JPH0829096B2 - 融合蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

融合蛋白質をコードするｄｎａ

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JPH0829096B2
JPH0829096B2 JP61070648A JP7064886A JPH0829096B2 JP H0829096 B2 JPH0829096 B2 JP H0829096B2 JP 61070648 A JP61070648 A JP 61070648A JP 7064886 A JP7064886 A JP 7064886A JP H0829096 B2 JPH0829096 B2 JP H0829096B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 発現生産物に商業的用途が見出だされるその発現に利
用できる遺伝子の数がだんだんと多くなってきている。
多くの場合に、初期の発現はE.コリー（E.coli）で観察
されてきている。E.コリーにおける発現は多くの不利益
をもち、その１つは特にエンテロトキシンの存在であ
り、これは生産物を汚染して哺乳動物への投与に適さな
いものにする。更に、バチルス・スブチリス（Bacillus
subtilis）、ストレプトマスセス（Streptomyces）、
又は酵母（例えばサッカロマイセス（Saccharomyce
s））のようなその他の微生物と比較てE.コリーにおけ
る生産物の生産に関しての広範囲の技術が以前にはなか
った。
多くの場合に、まだ解明されていない理由で、活性プ
ロモーター及び高コピー数プラスミドにもかかわらず、
異種性生産物は微生物宿主中でほんの少量でのみ生産さ
れる。そのプロセスの経済性は、所望の生産物の発現に
用いられる栄養分の実質的な割合に依存するので、単細
胞微生物中でのこれらの生産物の生産は有望でないこと
は明らかである。それ故に、宿主の生存度及び成長特性
に実質的に害を与えることなしに所望のポリペプチドの
生産を大きく増強する方法およびシステムが実質的に必
要とされている。
従来技術の説明 Villa−Komaroff等は、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA（1978）75:3727〜3731頁において、E.コリーにおけ
る発現のためのペニシリナーゼのＮ−末端に連結された
プロインシュリンをコードする融合配列を記載してい
る。Paul等は、European J.Cell Biol.（1983）31:171
〜174頁において、E.コリーにおける発現のためのトリ
プトファンＥ遺伝子生産物の一部のCOOH−末端に連結さ
れたプロインシュリンをコードする融合配列を記載して
いる。Goeddel等は、同書（1979）76:106〜110頁におい
て、E.コリーにおいて融合ポリペプチドを提供するため
にE.コリーβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合したヒト
インシュリンＡ及びＢ鎖についての合成遺伝子を記載し
ている。Stepien等は、Gene（1983）24:289〜297頁にお
いて、酵母における融合生産物としてのインシュリンの
発現を記載しており、その場合に、プロインシュリン遺
伝子を、酵母における発現のためにGAL1のＮ−末端をコ
ードする配列に融合させている。
発明の要旨 異種性のポリペプチドを真核微生物宿主中で高収率で
生産するための方法及び造成物が提供され、それによっ
て完全に異種性の融合生産物が発現され、そのペプチド
の一部はそのような宿主中で他とは無関係に高収率で発
現されることが示されている生産物であり、そしてその
生産物の残りの部分は関心のあるポリペプチドであり、
高収率での融合生産物の生産がもたらされる。その２つ
のポリペプチドをコードする配列はオープンリーディン
グフレームを合わせて融合され、この場合に高収率ポリ
ペプチドをコードする配列は５′−末端又は３′−末端
のいずれかにあり得る。その発現生産物中に含まれる２
つのポリペプチドは選択的に開裂できる結合によって連
結されていてもよく、その結果としてその２つのポリペ
プチドは各々のポリペプチドを高収率で提供ために分離
されてもよい。他の方法としては、融合蛋白質の開裂が
その意図された用途にとって必要でないならば、その開
裂部位は存在しなくてもよい。特に、高収率のポリペプ
チドがスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）場合には
酵母宿主が用いられる。
特定の態様の説明 ポリペプチドをコードする配列を用いることによっ
て、真核生物、特に酵母中での異種性生産物の生産を増
強する新規な方法及び組成物が提供され、それは選択的
に開裂できる部位によって連結された２つのポリペプチ
ド領域の組み合わせである。その２つの領域は、宿主中
で他とは無関係に高収率で生産されるポリペプチドであ
る第一域、及びそれ自体として注目されそして活性であ
る第二のポリペプチド、特に、宿主中ではなかなか得ら
れないものである。
関心のある宿主としては真核単細胞微生物、特に菌
類、例えばフイコミセテス(Phycomycetes)、アスコミセ
テス(Ascomycetes)、バシジオミセテス(Basidiomycete
s)及びデューテロミセテス(Deuteromyteces)、一層特定
的にはアスコミセテス、例えば酵母、例えばサッカロミ
セス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosacc
haromyces)、及びクルイベロミセス(Kluyveromyces)等
がある。E.コリー(E.coli)、B.サブチリス(B.subtilis)
等のような原核宿主を用いてもよい。
融合において第一領域として用いられる安定なポリペ
プチドは経験的に決定できる。従って、異種性ポリペプ
チドは種々の宿主生物中で発現されるので、全蛋白質に
対するポリペプチドの収率は容易に求められる。宿主に
よって生産される全蛋白質の５％以上の量で生産される
ポリペプチドに関して、そのようなポリペプチドをコー
ドするDNA配列は本発明で用いてもよい。DNA配列はその
配列をコードする異種性遺伝子と同じでもよく、異種性
遺伝子の突然変異種でもよく、または置換された１種以
上のコドンをもっていて、この場合にそのコドンは宿主
によって好まれるコドンとして選択されてもよい。好ま
しいコドンは、遺伝暗号の縮重に基づいて、宿主中で個
々の最大の豊富さで生産される蛋白質中の、そのような
コドンを見出だす数学的な確率よりも実質的に大きく見
いだされるコドンである。特に、酵母においては、解糖
酵素は好ましいコドンを決定する基礎であり得る。
宿主中でポリペプチドを所望の高収率で提供する遺伝
子全体又は遺伝子のいずれかの部分を用いてもよい。従
って、安定なポリペプチドが関心のあるポリペプチドよ
りも経済的価値がかなり低い場合には、遺伝子の一部を
切り取って、遺伝子全体及びそれのポリペプチド生産物
の所望の特性をまだ保持しながら、一方全融合生産物中
の安定化ポリペプチドの割合を低下させるような断片に
することが望ましいかもしれない。酵母中の安定なポリ
ペプチド生産物をコードする遺伝子の例としては、スー
パーオキシドジスムターゼ、特にヒトスーパーオキシド
ジスムターゼをコードする遺伝子がある。
２つのポリペプチド、即ち安定化ポリペプチド及び関
心のあるポリペプチド、をコードするDNA配列は種々の
方法で得ることができる。ポリペプチドをコードする配
列は天然源から誘導することができ、この場合にメッセ
ンジャーRNA又は染色体DNAは適切なプローブにより同定
することができ、このプローブはコード配列又は非コー
ド配列の一部と相補的である。メッセンジャーRNAか
ら、一本鎖（ss）DNAが慣用の技術に従って逆転写酵素
を用いて調製され得る。そのssDNA相補鎖を次いで、ポ
リペプチドをコードする領域を含む二重鎖（ds）c DNA
を提供するための第二鎖を調製するための鋳型として用
いることができる。染色体DNAを用いる場合には、コー
ドする領域を含む領域をプローブを用いて検出し、制限
酵素マッピングし、そして適切な技法を用いて非翻訳
５′及び３′領域を本質上含まない領域を単離する。コ
ード配列の一部のみが得られる場合には、その残りの部
分は、コード部分に連結することができしかも特定の機
能又は特徴を提供するその他の配列に連結するための便
利な末端を提供するアダプター合成によって提供されて
もよい。
２つの遺伝子が天然源から完全に又は一部として得ら
れる場合には、その２つの遺伝子を適当なリーディング
フレーム内に連結させることが必要である。融合蛋白質
の開裂が必要ならば、それらの連結部が選択可能な開裂
部位を定義しない場合には、遺伝子は選択的に開裂でき
る部位によって分離される。選択的に開裂できる部位は
ある程度は遺伝子の性質に依存する。即ち、開裂のため
の手段は一方または両方の遺伝子のアミノ配配列に依存
して変化する。
他方、開裂が必要でない場合があり、またある場合に
は望ましくない。融合蛋白質が診断薬として、アフイニ
テイーカラムに、配列の決定のための源として、免疫源
として融合蛋白質を用いての抗体の生産、等に用いられ
る。
２つの遺伝子は普通にはイントロンを含まない。なぜ
ならmRNAのスプライシングは関心のある真核単細胞微生
物に広範囲には用いられていないからである。
関心のあるポリペプチドは、原核性源又は真核性源か
ら誘導された、天然の又は合成のいずれかの、あらゆる
ポリペプチドであり得る。普通には、ポリペプチドは少
なくとも15個のアミノ酸（45bpの遺伝子）、一層普通に
は30個のアミノ酸（90bpの遺伝子）をもち、そして300
個以上のアミノ酸（900bp以上の遺伝子）であってもよ
い。
関心のあるポリペプチドとしては、酵素、ウイルス蛋
白質（例えば、エイズ（AIDS）に関連したウイルス、例
えばp18,p25,p31,gp41等からの蛋白質）、哺乳動物蛋白
質、例えば調節機能に関連するもの、例えばリンフォカ
イン、成長因子、ホルモン又はホルモン前駆体（例え
ば、プロインシュリン、インシュリン様成長因子、例え
ば、IGF−Ｉ及び−II等）、等、血液凝固因子、血餅溶
解因子、免疫グロブリン等がある。ポリペプチドのフラ
グメントまたはフラクションは、そのようなフラグメン
トが生理学的活性、例えば免疫活性（例えば親蛋白質と
の交差反応活性）、アゴニストまたはアンタゴニストと
しての生理学的活性、等をもつ場合に用いられる。
選択可能な開裂のための方法の１つは、米国特許第4,
366,246号に記載されている臭化シアノゲンの使用であ
る。この技術は、開裂部位以外に利用できるメチオニン
がないこと、または開裂されるメチオニンとポリペプチ
ド配列内のメチオニンとを選択的に区別できること、を
必要とする。他の方法としては、特定タイプのアミノ酸
によって特定される部位を識別して開裂するプロテアー
ゼを用いてもよい。通常のプロテアーゼとしてはトリプ
シン、キモトリプシン、ペプシン、ブロメライン、パパ
イン等がある。トリプシンは塩基性アミノ酸に対して特
異的でありそしてリシンまたはアルギニンのいずれかに
ついてのペプチド結合のカルボキシル基側で開裂させ
る。更に、アミノ酸の特定の配列に対して特異的なペプ
チダーゼ、例えばポリペプチドからの分泌リーダーシグ
ナルの選択的開裂に関与するペプチダーゼ、を用いるこ
とができる。これらの酵素は酵素中のα−因子及びキラ
ートキシンで見出だされるような配列に特異的であり、
例えば、KEX2エンドペプチダーゼは塩基性残基の対に対
して特異的である（Julius等、Cell（1984）37:1075〜1
089頁）。また、アミノ酸の特定の配列で開裂させる酵
素が存在する。ウシエンテロキナーゼ（Light等、Anal.
Biochem．（1980）106:199〜206）はアスパラギン酸、
グルタミン酸、又はカルボキシメチルシステインの酸残
基によって先行されるリジンまたはアルギニンのカルボ
キシル基側を開裂する。多くの種中のトリプシノゲンの
活性ペプチドの一部として天然に見出だされる配列（Aa
p）4Lysは特に有用である。特定の配列を認識し、そし
て開裂するその他の酵素としては、コラゲナーゼ（Germ
ino及びBatia、Proc.Natl.Acad.Sci.（1984）81:4692〜
4696頁）；因子ｘ（Nagai及びThygersen、Nature（198
4）309:810〜812頁）；及びポリウビクイチン・プロセ
ッシング酵素（Ozakaynak等、Nature（1984）312:663〜
666頁）がある。
開裂可能な部位を含むアミノ酸に加えて、その２つの
融合ポリペプチドを更に分離することが有益であり得
る。そのような“ヒンジ”は立体融通性を可能にしそれ
で融合ポリペプチドはおそらく相互にあまり妨害せず、
従って開裂部位の誤った折りたたみ、阻止等が防止され
る。
“ヒンジ”アミノ酸配列は種々の長さであることがで
き、アミノ酸側鎖が開裂可能な部位で破壊させるのに用
いられる作用方式を、またはいずれかの融合ポリペプチ
ド、において必要とされる相互作用、例えばイオン結
合、疎水性結合又は水素結合を妨害しない限りは、いか
なるアミノ酸側鎖を含んでいてもよい。好ましくは、ヒ
ンジを含むアミノ酸は側鎖をもち、それは中性で且つ極
性または非極性のいずれかであり、そして１個以上のプ
ロリンを含んでいてもよい。そのヒンジ域は少なくとも
１つのアミノ酸をもち、そして20個以上のアミノ酸をも
っていてもよく、普通には15個以下のアミノ酸をもち、
特に非極性アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、及び中性
の極性アミノ酸Ｎ、Ｑ、Ｓ、及びＴを持つ。
例示としてヒンジ配列はＮ−S;Q−A;N−Ｓ−Ｇ−Ｓ−
P;A−Ａ−Ｓ−Ｔ−P;N−Ｓ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−
Ｐ−Ｇ−Ｓ−P;S−Ｓ−Ｐ−Ｇ−A;等であるが、これら
に限定されるものではない。そのようなヒンジ配列は融
合ポリペプチド間の分離を更に増加させるために繰り返
し単位として用いてもよい。
“ヒンジ”アミノ酸は、関心のある最終の開裂したポ
リペプチドに結合されないようにするために、他とは無
関係に高収率で生産されるポリペプチドと開裂可能な部
位配列との間に“ヒンジ”を入れるように本発明を実施
することが望ましいが、しかし必須ではない。
１個以上のアミノ酸が開裂部位に関与する場合には、
そのような配列をコードするコドンは、合成的に調製さ
れ、そして全てのコドンが適切なリーディングフレーム
内にありそして選択可能な開裂部位が２つのポリペプチ
ドを連結している融合蛋白質を提供するように、ポリペ
プチドをコードする配列に連結されるであろう。
融合コード配列のほんの小部分を合成的に調製する代
りに、全配列を合成的に調製してもよい。このことはコ
ドンの選択においてある種の融通性を可能にし、それに
よって好ましいコドン、制限部位、を提供することがで
きるようになり、DNA及びメッセンジャーRNA等の特定の
内部構造を避けるかまたは提供することができるように
なる。
ほとんどの場合について、融合コード配列は単一体と
して調製されるが、それは種々の断片として調製されて
もよく、これらの断片は種々の非翻訳領域に連結されて
特定の機能を提供し、そして最終的にそのコード配列を
次の段階で結合されてもよいことを認識すべきである。
しかしながら、表現を明確にするために、解説を主とし
て、コードする配列が単一体として調製され、次いで発
現ベクターに移す場合に向けられている。
融合コード配列の部分を構成する種々の配列を、クロ
ーニングベクターに第１の断片を導入することにより連
結することができる。次に、生ずるクローンを、コード
配列、及び失われたコドンを置き換えそして次の断片へ
の連結のための便利な末端を有する、導入されたアダプ
ターの内側の部位において制限開裂することができる。
末端は使用する特定のヌクレオチドに依存して付着末端
又は平滑末端である。一緒にされた第１断片及びアダプ
ターのクローニングの後、アダプターにより提供される
制限部位においてベクターを制限切断し、そして第２断
片の残りのコード配列をベクターに導入して連結及びク
ローニングを行う。生ずる融合配列は適当な制限部位を
両端に有すべきであり、これによって完全配列がクロー
ニングベクターから容易に取り出され、そして発現ベク
ターに移される。
発現ベクターは適切なコピー数を有するように、そし
て安定な染色体外での維持をもたらすように選択され
る。他の方法として、ベクターは宿主ゲノム配列に相同
の配列を含有し、これにより組込み及び増幅が可能にさ
れる。発現ベクターは通常、発現宿主中での選択を可能
にするマーカーを有する。好ましくは、ある状況下で使
用される殺生物剤の使用を回避するため、補完（comple
mentation）を用い、この場合、宿主は栄養要求性であ
りそしてマーカーは原栄養性をもたらす。他の方法とし
て、エピゾーム因子は、短時間の供給において必須栄養
素又は代謝産物を利用する増強された能力を宿主に与え
ることにより選択における利点をもたらすであろう。重
要な因子は、染色体外クローニングベクターが好ましく
は、融合蛋白質の生産の間にベクターを自然に失う宿主
に比べて、ベクターを含有する宿主について選択におけ
る利点をもたらすことである。
クローニングベクターはまた、宿主の生存を深刻に妨
害しない活性な転写開始制御領域を含むであろう。特に
興味ある領域は、解糖に関する酵素；酸性ホスファター
ゼ；熱ショック蛋白質；メタロチオネイン等の発現と関
連するであろう。解糖系に関与する酵素にはアルコール
デヒドロゲナーゼ、グルセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ、トリ
オースホスフェートイソメラーゼ、ホスホフラクトキナ
ーゼ等が含まれる。
種々の転写制御領域を用いることができ、これらの領
域はRNAポリメラーゼの結合及び転写開始と関連する領
域（“プロモーター領域”）（これらの２つの領域はタ
ンデムに配置される）、又は通常プロモータ領域の５′
にある転写開始制御領域（“調節領域”）のみを含み、
ここで調節領域は通常、前記プロモーター又は野性型宿
主中の他のプロモーターと関連する。調節領域は誘導的
制御をもたらし、ここで誘導は物理的変化、例えば温度
の変化、又は化学的変化、例えば栄養又は代謝産物、例
えばグルコース又はトリプトファンの濃度の変化、ある
いはpH又はイオン強度の変化の結果であろう。
特に興味あるのは、ハイブリド転写開始制御領域の使
用である。好ましくは、このハイブリド転写開始領域は
解糖系酵素のプロモーター領域を使用するであろう。調
節領域は、宿主の種々の発現生成物の調節領域、例えば
ADHII、GAL4、PHO5等の調節領域に由来することができ
る。
転写開始制御領域は野性型遺伝子の５′領域の約50〜
1000塩基対（bp）の範囲であることができるRNAポリメ
ラーゼの結合に関与する領域に加えて、他の制御シグナ
ル、例えばキャッピング配列、転写開始配列、エンハン
サー、誘導的転写のための転写制御領域等が存在するこ
ともできる。
転写開始制御領域は一般にポリリンカーによりターミ
ネーター領域から分離され、このポリリンカーは多数の
ユニーク制限部位、通常２個以上、そして約10個以下、
通常６個以下のユニーク制限部位を有する。ポリリンカ
ーは一般に約10〜50bpであろう。ポリリンカーの次にタ
ーミネーター領域が続くであろう。この領域は、２つの
領域が使用される場合に効果的な転写開始及び停止が達
成される限り、プロモーター領域が得られたのと同じ野
性型遺伝子から、又は異る野性型遺伝子から得られる。
発現ベクターを適当な制限酵素で消化することによ
り、ポリリンカーが開裂され、そして融合ポリプペチド
をコードするオープンリーディングフレームが挿入され
る。ポリリンカーが区別可能な末端を許容する場合、融
合遺伝子が１つの方向に挿入することができ、他方末端
が同一であれば、融合遺伝子の挿入は２つの異る方向を
有するプラスミドをもたらし、その内の１つのみが正し
い方向を有する。ともかく、単離及び精製のために原核
性複製系を有する発現ベクターをクローン化し、そして
次に適当な真核性宿主、例えば酵母宿主に導入する。外
来性DNAの真核宿主への導入は種々の方法、例えばカル
シウム−ポリエチレングリコール処理スフェロプラス
ド、リポゾームの使用、接合等により行うことができ
る。
次に、発現することができる融合遺伝子を含有するプ
ラスミドを含む宿主細胞を、宿主のために適切な栄養培
地中で増殖せしめる。誘導性の転写開始制御領域を用い
る場合、宿主細胞を高濃度に増殖せしめ、そして融合ポ
リペプチドの発現について開始をターン・オンする。プ
ロモータが誘導的でない場合、目的とする融合ポリペプ
チドの構成的生産が起こるであろう。
生成物がもはや増加しなくなるまで、又は生成物の生
産と消費される栄養との比率が所定の値より低くなるま
で、細胞を増殖せしめ、この時点で細胞を回収し、溶菌
し、そして融合蛋白質を得、そして常法に従って精製す
る。これらの方法には、クロマトグラフィー、例えばHP
LC;電気泳動；抽出；密度勾配遠心等が含まれる。融合
蛋白質を得た後、これを、選択的に開裂可能な連結の種
類に従って選択的に開裂せしめる。これは、種々の連結
の記載との関連においてすでに記載されている。
幾つかの場合には、分泌リーダー及びプロセシングシ
グナルを、融合ポリペプチドの部分として含めることが
できる。種々の分泌リーダー及びプロセシングシグナ
ル、例えばα−ファクター、酵母キラートキシン等が知
られている。これらのポリペプチドシグナルをコードす
るDNA配列を、融合ポリペプチドをコードするDNA配列の
５′−末端（センス鎖の転写の方向において）にリーデ
ィングフレームを合わせて連結し、プレー融合ポリペプ
チドの転写及び翻訳をもたらすことができる。
この発明に従えば、宿主の全蛋白質に対して５重量％
以上、好ましくは６重量％以上、そしてさらに好ましく
は約10％以上の生成物を生産することができる。同様に
して、使用される栄養は目的生成物への転換のために効
果的に利用される。
次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
実験 例1.SOD−プロインシュリン融合蛋白質のための発現ベ
クターの造成及び発現 pYSI1の造成 GAPプロモーター及びターミネーターの制御のもとに
ヒト−プロインシュリン遺伝子のアミノ末端に融合した
ヒトSOD遺伝子を含有する酵母発現プラスミドpYSI1を造
成した。融合蛋白質のプロセシングを可能にするため、
SOD遺伝子及びプロインシュリン遺伝子の間にメチオニ
ンをコードするトリプレットを含有せしめた。SOD配列
は、化学合成された最初の20コドンを除き、ヒト−肝臓
ライブラリーから単離されたcDNAに対応する。プロイン
シュリン配列は、Bell等、1979、Nature 282:525〜527
により報告されたアミノ酸配列に従って、しかし酵母に
おいて好ましいコドンを用いて化学合成した。GAPプロ
モーター及びターミネーター配列は酵母ライブラリーか
ら単離された酵母GAP遺伝子（Holland及びHolland,J.Bi
ol. Chem.,,1972,254;5466−5474）から得た。
プラスミドpYSI1を次のようにして造成した。３つの
断片、すなわち、phSOD（pSOD Nco５とも称する）から
単離された454b pNcoＩ−Sau3A断片〔この断片は、ヒト
スーパーオキシドジスムターゼ（hSOD）の最後の３個の
３′−コドンを除く全配列を含む）;hSODの最後の３個
のコドン、メチオニン、及びプロインシュリンの最初の
14コドンをコードする51bpSau3A−HindIII合成アダプタ
ー；及び最初の14アミノ酸を除くプロインシュリンをコ
ードする、pINS5から単離された231bpHindIII−SalＩ断
片、を使用した。これらの断片を一緒に連結し、そして
次に、NcaＩ及びSalＩによりあらかじめ消化されそして
アルカリ性ホスファターゼで処理されたプラスミドpPGA
Pに導入した。得られたプラスミドpSI1をBamHIで消化し
て発現カセットを得、これをプラスミドpC1/1にクロー
ン化してpYSI1を得た。
プラスミドphSOD（pSODNco５とも称される）はpBR322
由来細菌性発現ベクターであって、1984年５月11日に出
願された米国特許出願609,412号明細書に記載されてい
るように、hSODをコードする完全なcDNA（最初の20コド
ンは化学的に合成された）。プラスミドpINS5はpBR322
由来ベクターであり、Bell等、Nature、1979、282:525
−527により報告されたアミノ酸配列に従って化学的に
合成されたプロインシュリンコード配列を含有する。プ
ラスミドpPGAPは前記の特許出願No.609,412号明細書中
に記載されているpBR322由来ベクターであって、クロー
ニングのための複数の単一制限部位をもたらすポリリン
カーを介してGAPプロモーター及びGAPターミネータ（Ho
lland及びHolland,J.Biol. Chem.,1979,254,5466−547
4を含有する。プラスミドpC1/1は、pBR322配列、２μプ
ラスミド配列及び選択マーカーとしての酵母遺伝子LEL2
を含有する酵母発現ベクターである。EPO83/306507.1を
参照のこと。
なお、ヒト−Cu・Zn型スーパーオキシドジスムターゼ
のアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列の１例
を次に示す。
pYSI2の造成 Ｋ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ｓをコードするコドンの
“スペーサ”によりプロインシュリン遺伝子から分離さ
れて、転写の方向において５′−末端に、hSODコード配
列を有する融合遺伝子を調製するため、次の断片すなわ
ち、GAPプロモーター、プロインシュリン遺伝子及びス
ペーサーアミノ酸を含有する671bpBamHI−SalＩ断片；
両遺伝子の連結部として最後のスペーサーアミノ酸をコ
ードする14bpSalＩ−NcoＩ合成アダプター；並びに、前
記の特許出願書No.609,412号明細書に記載されているpC
1/1 SAPSODから単離された1.5kbNcoＩ−BamHI断片（hSO
Dコード領域、56bpのhSODターミネーター及び934bpのGA
Pターミネーター領域を含有する）を連結した。得られ
るクローン化断片を単離し、そしてBamHI消化されそし
てアルカリ性ホスファターゼ処理されたpC1/1中に挿入
した。
プラスミドpPKI1及びpPKI2 pYSI1及びpYSI2に類似するプラスミドを、hSOD遺伝子
の代わりに酵母ピルベートキナーゼ（PYK）を用いて造
成した。pPKI1は、酵母PYKプロモーター及び酵母GAPタ
ーミネーターの制御のもとに、ヒト−プロインシュリン
遺伝子のアミノ末端に融合したPYKコード配列を含有す
る。pPKI2は、Ｋ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｓをコードするコドン
の“スペーサー”によりプロインシュリン遺伝子から分
離されて、転写の方向において３′−末端に、PYKコー
ド配列を含有する。
pYASI1の造成 この酵母発現ベクターはpYSI1に類似し、そしてメチ
オニンコドンを介してヒト−プロインシュリン遺伝子の
アミノ末端に融合したhSOD遺伝子を含有する。この融合
遺伝子はハイブリド誘導性プロモーターADH2−GAP（酵
母アルコールデヒドロナーゼ２）及びGAPターミネータ
ーの制御のもとにある。pYSI1からのGAPプロモーター配
列をハイブリドADH2−GAPプロモーター配列で置き換え
ることにより約3KbpBamHI発現カセットを造成した。
このプロモーターのADH2部分を次のようにして造成し
た。すなわち、野性型ADH2遺伝子を含有するプラスミド
（プラスミドpADR2,Beier及びYoung,Nature,1982,300,7
24−728を参照のこと）を制限酵素EcoR5で切断した。こ
の制限酵素は、ATC開始コドンに対して＋66位、及びADH
2領域外のpADR2中の他の２つの部位を切断する。ベクタ
ー断片及び２つの小断片の混合物をBal31エキソヌクレ
アーゼで切り取って約300bpを除去した。Bal31処理され
たDNAに合成XhoIリンカーベクター断片（約5kb）をカラ
ムクロマトグラフィーによりリンカーから分離し、制限
酵素XhoＩで切断し、再連結し、そしてこれを用いてE.
コリをアンピシリン耐性に形質転換した。XhoＩリンカ
ー付加の位置をDNA配列決定により決定した。ADH2遺伝
子の５′−非転写領域（ATGから−232位）内に位置する
XhoＩリンカーを含有する１つのプラスミドを制限酵素X
hoＩで切断し、 ヌクレアーゼS1で処理し、そして次に制限酵素EcoRIで
処理してXhoＩリンカーの部位に１つの平滑末端、及びE
coRI末端を有する線状ベクター分子を形成した。
プロモーターのGAP部分を、プラスミドpPGAP（前掲）
を酵素BamHI及びEcoRIで切断し次に0.4kbpDNA断片を単
離することにより造成した。
プラスミドpJS104を、AluＩ−EcoRI GAPプロモーター
断片を上記の線状ベクター上に存在するADH2断片に連結
することにより造成した。
プラスミドpJS104をBamHI（これは、ADH2領域の上流
を切断する）及びNcoＩ（これは、GAP領域の下流を切断
する）により消化した。
ADH2−GAPプロモーターを含有する約1.3kbp断片をゲル
精製し、そしてpYSI1（前記）中に存在するGAPターミネ
ーター及びhSOD−プロインシュリン融合DNA配列を含有
する約1.7kbp断片に連結した。この3kbp発現カセット
を、BamHI消化されそしてホスファターゼ処理されたpC1
/1にクローン化してpYASI1を得た。
トリプシン及びエンテロキナーゼ開裂部位を含有するpY
ASI1の誘導体の造成 pYASI1から一連のプラスミドを造成した。ここでは、
GPAターミネーターをα−フアクターターミネーター（B
rake等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:4642）によ
り置き換え、そしてSODとプロインシュリンとの開裂部
位をトリプシン又はエンテロキナーゼプリセシング部位
をコードするように変形した。Lys−Argをコードする配
列を用いてpYASI1中のメチオニンコドンを置換してトリ
プシン部位を得た。別法として、開裂部位に（Asp）4Ly
sをコードする配列を用いてエンテロキナーゼ部位を得
た。さらに、余分のヒンジアミノ酸をコードする配列を
SODと開裂部位との間に挿入して他の造成も行った。
融合蛋白質の発現 酵母2150−２−３株（Mata，adel，leu2-04,cir°）
又はPOVI株（Mata，Leu2-04,cir°）を異るベクターに
より、Hinnen等、Proc.Natl.Acad.USA（1978）75:1929
−1933に従って形質転換した。構成的GAP制御ベクター
を担持する単一形質転換体コロニーを2mlのleu-選択培
地に後対数増殖期又は定常期まで増殖せしめた。誘導性
ADH2−GAP制御ベクターをleu-選択培地中で飽和まで増
殖せしめ、次にYEP（３％エタノールを含み、２〜3.5mM
cuSO4を含むか又は含まない）中に1:20（v/v）に稀釈
し、そしてこの培地中で飽和まで増殖せしめた。SDS及
び還元剤の存在下で細胞を溶解し、そしてこの細胞溶解
物を遠心分離により透明にした。透明な細胞溶解物をポ
リアクリルゲル電気泳動にかけた（Laemmli,Nature（19
70）277:680）。クマーシーブルーにより染色した後、
約28kDal（キロダルトン）のバンドが観察され、そのサ
イズは融合蛋白質であることを予想せしめた。このバン
ドは、発現ベクターにより形質転換された細胞において
は観察されたが、対照（pC1/1）プラスミドを担持する
細胞の抽出物には存在しなかった。バンド当りの蛋白質
の量を、クマーシーブルー染色されたゲルのデンシトメ
ーターによる分析により決定した。pYSI1、pYSI2又はpY
ASI1で形質転換された細胞における染色ゲルから算定し
た場合、融合蛋白質は全細胞蛋白質の10％以上であり、
他方pYPKI1又はpYPKI2による形質転換体においては0.5
％より少ない（第１表を参照のこと）。
第１表に示す結果は、PYK−プロインシュリン融合体
の発現レベルはプロインシュリンのみについて得られた
それに匹敵する（それぞれ約0.5％及び0.1％）がhSOD−
プロインシュリンの発現レベルは約20〜100倍高いこと
を示している。
誘導性ADH2−GAPハイブリド転写開始制御領域が好ま
しい。なぜなら、大規模培養における構成的生産は不安
定な発現をもたらすからである。
酵母により合成されたhSOD−プロインシュリン蛋白質
をさらにウェスタンブロットにかけた。上記のようにし
て調製された透明な酵母細胞溶解物をポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動し（Laemmli、前掲）、そして次に
蛋白質をニトロセルロースフィルター上に電的的にブロ
ットした（Towbin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979,7
6:3450）。２枚の同じフィルターにブロットした。この
フィルターをPBS中１％BSAと共に１時間プレインキュベ
ートし、そして次にラビット抗−hSOD又はモルモット抗
−インシュリン抗体により４℃にて12時間処理した。い
ずれの血清も、10％やぎ血清中pC1/1対照細胞溶解物に
より前吸着しておいたものである。フィルターを１％BS
A/PBSで洗浄し、そしてホースラディッシュパーオキシ
ダーゼと接合した第２ヤギ抗−ラビット抗体又は抗−モ
ルモット抗体を加えた。最後に、フィルターをホースラ
ディッシュパーオキシダーゼ発色剤（ビオーラド）と共
にインキュベートし、そして洗浄した。ウェスタン分析
は、融合蛋白質が両抗体と反応したことを示した。
融合蛋白質の開裂 2150（pYASI1）の飽和培養物をSDC（−ロイシン＋スレ
オリンおよびアデニン、２％グリコース含有）中で増殖
せしめた。これを、炭素原として３％エタノールを含有
するYEPを収容する10lファーメンターに接種した。30℃
にて48時間の後、細胞を遠心分離（シャープレス）によ
り集め、秤量し（124g）、そして冷水で洗浄した。
10mMTris−Hcl、pH7.0、1mMEDTA、１μg/mlペプスタ
チンＡ及び1mMPMSFを含有する緩衝液を用いてガラスビ
ーズ破砕機（ダイノミル）により細胞を溶解した。この
混合物をJA10ロータ（ベックマン）中で8,000rpmにて20
分間遠心分離した。ペレットを100mlの緩衝液中に再懸
濁し、そして液体をビーズから離した。約500mlの緩衝
液が使用されるまでこれを反復して、すべてのペレット
物質をガラスビーズから十分に話した。再懸濁されたペ
レットを遠心分離し、そしてこのペレットを再度洗浄し
た。次にペレットを１％SDSを含有する緩衝液中で30分
間抽出した。
SDS可溶性画分を500mlの溶剤Ａ（Komigsberg及びHend
erson,1983,Meth.in Enz.91,254−259頁）を用いてイオ
ン対（ion−pair）抽出し、ペレットを溶剤Ａで一回及
びアセトンで１回洗浄した。
真空デシケーターで乾燥した後、粉末を140mlの100％
蟻酸中に溶解した。60mlの水及び20gのCNBrを加えた。
暗中室温にて24時間置いた後、さらに20gのCNBrを加
え、そして反応を24時間続けた。この時点で、この材料
を4lの水に対して一夜、2000MWカットオフチチューブ
（スペクトラポール）を用いて透析した。次に0.1％酢
酸に対して第２回目の透析を行った。凍結乾燥した後、
ほとんどSOD−ホモセリンとプロインシュリンとからな
る粉末を1.1g得た。
この粉末を７％尿素、９％亜硫酸ナトリウム、及び8.
1％ナトリウムテトラチオネート・2H2Oの溶液（pH7.5）
200mlに溶解した。37℃にて３時間インキュベートした
後、Ｓ−スルホネート生成物を10mMTris（pH8.0）に対
して２回、そして20mMTEAB（炭素水素トリメチルアンモ
ニウム（pH7.3）に対して１回透析した。
Ｓ−スルホネートを凍結乾燥により回収し、そして24
0mlのDEAEカラム緩衝液（Wetzel等、Gene,1981,17:63−
71）に溶解し、そして60mlのカラムに負荷した。２カラ
ム容積を用いて洗浄した後、プロインシュリン−Ｓ−ス
ルホネートを、カラム緩衝液中０〜0.4M NaClのグラジ
エント600mlにより溶出した。プロインシュリンＳ−ス
ルホネートを含有する画分をプールし、そして10mMTris
（pH7.5）に対して２回、そして1mMTrisに対して１回透
析した。
生成物、すなわち約90％純度のプロインシュリン−Ｓ
−スルホネートはpH9でのゲル電気泳動（Line等，Anal.
Biochem.,1980,107:165−176）において予想通りに泳動
することが示され、そして正しい15N−末端残基を有す
る。分析において、アミノ酸組成は予想のそれと非常に
近似しており、但し低レベルの不純物の存在のために完
全には正しくなかった。収量は150mgであった。
次の方法により、再生（renaturation）についての予
備的結果が得られた。プロインスリン−Ｓ−スルホネー
トは、pH10.5にてβ−メルカプトエタノールを用いて再
生することができる（Frank等,1981,Peptides:Synthesi
s,Structure and Function,Proceedings of the Sevent
h Amerecan Peptide Sympqsium,Rich及びGross編、ピア
ス．ケミカル社，ロックフォード,IL,729〜738頁）。予
備実験において、正しく再生されたプロインシュリンの
収量を、トリプシン及びカルボキシペプチダーゼＢによ
る消化によって生成するインシュリンの生産によりモニ
ターした。この方法により精製されたプロインシュリン
−Ｓ−SO3は、ブタ−プロインシュリン−Ｓ−SO3と同様
に再生するようにである。この方法は、インシュリンの
予想量の70％をもたらすことが報告されている。この方
法により製造されたインシュリンは、アミノ酸配列決定
により決定した場合、Ａ鎖およびＢ鎖のそれぞれに正し
いＮ−末端15残基を有する。
例2.SOD−p31融合タンパク質用の発現ベクターの造成及
び発現 AIDS関連ウイルス（ARV）〔Sanchez−Pescador等,Sci
ence（1985）227:484〕のpol遺伝子のエンドヌクレアー
ゼ領域のアミノ末端に融合したヒトSOD遺伝子を含む酵
母発現プラスミドpC1/1−pSP31−GAP−ADH2を造成し
た。SOD−p31の発現は非構成性であり、ハイブリッドAD
H−GAPプロモーターの調節下にある。
pC1/1−pSP31−GAP−ADH2誘導体の造成 酵母内で発現すべき融合タンパク質SOD−p31の遺伝子
を造成するためにプラスミド（pS14/39−２）を使用し
た。このプラスミドは、pYAS1と同じ態様で、ADH−2/GA
P プロモーターの制御下にプロインシュリン遺伝子に
融合したSOD遺伝子を含有している。プロインシュリン
遺伝子はEcoRI制御部位をSalＩ制御部位との間に位置す
る。プロインシュリン遺伝子をp31断片によって置き換
えために、ホスホラミディト（phosphoramidite）化学
を使用して、２種のオリゴマー（各々、ARV−300および
ARV−301と称す）を合成した。その配列は、２種のオリ
ゴマーをアニーリングした際に、分子の各側部にEcoRI
用およびNcoＩ用の付着端部を発生する。ARV−300およ
びARV−301は以下の配列をもつ。
EcoRIで線状化したpS1439−２の２μｇを、ATPおよび
T4DNAリガーゼの存在下において、リン酸化ARV−300お
よび脱リン酸化ARV−301の各々100ピコモルに連結した
（最終容量35μｌ）。反応を14℃で18時間実施した。DN
AをSalＩで更に消化し、断片を１％低融点アガロースゲ
ル上で分離し、前記ベクターとSOD遺伝子（〜6.5kb）と
を含む断片を前記と同様に精製し、そしてTE（10mMのTr
is、1mMのEDTA、pH8）50μｌ中に再懸濁した。５μｌの
この調製物を14℃で18時間p31断片（ARV248NL、後記参
照）５μｌに連結した（最終容量20μｌ）。コンピテン
トHB101細胞の形質転換には５μｌを使用した。得られ
たプラスミドをpSB31と称する。このプラスミド20μｇ
をBamHIで消化し、約2900bpの断片をゲル電気泳動によ
って単離し、TE中に再懸濁し、そして、予めBamHIで切
断しておいたpC1/1に連結した。このDNAを使用してHB10
1を形質転換し、BamHIカセットをもつ形質転換細胞を得
た。このpC1/1−pSP31−GAP−ADH2誘導対によって酵母
菌株PO17）Mata,leu2−04、cir°）を形質転換した。
ARV248NLすなわちp31コード断片の調製 800b p ARV248NL断片は、前記Sanchez−Pescador等の
文献の第２図に示すように、polタンパク質の末端に向
かって、アミノ酸737個をコードするものである。前記
の調製は以下の手順によって行った。
pol遺伝子の３′末端とorf−１、env、及びorf−２の
５′末端とを含み、予め１％低融点アガロース〔シー・
パック（Sea−Pack）〕ゲル上を泳動せしめそして65℃
でフェノールによって抽出したARV−２（9B）のKpnＩ消
化体〔前記のSanchez−Pescador等の文献参照）から5.2
kbDNA断片を単離し、100％エタノールで沈澱し、そして
TE中に再懸濁した。この材料８μｌを、37℃で１時間Ss
tＩで更に消化した（最終容量10μｌ）。酵素の加熱不
活性化の後で、前記の消化物1.25μｌを、予めKpnＩお
よびSstＩで切断した20μｇのM13mp19に、ATPの存在下
で連結した（最終容量20μｌ）。反応を室温で２時間進
行させた。この混合物５μｌを使用してコンピテントE.
コリJM101の形質転換を行った。透明なプラークが生長
した。MessingおよびVieira、Gene（1982）19:269−276
に記載のとおりにして一本鎖DNAを調製した。
M13鋳型中のDNA配列を部位特異的変質誘発によって変
更して、NcoＩによって認識される制限部位（CCATGG）
を生成した。3845位置〔前記のSanchez−Pescador等の
文献の第１図〕のＣとＡとを変えそして3851位置のＴと
Ａとを変えたオリゴデオキシヌクレオチドを、固相ホス
ホラミディト法によって合成した。これらの変化は両者
とも、アミノ酸配列に関しては影響を与えない。第２の
変化を導入して非対応（heterologous）分子の安定性を
低下させた。このオリゴマーをARV−216と称する。この
オリゴマーは配列 ５′−TTAAAATCACTTGCCATGGCTCTCCAATTACTG をもち、非コード鎖に相当する。なぜなら、M13誘導体
鋳型0110D484は一本鎖であってコード鎖を含むからであ
る。５′脱リン酸化M13配列決定プライマー、50mMのTri
s−HCl（pH8）、20mMのKCl、7mMのMgCl2および0.1mMのE
DTA。DNA二重鎖50ng/μｌ、dNTP150μＭ、ATP1mM、トリ
ス−アセテート（pH7.8）33mM、酢酸カリウム66mM、酢
酸マグネシウム10mM,ジチオトレイトール（DTT）5mM、T
4ポリメラーゼ12.5単位、T4遺伝子32プロテイン100μg/
mlおよびT4DNAリガーゼ５単位を含む100μｌ中で重合反
応を実施した。この反応混合物を30℃で30分間インキュ
ベートし、そしてEDTAおよびSDS（最終濃度で各々10mM
および0.2％）を添加して反応を停止した。コンピテン
トJM101E.コリ細胞を前記重合生成物の1:10希釈物１μ
ｌ、２μｌおよび４μｌで形質転換し、YTプレートにプ
レーティングした。プラークを吸着によってニトロセル
ロースフィルターに上げ、0.2NのNaOHおよび1.5MのNaCl
中で変性し、続いて0.5Mのトリス−HCl（pH7.3）および
3MのNaCl中で中和し、そして6xSSC中で平衡化した。フ
ィルターをブロッティングして乾燥し、80℃で２時間ベ
ーキングし、そして0.2％SDS、10xデンハート（Denhard
t）6xSSC中で37℃で前アニーリングした。１時間後ラベ
ル付ARV−216の7.5×106cpmをフィルターに加え、更に
２時間37℃でインキュベーションした。フィルターを6x
SSC中で20分間42℃で洗い、ブロッティングで乾かし、
そして補助（intensi−fying）スクリーンを使用する−
70℃における１時間のフィルム露出に使用した。ハイブ
リッド性の強いプラークが生長した。これから一本鎖DN
Aを調製し、配列決定用の鋳型として使用した。配列決
定が示すところによれば、鋳型U1021785はNcoＩ部位と
前記の第２置換とを含んでいた。
第２オリゴマーを合成し、pol遺伝子の末端コドンの
直後にSalＩ部位およびEcoRI部位を挿入した〔前記Sanc
hez−Pescador等の文献の第１図、4647位置〕。このオ
リゴマーをARV−248と称する。配列は以下のとおりであ
る。
５′−GGTGTTTTACTAAAGAATTCCGTCGACTAATCCTCATCC ハイブリッド形成後のフィルター洗浄を65℃で実施する
こと以外は前記と同様にして、鋳型01020785を使用して
部位特異的変異誘発を実施した。前記と同様に、ハイブ
リッド性の強いプラーク８個が生長し、一本鎖DNAを配
列決定した。鋳型01031985の配列が示すところによれ
ば、それは意図したとおり、NcoＩ、SalＩおよびEcoRI
用の制限部位を含んでいる。
透明プラーク６個を各々37℃で５時間2xYT（酵母抽出
液0.5％、トリプトン0.8％、NaCl0.5％、寒天1.5％）1.
5ml中で生長させることにより、M13 01031098鋳型の複
製型（RF）を調製した。Maniatis等、Molecular Clonin
g,a Laboratory manual,Cold Spring Harbor,1982に記
載のとおりにして二本鎖DNAを得、プールし、最終容量1
00μｌ中に再懸濁した。RFのアリコート20μｌを、消化
緩衝液40μｌ容量中で、NcoＩおよびSalＩで切断した。
この断片を酵母中でのp31発現に使用した。試料を１％
低融点アガロース〔シー・パック（Sea−Pack）〕ゲル
上で泳動させ、臭化エチジウムによる蛍光によってDNA
を可視化した。800bpバンドを切出し、前記と同様の方
法でDNAをゲルから抽出し、そしてTE10μｌ中に再懸濁
した。この断片をARV248NLと称する。
pC1/1−pSP31−GAP−ADH2の誘導 ３種類の異なる誘導を行った。
１）YEP/1％グリコース培地またはleu−/3％エタノール
培地のいずれか10ml中で24時間、P017コロニーを誘導さ
せた。各混合物からの酵母ペレットを、AIDS患者からの
血清を使用するWesternsおよびポリアクリルアミドゲル
の両者によって、p31に関して分析した。クーマシー（C
oomassie）染色ゲルは陰性の結果を示すが、どちらの場
合でも、Westernsは正確な分子量のバンドを示した。
２）YEP/1％エタノール培地30ml中で48時間、P017コロ
ニーを誘導した。誘導の際の種々の時点において、アリ
コートをPAGEによって分析した。クーマシー染色ゲルは
正しい分子量範囲（47−50kd）にバンドを示し、これは
YEP/1％エタノール中で14時間後に現われ、そして誘導
の24時間後に最大強度に達する。AIDS患者からの血清を
使用するSODp31に関するWesternの結果は、誘導の24時
間および48時間に強いバンドを示し、クーマシー染色ゲ
ルと良好に相関する。
酵母からのSOD−p31の精製及び特徴づけ 冷凍された酵母（細菌）細胞を室温で解凍し、そして
溶菌緩衝液〔細菌のためには、20mMのTris−Cl、pH＝8.
0、2mMのEDTA、及び1mMのフェニルメチルスルホニルフ
ルオリド（PMSF）：酵母のためには、50mMのTris−Cl、
pH＝8.0、2mMのEDTA、及び1mMのPMSF〕1.5容積中に懸濁
し、そして酸で洗浄されたガラスビーズ１容積と共に混
合した。
−20℃の冷却ユニットに連結されているDynomillユニ
ットのガラスチャンバーを用いて3,000rpmで非連続的に
15分間細胞を破壊した。カラスビーズを氷上で２〜３分
間デカントし、そして細胞溶解物を取り出した。デカン
トされたガラスビーズを40℃で溶菌緩衝液30mlにより２
度洗浄した。細胞溶解物を39,000xgで30分間遠心分離し
た。
上記の遠心分離から得られたペレットを溶菌緩衝液に
より１度洗浄し、その後かきまぜ、そして４℃でそのペ
レットを懸濁した（上と同じ遠心分離を行なった）。洗
浄されたペレットを溶菌緩衝液中0.2％SDS（細菌のため
には）及び0.1％SDS（酵母のためには）により処理し、
そして４℃で10分間揺動することによって攪拌した。溶
解物を39,000xgで30分間遠心分離した。ペレットをサン
プル緩衝液（67.5mMのTris−Cl、pH＝7.0、５％β−メ
ルカプトエタノール、及び2.3％SDS）中において10分間
煮沸し、そして39,000xgで10分間遠心分離した。上清液
を回収し、そして0.45μｍフィルターを通した。上のフ
ィルターからの上清液をリン酸緩衝溶液（PBS）および
0.1％SDSにより平衡化されたゲル濾過カラム（2.5×90c
m、ACA34LKB）上に0.3〜0.4ml/分の流量で負荷した（最
大50mgのタンパク質）。SOD−p31を含む画分をプール
し、そして真空透析するか、又は40psiでYM5Amicon膜を
用いるかいづれかによって濃縮した。このタンパク質を
濃厚溶液として−20℃で貯蔵した。
ゲル電気泳動分析は、約46kdの分子量を有するSOD−p
31タンパク質が泳動し、そして90％以上の純度であるこ
とを示した。
類似する構成及び結果が、E．コリ中において細菌のt
rp−lacプロモーターの制御下でSOD−p31融合体を発現
することによって得られた。
このSOD−p31融合タンパク質は、体液中のAIDSに対す
る抗体の存在を検出するための免疫検定に使用できる。
好効果がSOD−p31融合タンパク質を用いて、ELISA及び
ストリップ検定において得られた。例３ :SOD−IGF−２融合タンパク質のための発現ベクタ
ーの造成及び発現 IGF−２遺伝子のアミノ末端に融合したヒトSOD遺伝子
を含む酵母発現プラスミドpYLUIGF2−14（EPO 123228を
参照のこと）を造成した。
SOD−IGF2の発現は非構成的であり、そしてそれはハ
ンブリッドADH−GAPプロモーターの制御下にある。
pYLUIGF2−14の造成 酵母中で発現されるべき融合タンパク質SOD−IGF2の
ための遺伝子の造成のために、プラスミドpYS18を使用
した。プラスミドpYS18はADH−GAPプロモーター及びα
−因子ターミネーターの制御下にプロインシュリン遺伝
子に融合したSOD遺伝子を含む（第１表を参照のこ
と）。プラスミドpYS18をBamHI及びEcoRIにより消化し
た。1830bpの断片（ADH−GAPプロモーター及びSOD遺伝
子を含む）をゲル電気泳動によって精製した。
第２のBamHI（460bp）フラグメント（IGR−２）のア
ミノ酸残基41〜201及びα−因子ターミネーターをコー
ドする）EPO123228を参照のこと）を次のリンカー： に連結した。このリンカーはEcoRIオーバーハング、メ
チオニンのためのATGコドン及びIGF2のコドン１〜40並
びにSalＩオーバーハングを提供する。
IGF−２遺伝子及びα−因子ターミネーターを含む得
られるEcoRI−BamHI断片（510bp）を、ADH−GAPプロモ
ーター及びSODを含む1830bpのBamHI−EcoRI断片に連結
した（上記を参照のこと）。この得られるBamHI断片（2
340bp）を、BamHIにより消化され、そしてホスファター
ゼにより処理されたpAB24（下記を参照のこと）にクロ
ーンし、pYLUIGF2−14を得た。
pAB24は、完全な２μ配列〔Broach,Molecular Bioloy
g of the Yeast Saccharomyces（1981）1:445,Cold Spr
ing Harbor出版〕及びpBR322配列を含む酵母発現ベクタ
ーである。これはまた、プラスミドYEp24に由来する酵
母URA3遺伝子〔Bot−steinなど，Gene（1979）8:17〕及
びプラスミドpC1/1に由来する酵母LEU2d遺伝子（EP0116
201を参照のこと）を含む。発現カセットの挿入はpBR32
2のBamHI部位においてであり、従って、テトラサイクリ
ンに対する細菌耐性のための遺伝子を中断した。
SOD−IGF2の発現 酵母AB110（Matα,ura３−52,leu２−04又はleu２−
３及びleu２−112の両者，pep４−3,his４−580,cir
°）をpYLUIGF2−14により形質転換した。形質転換体を
ura-選択プレート上で増殖せしめた。形質転換コロニィ
ーを3mlのleu -選択培地に移し、そして30℃のシェーカ
ー内で24時間増殖せしめた。この培養物の１×10-4希釈
物100μｌをura -プレート上にプレートし、そして個々
の形質転換体を約48〜72時間増殖せしめた。個々の形質
転換体を3mlのleu -培地に移し、そして30℃のシェーカ
ー内で24時間増殖せしめた。これらの培養物のおのおの
の1mlを24mlのUEP及び１％グルコース培地中に希釈し、
そして細胞をSOD−IGF2の最大収得のために16〜24時間
増殖した。細胞を遠心分離し、そして水により洗浄し
た。細胞を溶菌緩衝液〔リン酸緩衝液、pH＝7.3（50〜1
00mM）,0.1％Triton×100〕２溶積中に再懸濁した。酸
により洗浄されたガラスビーズ２溶積を添加し、そして
その懸濁液を交互にかきまぜるか又は氷上においた（5
x,1分のおのおののサイクル）。懸濁液を遠心分離し、
そして上清液をデカントした。不溶性ペレットを室温で
30分間１％SDSの溶菌緩衝液中においてインキュベート
した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液を凍結乾
燥せしめた。
２つの他の造成物:pYLUIGF2−15及びpYUIGF2−13を非
融合IGF2の発現のための対照として使用した。細胞内発
現のための前者のプラスミド（pYLUIGF2−15）は、GAP
プロモーター及びα−因子ターミネーターの制御下にIG
F遺伝子を含む。IGF2の分泌のための後者のプラスミド
（pYUIGF2−13）は、GAPプロモーター、α−因子リーダ
ー及びα−因子ターミネーターの制御下にIGF2の因子を
含む。
＊クーマシーブルー染色によって、SOD・IGF2融合タ
ンパク質は全細胞タンパク質の10〜15％を示し、すなわ
ち１の培養物当り約100〜300mgに相当する。IGF2は融
合タンパク質の約1/3を代表し、従ってそれは１の培
養当り約30〜100mgに相当する。融合タンパク質とCNBr
との分析的な開裂反応は、PAGE上に、IGF2について予期
される位置に移動するバンドをもたらした。
＋RRA−IGF2レベルをHornerなど.,J.of Clinical End
ocrinology and Metabolism（1978）47:1287及びMarsha
llなど.,J.of Clinical Endocrinology and Metabolism
（1974）39:283に従って、胎盤膜のラジオレセプターア
ッセイ（RRA）によって測定した。RRAのための胎盤膜
を、Cuatrecasas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1972）69:3
18の方法によって調製した。
SOD・IGF2のNBrによる開裂のための方法 酵母細胞のカラスビーズ溶菌からの不溶性画分を70％
蟻酸に溶解した。CNBr結晶（〜/gのCNBr/100mgの融合タ
ンパク質）を添加し、そして室温で12〜15時間暗中でイ
ンキュベートした。開裂が不完全である場合、この段階
を24時間後くり返すことができる。
この方法を使用しなければむずかしく且つ非能率的に
生産されるポリペプチドを、融合タンパク質（ここで、
この融合タンパク質は、選択的に開裂可能な部位によっ
て他のポリペプチドに結合される比較的に短い安定した
ポリペプチド配列を含む）を用いることによって、実質
的に高められた収量をもたらすことができることが上記
の結果から明らかである。従って、高いレベルの融合タ
ンパク質を真核宿主、たとえば酵母中で得ることがで
き、そして該宿主とは異質の目的とするポリペプチドの
効率的な製造を可能にする。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で変更及び変性を行なうことができる。
S．セレビシア（S．cerevisiae）菌株2150−２−３
（pYASI1）およびAB110（pYLUIGF2−14）をそれぞれ、1
985年２月27日及び1986年３月19日にA.T.C.C.にブタペ
スト条約に基き国際寄託し、そしてそれぞれ寄託番号第
20745号及び20796号を得た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ジエフリー アール．シヤスター アメリカ合衆国，カリフオルニア 94596, ウオルナツト クリーク，３エー，コレ アベニユ 1810 (72)発明者 ジエイムズ ピー．メリーウエザー アメリカ合衆国，カリフオルニア 94708, バークレイ，ヒルデイル 916

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】哺乳動物ポリペプチドをコードするDNAに
    連結されたヒト−Cu・Zn型スーパーオキシドジスムター
    ゼをコードするDNA。
  2. 【請求項２】連結がメチオニンのコドンを介して行われ
    ている、特許請求の範囲第１項に記載のDNA。
  3. 【請求項３】連結がＫ−Ｒのコドンを介して行われてい
    る、特許請求の範囲第１項に記載のDNA。
  4. 【請求項４】連結が（Ｄ）4Ｋをコードするコドンを介
    して行われている、特許請求の範囲第１項に記載のDN
    A。
  5. 【請求項５】連結がヒンジアミノ酸のコドンを含んでさ
    れている、特許請求の範囲第１項に記載のDNA。
  6. 【請求項６】連結が酵素的に除去できるアミノ酸の連結
    をコードしている、特許請求の範囲第１項に記載のDN
    A。
  7. 【請求項７】転写方向に、 （１）転写開始制御領域；及び （２）哺乳動物ポリペプチドをコードするDNA配列に連
    結されたヒト−Cu・Zn型スーパーオキシドジスムターゼ
    をコードするDNA; を含んで成る発現DNA。
  8. 【請求項８】転写開始制御領域が誘導性転写開始制御領
    域である、特許請求の範囲第７項に記載の発現DNA。
  9. 【請求項９】転写方向に、 （１）転写開始制御領域；及び （２）哺乳動物ポリペプチドをコードするDNA配列に連
    結されたヒト−Cu・Zn型スーパーオキシドジスムターゼ
    をコードするDNA; を含んで成る発現DNAにより形質転換された酵母宿主。
  10. 【請求項１０】転写開始制御領域が誘導性転写開始制御
    領域である、特許請求の範囲第９項に記載の宿主。
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