるようにけ
ん濁又は溶解する。グアニジン溶液が４から６Ｍの範囲
であるときは、顆粒が充分溶解して後、１から４Ｍにな
るよう水で希釈した方がＩＬ−２ポリペプチドの回収率
が高いことがある。グアニジン水溶液の−は、６から１
０の範囲、よシ好ましくは７から９の範囲である。また
、顆粒状ＩＬ−２ポリペゾチドかけん濁または溶解され
ているグアニジン水溶液は、温度５℃から４５℃の範囲
に置くのが好ましい。
におき、沈降物として採取される。遠心分離はＩＬ−２
ポリペプチド顆粒が沈降する条件で行えばよいが、通常
２，０００〜３０，０ＯＯＸ、！ｉ’、好ましくは１０
，０００Ｘ＃、５分程度行なわれる。また、蔗糖等の密
度勾配遠心分離を行ってもよい。このようにして得られ
る沈降物は、通常５Ｏｅｓ以上のＩＬ−２ポリペプチド
を含有する◎ 得られた顆粒状Ｉ Ｌ−２ポリペプチドよりなる沈降物
を１Ｍから６Ｍの範囲のグアニジン溶液中に、好ましく
は、ｏ、ｏｉから０．２１１／ｌの濃度となるようにけ
ん濁又は溶解する。グアニジン溶液が４から６Ｍの範囲
であるときは、顆粒が充分溶解して後、１から４Ｍにな
るよう水で希釈した方がＩＬ−２ポリペプチドの回収率
が高いことがある。グアニジン水溶液の−は、６から１
０の範囲、よシ好ましくは７から９の範囲である。また
、顆粒状ＩＬ−２ポリペゾチドかけん濁または溶解され
ているグアニジン水溶液は、温度５℃から４５℃の範囲
に置くのが好ましい。
グアニシンは、グアニジン塩酸塩が容易に入手できるの
で、塩酸塩が通常使用されるが、他の塩又は遊離形であ
ってもよい。
で、塩酸塩が通常使用されるが、他の塩又は遊離形であ
ってもよい。
顆粒状ＩＬ−２ポリペゾチドかけん濁又は溶解されてい
る１から６Ｍグアニジン水溶液は１弱い酸化条件に置か
れる。弱い酸化条件に置くには、グアニジン水溶液に空
気又は酸素を含む気体を通気してもよく、また、グルタ
チオン、システィン。
る１から６Ｍグアニジン水溶液は１弱い酸化条件に置か
れる。弱い酸化条件に置くには、グアニジン水溶液に空
気又は酸素を含む気体を通気してもよく、また、グルタ
チオン、システィン。
メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等のチオー
ル化合物（及び酸素又は他の酸化剤）及びこれらのジス
ルフィド体のような弱い酸化剤を水溶液に添加してもよ
い。弱い酸化剤は、顆粒状ＩＬ−２ポリペグテドと同時
にグアニジン水溶液に添加しても良いが、 ＩＬ−２ｙ
ｊ？リイプチドがある程度溶解して後、特に４から６
Ｍ’グアニジンを水にて希釈した後に添加してもよい。
ル化合物（及び酸素又は他の酸化剤）及びこれらのジス
ルフィド体のような弱い酸化剤を水溶液に添加してもよ
い。弱い酸化剤は、顆粒状ＩＬ−２ポリペグテドと同時
にグアニジン水溶液に添加しても良いが、 ＩＬ−２ｙ
ｊ？リイプチドがある程度溶解して後、特に４から６
Ｍ’グアニジンを水にて希釈した後に添加してもよい。
弱い酸化剤は大過剰量使用されるが１通常１から１００
ｍＭ好ましくは１０から２０ｍＭの濃度範囲で用いら
れる。ジスルフィド化合物を酸化剤として用いる場合は
、そのチオール体と混用するのがよく１例えばグルタチ
オンを用いる場合には、還元型グルタチオン（ＧＳＢ
）と酸化型グルタチオン（Ｇ５５Ｇ ）を好ましくは５
：１〜２０：１の比混用する。還元型のみを用いるとき
け、グアニジン水溶液に空気を流すのがよい。
ｍＭ好ましくは１０から２０ｍＭの濃度範囲で用いら
れる。ジスルフィド化合物を酸化剤として用いる場合は
、そのチオール体と混用するのがよく１例えばグルタチ
オンを用いる場合には、還元型グルタチオン（ＧＳＢ
）と酸化型グルタチオン（Ｇ５５Ｇ ）を好ましくは５
：１〜２０：１の比混用する。還元型のみを用いるとき
け、グアニジン水溶液に空気を流すのがよい。
酸化は１反応液を適当な時間間隔でサンプルをとりだし
、逆相ＨＰＬＣによる分析によシ、活性型ＩＬ−２のピ
ークの増加が停止する迄続けられる。
、逆相ＨＰＬＣによる分析によシ、活性型ＩＬ−２のピ
ークの増加が停止する迄続けられる。
かくして、グアニジン水溶液中に溶解されたＩＬ−２ポ
リペプチドを１通常の方法で回収する。
リペプチドを１通常の方法で回収する。
例えば、グアニジン水溶液をグル濾過によって脱塩し、
陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに
供する。塩濃度を上昇させることにより、吸着されたＩ
Ｌ−２ポリペプチドを溶離せしめ、溶離液を逆相ＨＰＬ
Ｃに直接負荷することによシ精製する。このようにして
、実質的に夾雑物を含まないＩＬ−２ポリベゾチドを得
ることが出来る。
陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに
供する。塩濃度を上昇させることにより、吸着されたＩ
Ｌ−２ポリペプチドを溶離せしめ、溶離液を逆相ＨＰＬ
Ｃに直接負荷することによシ精製する。このようにして
、実質的に夾雑物を含まないＩＬ−２ポリベゾチドを得
ることが出来る。
発明の作用、効果
この発明のＩＬ−２の回収方法によれば、高い比活性の
ＩＬ−２／ＩＪペプチドが、高い回収率で得られる。
ＩＬ−２／ＩＪペプチドが、高い回収率で得られる。
実施例Ｉ
ＩＬ−２産生微生物の取得
ＩＬ−２ポリペプチドを細胞内に顆粒状に蓄積できるエ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｌ
）ｐＴ９−１１／Ｉ（ＢＩＯＩを次のようにして得た
（第１図参照）。
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｌ
）ｐＴ９−１１／Ｉ（ＢＩＯＩを次のようにして得た
（第１図参照）。
即ち、ＩＬ−２全ｃＤＮＡを含むｐＩＬ２−５ＯＡ（欧
州特許出願公開９１５３９号）、（寄託エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒ ｉ ａｈ ｉ ａ ｃｏ １１
） ＃１７７６／ ｐ ＩＬ２−５ＯＡ、ＡＪ１１９９
６ ｊＦＥＲＭＢＰ−２２６）
ＥシＰｓｔｌで切断しインターロイキン−２ｃＤ
ＮＡ断片を得、さらにＤｒａＩで消化してＩＬ−２ｃＤ
ＮＡ遺伝子の３′非構造遺伝子に存在するＡ−Ｔ、Ｇ−
Ｃホモポリマーを含む約３００塩基対の断片を除去した
ところの５３０塩基対断片を得た。そしてこの断片とＢ
ａｍＨＩリンカ−と、ｐＢＲ３２２のＰｓ ｔ Ｉ −
ＥｃｏＲＩの大きい方の断片（ＥｃｏＲＩ部位はフレノ
ウで平滑末端にした）とをＴ ４ＤＮＡリガーゼで連結
し、インターロイキン−２構造遺伝子のおよそ５０塩基
対下流の非構造遺伝子の後ｉｃ ＢａｍＨ１切断部位の
入ったプラスミドを造成した。そしてこのプラスミドを
、Ｉ（ｇｉＡｌで消化しＩＬ−２遺伝子を含むＨｇ ｉ
Ａｌ断片を得、これをＤＮＡ ＆リメラーゼ■（フレ
ノウ）処理で３′側に突出した単鎖部分のヌクレオチド
を削シ取シ平滑末端にした。そしてさらにこの断片をＢ
ａｍＨＩで切断して約４５０塩基対の断片を得た。
州特許出願公開９１５３９号）、（寄託エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒ ｉ ａｈ ｉ ａ ｃｏ １１
） ＃１７７６／ ｐ ＩＬ２−５ＯＡ、ＡＪ１１９９
６ ｊＦＥＲＭＢＰ−２２６）
ＥシＰｓｔｌで切断しインターロイキン−２ｃＤ
ＮＡ断片を得、さらにＤｒａＩで消化してＩＬ−２ｃＤ
ＮＡ遺伝子の３′非構造遺伝子に存在するＡ−Ｔ、Ｇ−
Ｃホモポリマーを含む約３００塩基対の断片を除去した
ところの５３０塩基対断片を得た。そしてこの断片とＢ
ａｍＨＩリンカ−と、ｐＢＲ３２２のＰｓ ｔ Ｉ −
ＥｃｏＲＩの大きい方の断片（ＥｃｏＲＩ部位はフレノ
ウで平滑末端にした）とをＴ ４ＤＮＡリガーゼで連結
し、インターロイキン−２構造遺伝子のおよそ５０塩基
対下流の非構造遺伝子の後ｉｃ ＢａｍＨ１切断部位の
入ったプラスミドを造成した。そしてこのプラスミドを
、Ｉ（ｇｉＡｌで消化しＩＬ−２遺伝子を含むＨｇ ｉ
Ａｌ断片を得、これをＤＮＡ ＆リメラーゼ■（フレ
ノウ）処理で３′側に突出した単鎖部分のヌクレオチド
を削シ取シ平滑末端にした。そしてさらにこの断片をＢ
ａｍＨＩで切断して約４５０塩基対の断片を得た。
また、 ｔｒｐプロモーターを搭載したプラスミドとし
てｐＤＲ７２０を使用した。ｐＤＲ７２０はｐＫＯ−１
（Ｒｕｓ＋ｓｅ１．Ｄ、Ｒ，ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ、
Ｇ、Ｎ、、Ｇｅｎｅ＋ ２０ ＋２３１（１９８２）
）のＳｍａ ｌ切断部位１ｃｔｒｐプロ％−ター。
てｐＤＲ７２０を使用した。ｐＤＲ７２０はｐＫＯ−１
（Ｒｕｓ＋ｓｅ１．Ｄ、Ｒ，ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ、
Ｇ、Ｎ、、Ｇｅｎｅ＋ ２０ ＋２３１（１９８２）
）のＳｍａ ｌ切断部位１ｃｔｒｐプロ％−ター。
オペレーター断片が組込まれたものである。ｐＤＲ７２
０をＨｐａｌとＢ ａｍＨＩで消化し、大きいＨｐａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を得、 ｔｒｐプロモーターの１部
とＡＡＧＧなるＳＤ配列ならびに蛋白合成開始コドンＡ
ＴＧと成熟ＩＬ−２４リペプチドのＮ末端のアラニンを
コードするＯＣＡを含む合成オリゴマーとを第１図に示
すように連結しｐＭＩ−９を選びだした。
０をＨｐａｌとＢ ａｍＨＩで消化し、大きいＨｐａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を得、 ｔｒｐプロモーターの１部
とＡＡＧＧなるＳＤ配列ならびに蛋白合成開始コドンＡ
ＴＧと成熟ＩＬ−２４リペプチドのＮ末端のアラニンを
コードするＯＣＡを含む合成オリゴマーとを第１図に示
すように連結しｐＭＩ−９を選びだした。
一方、 ｐＢＲ３２２のＰｖｕｌと５ａｉｌ切断断片の
大きい断片と１合成したｔｒｐＡターミネータ−配列を
持つＤＮＡとを連結させｐＴｒｐＡを得た。セしてｐＭ
Ｉ−９とｐＴｒｐＡをともにＥｃｏＲ’ｌとＢ ａｍＨ
Ｉで消化しｐＭＩ−９はＩＬ−２遺伝子を含む方の断片
、 ｐＴｒｐＡはｔｒｐＡターミネータ−を含む方の断
片をそれぞれ調製し、この２者を連結して、 ｐＴ９−
１１を得た。そこでｐＴ′９−１１をエシュリヒア・コ
リＨＢＩＯＩ（Ｆ−、ｈｓｄｓ２０ （ｒＢ−。
大きい断片と１合成したｔｒｐＡターミネータ−配列を
持つＤＮＡとを連結させｐＴｒｐＡを得た。セしてｐＭ
Ｉ−９とｐＴｒｐＡをともにＥｃｏＲ’ｌとＢ ａｍＨ
Ｉで消化しｐＭＩ−９はＩＬ−２遺伝子を含む方の断片
、 ｐＴｒｐＡはｔｒｐＡターミネータ−を含む方の断
片をそれぞれ調製し、この２者を連結して、 ｐＴ９−
１１を得た。そこでｐＴ′９−１１をエシュリヒア・コ
リＨＢＩＯＩ（Ｆ−、ｈｓｄｓ２０ （ｒＢ−。
ｍＢ−） 、 ｒｅｃＡ１３． ａｒａ−１４＋ ｐｒ
ｏＡ２．１ｉｃＹ１． ｇａｌＫ２＋ｒｐｓＬ２０（Ｓ
ｍｒ）、 ｘｙｌ−５，ｍ＋４−１．５ｕｐＥ４４．λ
−）に導入Ｌ テｐＴ９−１１／’ＨＢＩＯＩ ｔ 得
ｆｃ。
ｏＡ２．１ｉｃＹ１． ｇａｌＫ２＋ｒｐｓＬ２０（Ｓ
ｍｒ）、 ｘｙｌ−５，ｍ＋４−１．５ｕｐＥ４４．λ
−）に導入Ｌ テｐＴ９−１１／’ＨＢＩＯＩ ｔ 得
ｆｃ。
ＩＬ−２ポリペグチド顆粒の調製
細胞は、（２チカデミノ酸、０．２チ酵母エキス。
０、５９６ ＮＨ４Ｃｌ 、 ２ ％グ＃：ｒ−ス、
０．１ ％ ＫＨ２ＰＯ４＃０、０５ ％ ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０、０，００５ＳＣ＆Ｃ１２−２Ｈ２０。
０．１ ％ ＫＨ２ＰＯ４＃０、０５ ％ ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０、０，００５ＳＣ＆Ｃ１２−２Ｈ２０。
０．８ダ／１ｔｔｔ Ｌ−ロイシン、０．８勢−Ｌ−プ
ロリン。
ロリン。
Ｂｑ／ｌサイアミン、１００μｌ／−アンピシリン。
２５μＩ／−ストレプトマイシン）の組成の培地３０〇
−中で、アンモニアで−を６．２に調節しながら３１℃
で１３時間、通気培養した。途中。
−中で、アンモニアで−を６．２に調節しながら３１℃
で１３時間、通気培養した。途中。
６６０ｎｍの０．Ｄ、がおよそ５．０に達した時点で。
３−インドールアクリル酸２５μＩ／−を加えて。
ＩＬ−２遺伝子を発現させた。
その後、細胞を集め、湿重量０．０２．９／−になるよ
うに、５０ｍＭのＥＤＴＡを加えた２ ０ ｍＭ ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にけん濁し、１〜／ゴとな
るようにリゾチーム（生化学工業部、卵白、比活性＞５
０，０ＯＯＵ／１ｍｇ）を加え、１０℃に３０分保った
。
うに、５０ｍＭのＥＤＴＡを加えた２ ０ ｍＭ ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にけん濁し、１〜／ゴとな
るようにリゾチーム（生化学工業部、卵白、比活性＞５
０，０ＯＯＵ／１ｍｇ）を加え、１０℃に３０分保った
。
次いで、このうち２０ｄを４℃、５０Ｗ、１０分間超音
波処理して（大岳製作所５ｏｎｉｃａｔｏｒ使用）細胞
を破砕し、１２，０ＯＯＸ、９ 、５分間遠心分離して
、ＩＬ−２ポリイグチドの顆粒を採取した。
波処理して（大岳製作所５ｏｎｉｃａｔｏｒ使用）細胞
を破砕し、１２，０ＯＯＸ、９ 、５分間遠心分離して
、ＩＬ−２ポリイグチドの顆粒を採取した。
活性型Ｉ Ｌ−２ポリペプチドの回収
得られたＩＬ−２ｙｊ？ｌＪペプチド顆粒を、６Ｍグア
ニジン塩酸塩（Ｇｕｎ−Ｈ（’ｔ） ２０−に溶解して
、液体クロマトグラフィーによりＩＬ−２／リペグチド
量を測定した。一方、培養終了後の細胞をリゾチーム処
理、超音波による細胞破砕をせずに直接６ＭＧｕｎ−Ｈ
Ｃ２Ｋよシ可溶化したものを調製し、液体クロマトグラ
フィーによりＩＬ−２ポリペグチド量を測定した。これ
らの結果を表１に示す。
ニジン塩酸塩（Ｇｕｎ−Ｈ（’ｔ） ２０−に溶解して
、液体クロマトグラフィーによりＩＬ−２／リペグチド
量を測定した。一方、培養終了後の細胞をリゾチーム処
理、超音波による細胞破砕をせずに直接６ＭＧｕｎ−Ｈ
Ｃ２Ｋよシ可溶化したものを調製し、液体クロマトグラ
フィーによりＩＬ−２ポリペグチド量を測定した。これ
らの結果を表１に示す。
表 １
得られたＩＬ−２ポリ−ｅｆチドを含むペレットを。
６Ｍ塩酸グアニジンを含む０．１ Ｍ ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０，以下Ａと略す）に、ＩＬ−２濃度０
．３１１９／−となるように溶解した。その後、０．１
Ｍ ） リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０，以下、Ｂと
略す）で、３倍に希釈し、 ＧＳＨ及びＧ５５Ｇをそれ
ぞれ、最終濃度１０ｍＭ及び１ ｒｎＭとなるように加
えた後、希苛性ソーダを用いて、ＰＨを８に調整した。
衝液（ｐＨ８，０，以下Ａと略す）に、ＩＬ−２濃度０
．３１１９／−となるように溶解した。その後、０．１
Ｍ ） リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０，以下、Ｂと
略す）で、３倍に希釈し、 ＧＳＨ及びＧ５５Ｇをそれ
ぞれ、最終濃度１０ｍＭ及び１ ｒｎＭとなるように加
えた後、希苛性ソーダを用いて、ＰＨを８に調整した。
室温下、１２時間静止した後反応液０．０５ Ｍ酢酸す
） ＩＪウム緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５を用いるカラムクロマトグラフィーに
供して低分子を除去した。０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したＣＭ−セフ７デツク
スＣ−２５を充填したカラムに通液し、 ＩＬ−２を吸
着させた後に、０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）で。
） ＩＪウム緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５を用いるカラムクロマトグラフィーに
供して低分子を除去した。０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したＣＭ−セフ７デツク
スＣ−２５を充填したカラムに通液し、 ＩＬ−２を吸
着させた後に、０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）で。
ＩＬ−２を溶出した。
得られたＩＬ−２ポリイグチド画分を逆相ＨＰＬＣ（特
開昭５９−２２５１９５に記載されている方法を使用し
た）に供し、 ＩＬ−２画分を分取した。得られたＩＬ
−２ポリペゾチドは、細胞障害性Ｔ−リン・臂球株を用
いる活性検定法では４．８Ｘ１０’Ｕ／■の比活性を示
した。またペプチドマツプ法にヨリ、シじ（Ｃｙｓ−５
８とＣｙｓ−１０５間にあることが判った。
開昭５９−２２５１９５に記載されている方法を使用し
た）に供し、 ＩＬ−２画分を分取した。得られたＩＬ
−２ポリペゾチドは、細胞障害性Ｔ−リン・臂球株を用
いる活性検定法では４．８Ｘ１０’Ｕ／■の比活性を示
した。またペプチドマツプ法にヨリ、シじ（Ｃｙｓ−５
８とＣｙｓ−１０５間にあることが判った。
また、ペレット中に含まれるＩＬ−２ポリペゾチドから
の回収率は８６チであった。
の回収率は８６チであった。
実施例２
実施例１に記した緩衝液Ａで可溶化したペレットを緩衝
液Ｂで希釈する際に、ペレット量に対すリペプチド儀度
及び塩酸グアニジン濃度を表１に示した値になるように
調節した溶液を作成した。
液Ｂで希釈する際に、ペレット量に対すリペプチド儀度
及び塩酸グアニジン濃度を表１に示した値になるように
調節した溶液を作成した。
これを、実施例１に記載した方法と同様にして。
ＧＳＨとａｓｓａで処理し、処理液を直接逆相ＨＰＬＣ
で分析することによって、総ＩＬ−２ポリー２ｆチドに
対する活性型、すなわちＣｙｓ−５８Ｃｙｓ−１０５間
にジスルフィド結合を持つＩＬ−２の変換率を求めた。
で分析することによって、総ＩＬ−２ポリー２ｆチドに
対する活性型、すなわちＣｙｓ−５８Ｃｙｓ−１０５間
にジスルフィド結合を持つＩＬ−２の変換率を求めた。
結果を表２に記した◎
表２ ＩＬ−２ポリペプチドの活性型への変換率（チ
）実施例３ 実施例１に記載した方法によって得たＩＬ−２ポリペプ
チドを含むペレットを、緩衝液Ａ ＶＣｒＬ−２濃度０
．３１１／−となるように溶解し、続いて緩衝液Ｂで３
倍に希釈した。この溶液に空気をおだやかに通じながら
１２時間攪拌した。しかる後に、実施例２に記した方法
によシ、脱塩、イオン交換クロマトグラフィー、逆相Ｈ
ＰＬＣ工程を経て、ＩＬ−２画分を得た。得られたＩＬ
−２は４．９Ｘ１０ Ｕ／ａｐの比活性を示し、また、
ジスルフィド結合位置は。
）実施例３ 実施例１に記載した方法によって得たＩＬ−２ポリペプ
チドを含むペレットを、緩衝液Ａ ＶＣｒＬ−２濃度０
．３１１／−となるように溶解し、続いて緩衝液Ｂで３
倍に希釈した。この溶液に空気をおだやかに通じながら
１２時間攪拌した。しかる後に、実施例２に記した方法
によシ、脱塩、イオン交換クロマトグラフィー、逆相Ｈ
ＰＬＣ工程を経て、ＩＬ−２画分を得た。得られたＩＬ
−２は４．９Ｘ１０ Ｕ／ａｐの比活性を示し、また、
ジスルフィド結合位置は。
Ｃｙ＠−５８−Ｃｙｓ−１０５間であることが確認され
た。なおペレット中に含まれるＩＬ−２ポリペゾチドか
らの回収率は７２％であった。
た。なおペレット中に含まれるＩＬ−２ポリペゾチドか
らの回収率は７２％であった。
実施例４
実施例１に記載した方法によって得られたＩＬ−２ｙＲ
リペｆチドを含むにレットを、３Ｍ塩酸グアニジン、
１０ ｍＭ ＧＳＨ、１ｍＭ Ｇ５５Ｇを含む０．１
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し、室温
下。
リペｆチドを含むにレットを、３Ｍ塩酸グアニジン、
１０ ｍＭ ＧＳＨ、１ｍＭ Ｇ５５Ｇを含む０．１
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し、室温
下。
２４時間、緩かに攪拌した。遠心分離によって不溶性画
分を除去した後実施例２に記した方法によって脱塩、イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣを行ない、
Ｉ Ｌ−２画分を得た。得られたＩＬ−２は、４８Ｘ１
０ Ｕ／即の比活性を示し、ジスルフィド結合をＣｙｓ
−５８−１０５間に有していた。また、−（レフト中に
含まれるＩＬ−２ポリペプチドからの回収率は６５％で
あった。
分を除去した後実施例２に記した方法によって脱塩、イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣを行ない、
Ｉ Ｌ−２画分を得た。得られたＩＬ−２は、４８Ｘ１
０ Ｕ／即の比活性を示し、ジスルフィド結合をＣｙｓ
−５８−１０５間に有していた。また、−（レフト中に
含まれるＩＬ−２ポリペプチドからの回収率は６５％で
あった。
実施例５
実施例１に記載した方法によって得られたＩＬ−２ポリ
ペプチドを含むペレットを３Ｍ塩酸グアニジンを含む０
．１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し
、室温下空気を通じながら、２４時間攪拌した。遠心分
離によって不溶性画分を除去した後。
ペプチドを含むペレットを３Ｍ塩酸グアニジンを含む０
．１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し
、室温下空気を通じながら、２４時間攪拌した。遠心分
離によって不溶性画分を除去した後。
実施例２に記した方法によシ脱塩、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相ＨＰＬＣを行ないＩＬ−２画分を得た
。得られたＩＬ−２は、５．０Ｘ１０ Ｕ／ダの比活性
を示し、ジスルフィド結合をＣｙｓ−５８−１０５間に
有していた。またペレット中に含まれるＩＬ−２ポリペ
ブチＰからの回収率は、５２チであっ念。
グラフィー、逆相ＨＰＬＣを行ないＩＬ−２画分を得た
。得られたＩＬ−２は、５．０Ｘ１０ Ｕ／ダの比活性
を示し、ジスルフィド結合をＣｙｓ−５８−１０５間に
有していた。またペレット中に含まれるＩＬ−２ポリペ
ブチＰからの回収率は、５２チであっ念。
第１図は、インターロイキン２産生微生物の取得経過説
明図である。
明図である。
Claims (1)
- インターロイキン２ポリペプチドを細胞内に顆粒状に蓄
積している微生物細胞をリゾチームに接触させる第１工
程、リゾチームに接触された細胞を超音波により破砕す
る第２工程、破砕物を重力場に置き沈降物を採取する第
３工程、沈降物を１Ｍから６Ｍグアニジン水溶液中にて
弱い酸化条件に置く第４工程及びグアニジン水溶液中に
溶解されているインターロイキン２ポリペプチドを採取
する第５工程よりなるインターロイキン２ポリペプチド
の回収方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60099262A JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60099262A JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61257931A true JPS61257931A (ja) | 1986-11-15 |
| JPH0640832B2 JPH0640832B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=14242791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60099262A Expired - Lifetime JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | インタ−ロイキン２ポリペプチドの回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0640832B2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02503384A (ja) * | 1987-05-11 | 1990-10-18 | カイロン コーポレイション | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐２を回収する方法 |
| WO1992014832A1 (fr) * | 1991-02-26 | 1992-09-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Procedes pour la purification de fdlb humains |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US6140128A (en) * | 1998-12-23 | 2000-10-31 | Genentech, Inc. | Preparation of calcium phosphate transfectacons |
| US6180367B1 (en) | 1998-10-28 | 2001-01-30 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| EP2210943A1 (en) | 2002-08-26 | 2010-07-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel aldolase and production process of substituted alpha-keto acids |
| US7858339B1 (en) | 1998-10-28 | 2010-12-28 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| DE112009001080T5 (de) | 2008-05-12 | 2011-03-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon |
| EP2295579A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2330211A2 (en) | 2001-12-27 | 2011-06-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing glutamic acid derivatives |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59161321A (ja) * | 1982-12-22 | 1984-09-12 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法 |
| JPS59220189A (ja) * | 1983-02-08 | 1984-12-11 | バイオジェン ナームローズ ベンノットシャップ | ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 |
-
1985
- 1985-05-10 JP JP60099262A patent/JPH0640832B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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| US8183029B2 (en) | 1998-10-28 | 2012-05-22 | Genentech, Inc. | Replicable expression vector for bacterial expression of a mammalian polypeptide |
| US6140128A (en) * | 1998-12-23 | 2000-10-31 | Genentech, Inc. | Preparation of calcium phosphate transfectacons |
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| EP2460884A2 (en) | 2001-12-27 | 2012-06-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for preparing monatin |
| EP2330211A2 (en) | 2001-12-27 | 2011-06-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing glutamic acid derivatives |
| EP2298909A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2298907A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2298906A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2295579A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2298908A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2298905A2 (en) | 2002-07-26 | 2011-03-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel peptide-forming enzyme gene |
| EP2280068A1 (en) | 2002-08-26 | 2011-02-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel aldolase and production process of substituted alpha-keto acids |
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| DE112009001080T5 (de) | 2008-05-12 | 2011-03-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0640832B2 (ja) | 1994-06-01 |
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